一種核苷酸突變位點的檢測方法

2023-10-21 05:17:17 2

專利名稱：：一種核苷酸突變位點的檢測方法
技術領域：
：本發明屬於基因組學和分子生物學中有機生物分子領域，尤其涉及核苷酸突變位點的4企測方法。
背景技術：
：自然界大多數生物體的遺傳信息均包含在脫氧核糖核酸(DNA)中，人類全基因組中30億個鹼基，約4萬個基因，分布在24對染色體上。每個基因通過轉錄、翻譯，編碼特異的蛋白質，調控生物體內特定的生化反應，發揮特異的生物學功能。DNA序列的改變，即基因突變，會導致蛋白質結構、功能的改變或缺失，進而引起相關的遺傳疾病。基因突變包括DNA分子中發生鹼基對的插入、缺失和改變(點突變)。研究表明許多疾病的發生，如血友病、地中海貧血、杜氏型肌營養不良、亨廷頓舞蹈症、老年痴呆症、糖尿病、肥胖症、心血管疾病以及自身免疫等3000多個疾病與基因突變密切相關。另外，近年來人們逐漸認識到癌症的發生發展也是基因累積突變的結果。在人類基因組中，約卯％的差異是以單個核苷酸的差異體現出來的，主要由單個鹼基的轉換(transition)或顛換(transversion)所引起，這樣的差異位點稱作單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。在人群中，這種變異的發生頻率至少要大於1%,否則被認為是點突變。SNP位點大多數為雙態，即在一個位點上僅有兩種表現形式，並且在人類基因組中廣泛存在，平均每500~1000個石威基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。這些差異極有可能是造成個體差異的遺傳因素，因此發現這些位點可廣泛地應用於遺傳標記的研究、評估個體遺傳關係、評估物種進化等研究領域。目前檢測SNP和基因突變的方法有許多種，如直接PCR測序、RFLP、基因晶片和焚光定量PCR等。其中，直接PCR測序最不敏感，只有耐藥突變株達到20%以上才能#皮檢測到；也不適用於大規模篩選；RFLP分析只能檢測出在病毒總體中大於5%的突變抹，但是對於每個感興趣的突變，必須特別設計單獨的核酸內切酶。針對某些突變的特異性內切酶可能並不存在，RFLP分析並不適用於所有的突變。基因晶片技術利用寡核苷酸微點陣，可以檢測新發現的突變，但這種方法代價昂貴，沒有得到廣泛應用。總之，上述這些方法不是費時費力，靈敏度低，準確度低，就是成本高，不適合大規模篩查。
發明內容本發明實施例的目的在於提供一種核苷酸突變位點的檢測方法，旨在解決現有核苷酸突變位點的檢測方法靈敏度低、準確性低的問題。本發明實施例是這樣實現的，一種核苷酸突變位點的一企測方法，包括如下步驟一種核香酸突變位點的^^測方法，包括如下步驟(1)針對待檢核苷酸序列可能存在的突變位點，並確定突變位點在待檢序列中的位置；(2)根據突變位點的位置，設計3條引物，其中，一對為擴增引物，每條引物長度至少30bp,其5'端各含10bp的tag;另一條為延伸引物，長度為17-28bp，正好位於突變位點的5'端；(3)通過PCR擴增，獲得含有所述突變位點的靶序列擴增產物；(4)通過SAP酶處理，除去所述擴增產物中含有的dNTPs;(5)通過延伸反應，在延伸引物的3，端連接一個鹼基，且該鹼基正好與突變位點上的石成基互補，延伸反應所使用的原料是是以擴大分子量差異為目的進行過質量修飾的四種ddNTP分子(6)釆用樹脂純化延伸反應產物；(7)將純化後的產物與晶片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然後用瞬時納秒強雷射激發進行質譜檢測，確定突變的基因型。與現有技術相比，上述技術方案，通過SAP酶(壞磁Z疇酸酶)處理，除去所述擴增產物中含有的dNTPs,可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到後續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個鹼基；延伸反應所使用的原料是經過質量修飾的ddNTP，以增大四種ddNTP分子量差異，提高解析度。將純化產物與晶片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然後用瞬時納秒強雷射激發，由於基質分子經輻射吸收能量，導致能量蓄積並迅速產熱，從而使基質晶體升華，核酸分子就會解吸附並轉變為亞穩態離子，產生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動能，進而在一非電場漂移區內按照其質荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達^r測器。這樣，採用質語儀檢測待檢測突變位點不僅方便，而且靈敏度高、準確性高。上述耙序列擴增產物長度為80-120bp。作為本發明的一個具體的實施方式，四種ddNTP的分子量分別是ddATP271.2Da，ddTTP327.1Da，ddCTP247.2Da,ddGTP287.2Da,其中分子量差異最小的是16Da,大大提高了解析度。作為本發明的一個較佳的實施方式，上述步驟(2)還可以包括按照引物間，引物與擴增產物間不形成二聚體、髮夾結構，以及不發生錯配的原則，將多個檢測位點的擴增引物與擴增引物混合，延伸引物與延伸引物混合。這樣可以同時檢測多個非連續的SNP位點，提高了效率，節省了成本。作為本發明的另一個較佳的實施方式，還可以將連續多個突變位點標記在同一條核苷酸序列上，共用一對擴增引物。擴增產物的長度可在100-350bp間。兩端的突變位點採取向左右兩側設計，左側突變位點的延伸引物採取正向設計，右側突變位點的延伸？1物採取反向設計；位於中間的突變位點的延伸引物有多條，且包含其上遊的突變位點可能存在的所有核苷酸情況。這樣，可以同時檢測連續突變的多個位點，節省了成本，縮短了周期，-提高了效率。具體來講，可以採用如下方法設計連續多個突變位點的引物若左側突變位點為Snpl，中間的突變位點為S叩2，右側突變位點為S叩3,S叩l/SnpWSnp3所在序列為S叩1[C/T]，右側SNP位點，正向設計，延伸引物為......TCAGCGATATSnp3[T/G]，左側SNP位點，反向設計，延伸引物為......TACGAATTSnp2[G/A],中間SNP位點，兼併引物，延伸引物為......AGCGATATCC和......AGCGATATTC。上述具體實施方式中，質譜儀選擇基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)。該飛行時間質i普基因分型系統的反應體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯配幹擾，也不需要引入各種標記物，因而準確性高。圖1A為本發明實施例1中，所得到的陰性對照Al的質譜圖；圖1B為本發明實施例1中，所得到的待測樣本B1的質譜圖；圖1C是本發明實施例1中，所得到的待測樣本C1的質譜圖2A為本發明實施例2中，所得到的陰性對照A2的質譜圖；圖2B為本發明實施例2中，所得到的待測樣本B2的質譜圖；圖2C是本發明實施例2中，所得到的待測樣本C2的質譜圖；圖2D為本發明實施例2中，所得到的待測樣本D2的質譜圖；圖2E是本發明實施例2中，所得到的待測樣本E2的質譜圖3A-1為本發明實施例3中，所得到的陰性對照A3-l的質譜圖；圖3A-2為本發明實施例3中，所得到的陰性對照A3-2的質譜圖；圖3B為本發明實施例3中，所得到的待測樣本B3的質譜圖；圖3C是本發明實施例3中，所得到的待測樣本C3的質譜圖；、圖4A為本發明實施例4中，所得到的待測樣本A4的質譜圖；圖4B-E分別為圖4A的局部放大圖，其中，圖4B為本發明實施例4中，檢測180位點的質譜圖；圖4C為本發明實施例4中，檢測204位點的質譜圖；圖4D為本發明實施例4中，檢測250位點的質譜圖；圖4E為本發明實施例4中，檢測184位點的質譜圖。具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。實施例1:(1)設計擴增B肝病毒逆轉錄酶區180位密碼子的引物B型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染是嚴重的世界性衛生問題，每年約有近百萬人死於B肝病毒感染引起的各類疾病。目前治療B肝的藥物主要是核酸類似物，包括拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋等，這類藥物在病毒DNA複製過程中替代正常dNTP，從而導致DNA合成終止。然而，長期服用某種藥物會導致耐藥性的產生，不僅達不到治療的目的，反而導致反彈。如果對B肝患者體內的耐藥變異進行研究，即可揭示人群中不同個體對相同藥物的敏感性差異的根本原因，也有助於研究者篩選更合適的藥物。其中，B肝病毒基因組逆轉錄酶區180位密碼子C/TTG變成ATG，使得胺基酸由亮氨酸變為曱硫氨酸(L180M)，從而產生對抗病毒藥物拉米夫定的耐藥性。對於該突變位點的質譜檢測，我們設計如下實驗首先根據B肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號NC—003977)，設計一對PCR引物和一條延伸引物，PCR引物為上遊5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3';下遊5，-acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3，；延伸引物為5，畫GCCTCAGTCCGTTTCTC-3，。其中，小寫字母部分表示10bp的tag。(2)擴增含有B肝病毒逆轉錄酶區180位密碼子的片段PCR反應片段長度大小為101bp，反應體系為5ul，其中含有4mMMg2+,lx緩衝液，100nM引物，500uMdNTP,0.5UHotstarTaq;反應條件95。C15min;45個循環(94°C20s，56°C30s,72。Clmin);72°C3min。PCR反應後，B肝病毒基因組DNA中帶有突變位點的那段核苷酸序列的拷貝數得到了放大。反應完成後的純化產物可在4。C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可直接用於後續的SAP處理。(3)SAP處理PCR反應產物經過SAP處理，去除多餘的dNTPs。具體的SAP反應體系lxSAP緩衝液和0.5USAP酶，反應總體積為7ul(2ulSAP+5ulPCR產物)。反應條件為37°C40min，85°C5min。SAP為蝦鹼磷酸酶，可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到後續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個鹼基。反應完成後的純化產物可在4。C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可直接用於後續的延伸反應。(4)延伸反應延伸反應後得到一個片段大小為18bp的產物，它與延伸引物(17bp)的區別僅在於3'端多了一個鹼基。延伸反應所使用的原料是經過質量修飾的ddNTP,它既保證了延伸反應只連接一個鹼基，又進一步整個系統的解析度提高。延伸反應體系為9ul，緩沖液、ddNTPs(質量經過修飾)、延伸引物、iPLEX酶等各種試劑的反應濃度因反應叢數的不同而不同，反應總體積為9ul(2ul延伸mix+7ulSAP處理產物)。反應條件94°C30s;40個循環(94。C5s,5個小循環(52。C5s,80°C5s)};72°C3min。反應完成後的延伸產物可在4。C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可直接用於後續的樹脂純化。(5)樹脂純化在延伸反應的產物中加入6mg樹脂，上下顛倒30min。經過本步反應，樹脂將充分與反應體系中的陽離子結合，從而使反應體系脫鹽。反應完成後的純化產物可在4。C保存lt天，也可在-20。C保存數周，也可4000rpm離心5min後取上清直接用於質i條險測。(6)質譜檢測純化後的產物與晶片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然後用瞬時納秒強雷射激發，即可進行MALDI-TOF-MS分析。判定標準如下如果沒有發生耐藥突變，延伸產物的質譜結果為5'-GCCTCAGTCCGTTTCTCC-3，或5，-GCCTCAGTCCGTTTCTCT-3，，分子量分別為5335.5Da和5415.4Da;如果發生耐藥突變，延伸產物的質譜結果為5，-GCCTCAGTCCGTTTCTCA-3，，分子量為5359.5Da。檢測結果如下其中樣本A1為陰性對照樣本，樣本B1和C1為待測樣本。對於陰性對照樣本Al,由於其沒有發生耐藥突變，因此延伸產物的分子量為5415.4Da(見圖1A);對於樣本B2，質譜4企測到的分子量為5359.5Da，可以確定樣本B2發生了耐藥突變(見圖1B);對於樣本Cl，質譜圖上出規,了兩個峰，分別在5359.5Da和5415.4Da，可以推斷該樣本中存在野生林和突變林(見圖1C)。實施例2(1)設計擴增B肝病毒逆轉錄酶區181位密碼子的引物B肝病毒基因組逆轉錄酶區181位密碼子GCT變成GTT或ACT，使得胺基酸由丙氨酸變為纈氨酸或蘇氨酸(A181V/T),從而產生對抗病毒藥物阿德福韋酯的耐藥性。對於該突變位點的質譜檢測，根據B肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號NC—003977),設計1對PCR引物和5條延伸引物，PCR引物為上遊5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3';下遊5'畫acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3,。其中，小寫字母部分表示lObp的tag。由於181位點的上遊180位點也容易發生突變，即C/TTG也會變成ATG，而下遊184位點也會發生突變，由ACT變成GGT,所以針對l81密碼子的第一個鹼基設計了3條兼併延伸引物，分別為181歸1:5，-TCAGTCCGTTTCTCTTG-3，，181歸2:5，-TCAGTCCGTTTCTCCTG-3，，181#1#3:5，畫TCAGTCCGTTTCTCATG-3，。其第二個密碼子設計了2條兼併延伸引物，分別為18翻1:5，-ATGGCACTAGTAAACTGA-3,,181#2#2:5，-TGGCACTACCAAACTGA-3，。(2)擴增含有B肝病毒逆轉錄酶區181位密碼子的片段PCR反應片段長度大小為98bp，反應體系為5ul，其中含有4mMMg2+，1x緩衝液，100nM引物，500uMdNTP，0.5UHotstarTaq;反應條件95。C15min;45個循環(94°C20s,56°C30s，72°Clmin);72°C3min。PCR反應後，B肝病毒基因組DNA中帶有突變位點的那段核苷酸序列的拷貝數得到了放大。反應完成後的純化產物可在4。C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可直接用於後續的SAP處理。(3)SAP酶處理PCR反應產物經過SAP處理，去除多餘的dNTPs。具體的SAP反應體系1xSAP緩衝液和0.5USAP酶，反應總體積為7ul(2ulSAP+5ulPCR產物)。反應條件為37°C40min，85°C5min。SAP為蝦i成磷酸酶，可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到後續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個鹼基。反應完成後的純化產物可在4"保存數天，也可在-20。C保存數周，也可直接用於後續的延伸反應。(4)延伸反應延伸反應後得到一個片段大小為18bp的產物，它與延伸引物的區別僅在於3，端多了一個鹼基。延伸反應所使用的原料是經過質量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應只連接一個鹼基，又進一步整個系統的解析度提高。延伸反應體系為9ul，緩沖液、ddNTPs(質量經過修飾)、延伸引物、iPLEX酶等各種試劑的反應濃度因反應叢數的不同而不同，反應總體積為9ul(2ul延伸mix+7ulSAP處理產物)。反應條件94°C30s;40個循環(94。C5s,5個小循環(52°C5s,80°C5s)};72°C3min。反應完成後的延伸產物可在4。C保存數天，也可在-2(TC保存數周，也可直接用於後續的樹脂純化。(5)樹脂純化在延伸反應的產物中加入6mg樹脂，上下顛倒30min。經過本步反應，樹脂將充分與反應體系中的陽離子結合，從而使反應體系脫鹽。反應完成後的純化產物可在4。C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可4000rpm離心5min後取上清直接用於質語檢測。(6)質鐠檢測純化後的產物與晶片基質共結晶，將該晶體放入質語儀的真空管，然後用瞬時納秒強雷射激發，即可進行MALDI-TOF-MS分析。分型結果依據分子量來判定，標準如下181#1#1，野生型為5405.5Da，突變型為5389.5Da;181#1#2,野生型為5390.5Da，突變型為5374.5Da;181#1#3,野生型為5414.6Da,突變型為5398.5Da;181#2#1，野生型為5818.8Da，突變型為5802.8Da;181#2#2，野生型為5450.6Da，突變型為5434.6Da。;險測結果如下樣本A2、B2、C2、D2和E2為臨床待測樣本。樣本A2，由181#1#1檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5405.5Da和5389.5Da(見圖2A);樣本B2，由181#1#2檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5390.5Da和5374.5Da(見圖2B);樣本C2，由181#1#3檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5414.6Da和5398.5Da(見圖2C);樣本D2，由181#2#1檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5818.8Da和5802.8Da(見圖2D);樣本E2，由181#2#2衝企測到突變型，因此延伸產物的分子量為5434.6Da(見圖2E)。實施例3(1)KRAS基因第12，13位密碼子突變4全測引物設計KRAS基因又稱鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因，其功能與GTP酶活性密切相關。檢測KRAS基因是否突變能預測結腸癌患者對西妥昔單抗(Erbitux，愛必妥，百時美施貴寶)的療效，已被NCCN列為推薦檢測的基因項目之一；KRAS最為重要的突變為第一外顯子12、13位密碼子，野生型12、13位密碼子為GGTGGC,其存在多種突變；12、13位密碼子第一二位石威基的突變可引起編碼胺基酸的改變，進而影響KRAS基因表達產物的功能。對於該突變位點的質譜檢測，根據KRAS基因的序列(NCBI登錄號EU332849)，設計1對PCR引物和10條延伸引物。由於KRAS基因第12，13位密碼子的第1,2個鹼基均可能發生突變，所以採取兩側設計和兼併引物設計的方法。KRAS引物序列表見表1。表1tableseeoriginaldocumentpage13KRAS13c2GAAGGCACTCTTGCCTACGCKRAS13c2ATCAAGGCACTCTTGCCTACGTKRAS13c2CCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGG(2)擴增含有KRAS12、13位密碼子的136bp的片段PCR反應片段長度大小為136bp，反應體系為5ul，其中含有4mMMg2+,lx緩沖液，100nM引物，500uMdNTP,0.5UHotstarTaq;反應條件95。C15min;45個循環(94°C20s,56°C30s,72°Clmin);72°C3min。PCR反應後，KRAS中帶有易突變12、13為密碼子位點的那段核苷酸序列的拷貝數得到了放大。反應完成後的純化產物可在4。C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可直接用於後續的SAP處理。(3)SAP處理PCR反應產物經過SAP處理，去除多餘的dNTPs。具體的SAP反應體系1xSAP緩沖液和0.5USAP酶，反應總體積為7ul(2ulSAP+5ulPCR產物)。反應條件為37°C40min，85°C5min。SAP為蝦減z瞵酸酶，可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到後續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個鹼基。反應完成後的純化產物可在4。C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可直接用於後續的延伸反應。(4)延伸反應延伸反應後得到一個片段大小範圍在19-29bp範圍內的產物，它與延伸引物的區別僅在於3，端多了一個鹼基。延伸反應所使用的原料是經過質量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應只連接一個鹼基，又進一步整個系統的解析度提高。延伸反應體系為9ul，緩衝液、ddNTPs(質量經過修飾)、延伸引物、iPLEX酶等各種試劑的反應濃度因反應叢數的不同而不同，反應總體積為9ul(2ul延伸mix+7ulSAP處理產物)。反應條件94°C30s;40個循環{94匸5s,5個小循環(52。C5s,80°C5s)};72°C3min。反應完成後的延伸產物可在4。C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可直接用於後續的樹脂純化。(5)樹脂純化在延伸反應的產物中加入6mg樹脂，上下顛倒30min。經過本步反應，樹脂將充分與反應體系中的陽離子結合，從而使反應體系脫鹽。反應完成後的純化產物可在4'C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可4000rpm離心5min後取上清直接用於質譜檢測。(6)質譜檢測純化後的產物與晶片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然後用瞬時納秒強雷射激發，即可進行MALDI-TOF-MS分析。分型結果依據分子量來判定，標準如下如KRAS12cl，野生型為5574.6Da,突變型會有三種質譜質量，分別為5534.6Da,5558.6Da，5614.5Da;KRAS12clG,野生型為6819.5Da,突變型會有三種質譜質量分別為6779.4Da，6803.5Da，6859.3Da。檢測結果如下其中樣本A3為陰性對照樣本，樣本B3和C3為待測樣本。對於陰性對照樣本A3，由於密碼子沒有發生突變，因此KRAS12cl和KRAS12clG延伸產物分子量為5574.6Da(圖3A-1)和6819.5Da(圖3A-2);對於樣本B3，質譜檢測KRAS12cl產物的分子量為5614.5Da和5574.6Da,可以確定樣本B3發生了KRAS12位密碼子第一鹼基的突變(圖3B);對於樣本3C，質譜檢測KRAS12clG產物的分子量為，分別在6819.5Da和6803.5Da，可以推斷該樣本中存在KRAS12位密碼子第二鹼基的突變(見圖3C)。實施例4(1)設計擴增B肝病毒逆轉錄酶區180、204、250和184位密碼子的引物B肝病毒基因組逆轉錄酶區180位密碼子TTG或CTG變成ATG,204位密碼子ATG變成ATT，250位密碼子ATG變成GTG,以及184位密碼子ACT變成GCT,/人而產生抗病毒藥物耐藥性。對於這些突變位點的質譜檢測，根據B肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號NC—003977)，設計1對PCR引物和4條延伸引物，PCR引物為上遊5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，；下遊5，畫acgttggatgACCCCAACTTCCAATTACAT-3'。其中，小寫字母部分表示10bp的tag。4條延伸引物分別對應4個鬥企測位點，信息如下180:5，-GCCTCAGTCCGTTTCTC-3'204:5，-CCCCCAATACCACATCATC-3'250:5，-GGGCTACTCCCTTAACTTC-3'184:5，-ACTGAACAAATGGCACTAC-3(2)擴增含有B肝病毒逆轉錄酶區181位密碼子的片段PCR反應片段長度大小為293bp，反應體系為5ul，其中含有4mMMg2+,lx緩衝液，100nM引物，500uMdNTP，0,5UHotstarTaq;反應條件95°C15min;45個循環(94°C20s,56°C30s,72°Clmin);72°C3min。PCR反應後，B肝病毒基因組DNA中帶有突變位點的那段核苷酸序列的拷貝數得到了放大。反應完成後的純化產物可在4。C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可直接用於後續的SAP處理。(3)SAP酶處理PCR反應產物經過SAP處理，去除多餘的dNTPs。具體的SAP反應體系1xSAP緩衝液和0.5USAP酶，反應總體積為7ul(2ulSAP+5ulPCR產物)。反應條件為37°C40min，85°C5min。SAP為奸石威磷酸酶，可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到後續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個鹼基。反應完成後的純化產物可在4。C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可直接用於後續的延伸反應。(4)延伸反應延伸反應後得到4個片段大小為18-29bp的產物，它與延伸引物的區別僅在於3，端多了一個石鹹基。延伸反應所使用的原料是經過質量修飾的ddNTP,它既保證了延伸反應只連接一個鹼基，又進一步整個系統的解析度提高。延伸反應體系為9ul，緩沖液、ddNTPs(質量經過修飾)、延伸引物、iPLEX酶等各種試劑的反應濃度因反應叢數的不同而不同，反應總體積為9ul(2ul延伸mix+7ulSAP處理產物)。反應條件94°C30s;40個循環(94。C5s，5個小循環(52°C5s,80°C5s)};72°C3min。反應完成後的延伸產物可在4。C保存數天，也可在-2(TC保存數周，也可直接用於後續的樹脂純化。(5)樹脂純化在延伸反應的產物中加入6mg樹脂，上下顛倒30min。經過本步反應，樹脂將充分與反應體系中的陽離子結合，從而使反應體系脫鹽。反應完成後的純化產物可在4。C保存數天，也可在-20。C保存數周，也可4000rpm離心5min後取上清直接用於質譜;險測。(6)質譜4全測純化後的產物與晶片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然後用瞬時納秒強雷射激發，即可進行MALDI-TOF-MS分析。分型結果依據分子量來判定，標準如下180，野生型為5335.5Da,突變型為5359.5Da;2(M，野生型為5868.9Da,突變型為5892.9Da;250，野生型為5985.9Da，突變型為6001.9Da;184，野生型為6037.0Da，突變型為6116.9Da。;險測結果如下樣本A4為臨床待測樣本。從圖中可以看出，通過這一次反應，實現了4個位點同時4全測(圖4A)。其中檢測到180位點為野生型，分子量為5335.5Da(圖4B);204位點為野生型，分子量為5868.9Da(圖4C);250位點為野生型，分子量為5985.9Da(圖4D);184位點為突變型，分子量為6116.9Da(圖4E)。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。權利要求1、一種核苷酸突變位點的檢測方法，包括如下步驟(1)針對待檢核苷酸序列可能存在的突變位點，並確定突變位點在待檢序列中的位置；(2)根據突變位點的位置，設計3條引物，其中，一對為擴增引物，每條引物長度至少30bp，其5』端各含10bp的tag；另一條為延伸引物，長度為17-28bp，正好位於突變位點的5』端；(3)通過PCR擴增，獲得含有所述突變位點的靶序列擴增產物；(4)通過SAP酶處理，除去所述擴增產物中含有的dNTPs；(5)通過延伸反應，在延伸引物的3』端連接一個鹼基，且該鹼基正好與突變位點上的鹼基互補，延伸反應所使用的原料是以擴大分子量差異為目的進行過質量修飾的四種ddNTP分子；(6)採用樹脂純化延伸反應產物；(7)將純化後的產物與晶片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然後用瞬時納秒強雷射激發進行質譜檢測，確定突變的基因型。2、如權利要求1所述的核苷酸突變位點的檢測方法，其特徵在於，所述靶序列擴增產物長度為80-120bp。3、如權利要求1所述的核苷酸突變位點的檢測方法，其特徵在於，所述經過質量修飾的四種ddNTP的分子量分別是ddATP271.2Da,ddTTP327.1Da,ddCTP247.2Da，ddGTP287.2Da。4、如權利要求1所述的核苷酸突變位點的檢測方法，其特徵在於，所述步驟(2)還包括按照引物間，引物與擴增產物間不形成二聚體、髮夾結構，以及不發生錯配的原則，將多個檢測位點的擴增引物與擴增引物混合，延伸引物與延伸引物混合。5、如權利要求1所述的核苷酸突變位點的檢測方法，其特徵在於，待檢測核苷酸突變位點為連續多個，該連續多個突變位點標記在同一條核苷酸序列上，且共用一對擴增引物，兩端的突變位點採取向左右兩側設計，左側突變位點的延伸引物採取正向設計，右側突變位點的延伸引物釆取反向設計；位於中間的突變位點的延伸引物有多條，且包含其上遊的突變位點可能存在的所有核苷酸情況。6、如權利要求5所述的核苷酸突變位點的檢測方法，其特徵在於，擴增產物的長度為100-350bp。7、如權利要求5所述的核苷酸突變位點的檢測方法，其特徵在於，若所述左側突變位點Snpl,中間的突變位點為Snp2,右側突變位點為S叩3，Snpl/S叩2/Snp3所在序列為S叩1[C/T]，右側SNP位點，正向設計，延伸引物為......TCAGCGATATS叩3[T/G]，左側SNP位點，反向設計，延伸引物為......TACGAATTSnp2[G/A],中間SNP位點，兼併引物，延伸引物為……AGCGATATCC和......AGCGATATTC。'8、如權利要求17任一項所述的核苷酸突變位點的檢測方法，其特徵在於，所述質譜儀為基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜儀。全文摘要本發明提供了一種核苷酸突變位點的檢測方法，包括如下步驟(1)確定突變位點在待檢序列中的位置；(2)根據突變位點的位置，設計引物；(3)PCR擴增；(4)SAP酶處理，除去所述擴增產物中含有的dNTPs；(5)延伸反應，在延伸引物的3』端連接一個鹼基；(6)採用樹脂純化延伸反應產物；(7)將純化後的產物與晶片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然後用瞬時納秒強雷射激發進行質譜檢測，確定突變的基因型。本發明解決了現有核苷酸突變位點的檢測方法靈敏度低、準確性低的問題。文檔編號C12Q1/68GK101440407SQ20081021834公開日2009年5月27日申請日期2008年12月12日優先權日2008年12月12日發明者平吳,爽喻,李晶晶,玲楊,威王,清韋,揚高申請人:深圳華大基因科技有限公司