一種低pH條件下抑菌複合微生物製劑的製作方法
2023-10-08 11:41:39
本發明屬於微生物技術領域，尤其涉及一種低pH條件下抑菌複合微生物製劑。
背景技術：
潰瘍性結腸炎(UC)、隱窩炎和羅恩氏病是炎性腸病(IBD)的主要類型，所述炎性腸病的特徵在於腸中的慢性炎症。臨床症狀是腹瀉、腹痛、偶然性直腸出血、體重減輕、疲倦和有時發熱。儘管會發生在任何年齡，IBD最常見於青少年和年輕的成年人中，所以這些人可能遭受延遲的發育和矮化的生長。資料顯示，每年美國UC患病率為200/10萬人，治療UC的花費在1至1.5億美元左右，截止到2012年，UC患者總數是2000年的2.5倍，且復發率達72％；近年來我國UC的患病人數呈明顯上升趨勢。
在醫學上，通過減少炎症並從而控制胃腸道徵狀來治療IBD。但是，目前尚不能在醫學上治癒IBD。IBD的臨床進程有很大差異，具有輕度至中度徵狀的患者無需住院治療，但是，10-15％的患者會發生該疾病的嚴重進程，其在許多情況下繼之以外科手術，結腸切除術可以消除UC，但是會降低生活質量和增加併發症的風險。
用於治療IBS的藥物已經獲得普及，儘管它們在臨床試驗中的效力是不大的，並且它們的臨床實用性受到不利副作用的限制，可利用的藥物包括：使用5-對氨水楊酸(5-ASA)、皮質類固醇和免疫調節藥物。通常使用5-ASA進行輕度至中度IBD徵狀的長期治療，而皮質類固醇和免疫調節藥物被用於治療嚴重的徵狀；腹瀉或腹痛作為5-ASA的副作用而出現，而皮質類固醇的長期使用經常顯示出嚴重的副作用，包括骨質減輕、感染、糖尿病、肌肉消瘦和精神病學障礙；免疫調節藥物會抑制免疫系統，這會控制IBD徵狀。但是，產生的免疫受損的狀態會使患者易感許多疾病。血清素能性藥劑已經表現出對IBS的總體徵狀的效力，但是，最近關於安全性的憂慮已經嚴重地限制了它們的應用。
益生菌被定義為「活的微生物，其在以特定數目攝入以後，會發揮超出固有的基礎營養以外的健康益處」(Araya M.等人,2002；Guarner F.等人,1998)。來自雙歧桿菌屬的幾種乳酸細菌和種是益生菌，這暗示，已經證實它們會促進特定健康效應。益生細菌必須滿足與沒有毒性、生存力、附著和有益效果有關的幾個要求。然而，現有益生菌對治療腸炎效果不佳。
技術實現要素：
發明目的：本發明的第一目的在於提供一種低pH條件下抑菌複合微生物製劑。
本發明的第二目的在於提供上述複合微生物製劑在製備抗菌藥物中的應用。
本發明的第三目的在於提供上述複合微生物製劑在製備治療胃腸道疾病藥物中的應用。
本發明的第四目的在於提供上述複合微生物製劑在製備治療腸炎藥物中的應用。
技術方案：為了解決上述技術問題，本發明所採用的技術方案為：一種低pH條件下抑菌複合微生物製劑，包括羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08；所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02，保藏在中國典型培養物保藏中心，，保藏單位地址：湖北省武漢市武昌區武漢大學，郵政編碼為430072，保藏編號為：CCTCC No.M 2016546，保藏日期為2016年10月10日；所述鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08，保藏在中國典型培養物保藏中心，，保藏單位地址：湖北省武漢市武昌區武漢大學，郵政編碼為430072，保藏編號為：CCTCC NO.M 2016548，保藏日期為2016年10月10日。
優選地，所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的質量比為(1-1.5)：1，優選1.2:1。
羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的生理活性特徵如下：
所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02在MRS培養基平板上菌落較小，乳白色，直徑1-2mm，表面平滑，邊緣較規則。
所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02菌體為杆狀，革蘭氏染色陽性，不形成芽孢，產生乳酸，兼性厭氧。
羅伊氏乳桿菌的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。將所測16SrDNA序列通過BLAST比對，鑑定其為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)。
鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的生理活性特徵如下：
所述鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08在MRS培養基平板上菌落較小，乳白色，直徑1-2mm，表面平滑，邊緣較規則。
所述鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08菌體為杆狀，革蘭氏染色陽性，不形成芽孢，產生乳酸，兼性厭氧。
鼠李糖乳桿菌的16SrDNA序列如SEQ ID No.2所示。將所測16SrDNA序列通過BLAST比對，鑑定其為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。
所述的複合微生物製劑是在製備抗菌藥物中的應用。
所述的複合微生物製劑是在製備治療胃腸道疾病藥物中的應用。
所述的複合微生物製劑是在製備治療腸炎藥物中的應用。
有益效果：與現有技術相比，本發明的優點是：
(1)本發明提供的複合微生物製劑對多種病原菌具有抑制作用；對病原菌的作用方式多樣化；繁殖速度快；能夠人工培養，易於操作，便於生產應用；抗逆能力強等優點。
(2)本發明提供的複合微生物製劑培養條件簡單、發酵時間短、容易保存，適於工業化生產，具有良好的開發應用前景。
附圖說明
圖1為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的菌落圖。
圖2為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的菌落放大圖。
圖3為菌種第一批次功能性評價生長曲線。
圖4為菌種第二批次功能性評價生長曲線。
圖5為菌株耐酸實驗結果圖。
圖6為乳酸菌數量與腸炎小鼠的體重關係曲線。
圖7為乳酸菌數量與腸炎小鼠的結腸長度關係曲線。
圖8為治療前後腸炎小鼠切片圖。
圖9為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的菌落圖。
圖10為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的菌落放大圖。
圖11為菌種第一批次功能性評價生長曲線。
圖12為菌種第二批次功能性評價生長曲線。
圖13為菌株耐酸實驗結果圖。
圖14為鼠李糖乳桿菌數量與腸炎小鼠的體重關係曲線。
圖15為鼠李糖乳桿菌數量與腸炎小鼠的結腸長度關係曲線。
圖16為治療前後腸炎小鼠切片圖。
圖17為鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02混合培養液抑菌效果圖。
具體實施方式
下面結合實驗例詳細闡述本發明的應用。
實施例1
羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的分離
1、菌種和培養基和培養條件
(1)菌源
來自中國某軍區健康士兵糞便。
(2)培養基
平板培養基：1000mL蒸餾水，蛋白腖10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三銨2g，半胱氨酸0.5g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，吐溫1ml，瓊脂粉15-20g，pH5.5-6.5。
2、菌株的分離和鑑定
(1)菌株的分離
預先經滅菌處理後的手套箱中取適量新鮮糞便置於盛裝有無菌培養基的無菌試管中，充分震蕩渦旋混勻；
以上述充分震蕩渦旋混勻的糞便溶液為原液，做十倍梯度稀釋至合適梯度，取100μl均勻塗布於MRS+0.05％半胱氨酸固體平板培養基上，隨後取出置於厭氧罐中，37℃厭氧培養過夜。
次日可見平板上長有形態大小各異的菌落，結合羅伊氏乳桿菌典型菌落形態特徵，挑取若干有代表性的菌落作二代劃線純化處理，平板厭氧活化1天，得培養物，隨後做菌株鑑定。
(2)菌株的鑑定
革蘭氏染色形態學鑑定：
a、塗片：取滅過菌的載玻片於實驗臺上，在玻片上用記號筆做記號，便於觀察，隨後將玻片倒置，然後用移液器吸取10μl無菌生理鹽水均勻塗布在記號處，繼而用移液槍挑取純培養物均勻溶於生理鹽水中，塗布面不宜過大。
b、乾燥：將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。
c、固定：固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰處儘快的來回通過2-3次，共約2-3秒種，並不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜(不超過60℃)，放置待冷後，進行染色。
d、初染：在塗片薄膜上滴加草酸銨結晶紫1-2滴，使染色液覆蓋塗片，染色約1min。
e、水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流衝洗，直至洗下的水呈無色為止。
f、媒染：用100-1000ul移液槍吸取約300ul碘液滴在塗片薄膜上，使染色液覆蓋塗片，染色約1min。
g、水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流衝洗，直至洗下的水呈無色為止。
h、脫色：斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現紫色為止，大約需時20-30S，隨即水洗。
i、復染：在塗片薄膜上滴加沙黃染液1-2滴，使染色液覆蓋塗片，染色約1min。
j、水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流衝洗，直至洗下的水呈無色為止。
k、乾燥、觀察：用吸水紙吸掉水滴，待標本片幹後置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發現目的物後滴一滴浸油在玻片上，用油鏡觀察細菌的形態及顏色，紫色的是革蘭氏陽性菌，紅色的是革蘭氏陰性菌。
結果顯示：該菌株為革蘭氏陽性菌。
16S rRNA序列的測定：
16S rRNA基因的PCR擴增使用的引物是一般細菌的引物——8F(5′-CACGGATCCAGAGTTTGAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG-3′)和1510R(5′-GTGAAGCTTAGGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′)產物委託有資質的第三方實驗室進行sanger測序。應用BLAST算法在GenBank資料庫中把序列和16S rRNA基因進行比較，應用MEGA 4.0程序建立鄰接樹。
BLAST分析表明TR02菌十分接近羅伊氏乳桿菌(99％親緣性)。
羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的評價
(一)菌種功能性評價
A.生長曲線及各監測點pH值的測定
1.標記
取11支無菌大試管，用記號筆分別標明培養時間，即0、2、4、6、8、24h。
2.接種
分別用5mL無菌吸管吸取2.5mL TR02過夜培養液(培養8-16h)轉入盛有50mLMRS+0.05％半胱氨酸培養液的三角瓶內，混合均勻後分別取5mL混合液放入上述標記的11支無菌大試管中。
3.培養
將已接種的試管置37℃培養箱中靜置培養，分別培養0、2、4、6、8、24h，將標有相應時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最後一同比濁測定其光密度值。
4.比濁測定
用未接種的MRS+0.05％半胱氨酸培養基作空白對照，選用600nm波長進行光電比濁測定，從早取出的培養液開始依次測定，對細胞密度大的培養液用MRS+0.05％半胱氨酸液體培養基適當稀釋後測定，使其光密度值再0.1～0.65之內(測定OD值前，將待測定的培養液振蕩，使細胞均勻分布)。
5.pH值的測定
剩餘培養液測定pH值。
B.顯微鏡直接計數
1.菌懸液製備
以無菌生理鹽水將培養液製成濃度適當的菌懸液。
2.鏡檢技術室
在加樣前，先對計數板的技術室進行鏡檢，若有汙物，則需清洗，吹乾後才能進行計數。
3.加樣品
將清潔乾燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的培養液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入技術室，一般技術室均能充滿菌液。
取樣時先要搖勻菌液；加樣時技術室不可有氣泡產生。
4.顯微鏡計數
加樣後靜止5min，然後將血細胞計數板置於顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到技術室所在位置，然後換成高倍鏡進行計數。
調節顯微鏡光線的強弱適當，對於用反光鏡採光的顯微鏡還要注意不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚技術室方格線，或只見豎線或只見橫線。
在計數前若發現菌液太濃或太稀，需重新調節稀釋度後再計數，一般樣品稀釋度要求每小格內約有5～10個菌體為宜。每個技術室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數。位于格線上的菌體一般只數上方和右邊線上的。計數一個樣品要從兩個技術室中計得的平均值來計算樣品的含菌量。
5.清洗血細胞計數板
使用完畢後，將血細胞計數板在水龍頭上用水衝洗乾淨，切勿用硬物刷洗，洗完後自行晾乾或用吹風機吹乾。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉澱物。若不乾淨，則必須重複洗滌至乾淨為止。
兩批次菌種功能性評價結果平行性較好(見表1、表2、圖3和圖4)，生長曲線結果表明TR02菌在0～4h內處於適應期，4～8h內處於對數生長期，8～12h處於平臺期，12h後即進入衰退期；pH曲線與生長曲線呈既截然相反的態勢，培養終點pH為4.44。
終點培養液經顯微計數結果為3.54×108cfu/ml。
表1批次一菌種功能性評價
表2批次二菌種功能性評價
(二)菌株耐酸實驗
將供試菌株接種於MRS+0.05％半胱氨酸鹽酸鹽液體培養基中，活化培養24h，以5％的接種量加入到兩份用鹽酸調pH為2.5和6.2的MRS培養基中(pH為6.2的培養基為空白對照)。第一份用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取稀釋液100μL接種到MRS平板塗板，置於37℃，培養48h，進行菌落計數。第二份37℃處理3h後，再用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取稀釋液100μL接種到MRS平板塗板，置於37℃培養48h，進行菌落計數，即3h的活菌數，並計算出乳酸菌的存活率：存活率(％)＝(3h的活菌數/0h的活菌數)×100。
由表3和圖5可見，TR02在pH6.5及pH4.5環境下培養3h未見顯著影響，而在pH3.0條件下生長受到影響，表明pH4.5環境下TR02可以耐受。
表3菌株耐酸試驗結果
羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02的體內實驗
1.結腸炎的誘導與治療
用含2.5％DSS(分子量36-50KDa)的溶液飼餵C57BL/6型小鼠(1-7天)，以誘導結腸炎模型小鼠；對照組則飼餵水。在隨後的10天內，分別口服水、乳酸菌(包埋0.9*109、1.2*109、2.4*109，未包埋2.4*109)和柳氮黃胺吡啶(0.5g/kg)。
每天稱量體重，觀察小鼠糞便粘稠度及糞便中和肛門處是否有血。計算疾病活動指數(DAI)。簡言之，通過以下參數進行計算：
a)腹瀉(0分＝正常，2分＝輕便糞便，4分＝水性腹瀉)；
b)血膽量(0分＝沒有出血，2，輕微出血，4分，大出血)。
在誘導結腸炎後第10天，處死動物，取出結腸，並製備結腸組織片用於離體分析。為了進行組織學分析，將結腸的一部分在10％的福馬林中固定，並包埋在石蠟中。根據標準方案用H&E對切片染色。
H&E染色的結腸切片的組織學評價如下分級：0，無炎症跡象；1.低白細胞浸潤；2.中度白細胞浸潤；3.高白細胞浸潤，中度纖維化，高血管密度，結腸壁增厚，中度杯 狀細胞損失和隱窩的病灶損失和4.透壁浸潤，杯狀細胞的大量損失，廣泛的纖維化和隱窩的瀰漫性損失。組織學評分由病理學家進行。
由圖6、7、8可見，隨著乳酸菌數量的增加對腸炎小鼠的體重有明顯的改善作用，對腸炎小鼠的結腸長度有明顯的改善作用，腸炎小鼠與正常小鼠的切片比較，杯狀細胞逐漸減少，炎性細胞逐漸增加。
實施例2
鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的分離
1、菌種和培養基和培養條件
(1)菌源
來自中國某軍區健康士兵糞便
(2)培養基
平板培養基：1000mL蒸餾水，蛋白腖10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三銨2g，半胱氨酸0.5g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，吐溫1ml，瓊脂粉15-20g，pH5.5-6.5。
2、菌株的分離和鑑定
(1)菌株的分離
預先經滅菌處理後的手套箱中取適量新鮮糞便置於盛裝有無菌培養基的無菌試管中，充分震蕩渦旋混勻；
以上述充分震蕩渦旋混勻的糞便溶液為原液，做十倍梯度稀釋至合適梯度，取100μl均勻塗布於MRS+0.05％半胱氨酸固體平板培養基上，隨後取出置於厭氧罐中，37℃厭氧培養過夜。
次日可見平板上長有形態大小各異的菌落，結合乳桿菌典型菌落形態特徵，挑取若干有代表性的菌落作二代劃線純化處理，平板厭氧活化1天，得培養物，隨後做菌株鑑定。
(2)菌株的鑑定
革蘭氏染色形態學鑑定：
a、塗片：取滅過菌的載玻片於實驗臺上，在玻片上用記號筆做記號，便於觀察，隨後將玻片倒置，然後用移液器吸取10μl無菌生理鹽水均勻塗布在記號處，繼而用移液槍挑取純培養物均勻溶於生理鹽水中，塗布面不宜過大。
b、乾燥：將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。
c、固定：固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰處儘快的來回通過2-3次，共約2-3秒種，並不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜(不超過60℃)，放置待冷後，進行染色。
d、初染：在塗片薄膜上滴加草酸銨結晶紫1-2滴，使染色液覆蓋塗片，染色約1min。
e、水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流衝洗，直至洗下的水呈無色為止。
f、媒染：用100-1000ul移液槍吸取約300ul碘液滴在塗片薄膜上，使染色液覆蓋塗片，染色約1min。
g、水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流衝洗，直至洗下的水呈無色為止。
h、脫色：斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現紫色為止，大約需時20-30S，隨即水洗。
i、復染：在塗片薄膜上滴加沙黃染液1-2滴，使染色液覆蓋塗片，染色約1min。
j、水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流衝洗，直至洗下的水呈無色為止。
k、乾燥、觀察：用吸水紙吸掉水滴，待標本片幹後置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發現目的物後滴一滴浸油在玻片上，用油鏡觀察細菌的形態及顏色，紫色的是革蘭氏陽性菌，紅色的是革蘭氏陰性菌。
結果顯示：該菌株為革蘭氏陽性菌。
16S rRNA序列的測定：
16S rRNA基因的PCR擴增使用的引物是一般細菌的引物——8F(5′-CACGGATCCAGAGTTTGAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG-3′)和1510R(5′-GTGAAGCTTAGGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′)產物委託有資質的第三方實驗室進行sanger測序。應用BLAST算法在GenBank資料庫中把序列和16S rRNA基因進行比較，應用MEGA 4.0程序建立鄰接樹。
BLAST分析表明TR02菌十分接近鼠李糖乳桿菌(99％親緣性)。
鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的評價
(一)菌種功能性評價
A.生長曲線及各監測點pH值的測定
6.標記
取11支無菌大試管，用記號筆分別標明培養時間，即0、2、4、6、8、24h。
7.接種
分別用5mL無菌吸管吸取2.5mL TR02過夜培養液(培養8-16h)轉入盛有50mL MRS+0.05％半胱氨酸培養液的三角瓶內，混合均勻後分別取5mL混合液放入上述標記的11支無菌大試管中。
8.培養
將已接種的試管置37℃培養箱中靜置培養，分別培養0、2、4、6、8、24，將標有相應時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最後一同比濁測定其光密度值。
9.比濁測定
用未接種的MRS+0.05％半胱氨酸培養基作空白對照，選用600nm波長進行光電比濁測定，從早取出的培養液開始依次測定，對細胞密度大的培養液用MRS+0.05％半胱氨酸液體培養基適當稀釋後測定，使其光密度值再0.1～0.65之內(測定OD值前，將待測定的培養液振蕩，使細胞均勻分布)。
10.pH值的測定
剩餘培養液測定pH值。
B.顯微鏡直接計數
6.菌懸液製備
以無菌生理鹽水將培養液製成濃度適當的菌懸液。
7.鏡檢技術室
在加樣前，先對計數板的技術室進行鏡檢，若有汙物，則需清洗，吹乾後才能進行計數。
8.加樣品
將清潔乾燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的培養液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入技術室，一般技術室均能充滿菌液。
取樣時先要搖勻菌液；加樣時技術室不可有氣泡產生。
9.顯微鏡計數
加樣後靜止5min，然後將血細胞計數板置於顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到技術室所在位置，然後換成高倍鏡進行計數。
調節顯微鏡光線的強弱適當，對於用反光鏡採光的顯微鏡還要注意不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚技術室方格線，或只見豎線或只見橫線。
在計數前若發現菌液太濃或太稀，需重新調節稀釋度後再計數，一般樣品稀釋度要求每小格內約有5～10個菌體為宜。每個技術室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數。位于格線上的菌體一般只數上方和右邊線上的。計數一個樣品要從兩個技術室中計得的平均值來計算樣品的含菌量。
10.清洗血細胞計數板
使用完畢後，將血細胞計數板在水龍頭上用水衝洗乾淨，切勿用硬物刷洗，洗完後自行晾乾或用吹風機吹乾。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉澱物。若不乾淨，則必須重複洗滌至乾淨為止。
兩批次菌種功能性評價結果平行性較好(見表4、表5、圖11和圖12)，生長曲線結果表明TR02菌在0～4h內處於適應期，4～8h內處於對數生長期，8～12h處於平臺期，12h後即進入衰退期；pH曲線與生長曲線呈既截然相反的態勢，培養終點pH為4.44。
終點培養液經顯微計數結果為3.54×108cfu/ml。
表4批次一菌種功能性評價
表5批次二菌種功能性評價
(二)菌株耐酸實驗
將供試菌株接種於MRS+0.05％半胱氨酸鹽酸鹽液體培養基中，活化培養24h，以5％的接種量加入到兩份用鹽酸調pH為2.5和6.2的MRS培養基中(pH為6.2的培養基為空白對照)，第一份用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取稀釋液100μL接種到MRS平板塗板，置於37℃，培養48h，進行菌落計數。第二份37℃處理3h後，再用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取稀釋液100μL接種到MRS平板塗板，置於37℃培養48h，進行菌落計數，即3h的活菌數，並計算出乳酸菌的存活率。存活率(％)＝(3h的活菌數/0h的活菌數)×100。
由表6和圖13可見，TR02在pH6.5及pH4.5環境下培養3h未見顯著影響，而在pH3.0條件下生長受到影響，表明pH4.5環境下TR02可以耐受。
表6菌株耐酸試驗結果
鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08體內實驗
1.結腸炎的誘導與治療
用含2.5％DSS(分子量36-50KDa)的溶液飼餵C57BL/6型小鼠(1-7天)，以誘導結腸炎模型小鼠；對照組則飼餵水。在隨後的10天內，分別口服水、乳酸菌(包埋0.9*109、1.2*109、2.4*109，未包埋2.4*109)和柳氮黃胺吡啶(0.5g/kg)。
每天稱量體重，觀察小鼠糞便粘稠度及糞便中和肛門處是否有血。計算疾病活動指 數(DAI)。簡言之，通過以下參數進行計算：
a)腹瀉(0分＝正常，2分＝輕便糞便，4分＝水性腹瀉)；
b)血膽量(0分＝沒有出血，2，輕微出血，4分，大出血)。
在誘導結腸炎後第10天，處死動物，取出結腸，並製備結腸組織片用於離體分析。為了進行組織學分析，將結腸的一部分在10％的福馬林中固定，並包埋在石蠟中。根據標準方案用H&E對切片染色。
H&E染色的結腸切片的組織學評價如下分級：0，無炎症跡象；1.低白細胞浸潤；2.中度白細胞浸潤；3.高白細胞浸潤，中度纖維化，高血管密度，結腸壁增厚，中度杯狀細胞損失和隱窩的病灶損失和4.透壁浸潤，杯狀細胞的大量損失，廣泛的纖維化和隱窩的瀰漫性損失。組織學評分由病理學家進行。
由圖14、15、16可見，隨著乳酸菌數量的增加對腸炎小鼠的體重有明顯的改善作用，對腸炎小鼠的結腸長度有明顯的改善作用，腸炎小鼠與正常小鼠的切片比較，杯狀細胞逐漸減少，炎性細胞逐漸增加。
實施例3抑菌功效
將鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02與白念珠菌培養液混合培養，所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的質量比為1.2:1，分別測定0、6、9、12、24h的OD值與pH值，如圖17所示，鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02對白念珠菌有明顯的抑菌效果，且能明顯降低環境的pH值。
實施例4抑菌功效
將鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02與白念珠菌培養液混合培養，所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)TR08的質量比為1.5:1，分別測定0、6、9、12、24h的OD值與pH值，結果顯示：鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02對白念珠菌有明顯的抑菌效果，且能明顯降低環境的pH值。
實施例5抑菌功效
將鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02與白念珠菌培養液混合培養，所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)TR02和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus) TR08的質量比為1.0:1，分別測定0、6、9、12、24h的OD值與pH值，結果顯示：鼠李糖乳桿菌TR08與羅伊氏乳桿菌TR02對白念珠菌有明顯的抑菌效果，且能明顯降低環境的pH值。
SEQUENCE LISTING
天益健康科學研究院（鎮江）有限公司
一種低pH條件下抑菌複合微生物製劑
SC20161025001
2
PatentIn version 3.3
1
1490
DNA
Lactobacillus reuteri
misc_feature
(1)..(1490)
1
gggtacgcgg cggtgtgcta tacatgcaag tcgtacgcac tggcccaact gattgatggt 60
gcttgcacct gattgacgat ggattaccag tgagtggcgg acgggtgagt aacacgtagg 120
taacctgccc cggagcgggg gataacattt ggaaacagat gctaataccg cataacaaca 180
aaagccacat ggcttttgtt tgaaagatgg ctttggctat cactctggga tggacctgcg 240
gtgcattagc tagttggtaa ggtaacggct taccaaggcg atgatgcata gccgagttga 300
gagactgatc ggccacaatg gaactgagac acggtccata ctcctacggg aggcagcagt 360
agggaatctt ccacaatggg cgcaagcctg atggagcaac accgcgtgag tgaagaaggg 420
tttcggctcg taaagctctg ttgttggaga agaacgtgcg tgagagtaac tgttcacgca 480
gtgacggtat ccaaccagaa agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 540
aggtggcaag cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttgcttaggt 600
ctgatgtgaa agccttcggc ttaaccgaag aagtgcatcg gaaaccgggc gacttgagtg 660
cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata tggaagaaca 720
ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgca actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag 780
cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta ggtgttggag 840
ggtttccgcc cttcagtgcc ggagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc 900
gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960
aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cttgcgctaa ccttagagat 1020
aaggcgttcc cttcggggac gcaatgacag gtggtgcatg gtcgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg ttactagttg ccagcattaa 1140
gttgggcact ctagtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga cgacgtcaga 1200
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacggta caacgagtcg 1260
caagctcgcg agagtaagct aatctcttaa agccgttctc agttcggact gtaggctgca 1320
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gtggcctaac ctttatggag ggagccgcct aaggcggaca gagactgggt 1490
2
1474
DNA
Lactobacillus rhamnosus
misc_feature
(1)..(1474)
2
cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gaacgagttc tgattattga aaggtgcttg 60
catcttgatt taattttgaa cgaatggcgg aagggtgaat aacccgtggg taacctggcc 120
ttaaatgggg gataaccttt ggaaaccgaa gctaataccg cataaatccc aaaaccgcat 180
ggttcttggc tgaaagatgg ggtaaactat cccttttgga tggacccccg gcgtattaac 240
ttgttggtga ggtaacggct ccaccaggga atgataccta acccaactga aaggttgatc 300
ggccaccttg ggactgagac ccggcccaaa ctcctaccgg agggagcaat agggaatctt 360
ccccaatgga cgccagtctg aaggaacaac cccccgtggg tgaaaaaggg tttccggtcc 420
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ccaacccgaa agccacggct aactacctgc ccagcaccgc ggtaataccg aggtggcaag 540
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tagataccct gggagtccat gccgtaacga tgaatgctag tggtggaagg tttccgccct 840
tcaatgccga gcttacgcaa taagcaatcc gcctggggga atacgaccgg caggttgaaa 900
cttcaaagaa tttgaccggg gccgcacaag ccggtggagc attgtggttt aattcgaagc 960
acgcgaagaa cttaccaggt cttgacatct tttgatcact tgaagatcaa gtttcccttc 1020
gggcaaatga cagtggtgca tggttgtcgt cagctccgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080
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gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200
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acaccgcccg tcacaccatg agagtttgta acacccgaag ccggtggcgt aaccctttta 1440
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