一種血清自身抗體檢測試劑盒的製作方法
2023-10-20 15:26:42 1
一種血清自身抗體檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於檢測哺乳動物血清自身抗體的檢測試劑盒，包括抗原蛋白，所述抗原蛋白選自p53、Annexin1、CAGE、NY‐ESO‐1、HuD、Cyclin?D、PGP9.5、GBU4‐5、MDM2、GAGE7、XAGE1b、SOX2、MAGE?A1和MAGE?A4中的五種或以上的組合。本發明的檢測試劑盒採用一組新型癌症相關生物標誌物的自身抗體所對應的抗原組合，利用生物素形成多聚體的特徵進行抗原蛋白包被，以人抗標籤肽作為定量檢測的標準品，從而提高了血清自身抗體檢測的敏感性和準確性，為以自身抗體來進行癌症診斷提供了優化的檢測方法。
【專利說明】一種血清自身抗體檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬於抗體檢測領域，具體地說，是關於一種新的血清自身抗體檢測試劑盒。【背景技術】
[0002]根據中國腫瘤登記中心發布的《2012中國腫瘤登記年報》，每年新發腫瘤病例約為312萬例，平均每天8550人，每分鐘就有6人確診為癌症。居全國惡性腫瘤發病第一位的是肺癌，其次為胃癌、結直腸癌、肝癌和食管癌，前10位惡性腫瘤佔全部惡性腫瘤的76.39%。居全國惡性腫瘤死亡第一位的仍是肺癌，其次為肝癌、胃癌、食管癌和結直腸癌，前10位惡性腫瘤佔全部惡性腫瘤的84.27%。同時，癌種也呈現地域化特點，食管癌高發區主要集中河南、河北等中原地區；胃癌高發區主要集中在西北及沿海各省，如上海、江蘇、甘肅、青海等較為突出；肝癌高發區集中在東南沿海及東北吉林等地區。肺癌在所有的腫瘤死亡率中高居首位。世界衛生組織在2001年曾經發布警告說，在過去的10年中，全球肺癌的發病率每年以22%的速度在飛快上升，每年全球新增肺癌患者達120萬人，死亡110萬人。據北京市衛生局提供的統計數據顯示，2010年肺癌位居北京市戶籍人口男性惡性腫瘤發病的第一位，在女性中居第二位，僅次於乳腺癌。2001至2010年，北京市肺癌發病率增長了 56%。全市新診斷出的癌症中有五分之一為肺癌。據流行病學專家預測，如果不控制吸菸和空氣汙染，到2025年，我國每年肺癌患者將超過100萬，成為世界第一肺癌大國。肺癌的預後與其發展階段緊密相關，局限性肺癌五年存活率為53%，而在出現轉移的情況下五年存活率僅為4%。肺癌的早期發現和及時防治能顯著提高患者的存活率和生活質量。
[0003]腫瘤早期篩查的目的在於準確地診斷出在顯著症狀出現之前的、尚處於發展早期的癌症。各種癌症都有各自適合的檢測方法，但都存在相應的優缺點，檢測中一個尤其普遍的問題是很難在癌症發生的早期檢測到腫瘤的存在，而且檢測結果的特異性不高從而導致過度診斷的問題。以肺癌為例，隨著醫學影像學的發展，低劑量螺旋CT被廣泛用於檢測肺部早期結節。但是低劑量螺旋CT的問題在於其檢測結果的假陽性，CT不能區分腫瘤和其他的陰影比如肺部組織瘢痕化或良性腫塊。這樣的檢測方法不僅不能有效地降低肺癌患者的死亡率，多次CT檢測還有可能加速肺癌的惡化。其他的檢查方法包括正電子發射斷層掃描、經皮細針支氣管針吸活檢和經支氣管壁針吸活檢、痰細胞病理學檢查以及支氣管內鏡檢查，則存在各方面的、如價格昂貴、無法早期篩查、有創傷、或可靠性差的問題。因此，真正的非介入性診斷方法成為醫生和患者共同期待的、用於及早確認肺癌的輔助手段。
[0004]20世紀初，Paul Ehrlich在動物個體之間進行腫瘤移植的研究，發現移植瘤能在被移植動物體內萎縮消除，第一次提出了腫瘤抗原和腫瘤免疫的概念。1966年，Baldwin首次證實了機體免疫系統對自發腫瘤的鑑別和排斥反應，從而奠定了腫瘤抗原研究的理論基礎。20世紀70年代初免疫監控的概念被正式提出，該理論認為在腫瘤發生的早期，機體的免疫系統可以及時識別癌細胞，並抑制癌細胞的生長甚至清除癌細胞，為癌症的早期檢測和治療提供了新的思路。癌症的抗原檢測用於輔助診斷的方法被大量採用，但是抗原檢測的一個問題是，其在血清中含量非常低，到其濃度增加到利用現有技術即可檢測出來的水平時，癌症已經發展到晚期了。因此，要達到早期準確檢測腫瘤相關抗原的目的，必須顯著提高檢測的靈敏度。利用機體免疫應答反應的特點，極低濃度的抗原即可激發放大的免疫反應從而產生相應的抗體，而且由於B細胞的記憶功能，免疫反應可以持續存在。因此有一個切實可行的、採用檢測血清自身抗體滴度來推斷機體對相應腫瘤相關抗原的免疫反應。
[0005]關於自身抗體產生的機理還不是很清楚。近年來癌症領域的研究進一步證實，在正常情況下正常細胞表達的野生型蛋白質不會導致機體的免疫應答。癌症研究領域一個廣泛接受的觀點是，在腫瘤發展的早期腫瘤細胞產生基因突變、異位或重組，相關的抗原釋放後被免疫系統識別為「異體蛋白」而發生免疫應答反應，因而產生針對該抗原的抗體，即腫瘤自身抗體。自身抗體以游離的形式或與相關抗原結合成抗原抗體複合物的形式存在於體內循環中。由於免疫系統的敏感性和穩定性，且體液免疫反應具有放大作用，癌症自身抗體可以比影像學診斷出癌細胞前5年在血液中被檢測出。與血清中的其他多肽和蛋白質不同，抗體可以非常穩定地存在而不易被降解。加上人體免疫系統的記憶功能，肺癌自身抗體可以在體內長期存在，其濃度不隨腫瘤的發展而變化。多篇中外文獻研究表明，在多種腫瘤包括肺癌患者的血清中均可檢測到腫瘤相關抗原的自身抗體的存在。對腫瘤早期抗原和抗體的免疫檢測正逐漸成為診斷領域的一個研究熱點。
[0006]抗體的檢測在生物學上是一種很成熟的技術，這使得自身抗體的精確檢測成為可能。雖然已經有大量證據證實在癌症發展的早期人體免疫系統可以產生自身抗體，但是由於技術的限制，很多自身抗體在癌症發展的早期很難被檢測到。根據報導，迄今為止已有超過40種自身抗體和癌症有相關性，哪些組合具有臨床意義，尤其在中國人中有臨床意義還不清楚。即使有些自身抗體的檢測被認為與某一種癌症具有相關性，也只是停留於小範圍的研究階段。由於缺乏切實可行的大規模、可重複的檢測方法，在中國人中採用自身抗體進行大規模臨床試驗尚屬空白。這方面的臨床研究在國外已經相繼有報導，例如採用Early⑶T -Lung酶聯免疫法來檢測血清自身抗體以進行肺癌的早期診斷，迄今已檢測了 12萬名患者，驗證了這種檢測方法的可靠性，目前已成為一種有效的輔助檢測手段。雖然自身抗體的檢測擁有廣闊的前景，但要精確且高敏感性地檢測血清中的自身抗體，推廣上還是有一定的難度。
[0007]肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，根據肺癌的發展又可分為1、I1、III和IV期。不同類型的肺癌其發生機理還不是很清楚，但該領域最近的臨床研究結果證實了人體對腫瘤細胞的免疫反應。在過去的幾十年中，已有多種腫瘤抗原被鑑定，其中有些腫瘤抗原已經被用於腫瘤診斷，但這些腫瘤抗原在部分良性病變或者妊娠期的病人的血液中也會明顯增加，缺乏對肺癌的特異性和敏感性。自身抗體作為腫瘤標記物，使用單個的自身抗體很難準確推測所有肺癌的發病情況。即使對於同樣的肺癌，不同的患者免疫系統的反應也是不一樣的，因此需要結合多個自身抗體的表達特徵綜合分析，以確定符合特定患者群體的抗體標記物。事實上，近年來的研究和實際操作傾向於採用一系列的抗體同時檢測來進行癌症診斷和輔助診斷。如Chapman等使用酶聯免疫法比較了採用6個(p53、NY - ESO - 1、CAGE、GBU4 - 5, Annexin I 和 S0X2)和 7 個(p53、NY - ESO - 1、CAGE、GBU4 - 5、S0X2、HuD 和MAGE A4)自身抗體來檢測肺癌患者和健康對照組血清中相應自身抗體的含量。結果顯示單一抗體檢出陽性率在5?36%之間，特異性為96?100%。相比之下，採用6個抗體聯合檢測得到的敏感性和特異性分別為39%和89%，而採用7種抗體聯合檢測的敏感性達到41%，特異性為 91% (Chapman CJ, et al.(2012)EarlyCDT (R) - Lung test:1mproved clinicalutility through additional autoantibody assays.Tumour Biol33(5):1319 -1326)。這充分說明腫瘤標誌物的單項檢測，雖然特異性很高，但檢出敏感性和準確性較低；而聯合多個抗原檢測後，雖然特異性相對降低，但敏感性和準確性均有顯著的提高。
[0008]以腫瘤抗原的自身抗體作為腫瘤診斷的標誌物，利用腫瘤抗原來檢測腫瘤自身抗體，與其他的診斷方法相比具有很高的特異性和敏感性，為真正在臨床上對腫瘤進行早期篩查提供可能。更為重要的是，這些抗原所激發的免疫反應在肺癌患者體內濃度升高刺激自身抗體的產生，此過程早在肺癌出現可檢出的腫塊前就已經發生。由於自身抗體的產生大大早於腫瘤的出現，檢測到自身抗體的存在比影像學方法檢出腫塊要早一至五年。隨著我國腫瘤發病率的逐年攀升，對高敏感性的、高通量的、可推廣使用的自身抗體的檢測方法成為業界急需解決的一個問題。
【發明內容】
[0009]本申請的發明人採用基因重組的辦法篩選出一組與癌症特異相關的抗原，採用固定抗原或抗體與固相載體的方法，發展出一套適合在中國患者中相對準確預測癌症的抗體標記物。
[0010]因此，本發明的目的在於提供一種新的血清自身抗體檢測試劑盒。
[0011]為了達到以上技術目的，本發明採用以下技術方案:
[0012]一種用於檢測哺乳動物血清自身抗體的檢測試劑盒，包括抗原蛋白，所述抗原蛋白選自 p53、Annexinl、CAGE、NY - ESO - l、HuD、Cyclin D、PGP9.5、GBU4 - 5、MDM2、GAGE7、XAGElb、S0X2、MAGE Al和MAGE A4中的五種或以上的組合。
[0013]根據本發明，所述p53包含如SEQ ID:1所示的胺基酸序列、所述Annexinl包含如SEQ ID:2所示的胺基酸序列、所述CAGE包含如SEQ ID:3所示的胺基酸序列、所述CyclinD包含如SEQ ID: 4所示的胺基酸序列、所述NY - ESO -1包含如SEQ ID: 5所示的胺基酸序列、所述GBU4-5包含如SEQ ID:6所示的胺基酸序列、所述HuD包含如SEQ ID:7所示的胺基酸序列、所述PGP9.5包含如SEQ ID:6所示的胺基酸序列、所述MDM2包含如SEQ ID:6所示的胺基酸序列、所述GAGE7包含如SEQ ID: 6所示的胺基酸序列、所述XAGElb包含如SEQID: 6所示的胺基酸序列、所述S0X2包含如SEQ ID: 6所示的胺基酸序列、所述MAGE Al包含如SEQ ID:6所示的胺基酸序列、所述MAGE A4包含如SEQ ID:6所示的胺基酸序列。
[0014]根據本發明，所述抗原蛋白固定於固相載體上，優選的，所述固相載體包括:酶標板微孔、磁珠、親和膜或液相晶片。
[0015]根據本發明，所述抗原蛋白的固定方法包括直接包被法和間接包被法，其中，直接包被法是將抗原蛋白直接固定於固相載體上，間接包被法是通過生物素與鏈黴親和素之間的特異性反應將抗原間接固定於固相載體上。
[0016]根據本發明，所述抗原蛋白上接有標籤肽，優選的，所述標籤肽包括:His標籤、GST標籤、c - Myc標籤、Flag標籤、HA標籤和生物素標籤。
[0017]根據本發明，不同抗原對應的血清自身抗體的相對滴度定量採用統一的標籤肽和標籤肽抗體之間的特異性反應及與標準曲線的回歸來進行計算。
[0018]根據本發明，所述抗原蛋白表達於大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞中。[0019]根據本發明，所述抗原蛋白經Ni柱、分子篩、離子柱、疏水柱純化。
[0020]根據本發明，所述檢測試劑盒還包括陽性質控品和標準品。根據一個優選實施例，所述陽性質控品和標準品為重組人抗標籤肽免疫球蛋白G或其片段。
[0021]根據本發明，所述檢測試劑盒還包括顯色劑、血清稀釋緩衝液、洗液和終止液。
[0022]根據本發明的優選實施例，所述顯色劑為TMB、AMPPD.4 - MUP、或吖啶酯；所述血清稀釋緩衝液為 NaC1300mM，KC12.7mM, Na2HP048.1mM, KH2PO4L 5mM,酪蛋白 lg/L，牛血清白蛋白 10g/L，硫柳汞 0.2g/L，ρΗ7.6 ;所述洗液為 NaCl0.137M，KC12.7mM, Na2HP048.1mM,KH2PO4L 5mM, pH7.6 ;所述終止液為2M硫酸或IM鹽酸。
[0023]根據本發明，所用的信號檢測方法包括可見光顯色法、化學發光法、螢光發光法。
[0024]根據本發明，所述哺乳動物為人類。
[0025]本發明的有益效果可歸納如下:
[0026]1、新的抗原組合提高檢測的敏感性。本發明相關的檢測試劑盒與國外同類產品相比加入了新的相對於惡性腫瘤的抗原標誌物，因而更能有效鑑別出非惡性/良性疾病和惡性腫瘤的情況。同時，本發明的檢測試劑盒中使用了在腫瘤中產生的抗原異位剪接形成新的異構體。新的異構體可能在癌症細胞發生發展的過程中特異性表達，它的序列與野生型不一樣，可能會與新的癌症特異性抗體反應，從而增加檢測的敏感性。
[0027]2、新的標準品的使用提高檢測的準確性。本發明的檢測試劑盒包含一組多個抗原蛋白，可以同時檢測多個自身抗體。本發明採用重組人抗c-Myc標籤的免疫球蛋白作為統一標準品，可特異性的識別所有帶有c - Myc標籤的檢測試劑盒中的抗原。每個抗原蛋白都帶有一個c - Myc標籤，可以與標準品中的重組人抗c - Myc標籤的免疫球蛋白特異性結合，同時與之相連接的癌症特異性抗體也可以與血清中的相關自身抗體結合，其自身抗體的滴度通過與人抗c - Myc標籤的免疫球蛋白標準品的滴度相比較計算出來。其對c - Myc標籤的相對滴度不隨測量的條件變化而改變，從而使相對c -Myc標籤的滴度準確反映出癌症特異性抗體滴度。由於每個抗原蛋白都帶有一個c -Myc標籤，重組人抗c -Myc標籤的免疫球蛋白標準品對每個抗原蛋白的c -Myc標籤的親合力固定不變，而且不同的抗原蛋白的c -Myc標籤得出的滴度成線性關係，所以在實際的試劑盒中只需要使用一個抗原蛋白的c - Myc標籤作為標準品，即可推算出其他抗原對應的自身抗體的相對滴度。
[0028]3、本發明的檢測試劑盒使用的抗原採用間接包被的方法，提高檢測的敏感性和特異性。間接包被法是通過生物素與鏈黴親和素之間的特異性反應將抗原間接固定於固相載體上。鏈黴親和素是四聚體，通過生物素使抗原形成四聚體，而抗體為二聚體，從而使抗體抗原反應產物更穩定，而且由於多聚體的形成可以起到放大信號的作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1為包含p53抗原蛋白外源片段的重組質粒示意圖。
[0030]圖2為不同抗原蛋白在鑑別中國正常人、肺癌患者和良性肺部患者的有效性的結果圖，其中，圖2A為p53 ;圖2B為Mdm2 ;圖2C為CAGE ;圖2D為MAGE Al ;圖2E為MAGE A4 ；圖 2F 為 GAGE7 ;圖 2G 為 Pgp9.5 ;圖 2H 為 GBU4 - 5 ;圖 21 為 S0X2 ;圖 2J 為 HuD ;圖 2K 為Cyclin D ;圖 2L 為 NY - ESO -1 ;圖 2M 為 Annexinl ;圖 2N 為 XAGE - lb。
[0031]圖3為標準品的劑量-效應曲線。[0032]圖4為標準品倍比稀釋後的線性曲線。
[0033]圖5為不同抗原倍比稀釋後的線性曲線與c - Myc的比較結果，其中，圖5A為c -Myc ;圖 5B 為 p53 ;圖 5C 為 MAGE Al ;圖 為 GAGE7 ;圖 5E 為 Pgp9.5 ;圖 5F 為 MAGE A4。
【具體實施方式】
[0034]以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而非用於限制本發明的範圍。
[0035]本發明提供了一種用於檢測哺乳動物血清自身抗體的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包含一組經過優化重組的抗原蛋白p53、AnnexinU CAGE、NY - ESO - 1、HuD> Cyclin D、PGP9.5、GBU4 - 5、MDM2、GAGE7、XAGElb, S0X2、MAGE Al 和 MAGE A4 中的任意五種或以上的抗原蛋白組合；抗原蛋白的胺基酸序列為全長或經異位剪切的序列；抗原蛋白均經過生物素標記，接有標籤肽，所述標籤肽可以選自:His標籤、GST標籤、c -Myc標籤、Flag標籤、HA標籤和生物素標籤，陽性質控品為重組人抗標籤肽免疫球蛋白G或其片段。
[0036]本發明中，所述用於檢測哺乳動物血清自身抗體的檢測試劑盒可以採用固定抗原或者固定抗體兩種檢測方法，通過對血清中多種抗體的聯合檢測，對肺癌的檢測準確性高。
[0037]間接固定抗原的檢測方法如下:將經過基因重組改良並純化的抗原採用生物素和鏈黴親和素之間的特異性反應包被在微孔板或吸附於磁珠、親和膜、液相晶片上，製成固相載體，向包被抗原的固相載體中加入待測血清樣本，當待測血清樣本中含有特異性抗體(一抗)時，該抗體與固相載體上的抗原特異性結合，然後加入辣根過氧化物酶標記的抗人c -Myc免疫球蛋白G抗體(二抗)，形成抗原-抗體-酶標抗體複合物，經顯色劑TMB顯色後，用酶標儀在450納米波長下測定其吸光度，吸光度值與待測血清樣本中的自身抗體濃度呈線性正相關，採用抗人c -Myc免疫球蛋白G抗體片段作為標準品來計算出待測樣本中的自身抗體的滴度。
[0038]直接固定抗原的檢測方法如下:純化的抗原蛋白吸附在微孔板、磁珠、親和膜、液相晶片上,製成固相載體，向包被抗原的固相載體中加入待測血清樣本，當待測血清樣本中含有特異性抗體(一抗)時，該抗體與固相載體上的抗原特異性結合，然後加入經辣根過氧化物酶標記的抗原蛋白，抗原抗體反應形成抗原抗體複合物，經洗液清洗三次後，直接加入顯色劑TMB測定樣本的吸光度，與標準品的標準曲線進行比較從而推算出樣本中自身抗體的滴度。
[0039]本發明中，所述用於檢測哺乳動物血清自身抗體檢測試劑盒的檢測原理，以間接包被的酶聯免疫試劑盒為例，鏈黴親和素被包被在酶標板上，利用生物素和鏈黴親和素之間反應的高親和力和高特異性的特徵，將生物素標記的抗原蛋白包被在酶標板上。抗原蛋白能夠特異地與相應的肺癌血清中的抗體結合併俘獲相應的抗體，辣根過氧化物酶標記的抗c - Myc人免疫球蛋白G能夠特異地與被俘獲的抗體結合，最終形成針對肺癌血清抗體的「鏈黴親和素+生物素-抗原蛋白+血清抗體+ 二抗+辣根過氧化物酶」的複合物，辣根過氧化物酶催化四甲基聯苯胺反應生成黃色產物，通過酶標儀檢測450納米波長的吸光度值，與標準曲線換算，用於檢測酶標板上結合的血清中肺癌自身抗體的含量。
[0040]以下實施例中使用的試劑和溶液的組分及配製方法如下:
[0041]1、PBS:NaCl 137mM ；KC12.7mM ；Na2HP048.1mM ；KH2PO41.5mM ；pH7.6,0.22 μ m 濾膜負壓過濾；
[0042]2、血清 / 抗體稀釋緩衝液:NaC1300mM ；KC12.7mM ；Na2HP048.1mM ；KH2PO41.5mM ;酪
蛋白lg/L;牛血清白蛋白10g/L ;硫柳萊0.2g/L ；pH7.6 ；0.22 μ m濾膜負壓過濾。
[0043]3、20X 洗液:NaC12.74M ；KC154mM ；Na2HP04162mM ；KH2P0430mM ；pH7.6 ；0.22 μ m 濾
膜負壓過濾；
[0044]4、TMB顯色劑:50mM咪唑緩衝液pH5 ；7.5mM PEG3350 ；2.94mM過氧化氫尿素；
1.6mM TMB ；
[0045]5、終止液:2M硫酸；
[0046]6、抗體稀釋液 / 血清稀釋緩衝液:NaC1300mM ；KC12.7mM ；Na2HP048.1mM ；
KH2PO4L 5mM ;牛血清白蛋白lOg/L ;硫柳汞0.2g/L ；pH7.6 ；0.22 μ m濾膜負壓過濾；
[0047]7、封閉液:1 XPBS ρΗ7.4 ；163mM NaCl ；0.5% 酪蛋白；0.05%NaN3 ；
[0048]8、抗原稀釋液:1XPBS ρΗ7.4 ；163mM NaCl ；l%TritonX - 100 ；
[0049]9、抗原洗滌液:1XPBS ρΗ7.4 ；163mM NaCl ；l%TritonX - 100 ；10% 甘油。
[0050]實施例1、重組抗原蛋白表汰及純化
[0051]以人類cDNA`文庫(購自Invitrogen公司)為模板,採用PCR擴增的方法製備所需
的重組抗原蛋白片段，其中，重組抗原蛋白的胺基酸序列信息如表1所示，PCR擴增的引物
信息如表2所示。
[0052]表1、重組抗原蛋白的胺基酸序列信息
[0053]
【權利要求】
1.一種用於檢測哺乳動物血清自身抗體的檢測試劑盒，其特徵在於，包括抗原蛋白，所述抗原蛋白選自 p53、Annexinl、CAGE、NY -ESO - l、HuD、Cyclin D、PGP9.5、GBU4 - 5、MDM2、GAGE7、XAGElb、S0X2、MAGE Al和MAGE A4中的五種或以上的組合。
2.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述p53包含如SEQID:1所示的胺基酸序列、所述Annexinl包含如SEQ ID: 2所示的胺基酸序列、所述CAGE包含如SEQ ID: 3所示的胺基酸序列、所述Cyclin D包含如SEQ ID:4所示的胺基酸序列、所述NY - ESO -1包含如SEQ ID:5所示的胺基酸序列、所述GBU4-5包含如SEQ ID:6所示的胺基酸序列、所述HuD包含如SEQ ID: 7所示的胺基酸序列、所述PGP9.5包含如SEQ ID: 6所示的胺基酸序列、所述MDM2包含如SEQ ID:6所示的胺基酸序列、所述GAGE7包含如SEQ ID:6所示的胺基酸序列、所述XAGElb包含如SEQ ID:6所示的胺基酸序列、所述S0X2包含如SEQ ID:6所示的胺基酸序列、所述MAGE Al包含如SEQ ID: 6所示的胺基酸序列、所述MAGE A4包含如SEQ ID: 6所示的胺基酸序列。
3.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗原蛋白固定於固相載體上。
4.如權利要求3所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述固相載體包括:酶標板微孔、磁珠、親和膜或液相晶片。
5.如權利要求3所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗原蛋白的固定方法包括直接包被法和間接包被法，其中，直接包被法是將抗原蛋白直接固定於固相載體上，間接包被法是通過生物素與鏈黴親和素之間的特異性反應將抗原間接固定於固相載體上。
6.如權利要求1所述的 檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗原蛋白上接有標籤肽。
7.如權利要求6所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述標籤肽包括:His標籤、GST標籤、c - Myc標籤、Flag標籤、HA標籤和生物素標籤。
8.如權利要求6所述的檢測試劑盒，其特徵在於，不同抗原對應的血清自身抗體的相對滴度定量採用統一的標籤肽和標籤肽抗體之間的特異性反應及與標準曲線的回歸來進行計算。
9.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗原蛋白表達於大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞中。
10.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗原蛋白經Ni柱、分子篩、離子柱、疏水柱純化。
11.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述檢測試劑盒還包括陽性質控品和標準品。
12.如權利要求11所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述陽性質控品和標準品為重組人抗標籤肽免疫球蛋白G或其片段。
13.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述檢測試劑盒還包括顯色劑、血清稀釋緩衝液、洗液和終止液。
14.如權利要求1所述的 檢測試劑盒，其特徵在於，所用的信號檢測方法包括可見光顯色法、化學發光法、螢光發光法。
15.如權利要求13所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述顯色劑為TMB、AMPH)、4-MUP、或吖啶酯；所述血清稀釋緩衝液為NaC1300mM，KC12.7mM, Na2HP048.1mM, KH2PO4L 5mM，酪蛋白lg/L，牛血清白蛋白10g/L，硫柳汞0.2g/L，ρΗ7.6 ;所述洗液為NaCl0.137Μ，KC12.7mM，Na2HP048.1mM, KH2PO4L 5mM, pH7.6 ;所述終止液為 2M 硫酸或 IM 鹽酸。
16.如權利要求1所述的`檢測試劑盒，其特徵在於，所述哺乳動物為人類。
【文檔編號】G01N33/68GK103869086SQ201410146727
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】孫蘇彭 申請人:杭州凱保羅生物科技有限公司