5氟尿嘧啶藥物敏感基因晶片檢測試劑盒的製作方法
2023-10-10 14:11:19
專利名稱：5氟尿嘧啶藥物敏感基因晶片檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於臨床檢測的基因晶片技術領域，具體地說涉及一種5氟尿嘧啶藥物敏感基因 晶片檢測試劑盒。
背景技術：
5氟尿嘧啶是一種一線抗腫瘤化療藥物。5氟尿嘧啶所涉及的藥物敏感基因有DPD (二 氫尿嘧啶脫氫酶基因)，GSTPi (穀胱苷肽轉移酶i)， MTHFR (5,10亞甲基四氫葉酸還原酶) 禾口XRCC1 (X線修復交叉互補蛋白1)四個基因。二氫嘧啶脫氫酶是一種主要參與嘧啶分解代謝的酶，是5氟尿嘧啶代謝的限速酶。該基 因第14內含子的第一個鹼基由G變為A將會引起mRNA剪切變化，造成第14外顯子165 個鹼基的缺失，從而使該酶失活，進而影響5氟尿嘧啶這種藥物的分解代謝，造成有毒藥物 在體內的積累而引起嚴重的毒副作用。AA基因型癌症患者接受5氟尿嘧啶治療會產生強烈 的毒副作用甚至致死，AG基因型患者接受5氟尿嘧啶治療也會引發很強的毒副作用。穀胱甘肽S轉移酶Pi基因編碼發生變化，編碼基因發生改變後105位由異亮氨酸變為纈 氨酸的穀胱甘肽S轉移酶Pi酶活降低，而低酶活則降低了化療藥物的失活，從而提高化療藥 物5氟尿嘧啶、草酸鉑的療效，增加GG基因型患者在化療中的生存，而化療藥物對AG基 因型患者也比AA基因型患者的療效提高許多。5氟尿嘧啶進入體內後經胸苷激酶催化後與5,10亞甲基四氫葉酸形成共價絡合物幹擾 DNA的合成於修復從而產生抗癌作用。MTHFR主要催化5,10亞甲基四氫葉酸還原為5甲基四 氫葉酸。因此5,10亞甲基四氫葉酸還原酶的活性將直接影響體內5，10亞甲基四氫葉酸的濃度。 MTHFR基因的677位鹼基由C變為T導致該酶222位上由丙氨酸變為纈氨酸,從而影響該酶活 性，使該酶活性降低，體內5,10亞甲基四氫葉酸濃度相應提高，增強5氟尿嘧啶的抗癌作用。 TT純合子的患者對5氟尿嘧啶敏感。DNA修復蛋白XRCC1: DNA修復蛋白XRCC1與多核苷酸激酶、DNA聚合酶P 、 DNA 連接酶III作用，共同參與DNA修復系統中鹼基切除修復。該基因發生突變後399位的精氨 酸變為穀氨醯氨降低了 XRCC1的DNA的修復能力從而造成5氟尿嘧啶和奧沙利鉑化療藥物 對GA雜合子和AA純合子的患者療效不佳，易在化療過程中誘發治療性急性白血病。目前用於檢測5氟尿嘧啶單位點突變的方法主要有測序法，這是最直接，最準確的方 法；螢光定量PCR法，和單鹼基延伸法。這些方法所需要的設備儀器都價格昂貴，技術複雜， 從經濟上考慮不適於用作常規方法加以推廣。發明內容為了對5氟尿嘧啶藥物敏感的相關基因進行平行檢測，對大量樣本進行同時分析，並考 慮經濟推廣的可行性，本發明提供一種5氟尿嘧啶藥物敏感基因晶片檢測試劑盒，包括抽提 液、雜交緩衝液、洗液、擴增液、Taq酶、基因晶片；其特徵在於，所含的擴增液含有擴增4 個含突變位點基因的引物，分別是含IVS14 A/G突變位點的DPD基因，含11el05Val突變位 點的GSTPi基因，含C677T突變位點的MTHFR基因，含Arg399Glu突變位點的XRCC1基因。所述的5氟尿嘧啶藥物敏感基因晶片檢測試劑盒，擴增液可以包含以下一組序列的引物DPD-1: CCTGGACAAAGCTCCTTTDPD-2: AAGCAACTGGCAGATTCGSTPi-l: TATGGGAAGGACCAGCGSTPi-2: GGTGCAGATGCTCACAMTHFR-1: CCTGAAGCACTTGAAGGAMTHFR-2: TTCACAAAGCGGAAGAXRCC1-1: AAGGAGTGGGTGCTGGAXRCC1-2: TTGCCCAGCACAGGAT 所述的5氟尿嘧啶藥物敏感基因晶片檢測試劑盒，還可以包括擴增液B，擴增液B中包含如 下序列的ASPE (Allele-Specific Primer Extension,即等位基因特特性引物延伸)引物DPD-G: 5'-GCTGACTTTCCAGACAACGDPD-A: 5，-GCTGACTTTCCAGACAACAGSTPi-A: 5，-TGACCTCCGCTGCAAATACAGSTPi-G: 5，-TGACCTCCGCTGCAAATACGMTHFR-C: 5，-AGGTGTCTGCGGGAGCMTHFR-T: 5'-AGGTGTCTGCGGGAGTXRCC1-A: 5'陽CGGCTGCCCTCCCAXRCC1-G: 5，-CGGCTGCCCTCCCG 所述的5氟尿嘧啶藥物敏感基因晶片檢測試劑盒，擴增液B中包含的ASPE引物還可以是含 有5'-端檢測定位序列的如下序列DPD-tag-G: 5'-CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACGDPD-tag-A: 5，-TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACAGSTPi- tag-A: 5'陽TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACAGSTPi- tag-G: 5，-AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACGMTHFR- tag-C: 5'-CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGCMTHFR- tag墨T: 5'-TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGTXRCC1 - tag-A: 5 ， -TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCAXRCC1 - tag-G: 5 '-CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCG 所述的5氟尿嘧啶藥物敏感基因晶片檢測試劑盒，擴增液B含有生物素標記的dCTP。 所述的5氟尿嘧啶藥物敏感基因晶片檢測試劑盒，所含的基因晶片上的探針序列可以是以下 序列 'posl: TGATTGTAGTATGTATTGATAAAGpos2: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTApos3: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGApos4: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATTpos5: TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAGpos6: GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGApos7: TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAApos8: TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG該試劑盒通過將5氟尿嘧啶所涉及的藥物敏感基因DPD (二氫尿嘧啶脫氫酶基因)，GSTPi (谷 胱苷肽轉移酶i)， MTHFR (5，10亞甲基四氫葉酸還原酶)和XRCC1四個基因結合在一起，達 到對相關基因進行平行檢測的目的。另外通過將ASPE法與化學發光法相結合，檢測單位點突 變，優點在於(1)結果準確，(2)通量大，(3)背景低，(4)操作簡便，(5)無需大型 儀器。
圖1為5氟尿嘧啶藥物敏感基因晶片檢測試劑盒應用流程圖 圖2為試劑盒中所含5氟尿噴啶藥物敏感基因檢測晶片示意圖具體實施方式
下面結合附圖和舉例說明本發明目的的實施。實施例子1. 樣本處理用口腔黏膜脫落細胞作為樣本來源，進行基因組DNA抽提。抽提使用博大泰克的細胞 基因組抽提試劑盒。2. 晶片製備，將文獻中已有標記定位探針在超平玻片上點樣，探針序列如下posl- TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG pos2: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA pos3: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA pos4: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT pos5: TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG pos6: GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA pos7: TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA pos8: TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG3. 引物設計(1)設計以下引物序列組A，用以擴增含突變位點的與5氟尿嘧瞎所涉及的藥物敏感相 關的基因片斷，包括有DPD(二氫尿嘧啶脫氫酶基因)，GSTPi (穀胱苷肽轉移酶i)， MTHFR (5,10亞甲基四氫葉酸還原酶)和XRCC1四個基因。 DPD-h CCTGGACAAAGCTCCTTT DPD-2: AAGCAACTGGCAGATTC GSTPi-l: TATGGGAAGGACCAGC GSTPi-2: GGTGCAGATGCTCACA MTHFR-1: CCTGAAGCACTTGAAGGA MTHFR-2: TTCACAAAGCGGAAGA XRCC1-1: AAGGAGTGGGTGCTGGAXRCC1-2: TTGCCCAGCACAGGAT (2)設計以下ASPE引物序列組B,用以擴增含突變位點的序列，同時引進用於基因檢測定 位的標記序列，以便與晶片上相應的定位探針雜交，從而獲得檢測結果。DPD-tag-G: 5，-CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACG DPD隱tag-A: 5，-TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACA GSTPi- tag-A: 5，-TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACA GSTPi- tag-G: 5,-AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACG MTHFR- tag墨C: 5'-CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR- tag-T: 5，-TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGT XRCC1- tag-A: 5'-TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCA XRCC1- tag-G: 5，-CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCG4. PCR擴增待測片斷並引入生物素標記。用引物序列組A擴增含待測突變位點的序列，用ASPE 引物序列組B擴增含突變位點的序列，擴增時加入含生物素標記的dCTP，以此引入對樣本產 物檢測所需的生物素標記。5. 雜交檢測 .—按以下步驟對得到的相應樣本產物進行雜交檢測(1) 將擴增得到的標記產物與雜交液(5XSSC,0.2%SDS)以1:6的比例混合，加入反應. 區域，50ul。(2) 42'C保溫保溼反應60分鐘。(3) 用洗液(2XSSC,0. 1%SDS)洗滌4-6次，每次2分鐘，振動。(4) 加入HRP標記的親和素反應液，50ul。(5) 在42。C反應15-20min。(6) 用洗液(2XSSC,0. 1%SDS)洗滌4-6次，每次2分鐘，晃動。(7) 加檢測液20ul/孔，使檢測液均勻分布於反應區域。(8) CCD檢測，視發光信號強度曝光30-60秒。6. 結果判定依據不同指標的OitOff值，參考標準品梯度曲線，判定樣本的陰陽性。 與此同時，用常規方法對測試的樣本進行常規檢測。結果表明，用本發明的試劑盒得出 的測試結果與常規方法相同。序列表DPD-1: CCTGGACAAAGCTCCTTT DPD-2: AAGCAACTGGCAGATTC GSTPi陽h TATGGGAAGGACCAGC GSTPi-2: GGTGCAGATGCTCACA MTHFR-1: CCTGAAGCACTTGAAGGA MTHFR-2: TTCACAAAGCGGAAGA XRCC1 -1: AAGGAGTGGGTGCTGGA XRCC1-2: TTQCCCAGCACAGGATDPD-G: 5' -GCTGACTTTCCAGACAACG DPD-A: 5' -GCTGACTTTCCAGACAACA GSTPi-A: 5' -TGACCTCCGCTGCAAATACA GSTPi-G: 5'陽TGACCTCCGCTGCAAATACG MTHFR-C: 5' -AGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-T: 5' -AGGTGTCTGCGGGAGT XRCC 1-A: 5' -CGGCTGCCCTCCCA XRCC1-G: 5' -CGGCTGCCCTCCCGDPD-tag-G: 5' -CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACG DPD-tag-A: 5' -TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACA GSTPi隱tag-A: 5' -TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACA GSTPi-tag-G: 5' -AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACG MTHFR-tag-C: 5' -CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-tag-T: 5' -TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGT XRCC 1-tag-A: 5' -TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCA XRCCl-tag-G: 5' -CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCGposl: TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG pos2: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA pos3: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA pos4: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT pos5: TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG pos6: GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGApos7: TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA pos8: TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG
權利要求
1.一種5氟尿嘧啶藥物敏感基因檢測試劑盒，包括抽提液、雜交緩衝液、洗液、擴增液、Taq酶、基因晶片；其特徵在於，所含的擴增液含有擴增4個含突變位點的基因，分別是含IVS14 A/G突變位點的DPD基因，含Ile105Val突變位點的GSTPi基因，含C677T突變位點的MTHFR基因，含Arg399Glu突變位點的XRCC1基因。
2. 根據權利要求1所述的5氟尿嘧啶藥物敏感基因檢測試劑盒，其特徵在於，所述的擴增液 可以包含以下一組序列的引物DPD-h CCTGGACAAAGCTCCTTT DPD-2: AAGCAACTGGCAGATTC GSTPi-l: TATGGGAAGGACCAGC GSTPi-2: GGTGCAGATGCTCACA MTHFR-1: CCTGAAGCACTTGAAGGA MTHFR-2: TTCACAAAGCGGAAGA XRCC1 -1: AAGGAGTGGGTGCTGGA XRCC1-2: TTGCCCAGCACAGGAT 。
3. 根據權利要求1或2所述的5氟尿嘧啶藥物敏感基因檢測試劑盒，其特徵在於，還可以包 括擴增液B，擴增液B中包含如下序列的ASPE (Allele-Specific Primer Extension,即等位 基因特特性引物延伸)引物-DPD-G: 5' - GCTGACTTTCCAGACAACG DPD-A: 5' -GCTGACTTTCCAGACAACA GSTPi-A: 5' -TGACCTCCGCTGCAAATACA GSTPi-G: 5' -TGACCTCCGCTGCAAATACG MTHFR-C: 5' -AGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-T: 5' -AGGTGTCTGCGGGAGT XRCC 1-A: 5' -CGGCTGCCCTCCCA XRCCl陽G: 5'垂CGGCTGCCCTCCCG 。
4. 根據權利要求3所述的5氟尿嘧啶藥物敏感基因檢測試劑盒，其特徵在於，所述的擴增液 B中包含的ASPE引物還可以是含有5'-端檢測定位序列的如下序列DPD-tag-G: 5' -CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACG DPD-tag-A: 5' -TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACA GSTPi-tag-A: 5' -TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACA GSTPi-tag-G: 5' -AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACG MTHFR-tag-C: 5' -CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-tag-T: 5' -TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGT XRCC 1 - tag-A 5' -TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCA XRCC 1-tag-G: 5' -CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCG 。
5. 根據權利要求3或4所述的5氟尿嘧啶藥物敏感基因檢測試劑盒，其特徵在於，所述的擴 增液B含有生物素標記的dCTP。
6. 根據權利要求4所述的5氟尿嘧啶藥物敏感基因檢測試劑盒，其特徵在於，所含的基因晶片上的探針序列可以是以下一組序列-posl: TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG pos2: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA pos3: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA pos4: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT pos5: TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG pos6: GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA pos7: TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA pos8: TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG
全文摘要
本發明提供一種5氟尿嘧啶藥物敏感基因晶片檢測試劑盒，可用於平行經濟地檢測與5氟尿嘧啶藥物敏感的相關基因。該試劑盒包括抽提液、雜交緩衝液、洗液、擴增液、Taq酶、基因晶片，所述的擴增液含有擴增4個含突變位點基因的引物，分別是含IVS14 A/G突變位點的DPD基因，含Ile105Val突變位點的GSTPi基因，含C677T突變位點的MTHFR基因，含Arg399Glu突變位點的XRCC1基因。5氟尿嘧啶是一種一線抗腫瘤化療藥物，本發明可用於檢測對5氟尿嘧啶藥物敏感的上述4個基因突變情況。
文檔編號C12Q1/68GK101333558SQ20071004317
公開日2008年12月31日 申請日期2007年6月29日 優先權日2007年6月29日
發明者杜喜玲, 汪寧梅, 穆海東 申請人:上海裕隆生物科技有限公司