一種用於防治動物腹瀉的微生物製劑及其製備方法與流程
2023-10-08 11:35:09 1
本發明涉及生物製劑領域，特別涉及一種用於防治動物腹瀉的微生物製劑及其製備方法。
背景技術：
目前，隨著微生物耐藥性的日趨嚴峻，耐藥菌及其耐藥譜的快速遞增，多重耐藥菌及超級耐藥菌成為現代醫學中的一個棘手問題，尋找新的有效且無毒副作用的抗菌製劑成為治療微生物感染性疾病迫切需要解決的問題。
噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌、螺旋體等微生物的病毒，對宿主菌具有高度的專一性。根據其侵染宿主菌後的狀態和結果，噬菌體分為兩種類型，其中一種能在宿主菌細胞內複製增殖，產生許多子代噬菌體，並最終裂解細菌，稱為烈性或毒性噬菌體。毒性噬菌體侵染細菌後，能在細菌中增殖並殺死細菌，而對動植物沒有毒性。因此，毒性噬菌體以其特有的自然特徵，被期待成為較好的抗菌藥。然而，裸露的噬菌體很容易被胃液等機體抗性因子滅活，而被宿主菌保護的噬菌體，因為噬菌體已經侵入宿主菌，必需首先破壞細菌，方能進一步破壞噬菌體。因此，受宿主菌保護的噬菌體比單純噬菌體抵抗力更強。只有有效的保持噬菌體的抗菌活性，減少機體抵抗力對噬菌體抗菌效力的削減，才能使噬菌體真正走向臨床應用。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題在於，提供一種用於防治動物腹瀉的微生物製劑及其製備方法，所述微生物製劑中的噬菌體突破機體免疫屏障，可以預防和治療機體內相應原核和真核細胞型微生物所致的感染性腸道疾病。
本發明所要解決的技術問題還在於，提供一種用於防治動物腹瀉的微生物製劑及其製備方法，可以預防和治療過敏性腹瀉。
本發明所要解決的技術問題還在於，提供一種用於防治動物腹瀉的微生物製劑及其製備方法，能減緩動物源性耐藥菌的產生。
為達到上述技術效果，本發明提供了一種用於防治動物腹瀉的微生物製劑，其由下述以重量份計的原料製成：蒙脫石複合物4-10份、噬菌體液0.1-3份、嗜酸乳桿菌粉0.5-5份、糞鏈球菌粉0.1-3份，
其中，蒙脫石複合物由下述方法製得：
將60-80%蒙脫石納米粉、10-30%甘草和5-15%石榴皮加水混合，煮沸0.5-2小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度小於56℃，乾燥後的混合物的水分含量低於12%，最後將混合物磨成粉末狀。
優選地，微生物製劑由下述以重量份計的原料製成：蒙脫石複合物5-8份、噬菌體0.5-2份、嗜酸乳桿菌粉1-3份、糞鏈球菌粉0.5-2份。
優選地，微生物製劑由下述以重量份計的原料製成：蒙脫石複合物6份、噬菌體1份、嗜酸乳桿菌粉2份、糞鏈球菌粉1份。
優選地，所述蒙脫石複合物由下述方法製得：
將65-75%蒙脫石納米粉、15-25%甘草和8-12%石榴皮加水混合，煮沸0.5-1.5小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度小於56℃，乾燥後的混合物的水分含量低於10%，最後將混合物磨成粉末狀。
優選地，所述蒙脫石複合物由下述方法製得：
將70%蒙脫石納米粉、20%甘草和10%石榴皮加水混合，煮沸0.8-1.2小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度小於56℃，乾燥後的混合物的水分含量低於10%，最後將混合物磨成粉末狀。
優選地，所述噬菌體液由下述方法製得：
將過濾得到的純化腸道病原菌烈性噬菌體液裡加入15-25%甘油鹽水，充分搖勻。
優選地，所述嗜酸乳桿菌粉由下述方法製得：
分離培養篩選嗜酸乳桿菌菌種，選用液體培養基純培養篩選出的嗜酸乳桿菌菌種，然後在低於50℃溫度條件下進行高速離心，取沉澱物冷凍乾燥，得到嗜酸乳桿菌粉；
或者，分離培養篩選嗜酸乳桿菌菌種，選用固體培養基純培養篩選出的嗜酸乳桿菌菌種，然後在低於50℃溫度條件下攪拌粉碎，得到嗜酸乳桿菌粉。
優選地，所述糞鏈球菌粉由下述方法製得：
分離培養篩選糞鏈球菌菌種，選用液體培養基純培養篩選出的糞鏈球菌菌種，然後在低於50℃溫度條件下進行高速離心，取沉澱物冷凍乾燥，得到糞鏈球菌粉；
或者，分離培養篩選糞鏈球菌菌種，選用固體培養基純培養篩選出的糞鏈球菌菌種，然後在低於50℃溫度條件下攪拌粉碎，得到糞鏈球菌粉。
優選地，微生物製劑還包括黃連素和/或鈣劑，所述黃連素的添加量為2-5份，所述鈣劑的添加量為0.1-3份。
相應的，本發明還提供一種用於防治動物腹瀉的微生物製劑的製備方法，包括：
將蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮加水混合，煮沸0.5-2小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度小於56℃，乾燥後的混合物的水分含量低於12%，最後將混合物磨成粉末狀，得到蒙脫石複合物；
將過濾得到的純化腸道病原菌烈性噬菌體液裡加入甘油鹽水，充分搖勻，得到噬菌體液；
將所述蒙脫石複合物、所述噬菌體液、嗜酸乳桿菌粉、糞鏈球菌粉混合，攪拌均勻，即成成品。
實施本發明具有如下有益效果：
本發明提供一種用於防治動物腹瀉的微生物製劑，包括蒙脫石複合物4-10份、噬菌體液0.1-3份、嗜酸乳桿菌粉0.5-5份、糞鏈球菌粉0.1-3份。其中，蒙脫石複合物是由蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮製成，本複合物自身具有良好的防治腸道敏感等導致的水樣急性腹瀉的功效，且通過蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮的協同作用，尚可達到在培養液中富集噬菌體和在機體內保護噬菌體通過胃酸屏障的功效，所述噬菌體突破機體免疫屏障，可以預防和治療機體內相應原核和真核細胞型微生物所致的感染性疾病，且能減少動物抗菌藥物的使用，降低動物產品抗菌藥物殘留，減緩動物源性耐藥菌的產生，避免耐藥性細菌在動物間或動物與人之間傳播。
本發明還提供一種用於防治動物腹瀉的微生物製劑的製備方法，所述製備方法過程簡單，工藝簡單，操作簡單，成本低，生產效率高，可以廣泛應用。
具體實施方式
為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明作進一步地詳細描述。
本發明提供了一種用於防治動物腹瀉的微生物製劑，其由下述以重量份計的原料製成：蒙脫石複合物4-10份、噬菌體液0.1-3份、嗜酸乳桿菌粉0.5-5份、糞鏈球菌粉0.1-3份，其中，蒙脫石複合物由下述方法製得：將60-80%蒙脫石納米粉、10-30%甘草和5-15%石榴皮加水混合，煮沸0.5-2小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度小於56℃，乾燥後的混合物的水分含量低於12%，最後將混合物磨成粉末狀。
優選地，微生物製劑由下述以重量份計的原料製成：蒙脫石複合物5-8份、噬菌體0.5-2份、嗜酸乳桿菌粉1-3份、糞鏈球菌粉0.5-2份。所述蒙脫石複合物由下述方法製得：將65-75%蒙脫石納米粉、15-25%甘草和8-12%石榴皮加水混合，煮沸0.5-1.5小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度小於56℃，乾燥後的混合物的水分含量低於10%，最後將混合物磨成粉末狀。
更佳地，微生物製劑由下述以重量份計的原料製成：蒙脫石複合物6份、噬菌體1份、嗜酸乳桿菌粉2份、糞鏈球菌粉1份。所述蒙脫石複合物由下述方法製得：將70%蒙脫石納米粉、20%甘草和10%石榴皮加水混合，煮沸0.8-1.2小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度小於56℃，乾燥後的混合物的水分含量低於10%，最後將混合物磨成粉末狀。
本發明的蒙脫石複合物是由蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮製成，其中，甘草味甜，可以改善口感，且具有抗炎，抗過敏作用，對腸道過敏性腹瀉有一定的緩解作用；石榴皮具有收斂、抗菌、抗病毒和驅蟲作用，對腸道多種原因導致的腹瀉有一定的療效；蒙脫石納米粉（montmorillonite）又名微晶高嶺石或膠嶺石，是一種矽鋁酸鹽，其主要成分為八面體蒙脫石納米粉微粒。蒙脫石納米粉既有輔助抗腹瀉作用，又可以幫助製劑中的活性微生物保持活性通過胃酸屏障。具體的，蒙脫石納米粉直接吸附其他益生菌，包括蠟樣芽胞桿菌、雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌，這樣雙雙具有增效作用，蒙脫石納米粉吸附並保護益生菌，幫助其通過胃液屏障。
上述蒙脫石複合物配合噬菌體、嗜酸乳桿菌粉和糞鏈球菌粉，其中，噬菌體具有特異性殺菌作用，蒙脫石納米粉具有吸附噬菌體，並保護噬菌體通過胃酸屏障的功效。糞鏈球菌（Enterococcus faecalis）是革蘭氏陽性，過氧化氫陰性球菌，是人和動物腸道內主要菌群之一 ，其能產生天然抗生素，有利於機體健康 ；同時還能產生細菌素等抑菌物質，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長，改善腸道微環境；還能抑制腸道內產尿素酶細菌和腐敗菌的繁殖，減少腸道尿素酶和內毒素的含量，使血液中氨和內毒素的含量下降。嗜酸乳桿菌屬於乳桿菌屬，革蘭氏陽性桿菌，能調整腸道菌群平衡，抑制腸道不良微生物的增殖。嗜酸乳桿菌能分泌抗生物素類物質(嗜酸乳菌素(acidolin)、嗜酸桿菌素(acidophilin)、乳酸菌素(1aetocidon)), 對腸道致病菌產生的拮抗作用。
通過上述蒙脫石納米粉、甘草、石榴皮、噬菌體、嗜酸乳桿菌粉和糞鏈球菌粉的協同作用，本發明微生物製劑可以有效防禦和治療多種動物的腹瀉，包括豬、牛、羊、驢、貓、狗、兔子、青蛙、魚、章魚、海參、龜、海膽。且能減少動物抗菌藥物的使用，降低動物產品抗菌藥物殘留，減緩動物源性耐藥菌的產生，避免耐藥性細菌在動物間或動物與人之間傳播。
進一步，所述噬菌體液由下述方法製得：
將過濾得到的純化腸道病原菌烈性噬菌體液裡加入15-25%甘油鹽水，充分搖勻。由於噬菌體具有自我擴增循環放大特異性抗菌殺菌的功效，對正常菌群及正常細胞沒有殺滅作用，只要有少量的活性噬菌體進入體內，噬菌體即可主動追蹤相應病原菌，直至徹底清除。
需要說明的是，純化腸道病原菌烈性噬菌體液是指特異性裂解腸道病原菌，包括致病性大腸桿菌、痢疾桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、艱難梭菌、葡萄球菌。
所述嗜酸乳桿菌粉為市售或自製乳酸桿菌活菌乾粉：嗜酸乳桿菌為腸道益生菌，單獨和協同使用，均有改善腸道微生態環境，使腸道不利於病原菌生長的功效。
優選地，所述嗜酸乳桿菌粉由下述方法製得：
分離培養篩選嗜酸乳桿菌菌種，選用液體培養基純培養篩選出的嗜酸乳桿菌菌種，然後在低於50℃溫度條件下進行高速離心，取沉澱物冷凍乾燥，得到嗜酸乳桿菌粉；
或者，分離培養篩選嗜酸乳桿菌菌種，選用固體培養基純培養篩選出的嗜酸乳桿菌菌種，然後在低於50℃溫度條件下攪拌粉碎，得到嗜酸乳桿菌粉。
更佳地，所述嗜酸乳桿菌粉由下述方法製得：
分離培養篩選嗜酸乳桿菌菌種，選用液體培養基純培養篩選出的嗜酸乳桿菌菌種，然後在40-50℃溫度條件下進行高速離心，取沉澱物冷凍乾燥，得到嗜酸乳桿菌粉；
或者，分離培養篩選嗜酸乳桿菌菌種，選用固體培養基純培養篩選出的嗜酸乳桿菌菌種，然後在40-50℃溫度條件下攪拌粉碎，得到嗜酸乳桿菌粉。
所述糞鏈球菌粉為市售或自製糞鏈球菌活菌乾粉：糞鏈球菌同為腸道益生菌，且具有良好的抗腹瀉功效。單獨和協同使用，也有改善腸道微生態環境，使腸道不利於病原菌生長的功效。
優選地，所述糞鏈球菌粉由下述方法製得：
分離培養篩選糞鏈球菌菌種，選用液體培養基純培養篩選出的糞鏈球菌菌種，然後在低於50℃溫度條件下進行高速離心，取沉澱物冷凍乾燥，得到糞鏈球菌粉；
或者，分離培養篩選糞鏈球菌菌種，選用固體培養基純培養篩選出的糞鏈球菌菌種，然後在低於50℃溫度條件下攪拌粉碎，得到糞鏈球菌粉。
更佳地，所述糞鏈球菌粉由下述方法製得：
分離培養篩選糞鏈球菌菌種，選用液體培養基純培養篩選出的糞鏈球菌菌種，然後在40-50℃溫度條件下進行高速離心，取沉澱物冷凍乾燥，得到糞鏈球菌粉；
或者，分離培養篩選糞鏈球菌菌種，選用固體培養基純培養篩選出的糞鏈球菌菌種，然後在40-50℃溫度條件下攪拌粉碎，得到糞鏈球菌粉。
糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌的有效成分為5×105—9×105pfu/mL，才可以協同蒙脫石納米粉、甘草、石榴皮、噬菌體，從而有效防禦和治療多種動物的腹瀉，包括豬、牛、羊、驢、貓、狗、兔子、青蛙、魚、章魚、海參、龜、海膽。且能減少動物抗菌藥物的使用，降低動物產品抗菌藥物殘留，減緩動物源性耐藥菌的產生，避免耐藥性細菌在動物間或動物與人之間傳播。
作為本發明更佳的實施例，微生物製劑還包括黃連素和/或鈣劑，所述黃連素的添加量為2-5份，所述鈣劑的添加量為0.1-3份。
本發明添加鈣劑，具有以下優點：1、鈣可以中和胃酸，保護該組方中的活性微生物免受胃酸破壞，順利通過胃部到達腸道，發揮作用，達到預期效果。2、鈣可以為服用者補充鈣質，防治骨質疏鬆。
本發明添加黃連素，所述黃連素能對抗病原微生物，對多種細菌如痢疾桿菌、結核桿菌、肺炎球菌、傷寒桿菌及白喉桿菌等都有抑制作用，可以治療腹瀉。但是，黃連素同時對益生菌有抑制作用。為了保證本發明微生物製劑產生較理想的功效，保護益生菌不受影響，所述黃連素的添加量需控制在2-5份。若黃連素的添加量大於5份，則對製劑本身的益生菌有抑制作用；若黃連素的添加量小於2份，則可減少對製劑本身益生菌的影響，而對腸道病原菌保留有效的抗菌效果。
相應的，本發明還提供一種用於防治動物腹瀉的微生物製劑的製備方法，包括：
將蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮加水混合，蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮與水的比例為100:100-150，煮沸0.5-2小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度小於56℃，乾燥後的混合物的水分含量低於12%，最後將混合物磨成粉末狀，得到蒙脫石複合物；
將過濾得到的純化腸道病原菌烈性噬菌體液裡加入甘油鹽水，充分搖勻，得到噬菌體液；
將所述蒙脫石複合物、所述噬菌體液、嗜酸乳桿菌粉、糞鏈球菌粉混合，攪拌均勻，即成成品。
優選地，所述製備方法包括：
將蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮加水混合，煮沸0.5-2小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度小於56℃，乾燥後的混合物的水分含量低於12%，最後將混合物磨成粉末狀，得到蒙脫石複合物；
將過濾得到的純化腸道病原菌烈性噬菌體液裡加入甘油鹽水，充分搖勻，得到噬菌體液；
將所述蒙脫石複合物、所述噬菌體液、嗜酸乳桿菌粉、糞鏈球菌粉混合，攪拌均勻；
加入黃連素和/或鈣劑，混合均勻，即成成品。
下面以具體實施例進一步闡述本發明
實施例1
（一）配方：蒙脫石複合物4份、噬菌體液0.1份、嗜酸乳桿菌粉0.5份、糞鏈球菌粉0.1份，其中，蒙脫石複合物包括60%蒙脫石納米粉、30%甘草和10%石榴皮。
（二）製備方法：
將蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮加水混合，蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮與水的比例為100:100，煮沸0.5小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度為56℃，乾燥後的混合物的水分含量低於12%，最後將混合物磨成粉末狀，得到蒙脫石複合物；
將過濾得到的純化腸道病原菌烈性噬菌體液裡加入15%甘油鹽水，充分搖勻，得到噬菌體液；
將所述蒙脫石複合物、所述噬菌體液、嗜酸乳桿菌粉、糞鏈球菌粉混合，攪拌均勻，即成成品。
實施例2
（一）配方：蒙脫石複合物6份、噬菌體液1份、嗜酸乳桿菌粉1份、糞鏈球菌粉1份，其中，蒙脫石複合物包括70%蒙脫石納米粉、25%甘草和5%石榴皮。
（二）製備方法：
將蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮加水混合，蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮與水的比例為100:120，煮沸1小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度為54℃，乾燥後的混合物的水分含量低於11%，最後將混合物磨成粉末狀，得到蒙脫石複合物；
將過濾得到的純化腸道病原菌烈性噬菌體液裡加入20%甘油鹽水，充分搖勻，得到噬菌體液；
將所述蒙脫石複合物、所述噬菌體液、嗜酸乳桿菌粉、糞鏈球菌粉混合，攪拌均勻，即成成品。
實施例3
（一）配方：蒙脫石複合物8份、噬菌體液2份、嗜酸乳桿菌粉3份、糞鏈球菌粉2份，黃連素2份，鈣劑0.1份，其中，蒙脫石複合物包括75%蒙脫石納米粉、15%甘草和10%石榴皮。
（二）製備方法：
將蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮加水混合，蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮與水的比例為100:130，煮沸1.5小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度為55℃，乾燥後的混合物的水分含量低於10%，最後將混合物磨成粉末狀，得到蒙脫石複合物；
將過濾得到的純化腸道病原菌烈性噬菌體液裡加入20%甘油鹽水，充分搖勻，得到噬菌體液；
將所述蒙脫石複合物、所述噬菌體液、嗜酸乳桿菌粉、糞鏈球菌粉混合，攪拌均勻；
加入黃連素和鈣劑，混合均勻，即成成品。
實施例4
（一）配方：蒙脫石複合物7份、噬菌體液2份、嗜酸乳桿菌粉4份、糞鏈球菌粉2份，黃連素3份，鈣劑1份，其中，蒙脫石複合物包括75%蒙脫石納米粉、20%甘草和5%石榴皮。
（二）製備方法：
將蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮加水混合，蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮與水的比例為100:140，煮沸2小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度為52℃，乾燥後的混合物的水分含量低於12%，最後將混合物磨成粉末狀，得到蒙脫石複合物；
將過濾得到的純化腸道病原菌烈性噬菌體液裡加入22%甘油鹽水，充分搖勻，得到噬菌體液；
將所述蒙脫石複合物、所述噬菌體液、嗜酸乳桿菌粉、糞鏈球菌粉混合，攪拌均勻；
加入黃連素和鈣劑，混合均勻，即成成品。
實施例5
（一）配方：蒙脫石複合物10份、噬菌體液3份、嗜酸乳桿菌粉5份、糞鏈球菌粉3份，黃連素5份，鈣劑3份，其中，蒙脫石複合物包括80%蒙脫石納米粉、10%甘草和10%石榴皮。
（二）製備方法：
將蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮加水混合，蒙脫石納米粉、甘草和石榴皮與水的比例為100: 150，煮沸2小時，然後將混合物進行乾燥處理，乾燥溫度為50℃，乾燥後的混合物的水分含量低於12%，最後將混合物磨成粉末狀，得到蒙脫石複合物；
將過濾得到的純化腸道病原菌烈性噬菌體液裡加入25%甘油鹽水，充分搖勻，得到噬菌體液；
將所述蒙脫石複合物、所述噬菌體液、嗜酸乳桿菌粉、糞鏈球菌粉混合，攪拌均勻；
加入黃連素和鈣劑，混合均勻，即成成品。
將實施例1-5所得的微生物製劑做技術檢測，結果如下：
一、試驗方法：
將微生物製劑混入到各動物平時的膳食中，每天一次，每次30ml。
二、實驗結果：
1、腹瀉頻率（單位：大便次數/天）
。
2、腹瀉指數
依照糞便的表觀形狀將腹瀉指數分為：
嚴重腹瀉：糞便為液態、不成形、水分含量高
中度腹瀉：糞便為粘稠狀、不成形、水分含量高
輕微腹瀉：糞便為軟狀、稍微成形
正常：糞便為圓條狀
。
3、腹瀉期間的體重變化情況（單位：KG）
。
綜上所述，本發明通過蒙脫石納米粉、甘草、石榴皮、噬菌體、嗜酸乳桿菌粉和糞鏈球菌粉的協同作用，可以有效防禦和治療多種動物的腹瀉，包括豬、牛、羊、驢、貓、狗、兔子、青蛙、魚、章魚、海參、龜、海膽。且能減少動物抗菌藥物的使用，降低動物產品抗菌藥物殘留，減緩動物源性耐藥菌的產生，避免耐藥性細菌在動物間或動物與人之間傳播。
以上所述是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護範圍。