scFvC6.5－sTrail融合基因和蛋白及製備的製作方法

2023-10-20 04:00:57

專利名稱：scFvC6.5－sTrail融合基因和蛋白及製備的製作方法
技術領域：
本發明涉及靶向抗腫瘤藥物和基因重組技術，具體地說是scFvC6.5-sTrail融合基因和蛋白及製備，尤其是細胞因子免疫毒素scFvC6.5-sTrail及其製備和應用。
背景技術：
免疫毒素是由靶向腫瘤細胞的抗體分子與細胞毒效應分子相連所產生的組合分子，主要用於靶向治療腫瘤或自身免疫性疾病。免疫毒素髮展至今經歷了三代歷程，重組免疫毒素(recombinantimmunotoxin)被認為是第三代免疫毒素，它是通過基因工程方法將抗體功能區或生長因子的基因與突變形式的毒蛋白基因融合表達產生。重組免疫毒素具有適於工業化、生產成本低、對實體瘤滲透性高、免疫原性小等優點。
對於重組免疫毒素進行基因工程和蛋白質工程方面的改造稱為免疫毒素工程(Engineering of immunotoxins)。對免疫毒素的改造可分為抗體部分和毒素部分兩個方面。對免疫毒素進行改造的目的是為了儘量降低免疫原性、增加特異殺傷作用、保證合理的半衰期、減小非特異性毒副作用。
Her2/neu是具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌基因，編碼一種分子量185KDa的單鏈跨膜糖蛋白激酶，稱之為p185或HER2/neu。這種蛋白與表皮生長因子受體高度同源，屬於表皮生長因子家族成員之一。此家族還包括EGFR(HER1/ErbB1)、HER2/neu(c-neu/erbB2)、HER3(ErbB3)及HER4(tyro2/ErbB4)。它們編碼的蛋白均具有內在的酪氨酸激酶活性。同屬於受體酪氨酸激酶超家族。Her2/neu過度表達在人類多種腫瘤組織中，如胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等，已經成為這些腫瘤的靶分子。也使其成為腫瘤一個亞類發生發展的標誌物，靶向HER2/neu的研究是近年來研究的熱點。另外臨床研究發現HER2/neu過度表達的癌細胞對sTrail的作用不敏感，其通過抵抗二者的細胞毒作用，使腫瘤細胞逃逸宿主防禦機制而促進腫瘤發生。
Trail(TNF相關的凋亡誘導配體，TNF-related apoptosis-inducedligand)是近幾年發現的一種具有抗腫瘤活性的腫瘤壞死因子家族的新成員，它通過Trail受體介導腫瘤細胞凋亡效應。Trail自從問世以來就在腫瘤治療領域引起廣泛重視，現有的研究證實，Trail對於來自胃、卵巢、結腸、肺、乳腺、腎、前列腺、腦和皮膚的惡性腫瘤中的大多數有細胞生長抑制和細胞殺傷效應，而人體的正常細胞除了肝臟細胞外則對Trail誘導的凋亡耐受。無論是膜形式Trail(memberaneTrail，mTrail)還是可溶性Trail(soluble Trail，sTrail)都具有抗腫瘤活性，目前Trail的可溶形式蛋白已經通過原核和真核兩種途徑表達出來，體外及體內生物學試驗均證明它的特異抗腫瘤活性。
sTrail相關的免疫毒素的研究剛剛起步，目前世界上構建成功的此類毒素只有兩例。

發明內容
為了增加過度表達HER2/neu的腫瘤細胞對sTrail的敏感性和提高HER2/neu抗體的腫瘤殺傷效應，申請人構建了一個新的由人源化抗HER2/neu單鏈抗體(scFvC6.5)和人sTrail組成的免疫毒素scFvC6.5-sTrail，並鑑定了其免疫特異性和生物活性；結果顯示重組免疫毒素能夠特異識別和殺傷HER2/neu陽性卵巢癌細胞SKOV-3和乳腺癌細胞MCF-7，對HER2/neu陰性黑色素瘤細胞A375沒有影響；提示它在抗HER2/neu過度表達的腫瘤靶向治療中具有潛在的應用價值。
本發明的目的是提供一種特異性強，滲透力高，對HER2/neu過度表達的腫瘤細胞具有靶向殺傷能力的細胞因子類免疫毒素，scFvC6.5-sTrail融合基因和蛋白及製備。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種scFvC6.5-sTrail融合基因，具有序列表SEQ ID NO1中鹼基序列；其編碼蛋白具有序列表SEQ ID NO2中的胺基酸序列。
scFvC6.5-sTrail融合基因的製備以人源化單鏈抗體scFvC6.5和人的可溶性TNF相關的凋亡誘導配體sTrail基因的114-281鹼基片斷為模板，進行PCR，擴增產物經瓊脂糖電泳回收後，經雙酶切，插入到表達載體pET28a中，進行酶連接反應，得到pET28a-scFvC6.5-sTrail；scFvC6.5-sTrail融合蛋白的製備pET28a-scFvC6.5-sTrail轉化致大腸桿菌BL21(DE3)中，進行表達；SDS-PAGE證明蛋白scFvC6.5-sTrail主要以包含體形式存在於菌體中；利用組氨酸殘基與Ni+結合的原理，應用金屬螯合柱層析梯度復性，將包含體蛋白進行了變性復性和純化，得到了純化的scFvC6.5-sTrail融合蛋白。
所述scFvC6.5-sTrail融合基因的編碼蛋白可用於製備對高表達HER2/neu的腫瘤細胞具有強特異性殺傷作用的藥物中，可使scFvC6.5-sTrail所誘導的腫瘤細胞凋亡。
本發明具有如下優點1.scFvC6.5-sTrail融合基因經過表達、變性、復性純化得到免疫毒素scFvC6.5-sTrail；而scFvC6.5-sTrail融合蛋白中的scFvC6.5為人源化抗體，sTrail為來自人本身的細胞因子，避免了實際應用中可能出現的免疫原性。
2.scFvC6.5-sTrail基因為人工製備的一種新的融合基因，屬首次製得的基因，該基因的表達可用於抗HER2/neu高表達的腫瘤靶向治療的研究。體外實驗證實該融合蛋白對HER2/neu高表達的腫瘤細胞具有明顯殺傷作用，而對HER2/neu陰性的細胞沒有殺傷作用，顯示出腫瘤殺傷強特異性。該免疫毒素為細胞表面過度表達HER2/neu的腫瘤靶向治療展示了潛在的應用前景；融合毒素scFvC6.5-sTrail分子量為47KDa，具有滲透實體瘤的能力。
3.本發明提供了一種製備融合毒素scFvC6.5-sTrail的工藝方法，據此方法可以製得分析純的scFvC6.5-sTrail蛋白；應用本發明，可進一步提供直接用於生產融合毒素scFvC6.5-sTrail的工程菌株。


圖1為scFvC6.5-sTrail融合基因在大腸桿菌中表達電泳圖其中1為中分子量蛋白標準，2為融合蛋白純品，3為誘導後細胞周質蛋白，4為誘導後細胞菌體蛋白，5為未誘導的工程菌菌體蛋白(陰性對照)。
具體實施例方式
實施例1一種scFvC6.5-sTrail融合基因，具有序列表SEQ ID NO1中鹼基序列。
CATATGCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCAGAGTTGAAAAAACCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTACATGGGGCTCATCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCGTCAGCACTGCCTACTTGCAATGGAGCAGTCTGAAGCCCTCGGACAGCGCCGTGTATTTTTGTGCGAGACATGACGTGGGATATTGCAGTAGTTCCAACTGCGCAAAGTGGCCTGAATACTTCCAGCATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTCACACCAATCGGCCCGCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTGCGGCCGCAGGTGGAGGCGGATCCGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAACACAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCCTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGCCTCGAG(1)SEQ ID NO1的信息(參見序列表)(a)序列特徵*長度1305鹼基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源scFvC6.5cDNA和sTrail cDNA(2)scFvC6.5-sTrail融合基因的製備為了獲得pET28a-scFvC6.5-sTrail融合基因，設計併合成了2對引物一對scFvC6.5引物和一對sTrail引物。
scFvC6.5Primer15`-gggtttcatatgcaggtgcagctggtgc-3`，含NdeI酶切位點。
scFvC6.5Primer25`-atttgcggccgcacctaggacggtcagc-3`含NotI酶切位點。
sTrail Primer15`-atttgcggccgcaggtggaggcggatccgtcaggtcatcttcac-3`含NotI酶切位點及Gly4Ser連接肽。
sTrail Primer25`-aattctcgagcagggcaataatcccaaag-3`含XhoI酶切位點。
用上述引物分別PCR擴增scFvC6.5和sTrail基因，條件為scrvC6.5進行PCR條件
變性94℃，30sec；退火58℃，30sec；延伸72℃，1min；35個循環；最後72℃延伸10min。
sTrail進行PCR條件變性94℃，30sec；退火62℃，30sec；延伸72℃，1min；35個循環；最後72℃延伸10min。
PCR擴增產物經瓊脂糖電泳回收後，用NdeI和NotI酶切scFvC6.5基因，用NotI和XhoI酶切sTrail基因。將NedI和XhoI酶切後的載體pET28a與scFvC6.5和sTrail酶切片段按照1∶3∶3的比例混合後，加入T4DNA連接酶在16℃過夜進行連接反應。
酶連接反應體系(30μl)

將酶連接後的混合物轉化大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)。感受態細胞的製備，CaCl2轉化方法，質粒DNA的提取鑑定參考《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，E.F.費裡奇，T.曼尼阿蒂斯，科學出版社1998年版。
卡那黴素平板篩選，挑取陽性克隆，接種於5mlLB(50μg/ml卡那黴素)培養基，37℃，220rpm培養過夜，小量提取質粒，進行測序。送至上海聯合基因生物公司進行測序；對轉化子的測序結果表明，DNA序列測定結果顯示scFvC6.5-sTrail的DNA序列及讀碼框完全正確。
(3)重組子pET28a-scFvC6.5-sTrail在大腸桿菌中的表達將上述重組菌擴大培養於500mlLB培養液(50μg/ml卡那黴素)中，37℃，220rpm培養至OD600nm＝0.5。加入IPTG至終濃度為1mM，誘導表達4h。4000g離心20min收集菌體。
(4)融合蛋白scFvC6.5-sTrail的變性、復性及純化PBS洗滌菌體一次。菌體經50ml 50mM Tris·HCl pH8.3重懸後，超聲破碎。12000g離心30min，得到上清和沉澱。對上清和沉澱分別進行SDS-PAGE及Western-blot鑑定，發現scFvC6.5-sTrail蛋白主要以包含體形式存在。依次用2.5M NaCl、0.05％TritonX-100及2M脲素洗滌scFvC6.5-sTrail的包含體後，10,000rpm離心30min，洗滌後的包含體按2mg/ml濃度溶解在變性液(8M脲素，50mMTris·HCl，pH8.3)中，4℃攪拌過夜，0.45μm微膜過濾，準備上柱純化。
應用IMAC梯度復性法進行產物蛋白的純化及復性。5mlChelating Sepharose裝柱後經Ni離子飽和，用變性液平衡柱體。將10ml變性的包涵體加入柱中，4℃孵育5h。用變性液將基線洗平，然後用200ml的線性梯度逐步由含8M脲素的變性液過渡到復性緩衝液(50mMTris·HCl，pH8.3)中。然後用洗脫液(0.5M咪唑，50mMTris·HCl，pH8.3)將復性後的蛋白洗出柱子。洗脫樣品在透析液(含10％甘油的PBS溶液)中透析過夜。保留各洗脫產物，分取10μl，進行SDS-PAGE，以鑑定蛋白純化情況。其中第一抗體為抗sTrail鼠單克隆抗體抗體，第二抗體為HRP標記的羊抗鼠抗體，底物為Supersignal發光底物。
(5)融合蛋白scFvC6.5-sTrail的SDS-PAGE檢測將scFvC6.5-sTrail誘導前後的菌體蛋白與上樣6×上樣緩衝液30μl體系，混勻後在100℃煮5min，取5ul進行12％SDS-PAGE。考馬斯亮藍染色，結果用紫外凝膠成像系統檢測蛋白的表達。
結果比較誘導後工程菌的細胞全蛋白電泳帶和誘導前工程菌的細胞全蛋白電泳帶，發現在47KDa處的蛋白帶明顯增粗，包含體純化後蛋白帶就在此處，正符合scFvC6.5-sTrail的分子大小。參見圖1，紫外凝膠成像掃描系統顯示此表達蛋白佔菌體總蛋白的5％左右。純化蛋白純度大於95％。折合產率700μg/1L菌液。
(6)ELISA檢測scFvC6.5-sTrail對不同程度表達HER2/neu的腫瘤細胞的結合活性將SKOV-3、MCF-7和A-375細胞分別培養至對數期，以每孔5×104接種96孔細胞培養板中，37℃、5％CO2細胞培養箱中培養12h。捨棄上清，4℃使用丙酮固定15min。5％BSA/PBS溶液100μl 37℃封閉2h後，分別加入不同濃度純化後的scFvC6.5-sTrail 50μl/孔，37℃孵育2h。PBS洗三次，加入鼠抗6×His·Tag抗體(1∶2000)50μl，37℃孵育2h。PBS洗三次，再加入HRP標記的羊抗鼠抗體50μl，37℃孵育1h。PBS洗三次，加入OPD底物5min，加12.5％硫酸50μl/孔中止反應。置酶標儀測492nm吸光度值。加入PBS的一組為陰性對照。每個樣品設三個平行孔，結果取三次重複試驗的平均值。
ELISA實驗表明，免疫毒素scFvC6.5-sTrail結合卵巢癌SKOV-3細胞的活性最高，而且隨著劑量的增高而加強，結合乳腺癌MCF-7細胞的能力較弱，幾乎不結合黑色素瘤A-375細胞。這說明融合蛋白scFvC6.5-sTrail的結合活性是特異的，能夠區分HER2/neu陽性和陰性細胞。
(7)融合蛋白scFvC6.5-sTrail的細胞殺傷活性試驗MTT法檢測不同濃度scFvC6.5-sTrail對SKOV-3、MCF-7和A-375三種細胞的細胞毒活性將培養至對數期的SKOV-3、MCF-7和A-375細胞，分別以每孔104傳人96孔細胞培養板中，37℃、5％CO2細胞培養箱中培養12h。加入不同濃度的scFvC6.5-sTrail50μl/孔，培養12h。加入MTT至終濃度為1mg/ml。孵育2h。吸淨培養液。加入50μl DMSO。振蕩5min，置於酶標儀中測定A570吸光度值。加入含10％甘油的PBS的一組為陰性對照。每組設三次平行，取三次試驗平均值。設空白對照。
MTT法檢測50nM下不同時間scFvC6.5-sTrail對SKOV-3、MCF-7和A-375三種細胞的細胞毒活性與上述方法相同，在加入scFvC6.5-sTrail後2、8、12、16、24h，分別加入MTT至終濃度為1mg/ml。測定A570吸光度值。
MTT試驗表明scFvC6.5-sTrail對HER2/neu高表達細胞SKOV-3的生長具有顯著的抑制作用，並且為劑量依賴性。在一定濃度下，scFvC6.5-sTrail對HER2/neu中度表達的MCF-7細胞也存在明顯的細胞毒效應，而對HER2/neu表達陰性的細胞A-375不敏感。
當申請人選擇50nM scFvC6.5-sTrail作為固定劑量，觀察不同時間(2-24h)對細胞生長的影響時，發現scFvC6.5-sTrail對細胞生長的抑制作用自孵育後第12開始加速，在第24h時，SKOV-3細胞死亡率接近100％，MCF-7細胞死亡率約80％；而HER2/neu表達陰性的細胞A-375沒有隨著時間的延長產生明顯的細胞毒現象，說明scFvC6.5-sTrail對靶細胞的殺傷作用呈現時間依賴性。
SEQUENCE LISTING110中國科學院瀋陽應用生態研究所120scFvC6.5-sTrail融合基因和蛋白及製備130
1602170PatentIn version 3.121012111305212DNA213人工序列220
221CDS222(1)..(1305)223
4001cat atg cag gtg cag ctg ttg cag tct ggg gca gag ttg aaa aaa ccc48His Met Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro1 5 10 15ggg gag tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc96Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr20 25 30agc tac tgg atc gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag144Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45tac atg ggg ctc atc tat cct ggt gac tct gac acc aaa tac agc ccg192Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro50 55 60tcc ttc caa ggc cag gtc acc atc tca gtc gac aag tcc gtc agc act240Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr65 70 75 80gcc tac ttg caa tgg agc agt ctg aag ccc tcg gac agc gcc gtg tat288Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr85 90 95ttt tgt gcg aga cat gac gtg gga tat tgc agt agt tcc aac tgc gca336Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala100 105 110aag tgg cct gaa tac ttc cag cat tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc384Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr115 120 125gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc432
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140gga tcg cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tct gcg gcc cca480Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro145 150 155 160gga cag aag gtc acc atc tcc tgc tct gga agc agc tcc aac att ggg528Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly165 170 175aat aat tat gta tcc tgg tac cag cag ctc cca gga aca gcc ccc aaa576Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys180 185 190ctc ctc atc tat ggt cac acc aat cgg ccc gca ggg gtc cct gac cga624Leu Leu Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg195 200 205ttc tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc agt ggg672Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly210 215 220ttc cgg tcc gag gat gag gct gat tat tac tgt gca gca tgg gat gac720Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp225 230 235 240agc ctg agt ggt tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta768Ser Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu245 250 255ggt gcg gcc gca ggt gga ggc gga tcc gtg aga gaa aga ggt cct cag816Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln260 265 270aga gta gca gct cac ata act ggg acc aga gga aga agc aac aca ttg864Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu275 280 285tct tct cca aac tcc aag aat gaa aag gct ctg ggc cgc aaa ata aac912Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn290 295 300tcc tgg gaa tca tca agg agt ggg cat tca ttc ctg agc aac ttg cac960Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His305 310 315 320ttg agg aat ggt gaa ctg gtc atc cat gaa aaa ggg ttt tac tac atc1008Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile325 330 335tat tcc caa aca tac ttt cga ttt cag gag gaa ata aaa gaa aac aca1056Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr340 345 350aag aac gac aaa caa atg gtc caa tat att tac aaa tac aca agt tat1104Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr355 360 365cct gac cct ata ttg ttg atg aaa agt gct aga aat agt tgt tgg tct1152Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser370 375 380aaa gat gca gaa tat gga ctc tat tcc atc tat caa ggg gga ata ttt1200Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe385 390 395 400gag ctt aag gaa aat gac aga att ttt gtt tct gta aca aat gag cac1248Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His405 410 415ttg ata gac atg gac cat gaa gcc agt ttt ttc ggg gcc ttt tta gtt1296Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val420 425 430ggc ctc gag1305Gly Leu Glu435
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1.一種scFvC6.5-sTrail融合基因，其特徵在於具有序列表SEQ ID NO1中的鹼基序列。
2.一種權利要求1所述scFvC6.5-sTrail融合基因的編碼蛋白，其特徵在於具有序列表SEQ ID NO2中的胺基酸序列。
3.一種權利要求2所述scFvC6.5-sTrail融合基因的編碼蛋白的製備，其特徵在於1)製備scFvC6.5-sTrail融合基因以人源化單鏈抗體scFvC6.5和人的可溶性TNF相關的凋亡誘導配體sTrail基因的114-281鹼基片斷為模板，進行PCR，擴增產物經瓊脂糖電泳回收後，經雙酶切，插入到表達載體pET28a中，進行酶連接反應，得到pET28a-scFvC6.5-sTrail；2)製備scFvC6.5-TNF-α融合蛋白將上述的pET28a-scFvC6.5-sTrail轉化致大腸桿菌BL21中，進行表達；運用IMAC梯度復性法對表達產物進行變性、復性及純化，得到scFvC6.5-sTrail分純產品。
4.一種權利要求2所述scFvC6.5-TNF-α融合基因的編碼蛋白的應用，其特徵在於用於製備對高表達HER2/neu的腫瘤細胞具有強特異性殺傷作用的藥物中。
全文摘要
本發明涉及靶向抗腫瘤藥物和基因重組技術，具體地說是scFvC6.5－sTrail融合基因和蛋白及製備，scFvC6.5－sTrail融合基因具有序列表1的鹼基序列。scFvC6.5－sTrail融合基因經過表達、變性、復性純化得到免疫毒素scFvC6.5－sTrail。體外實驗證實該融合蛋白對HER2/neu高表達的腫瘤細胞具有明顯殺傷作用，而對HER2/neu陰性的細胞沒有殺傷作用，顯示出腫瘤殺傷強特異性。該免疫毒素為細胞表面過度表達HER2/neu的腫瘤靶向治療展示了潛在的應用前景。
文檔編號C12P21/02GK1865445SQ20051004647
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月20日 優先權日2005年5月20日
發明者吳文芳, 蔣琳, 呂安國 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所