一種全細胞催化製備曲克蘆丁酯的方法與流程
2023-10-17 08:12:14
本發明屬於生物催化和藥物化學領域，具體涉及一種全細胞催化製備曲克蘆丁酯的方法。
技術背景
黃酮類化合物是一類重要的天然多羥基化合物，具有抗氧化性、抗癌、抗菌等多種生理功能。曲克蘆丁屬於黃酮類化合物的一種，廣泛存在於茶葉、咖啡豆、穀物以及各種果蔬當中，除此之外，曲克蘆丁還可以通過蘆丁衍生化製得。曲克蘆丁具有鎮痛、抑制紅細胞與血小板的凝集、防止腦血栓的形成、抗菌消炎、清除自由基以及治療糖尿病等多種藥理和生理活性。在治療心血管治病、糖尿病以及腦血病等方面得到廣泛的應用。但由於曲克蘆丁的結構限制導致其脂溶性較差，進而降低其生物利用度，極大地影響到它們的開發和應用。
目前，關於增強曲克蘆丁脂溶性的研究進展主要有：利用化學法和酶法合成曲克蘆丁酯以及對曲克蘆丁進行劑型改造製成一種w/o型的微乳液。但是化學法合成曲克蘆丁酯主要是通過強酸或強鹼進行催化，酸、鹼催化劑的大量使用導致嚴重的環境汙染問題，而且存在化學合成的區域選擇性差，副產物多，產率較低等缺點。對曲克蘆丁進行劑型改造雖然一定程度上能提高其生物利用度，但微乳液的製備需要大量的表面活性劑，這些表面活性劑（如卵磷脂）價格昂貴，造成生產成本高，而且有報導表明表面活性劑的用量越大其毒性也隨著增大。酶法雖然專一性強，但游離酶的分離純化過程繁瑣、複雜，且容易受到極端反應環境的影響，商品化酶的價格昂貴，不利於工業化的應用。
生物催化技術除了酶催化，還有一種為全細胞催化，它是指利用完整的微生物全細胞作為催化劑進行化學轉化的過程，其中起催化作用的是微生物全細胞內的酶系。相較於酶催化技術，全細胞催化劑的製備簡單易得，可以省略繁瑣的酶分離純化和固定化工藝，降低生產成本，而且全細胞具有完整的細胞結構和細胞膜，酶以天然固定化的方式被保護於細胞中，有利於在有機溶劑、極端ph、高溫等反應環境中最大程度地保持酶的構象和催化活性。此外，全細胞可以給多步生物轉化反應提供不同的酶系和輔助因子，而且可以有效地實現輔酶再生。全細胞催化技術也越來越多地應用到催化製備黃酮酯的研究中，然而，關於全細胞催化製備曲克蘆丁酯的研究還沒有報導。
技術實現要素：
本發明的目的在於克服現有技術存在的不足，提供一種綠色、簡單且高效的全細胞催化製備曲克蘆丁酯的方法。
本發明的目的通過如下技術方案實現。
一種全細胞催化製備曲克蘆丁酯的方法，包括如下步驟：
（1）將含吡啶的混合有機溶劑和曲克蘆丁混合均勻，再加入醯基供體，然後加入微生物細胞作為催化劑振蕩反應；
（2）反應結束後，將反應液分離純化得到曲克蘆丁酯。
優選的，步驟（1）所述含吡啶的混合有機溶劑為二甲基亞碸、n,n-二甲基甲醯胺、乙腈、四氫呋喃、叔丁醇、叔戊醇、環己烷、正己烷、石油醚、正庚烷和異辛烷中的一種與吡啶組成的二元混合溶劑。
進一步優選的，所述混合有機溶劑中吡啶的體積含量為25%-90%。
優選的，步驟（1）所述醯基供體為碳的個數為1-18的脂肪酸、碳的個數為1-18的脂肪酸酯或脂肪酸烯醇酯。
優選的，步驟（1）所述曲克蘆丁與醯基供體的摩爾比為1:5-1:40，進一步優選為1:10-1:40。
優選的，步驟（1）所述微生物細胞為施氏假單胞菌（pseudomonasstutzeri）、螢光假單胞菌（pseudomonasfluorescens）、銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）、少孢根黴（rhizopusoligosporus）、黑麴黴（aspergillusniger）、橘青黴（penicilliumcitrinum）、華根黴（rhizopuschinensis）、米黑根毛黴（rhizomucormiehei）、米根黴（rhizopusoryzae）、米麴黴（aspergillusoryzae）或白地黴（geotrichumcandidum）。
優選的，步驟（1）所述微生物細胞與曲克蘆丁的質量比為2:3-8:3。
優選的，步驟（1）所述微生物細胞用量為20-80mg/ml。
優選的，步驟（1）所述反應的溫度為20-55℃。
優選的，步驟（1）所述反應的時間為24-156小時。
優選的，步驟（2）所述分離純化是將反應後的反應液經離心除菌體，減壓蒸餾除去溶劑，再經柱層析或薄層層析分離得到曲克蘆丁酯；所用層析液為乙酸乙酯/甲醇/水，體積比為15：3.6：0.5。
與現有技術相比，本發明具有如下的優點：
（1）本發明採用高效的生物催化劑—微生物細胞來催化製備曲克蘆丁酯。由於全細胞催化劑有完整的細胞結構，其中的細胞連結酶以天然固定化的方式被保護於細胞中，克服了現有技術中游離酶在極端反應環境中容易失活，反應產率低的缺點。
（2）本發明無需基團保護和去保護操作，反應過程簡單易控。
（3）反應所需的全細胞催化劑製備簡單易得、便宜，避免了游離酶繁瑣、複雜的分離純化工藝和商品化酶的高生產成本。
（4）本發明在反應結束後可以通過簡單的過濾回收菌體，既實現全細胞催化劑的重複利用，又易於產物的分離純化。
（5）本發明具有反應條件溫和、環境友好、工藝簡單、副反應少且選擇性高等優點。
附圖說明
圖1為曲克蘆丁酯合成過程的高效液相色譜圖。
圖2為曲克蘆丁單酯的核磁共振碳譜圖。
圖3為曲克蘆丁雙酯的核磁共振碳譜圖。
具體實施方式
為了更好理解本發明，下面結合實施例對本發明做進一步地詳細說明，但是本發明要求保護的範圍並不局限於實施例表示的範圍。
實施例1
將30mmol曲克蘆丁溶解於1ml吡啶-異辛烷混合有機溶劑（吡啶體積含量為25%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克蘆丁與丙酸乙烯酯的摩爾比為1:20）混合均勻，再加入銅綠假單胞菌gim1.46（廣東省微生物研究所）（銅綠假單胞菌與曲克蘆丁的質量比為2:1），在20℃、振蕩速度180r/min下反應24小時。反應結束後，反應混合物經離心除菌體，減壓蒸餾除去溶劑，再經薄層層析分離得到曲克蘆丁酯，合成過程的高效液相色譜圖如圖1所示。所用層析液為乙酸乙酯/甲醇/水，體積比為15：3.6：0.5。該實施條件下，底物轉化率為12%，曲克蘆丁單酯產率為10.1%。曲克蘆丁單酯的核磁共振碳譜圖如圖2所示。
實施例2
將30mmol曲克蘆丁溶解於1ml吡啶-異辛烷混合有機溶劑（吡啶體積含量為25%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克蘆丁與丙酸乙烯酯的摩爾比為1:20）混合均勻，再加入施氏假單胞菌gim1.273（廣東省微生物研究所）（施氏假單胞菌與曲克蘆丁的質量比為2:1），在37.5℃、振蕩速度180r/min下反應90小時。反應結束後，反應混合物經離心除菌體，減壓蒸餾除去溶劑，再經薄層層析分離得到曲克蘆丁酯。所用層析液為乙酸乙酯/甲醇/水，體積比為15：3.6：0.5。該實施條件下，底物轉化率為78.2%，曲克蘆丁雙酯產率為60.2%。曲克蘆丁雙酯的核磁共振碳譜圖如圖3所示。
實施例3
將30mmol曲克蘆丁溶解於1ml吡啶-正庚烷混合有機溶劑（吡啶體積含量為25%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克蘆丁與丙酸乙烯酯的摩爾比為1:20）混合均勻，再加入銅綠假單胞菌gim1.46（銅綠假單胞菌與曲克蘆丁的質量比為2:1），在55℃、振蕩速度180r/min下反應156小時。反應結束後，反應混合物經離心除菌體，減壓蒸餾除去溶劑，再經薄層層析分離得到曲克蘆丁酯。所用層析液為乙酸乙酯/甲醇/水，體積比為15：3.6：0.5。該實施條件下，底物轉化率為80.1%，曲克蘆丁單酯產率為72%。
實施例4
將30mmol曲克蘆丁溶解於1ml吡啶-正庚烷混合有機溶劑（吡啶體積含量為90%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克蘆丁與丙酸乙烯酯的摩爾比1:20）混合均勻，再加入銅綠假單胞菌gim1.46（銅綠假單胞菌與曲克蘆丁的質量比為2:1），在40℃、振蕩速度180r/min下反應48小時。反應結束後，反應混合物經離心除菌體，減壓蒸餾除去溶劑，再經薄層層析分離得到曲克蘆丁酯。所用層析液為乙酸乙酯/甲醇/水，體積比為15：3.6：0.5。該實施條件下，底物轉化率為34.4%，曲克蘆丁單酯產率為27.7%。
實施例5
將30mmol曲克蘆丁溶解於1ml吡啶-正庚烷混合有機溶劑（吡啶體積含量為65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克蘆丁與丙酸乙烯酯的摩爾比為1:10）混合均勻，再加入銅綠假單胞菌gim1.46（銅綠假單胞菌與曲克蘆丁的質量比為2:1），在40℃、振蕩速度180r/min下反應120小時。反應結束後，反應混合物經離心除菌體，減壓蒸餾除去溶劑，再經薄層層析分離得到曲克蘆丁酯。所用層析液為乙酸乙酯/甲醇/水，體積比為15：3.6：0.5。該實施條件下，底物轉化率為60.1%，曲克蘆丁單酯產率為44.7%。
實施例6
將30mmol曲克蘆丁溶解於1ml吡啶-正庚烷混合有機溶劑（吡啶體積含量為65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克蘆丁與丙酸乙烯酯的摩爾比為1:40）混合均勻，再加入銅綠假單胞菌gim1.46（銅綠假單胞菌與曲克蘆丁的質量比為2:1），在40℃、振蕩速度180r/min下反應120小時。反應結束後，反應混合物經離心除菌體，減壓蒸餾除去溶劑，再經薄層層析分離得到曲克蘆丁酯。所用層析液為乙酸乙酯/甲醇/水，體積比為15：3.6：0.5。該實施條件下，底物轉化率為89.4%，曲克蘆丁單酯產率為78.5%。
實施例7
將30mmol曲克蘆丁溶解於1ml吡啶-正庚烷混合有機溶劑（吡啶體積含量為65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克蘆丁與丙酸乙烯酯的摩爾比為1:30）混合均勻，再加入銅綠假單胞菌gim1.46（銅綠假單胞菌與曲克蘆丁的質量比為1:1），在40℃、振蕩速度180r/min下反應120小時。反應結束後，反應混合物經離心除菌體，減壓蒸餾除去溶劑，再經薄層層析分離得到曲克蘆丁酯。所用層析液為乙酸乙酯/甲醇/水，體積比為15：3.6：0.5。該實施條件下，底物轉化率為65.7%，曲克蘆丁單酯產率為50%。
實施例8
將30mmol曲克蘆丁溶解於1ml吡啶-正庚烷混合有機溶劑（吡啶體積含量為65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克蘆丁與丙酸乙烯酯的摩爾比為1:30）混合均勻，再加入銅綠假單胞菌gim1.46（銅綠假單胞菌與曲克蘆丁的質量比為4:1），在40℃、振蕩速度180r/min下反應120小時。反應結束後，反應混合物經離心除菌體，減壓蒸餾除去溶劑，再經薄層層析分離得到曲克蘆丁酯。所用層析液為乙酸乙酯/甲醇/水，體積比為15：3.6：0.5。該實施條件下，底物轉化率為96.2%，曲克蘆丁單酯產率為81.2%。
實施例9
將30mmol曲克蘆丁溶解於1ml吡啶-正庚烷混合有機溶劑（吡啶體積含量為65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克蘆丁與丙酸乙烯酯的摩爾比為1:30）混合均勻，再加入銅綠假單胞菌gim1.46（銅綠假單胞菌與曲克蘆丁的質量比為5:2），在25℃、振蕩速度180r/min下反應120小時。反應結束後，反應混合物經離心除菌體，減壓蒸餾除去溶劑，再經薄層層析分離得到曲克蘆丁酯。所用層析液為乙酸乙酯/甲醇/水，體積比為15：3.6：0.5。該實施條件下，底物轉化率為40.4%，曲克蘆丁單酯產率為34.6%。
實施例10
將30mmol曲克蘆丁溶解於1ml吡啶-正庚烷混合有機溶劑（吡啶體積含量為65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克蘆丁與丙酸乙烯酯的摩爾比為1:30）混合均勻，再加入銅綠假單胞菌gim1.46（銅綠假單胞菌與曲克蘆丁的質量比為5:2），在55℃、振蕩速度180r/min下反應120小時。反應結束後，反應混合物經離心除菌體，減壓蒸餾除去溶劑，再經薄層層析分離得到曲克蘆丁酯。所用層析液為乙酸乙酯/甲醇/水，體積比為15：3.6：0.5。該實施條件下，底物轉化率為63.4%，曲克蘆丁單酯產率為53.5%。
本發明的上述實施例僅僅是為了清楚地說明本發明而作的舉例，並非是對本發明的實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明權利要求的保護範圍之內。