一種可溶性的多糖－蛋白交聯抗原的製備方法

2023-10-18 17:58:24 1

專利名稱：一種可溶性的多糖－蛋白交聯抗原的製備方法
技術領域：
本發明涉及多糖-蛋白交聯物的化學合成方法。
背景技術：
蛋白質和多糖可以通過酶催化或化學合成的方法進行交聯。目前在固定化酶和親和層析固定相的製備中，多數製備過程涉及蛋白質與多糖的化學交聯方法。固定化所用的載體有相當數量和種類是多糖物質，這些多糖載體是大分子量的凝膠多糖。
在抗體藥物生物技術領域，製備可溶性的、具有特定化學組成結構的多糖-蛋白交聯抗原已成為巨大需求。為了高效率地獲取某種特異性抗體，往往需要對可溶性的特異性抗原進行化學修飾。通過合適的化學合成方法，原有的多糖抗原分子可以通過共價鍵連接上特定的蛋白質或其他化合物，或原有的蛋白抗原分子可以通過共價鍵連接上特定的多糖或其他化合物。
在抗原改性設計中，要求原抗原分子在連接其他化合物分子後能保持或增強原有的免疫原性，同時儘可能地避免引入與交聯劑分子有關的、可能形成抗原表位的組成結構。化學交聯反應的條件必須是溫和的，能最大程度地保留原抗原分子的免疫原性；同時，要求反應過程中所用的試劑低毒、低汙染。在現有的合成方法中，很少方法能滿足以上要求。
多糖-蛋白交聯的方法很多，如溴化氰法、重氮鹽偶聯法、異硫氰酸酯法、還原胺化法、活化醯基化法、雙功能試劑交聯法等。人或動物用交聯疫苗的製備方法需滿足以下條件1)選用合適的交聯劑，避免引入可能誘導出不期望抗體的基團；2)反應條件應溫和，避免抗原結構被破壞；3)所用試劑儘可能無毒或低毒。理想的製備方法還應當操作方便，所用試劑環境友好且來源方便。

發明內容
本發明的目的在於提供一種可溶性的多糖-蛋白交聯抗原的新製備方法。
本發明包括將可溶性抗原多糖與蛋白通過雙功能團交聯試劑(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)共價連接的化學合成步驟；雙功能團交聯試劑(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)，式中的n＝2-10，(C2H3O)為環氧基團。所用的交聯試劑是含6-14個碳原子的直鏈化合物，可使交聯物結構緊湊，同時保持一定的伸展和旋轉空間。雙功能團交聯試劑優選1，4-丁二醇縮水二甘油醚。
前述抗原多糖包括來源於細菌的莢膜多糖以及來源於微生物和海藻的多糖，分子量20-500KDa在可溶性抗原多糖與雙功能團交聯試劑反應過程中，可溶性抗原多糖與雙功能團交聯試劑的重量配比為1∶1-20，pH9.0-11.0，反應溫度20-80℃。抗原多糖與載體蛋白的摩爾比為1/10-10/1。
適量的表面活性劑的存在有利於形成均相反應系統，可加快反應速度，同時保證了多糖抗原與蛋白交聯的完全性。
常用的表面活性劑如吐溫、SDS或TritionX-100等均可選用。
本發明還包括離子交換分離和凝膠柱層析分離結合的純化步驟。
純化步驟由離子交換分離和凝膠柱層析分離組合而成。當抗原多糖為酸性多糖時，採用732陽離子交換樹脂分離游離的酸性多糖；當抗原多糖為中性多糖時，採用DEAE纖維素分離游離的中性多糖。然後採用凝膠層析柱分離游離蛋白和多糖-蛋白交聯物，最終獲得多糖-蛋白交聯物。
本發明提供的交聯方法操作簡單，試劑來源方便，無毒性。
具體實施例方式
實施例1海藻多糖與血清白蛋白(BSA)交聯物的製備
(1)稱取500mg海藻多糖(20KDa)，加入50ml 0.3％醋酸鈉溶液中，充分攪拌，使之溶解。再加入150mg NaBH4，溶解後，用飽和NaOH溶液調節pH至11.0，然後用0.2μ膜過濾；(2)稱取10g的1，4-丁二醇縮水二甘油醚，加入溶液(1)中，再加入3.0g表面活性劑SDS，強力攪拌，使混合均勻；(4)在50℃條件下，反應20h，使多糖的羥基活化，交聯試劑的一個環氧鍵打開與之連接，形成多糖-交聯劑中間產物；(5)將上述的反應混合物取出，採用截留分子量3000的超濾膜，進行循環過濾。超濾過程可基本去除游離的交聯試劑。
(6)活化多糖與BSA的交聯稱取3000mg BSA(60KDa)，加入100ml蒸餾水，加熱(50℃)，強力攪拌，使之溶解，用0.2μ膜過濾。將活化多糖溶液(150ml)和BSA溶液混合，用5mol/LNa2CO3調節pH至10.5，置於55℃恆溫振蕩箱內，反應24小時。多糖-交聯劑中間產物的另一個環氧鍵打開，與蛋白質中的氨基或羥基反應，生成多糖-蛋白交聯物。反應完畢後，再往反應液中加入10g甘氨酸，65℃，繼續反應24小時，封閉活化多糖分子中殘留的環氧鍵活性基團。
(7)上述的反應液取出後，採用截留分子量3000的超濾膜，進行超濾分離操作，去除游離的甘氨酸。採用離子交換和凝膠柱層析方法，分離游離的多糖和BSA，最終獲得海藻多糖-BSA交聯物純品。
(8)多糖蛋白交聯物的特徵分析對所製備的海藻多糖-BSA交聯物純品，採用苯酚硫酸法測定多糖含量，多糖含量246mg；採用福林酚法測蛋白含量，蛋白含量為2590mg。所製備的多糖-蛋白交聯物中，多糖與蛋白的摩爾比約為1/3.5。
實施例2黃桿菌莢膜多糖與BSA交聯物的製備(1)黃桿菌莢膜多糖的活化將40.0mg黃桿菌莢膜多糖(200KDa)溶於8ml 0.3％醋酸鈉溶液中，加入5mgNaBH4，混合均勻後，用飽和NaOH溶液調節pH至11.0，然後用0.2μ膜過濾。在上述過濾液中，加入0.5g交聯劑(1，4-丁二醇縮水二甘油醚)和100mg表面活性劑TritionX-100，先用超聲波振蕩器劇烈振蕩20分鐘，再放入65℃恆溫振蕩箱內，進行多糖活化，反應18小時。活化18小時後的多糖溶液取出後放入截留分子量為10000的透析袋中，對蒸餾水透析48小時，去除游離的交聯試劑。
(2)活化莢膜多糖與BSA的交聯取出透析後的反應液，50℃濃縮至5ml，加入1ml BSA水溶液(50.0mg/ml)，振蕩使之混合均勻後，用飽和Na2CO3溶液調節pH至10.5，置於65℃恆溫振蕩箱中，交聯反應20小時。反應後，在反應液中加入1.0g甘氨酸，繼續反應24小時以封閉莢膜多糖分子中殘留的活性基團。上述反應液取出後，放入截留分子量為10000的透析袋中，4℃下用蒸餾水透析48小時以上以去除游離甘氨酸。
(3)多糖-蛋白交聯物的分離純化黃桿菌莢膜多糖是中性多糖。採用DEAE纖維素層析柱進行分離，可去除殘留的中性多糖。將上述透析後的反應液用Na2CO3溶液調節pH至8.0，然後以1倍過柱液體積/層析柱體積/時的流速流經DEAE纖維素層析柱，游離的BSA以及多糖-蛋白偶聯物被吸附在層析柱上，而殘留的中性多糖直接流過層析柱，達到分離的目的。用3％NaCl溶液將吸附在層析柱上的BSA以及多糖-蛋白交聯物洗脫。
洗脫下來的BSA與多糖-蛋白交聯物的混合物再用凝膠層析柱(saphadexG-100)進行分離，利用BSA與多糖-蛋白交聯物分子量的差異，可獲得黃桿菌莢膜多糖-BSA交聯物純品。凍幹後得乾粉純品(61.7mg)。
(4)黃桿菌莢膜多糖-BSA交聯物的特徵分析對於最終所獲得的黃桿菌莢膜多糖-BSA交聯物樣品，採用苯酚硫酸法測定多糖含量，採用福林酚法測定蛋白質含量。所製備的多糖-蛋白交聯物中，多糖/蛋白比例約為1/3.2(摩爾比)。
採用聚丙稀醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對BSA、多糖、以及反應後的料液進行檢測，並分別進行糖染色(schiff法)和蛋白染色(銀染)。銀染檢測結果顯示多糖-蛋白交聯反應液在BSA位置未觀察到電泳帶，在BSA位置以上(大於BSA分子量64000Da)的區域存在片裝(多條)的電泳帶，表明反應後BSA已基本以交聯物形式存在。糖染檢測結果顯示純多糖在電泳膠上無法染出顏色；而多糖-蛋白交聯反應液在BSA位置以上(大於BSA分子量64000Da)的區域存在片裝的電泳帶，其顯色位置與銀染顯色位置對應，表明反應液中有大量與蛋白交聯的糖類物質存在，即黃桿菌莢膜多糖-BSA交聯物。
實施例3肺炎球菌莢膜多糖與BSA交聯物的製備(1)肺炎球菌莢膜多糖的活化將100mg肺炎球菌莢膜多糖Pn1-Ps(280KDa)溶於15ml 0.6mol/L的NaOH溶液中，加入2ml 2mg/ml NaBH4溶液，調節pH至11.0，混合均勻後加入1.0g交聯劑(1，4-丁二醇縮水二甘油醚)和300mg表面活性劑TritionX-100，先用超聲波振蕩器劇烈振蕩20分鐘，劇烈振蕩，放入55℃恆溫振蕩培養箱，活化20小時。
活化20小時後的多糖溶液取出放入截留分子量為10000的透析袋中，4℃下對蒸餾水透析48小時，去除游離的交聯試劑。
(2)活化多糖與BSA的交聯取出透析後的反應液，50℃濃縮至18ml。加入50mgBSA，振蕩使之溶解後，採用飽和的Na2CO3溶液調節pH至10.5。反應液置於50℃恆溫震蕩培養箱中，交聯反應24小時。反應結束後，再在反應液中加入1.3g甘氨酸，55℃繼續反應24小時以封閉殘留的環氧活性基團。
封閉後的反應液取出後，放入截留分子量為10000的透析袋中，4℃下用蒸餾水透析48小時以上以去除游離的甘氨酸。
(3)多糖-BSA交聯物的分離純化莢膜多糖Pn1-Ps是酸性多糖。將上述透析後的反應液用HCl溶液調節pH至2.0，然後以1倍過柱液體積/層析柱體積/時的流速流經732陽離子交換樹脂，游離的BSA以及多糖-BSA交聯物帶正電荷，被吸附在陽離子交換樹脂上，而殘留的酸性多糖直接流過層析柱，達到分離的目的。最終用3％NH4OH溶液將吸附在陽離子交換樹脂上的BSA以及多糖-BSA交聯物洗脫。
洗脫下來的BSA與多糖-BSA交聯物的混合物再用凝膠層析柱(saphadexG-100)進行分離，獲得莢膜多糖-BSA交聯物。凍幹後得乾粉純品(101.5mg)。
(4)莢膜多糖-BSA交聯物的特徵分析對所製備的莢膜多糖-BSA交聯物純品，採用苯酚硫酸法測定多糖含量，採用福林酚法測蛋白含量。所製備的多糖-BSA交聯物中，多糖/蛋白的摩爾比約為1/2.4。
採用聚丙稀醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對BSA、莢膜多糖、莢膜多糖-BSA交聯物的樣品進行檢測，分別進行糖染色(schiff法)和蛋白染色(銀染)。銀染檢測結果顯示多糖-BSA交聯物樣品在BSA位置未觀察到電泳帶，在BSA位置以上(大於BSA分子量64000Da)的區域存在片裝的電泳帶，表明所製備的多糖-BSA交聯物純度較高，殘留的BSA沒有或很少。糖染檢測結果顯示純多糖樣品在電泳膠上無法染出顏色，多糖-BSA交聯物樣品在BSA位置以上(大於BSA分子量64000DA)的區域有片裝的電泳帶，其顯色位置與銀染顯色位置對應，表明存在與蛋白交聯的糖類物質，即所製備的莢膜多糖-BSA交聯物。
採用高效液相色譜(G-5000凝膠柱)，並分別採用紫外或示差檢測器對所製備的純品進行檢測。實驗結果顯示BSA約在24.5分鐘出峰(紫外檢測器)，Pn1-Ps莢膜多糖約在18.5分鐘出峰(示差檢測器)，而莢膜多糖-BSA交聯物的出峰時間在16.2-17.0分種(紫外和示差檢測器)。莢膜多糖-BSA交聯物提前出峰，這是由於交聯物分子量更大的緣故；交聯物的峰形較為尖銳，表明交聯物的分子量分布較為集中。
權利要求
1.一種可溶性的多糖-蛋白交聯抗原的製備方法，含有將可溶性抗原多糖與蛋白通過雙功能團交聯試劑共價連接的化學合成步驟，其特徵在於該步驟採用的雙功能團交聯試劑為(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)，n＝2-10，(C2H3O)為環氧基團。
2.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的抗原多糖包括來源於細菌的莢膜多糖以及來源於微生物和海藻的多糖，分子量2-50萬Da。
3.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的雙功能團交聯試劑為1，4-丁二醇縮水二甘油醚。
4.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的可溶性抗原多糖與雙功能團交聯試劑反應過程中，可溶性抗原多糖與雙功能團交聯試劑的重量配比為1∶1-20，pH9.0-11.0，反應溫度20-80℃；抗原多糖與載體蛋白的摩爾比為1/10-10/1；抗原多糖與載體蛋白交聯反應後，需添加過量的甘氨酸封閉抗原多糖分子中殘留的活性基團。
5.如權利要求1-4所述的製備方法，其特徵在於將可溶性抗原多糖與蛋白通過雙功能團交聯試劑共價連接過程中，添加表面活性劑吐溫或SDS或TritionX-100。
6.如權利要求5所述的製備方法，該方法還含有離子交換分離和凝膠柱層析分離結合的純化步驟，其特徵在於當抗原多糖為酸性多糖時，採用732陽離子交換樹脂分離游離的酸性多糖；當抗原多糖為中性多糖時，採用DEAE纖維素分離游離的中性多糖。
全文摘要
一種可溶性的多糖－蛋白交聯抗原的製備方法，涉及多糖－蛋白交聯物的化學合成方法。本方法含有將可溶性抗原多糖與蛋白通過雙功能團交聯試劑共價連接的化學合成步驟，以及離子交換分離和凝膠柱層析分離結合的純化步驟。採用的雙功能團交聯試劑為(C
文檔編號C07K1/10GK101024669SQ20061005483
公開日2007年8月29日 申請日期2006年2月17日 優先權日2006年2月17日
發明者郭養浩, 孟春, 石賢愛, 林海英, 王航, 葉林 申請人:福州昌暉生物工程有限公司