一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法與流程

2023-10-10 16:17:29

本發明屬於疫苗
技術領域：
，具體涉及一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法。
背景技術：
：偽狂犬病(porcinepseudorabies)是由偽狂犬病毒(pseudorabiesvirus，prv)引起的發生在多種家畜和野生動物體內的一種急性傳染病，以發熱、奇癢、腦脊髓炎為主要發病症狀。豬是偽狂犬病的唯一自然宿主，對其危害大。可致妊娠母豬流產，產死胎及胎兒乾屍化。對初生仔豬則引起神經症狀，出現運動失調，麻痺，衰竭死亡，病死率100％。成年豬多呈隱性感染。病豬、帶毒豬及帶毒鼠類是本病的主要傳染源。豬既是本病的原發感染宿主，又是病毒的長期貯存者和排毒者，在偽狂犬病的傳播上起著重要作用。偽狂犬病的傳播和蔓延，給養殖業造成了巨大損失。本病目前無特效治療藥物，對感染髮病豬可注射豬偽狂犬病高免血清，對未發病受威脅豬進行緊急免疫接種。本病以預防為主，疫苗的免疫接種是預防和控制豬偽狂犬病的根本措施，目前國內外已研製出豬偽狂犬病的常規弱毒疫苗、滅活疫苗和基因缺失疫苗，這些疫苗都能在一定程度上減輕或防治偽狂犬病的臨床症狀，從而減少造成的經濟損失。目前，我國商品化的豬偽狂犬病病毒疫苗主要是基因缺失活疫苗，其安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原純淨性，滅活工藝及佐劑等因素的影響。常規工藝生產的豬偽狂犬病毒滅活疫苗在臨床應用中有一定的副反應，主要與病毒抗原中所含的抗原外成分有關。這些成分包括：病毒培養用動物細胞的殘留蛋白質和殘留dna；培養基殘留如小牛血清；滅活劑殘留等。這些異源成分不僅會引起免疫動物的副反應，而且會大大降低疫苗的效力。以傳統滅活全病毒作為抗原的純化工藝主要以自然沉降、離心、膜包濃縮等工藝為主，生產的疫苗中有效抗原含量增加，同時有害物質殘留量濃度也升高，導致疫苗產品存在安全性隱患。所以，提高病毒滴度和抗原純淨性是提升疫苗質量的基本途徑。中空纖維膜過濾技術是料液以一定的流速在膜的上表面循環，小於膜孔徑的物質可以透過膜到透過端，而大於膜孔徑的物質會被膜截留，從而實現目標物質的濃縮以及不同物質的分級分離。中空纖維柱具有纖維管狀的開放式流道結構，無篩網的管狀流道結構避免了料液的無規則劇烈湍流，因此具有更低的剪切力，溫和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脫落和蛋白的聚集，同時有助於雜蛋白的透過和去除。分子篩凝膠層析是一種多孔性的不帶表面電荷的物質，當帶有多種成分的樣品在凝膠內運動時，由於分子量不同在緩衝液洗脫時，分子量大的物質不能進入凝膠孔內，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行"繞道"運行，這樣就可以按分子量的大小，先後流出凝膠柱，達到分離的目的。技術實現要素：本發明針對現有技術的不足，目的在於提供一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法。為實現上述發明目的，本發明採用如下技術方案：一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法，包括如下步驟：(1)取純懸浮bhk細胞培養的豬偽狂犬病毒培養液，連續流離心取上清作為待澄清樣品；(2)將步驟(1)所得待澄清樣品利用中空纖維柱澄清過濾，得到病毒澄清液；(3)將步驟(2)所得病毒澄清液利用中空纖維柱超濾濃縮，得到病毒濃縮液；(4)將步驟(3)所得病毒濃縮液利用分子篩凝膠層析柱層析，收集洗脫後的第一個洗脫峰，所得洗脫液即為高純度的豬偽狂犬病毒。上述方案中，步驟(2)所述中空纖維柱的孔徑為0.45μm～0.65μm，更為優選地，所述中空纖維柱的孔徑為0.45μm。上述方案中，步驟(2)所述中空纖維柱澄清過濾的具體操作為：首先用無菌的0.5mol/lnaoh溶液對中空纖維柱進行循環滅菌處理，再用無菌注射水對中空纖維柱進行清洗，直至ph為6.8～7.2，然後用無菌0.01mol/lpbs溶液平衡中空纖維柱，最後將豬偽狂犬病毒待澄清樣品通過中空纖維柱澄清過濾，收集透過端液體，得到病毒澄清液。所述豬偽狂犬病毒待澄清樣品通過中空纖維柱澄清過濾的過程為：先透過60％～70％待澄清樣品，然後補加體積與剩餘樣品體積相同的0.01mol/lpbs溶液，繼續透過，待透過樣品的體積等於加入的pbs溶液體積後，再補加體積與剩餘樣品體積相同的0.01mol/lpbs溶液，如此洗濾多次後，直至殘渣不能透過，結束澄清過濾過程。上述方案中，步驟(2)所述中空纖維柱澄清過濾時採用的tmp在2.0～3.0psi，進液端流速控制在60～80l/min。上述方案中，步驟(3)所述中空纖維柱的孔徑為500kd～750kd。更為優選地，所述中空纖維柱的孔徑為500kd。上述方案中，步驟(2)所述中空纖維柱的型號為：cfp-5-d-55a；步驟(3)所述中空纖維柱的型號為：ufp-500-e-55；步驟(2)和步驟(3)中所述中空纖維柱的設備型號為versaflux120。上述方案中，步驟(3)所述中空纖維柱超濾濃縮的過程為：首先用無菌的0.5mol/lnaoh溶液對中空纖維柱進行循環滅菌處理，再用無菌注射水對中空纖維柱進行清洗，直至ph為6.8～7.2，然後用無菌0.01mol/lpbs溶液平衡中空纖維柱，最後將病毒澄清液通過中空纖維柱超濾濃縮，收集濃縮後的液體，得到病毒濃縮液。所述病毒澄清液通過中空纖維柱超濾濃縮的過程為：(1)維持tmp在10.0～15.0psi持續透過，待樣品體積濃縮至起始體積的1/8～1/10(v/v)時，補加0.01mol/lpbs溶液進行第一次洗濾，待樣品體積濃縮至起始體積的1/16～1/20(v/v)時，補加與樣品等體積的0.01mol/lpbs溶液進行第二次洗濾，至樣品再次濃縮至起始體積的1/16～1/20(v/v)時，結束濃縮，收集濃縮後的液體；(2)用起始病毒澄清液1/16～1/20(v/v)體積的0.01mol/lpbs溶液循環衝洗中空纖維，收集洗膜液；(3)將步驟(1)所得濃縮後的液體與步驟(2)所得洗膜液混合後，即為8～10倍濃縮的病毒濃縮液。上述方案中，步驟(4)所述分子篩凝膠層析柱的填料為sepharose4ff瓊脂糖凝膠層析填料；所述分子篩凝膠層析柱的型號為bpg450/1000column。上述方案中，步驟(4)所述分子篩凝膠層析柱層析的過程為：用無菌的0.5mol/lnaoh溶液對分子篩凝膠層析柱衝洗2個柱體積，再用無菌水衝洗直至ph為7.2，隨後用0.01mol/lpbs溶液平衡分子篩凝膠層析柱至柱前柱後電導率一致(柱前和柱後的電導率都在15～16ms/cm)，ph穩定在7.0，紫外檢測uv280基線平穩；然後將步驟(3)所得病毒濃縮液上樣，上樣結束後，用洗脫液洗脫，待uv280值開始回升時，開始收集洗脫液，至第一洗脫峰結束停止收穫洗脫液。上述方案中，所述分子篩凝膠層析柱層析時，病毒濃縮液上樣的線性流速為45～100cm/h，壓力小於2.5bar，上樣量控制在10％～15％(v/v)柱體積，洗脫液為0.01mol/lpbs溶液。本發明的有益效果：(1)本發明解決了豬偽狂犬病毒難以實現高純度下大規模生產的技術難題，通過中空纖維柱的澄清過濾處理、中空纖維柱的超濾濃縮純化處理及sepharose4ff分子篩凝膠層析純化處理，實現了大規模(500l～1000l)高效生產製備高純度豬偽狂犬病毒，豬偽狂犬病毒的病毒回收率可達99.74％，雜蛋白去除率高達97％，有效抗原含量高達95.3％。(2)本發明將中空纖維澄清過濾、中空纖維濃縮純化和分子篩凝膠層析純化整合併應用在豬偽狂犬病毒純化領域，根據豬偽狂犬病毒的特性，採用特定型號/孔徑的中空纖維澄清過濾預處理，選擇合適型號/孔徑的中空纖維柱進行超濾濃縮，最後採用特定填料組分的分子篩凝膠層析進一步純化，在有效去除雜質的同時減少抗原流失，提高了處理效率、蛋白回收率或/和病毒回收率。(3)本發明所述方法操作簡單、成本低、處理效率高，並適合工業化大規模生產。經過純化所得豬偽狂犬病毒的純度高，在後期疫苗配製過程中，大大減少了抗原的使用量，既節約了成本，又從根本上解決了疫苗副反應的問題，因此，具有良好的推廣前景。(4)本發明所述豬偽狂犬病毒液純化工藝，雜蛋白去除率高達97％，有效抗原含量高達95.3％，使由雜蛋白引起的疫苗副反應降至更低，提高了疫苗安全性的同時保持了良好的免疫原性；由於豬偽狂犬病滅活疫苗接種對象為豬群，高質量的產品大大降低接種豬群的副反應，同時為養殖戶帶來較高的社會效益和經濟效益。(5)本發明所述方法在相同的實驗條件下，匹配相應的罐體和管道，可以進行工藝的線性放大，生產規模可以擴大到2000l、3000l、5000l，均具有可操作性。附圖說明圖1為分子篩凝膠層析柱層析純化圖譜。圖2為不同上樣量的蛋白純化圖譜，其中a為上樣量5％，b為上樣量10％，c為上樣量15％。具體實施方式為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限於下面的實施例。以下實施例中，所用儀器如下：用于澄清過濾的中空纖維柱型號為：cfp-5-d-55a。用於超濾濃縮的中空纖維柱型號為：ufp-500-e-55。中空纖維柱澄清過濾和超濾濃縮過程中空纖維柱設備型號為versaflux120。分子篩凝膠層析柱型號為：bpg450/1000column。分子篩凝膠層析柱填料為：sepharose4ff凝膠層析填料。上述儀器均購自ge公司。所用試劑如下：300l豬偽狂犬病毒液，108.0tcid50/ml，由本公司生產部提供；對每步所得產物分別通過a280檢測蛋白含量，通過tcid50檢測病毒滴度。所述流速公式v＝1.56πr2ml/min中，r表示層析柱半徑。實施例1一、中空纖維柱澄清工藝1系統預處理1.1將0.2μm、0.45μm、0.65μm中空纖維柱分別安裝到中空纖維柱控制設備中，接通相應的管道，組裝完畢後用無菌注射用水循環浸潤中空纖維柱10min。1.2系統完整性檢測壓力保持法檢測系統的完整性。1.3系統的處理清洗及滅菌：用無菌0.5mol/lnaoh溶液對系統進行循環滅菌處理30min，然後用無菌注射用水對系統進行清洗，洗去殘餘的鹼溶液，直至ph為7.0；1.4水通量的檢測用無菌注射用水在規定的泵速下透過，計算相應溫度下中空纖維柱的水通量。1.5中空纖維柱平衡用無菌0.01mol/lpbs溶液平衡中空纖維柱5min。2待澄清樣品的澄清過濾過程2.1取純懸浮bhk細胞培養的豬偽狂犬病毒培養液300l，連續流離心取上清作為待澄清的樣品280l；2.2將待澄清抗原分別通過0.2～0.65μm中空纖維柱，樣品在纖維柱內循環5min後，泵速控制在40～50％(進液端流速在60～80l/min)，打開透過端，維持tmp(跨膜壓)1.5～2.0psi，循環流速為78l/min，收集透過端液體；待收集透過端液體體積為200l，以1.5l/min流速連續補加80l0.01mol/lpbs溶液，繼續透過，待透過樣品的體積等於加入的pbs溶液體積後，再補加與剩餘樣品等體積的0.01mol/lpbs溶液，如此洗濾三次後，至殘渣不能透過結束澄清過程，透過端收集的抗原500l即為病毒澄清液。表1豬偽狂犬病毒澄清過濾效果評價表1結果表明，不同孔徑的中空纖維柱對豬偽狂犬病毒的澄清效果差異顯著。0.65μm的雜蛋白去除效果是最好的，但也導致病毒回收率的下降；0.2μm孔徑病毒回收率是最好的，但是處理效率卻是最差的。綜合處理效率、雜蛋白去除率和病毒回收率三個指標，0.45μm孔徑的中空纖維柱是最理想的選擇。在中空纖維澄清過濾過程中，樣品前期處理的澄清度越好，中空纖維柱的處理效率越高，中空纖維柱的澄清效果也直接影響了抗原濃縮的效率。實施例2一、中空纖維柱超濾濃縮工藝1系統預處理1.1將300kd、500kd、750kd中空纖維柱分別安裝到中空纖維柱控制設備中，接通相應的管道，組裝完畢後用無菌注射用水循環浸潤中空纖維柱10min。1.2系統完整性檢測壓力保持法檢測系統的完整性。1.3系統的處理清洗及滅菌：用無菌0.5mol/lnaoh溶液對系統進行循環滅菌處理30min。然後用無菌注射用水對系統進行清洗，洗去殘餘的鹼溶液，直至ph為7.0。1.4水通量的檢測用無菌注射用水在規定的泵速下透過，計算相應溫度下中空纖維柱的水通量。1.5中空纖維柱平衡用無菌0.01mol/lpbs溶液平衡中空纖維柱5min。2病毒澄清液超濾濃縮過程將待澄清抗原500l通過中空纖維柱，樣品在纖維柱內循環5min後，打開透過端，維持tmp14psi，循環流速為3.0l/min，透過端液體為廢液，將樣品進行10倍濃縮，待樣品濃縮至30l，補加0.01mol/lpbs溶液30l洗濾第1次；待樣品濃縮至30l，補加0.01mol/lpbs溶液30l洗濾第2次；至樣品濃縮至14l，收集20倍濃縮液。加入14l0.01mol/lpbs溶液循環衝洗中空纖維10min，收集洗膜液。20倍濃縮液和洗膜液混合後即為10倍濃縮樣28l。表2中空纖維超濾濃縮效果評價表2結果表明，不同孔徑的中空纖維柱對豬偽狂犬病毒的超濾濃縮的效果不盡相同。750kd中空纖維柱的雜蛋白去除效果是最好的，但病毒回收率較低；300kd孔徑的空纖維柱病毒回收率最好，但是處理效率最差。從綜合處理效率、雜蛋白去除率和病毒回收率三個指標，500kd孔徑的中空纖維柱是超濾濃縮中最合適的孔徑。實施例3分子篩凝膠層析工藝1系統預處理1.1將4ff分子篩預裝柱安裝到位，測柱效。1.2用無菌0.5mol/lnaoh處理分子篩凝膠層析柱2個柱體積(cv)，再用無菌注射水清洗至ph7.0，然後用0.01mol/lpbs溶液平衡離子交換柱至電導率柱前後一致(柱前和柱後電導率在15.69ms/cm)，ph穩定在7.0，紫外uv280基線平穩。2純化過程將濃縮後病毒樣上樣，設定上樣線性流速為30cm/h，壓力控制小於2.0bar。上樣量為5％、10％、15％柱體積，上樣結束後，用0.01mol/lpbs溶液開始洗脫蛋白，待uv280值開始起峰時收集洗脫後樣品，待目的蛋白峰結束uv280值下降至最低或者數值開始增加時停止收集第一洗脫峰洗脫樣品。繼續洗脫層析柱至抗原液全部流出柱體。收集的洗脫樣品即為豬偽狂犬病毒純化後樣。表3豬偽狂犬病毒純化效果評價樣品蛋白濃度(ug/ml)雜蛋白去除率tcid50/0.1ml病毒回收率病毒液原樣11214-7.89-5％上樣量40199.74％7.2999.00％10％上樣量154697.40％7.3898.70％15％上樣量193597.10％7.3598.20％*採用a280方法檢測蛋白濃度及tcid50檢測病毒毒價。上表結果顯示，5％上樣量雜蛋白去除率高達99.74％，病毒回收率也高達99％。增加上樣量雜蛋白去除率下降，病毒回收率同時下降。在大規模生產中10％～15％的上樣量更加合適。實施例4一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法，包括如下步驟：(1)抗原連續流離心取上清300l，即為待澄清樣品；(2)中空纖維柱澄清過濾：與實施例1方法相同，將300l待澄清的樣品經0.45μm中空纖維柱處理，得澄清後樣品450l；(3)中空纖維柱超濾濃縮：與實施例2方法相同，將澄清後樣品450l，經500kd中空纖維柱濃縮至35l，得濃縮後樣品35l；(4)分子篩凝膠層析：與實施例3方法相同，將濃縮後樣品35l，以30％柱體積(33l)上樣，收集洗脫後的第一個洗脫峰。實施例5一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法，包括如下步驟：(1)抗原連續流離心取上清400l，即為待澄清樣品；(2)中空纖維柱澄清過濾：與實施例1方法相同，將400l待澄清的樣品經0.65μm中空纖維柱處理，得澄清後樣品600l；(3)中空纖維柱超濾濃縮：與實施例2方法相同，將澄清後樣品600l，經750kd中空纖維柱濃縮至40l，得濃縮後樣品40l；(4)分子篩凝膠層析：與實施例3方法相同，將濃縮後樣品40l，以15％柱體積(16l)上樣，收集洗脫後的第一個洗脫峰，共需三次上樣完成純化。實施例6一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法，包括如下步驟：(1)抗原連續流離心取上清500l，即為待澄清樣品；(2)中空纖維柱澄清過濾：與實施例1方法相同，將500l待澄清的樣品經0.45μm中空纖維柱處理，得澄清後樣品750l；(3)中空纖維柱超濾濃縮：與實施例2方法相同，將澄清後樣品750l，經500kd中空纖維柱濃縮至50l，得濃縮後樣品50l；(4)分子篩凝膠層析：與實施例3方法相同，將濃縮後樣品50l，以15％柱體積(16l)上樣，收集洗脫後的第一個洗脫峰，共需三次上樣完成純化。表4實施例4～6純化所得豬偽狂犬病毒的效果評價樣品蛋白濃度(ug/ml)雜蛋白去除率tcid50/0.1ml病毒回收率實施例4164592.10％7.8984.50％實施例5157893.10％7.2975.10％實施例6200595.00％7.3895.00％表4結果顯示，豬偽狂犬病毒經過0.45μm中空纖維柱澄清過濾後，再經500kd超濾濃縮，經4ff凝膠層析以15％上樣量純化後，病毒回收率可達95％，雜蛋白去除率高達95％。這樣的工藝組合在生產規模下更具有優勢，既提高生產效率，又提高產品質量。在實施例的基礎上，採用相同的實驗方法，匹配相應的罐體和管道，可以將生產規模擴大為2000l、3000l、5000l。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所做的實例，而並非對實施方式的限制。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動仍處於本發明創造的保護範圍之內。當前第1頁12