馴養的大型動物的受精卵中的靶向基因組編輯的製作方法

2023-10-17 20:12:39 2

本申請根據35U.S.C.§119要求2014年3月26日提交的臨時申請系列號61/970,794的優先權，其整體援引加入本文。序列表本申請包含以ASCII形式通過EFS-Web提交的序列表，並且其整體援引加入本文。2015年3月22日創建的所述ASCII拷貝名UofMaryland，大小為16,384位元組。發明背景動物基因組的改造具有多種用途。當通過例如沉默基因、阻止蛋白的表達、改變表達產物或表達水平來改造基因時，基因或基因區域的功能變得明顯。基因的改變還可以導致修改為更期望的表型。當可以改造缺陷基因時，疾病的治療也是可能的。動物，特別是其中受精卵中的原核難以視覺上識別的大型馴養動物的有效基因靶向具有許多挑戰，阻止靶向構建體的可靠遞送以便有效靶向這樣的動物基因組中的特定區域。發明概述本方法允許將核酸分子注射入大型動物的受精卵，然後核酸分子併入細胞核，從而不需要視覺上識別受精卵的原核。所述方法提供在精子使卵受精之後和形成原核之前將核酸分子注射入受精卵。一實施方案中的方法採用同源重組，導致形成的核具有靶向的所關注的核酸分子。在本發明的實施方案中可以在靶基因座誘導雙鏈斷裂。向所關注的異源核酸分子以及與雙鏈斷裂位點側翼的序列具有同源性的序列提供核酸酶以及單鏈寡核苷酸或雙鏈靶向載體，這允許在所述位點同源重組。在一實施方案中，當使用單鏈寡核苷酸時，側翼序列可以是50個鹼基對(bp)或更多，當使用雙鏈靶向載體時，可以是500bp或更多。所述方法可以用於通過例如抑制表達、缺失、等位基因的置換或將在一實施方案中表達獨特蛋白的序列引入動物基因組來修改動物中序列的表達。附圖說明圖1是豬和小鼠受精卵的顯微照片。圖2示出CRISPR介導的GFP轉基因敲入PRNP基因座。A)是靶向載體的示意圖，其示出與內源PRNP基因座同源的靶向臂。術語「上」指切割位點上遊的500bp的靶向PRNP基因座，而「下」指1000bp的下遊側翼序列。UBC指(人泛素C啟動子)，GFP指綠色螢光蛋白；bPA(牛多腺苷酸化轉錄終止序列)；PGK/EM7–驅動新黴素(或者真核的G418)和卡那黴素抗性(原核)選擇標記Neo/kan的表達的混合真核(磷酸甘油激酶)和原核(EM7，使得能夠在大腸桿菌中組成型表達抗生素抗性的源自T7啟動子的合成細菌啟動子，專利/US7244609)RNA聚合酶II啟動子序列。將線性化的靶向載體與Cas9mRNA和靶向PRNP的單鏈導向(sgRNA)注射入豬受精卵。B)是示出所述方法的實施方案的原理圖。Cas9在PRNP的第三外顯子中誘導雙鏈斷裂。然後用靶向載體修復斷裂的DNA，導致靶向等位基因。圖3A和B是示出已發育至胚泡階段的代表性胚胎表現出GFP表達的照片，A)示出綠色螢光顯微鏡下的胚胎，而B)示出明視野顯微鏡視野。圖4是使用引物的凝膠，一個在靶向載體內，另一個在同源區外，顯示正確大小的特異性條帶，證實靶向至預期的基因座。圖5A和B示出CRISPR介導的同源性指導的豬基因組的修復和編輯，利用單鏈寡核苷酸併入受精卵。A)是注射入豬受精卵的Cas9載體、靶向ZBED6基因座的sgRNA以及包含LoxP位點和EcoR1限制性酶位點的單鏈寡核苷酸的原理圖。CMV和T7指HA標籤中的啟動子HA，NLS為核定位信號。B)是示出包含重組EcoRI位點的PCR擴增子的凝膠，可以將其消化以產生兩個片段，證實功能性EcoR1酶位點的重組。圖6示出重組ZBED6等位基因的測序(示出的整個序列為SEQIDNO:13)，示出插圖中的EcoR1位點(下劃線)和LoxP(SEQIDNO:11)。圖7示出A)具有loxP靶向的原核的原理圖；和兩個凝膠，B)示出具有loxP靶向的ZBED6的凝膠以及C)具有loxP靶向的PRNP。優選實施方案的詳細描述50年以前當通過磷酸鈣介導的轉染使得細胞耐受次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)選擇培養基時首先報導了遺傳物質轉移入哺乳動物細胞(Szybalska,E.etal.Geneticsofhumancellline.IV.DNA-mediatedheritabletransformationofabiochemicaltrait.ProcNatlAcadSciUSA48,2026-2034(1962))。通過在顯微操作器上安裝的微吸管的輔助下將DNA直接注射入組織培養細胞進一步提高了外源轉移的效率。(Graessmann,etal.Retransformationofasimianvirus40revertantcellline,whichisresistanttoviralandDNAinfections,bymicroinjectionofviralDNA.JVirol32,989-994(1979)；Capecchi,etal.HighefficiencytransformationbydirectmicroinjectionofDNAintoculturedmammaliancells.Cell22,479-488(1980))。這是將轉基因注射入小鼠受精卵的原核(PN)(Gordon,Jetal.GenetictransformationofmouseembryosbymicroinjectionofpurifiedDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA77,7380-7384(1980))並產生第一隻轉基因小鼠的前奏。(Brinster,R.L.etal.Somaticexpressionofherpesthymidinekinaseinmicefollowinginjectionofafusiongeneintoeggs.Cell27,223-231(1981))。在通過PN注射產生轉基因小鼠的第一次證實的成功之後不久，相似的方法用來產生生長激素轉基因豬。(Hammer,R.E.etal.Productionoftransgenicrabbits,sheepandpigsbymicroinjection.Nature315,680-683(1985))。PN注射方法仍然是廣泛使用的產生轉基因馴養的大型動物如豬、牛、綿羊、山羊、駱駝、狗、貓等的技術，但是，僅1％注射的受精卵產生穩定的轉基因奠基者。(Niemann,H.Transgenicpigsexpressingplantgenes.ProcNatlAcadSciUSA101,7211-7212(2004)；Prather,etal.Geneticallymodifiedpigsformedicineandagriculture.Biotechnology&GeneticEngineeringReviews25,245-265(2008))。除了產生奠基動物的低效率，該技術在豬和其他大型動物模型中具有挑戰性，其中胚胎是混濁的，並且難以定位原核用於注射大DNA構建體(圖1)。除了PN注射，已嘗試產生轉基因動物的其他方式，包括精子介導的基因轉移、卵母細胞轉導和轉座子，具有不同程度的成功。(Park,etal.RoleofstemcellsinlargeanimalgeneticengineeringintheTALENs-CRISPRera.ReprodFertilDev26,65-73(2013))。特別地結合使用CRISPR/Cas系統或其他位點特異性核酸酶，這類DNA構建體可以靶向基因的特定區域，允許候選基因的位點特異性敲入、核苷酸的修飾或等位基因的置換。但是，所有方法均具有一些相似的限制，包括(但不限於)：(1)基因組中的隨機整合；(2)插入誘變；(3)位置沉默；(4)在整合體的數量和表達中缺少控制；(5)不能在胚胎轉移之前預先篩選穩定整合；以及(6)不能缺失內源基因(即基因「敲除」或「KO」，其中基因表達失活或失效)。「基因靶向」抵消了上述所有缺點，由此可以靶向預期的基因序列用於缺失或外源DNA整合。基因靶向的成功可以歸因於發現側翼同源等基因序列組合陽性和陰性選擇方案促進在預期基因座的重組事件的產生和鑑定(Luciw,etal.LocationandfunctionofretroviralandSV40sequencesthatenhancebiochemicaltransformationaftermicroinjectionofDNA.Cell33,705-716(1983)；Kucherlapati,R.S.etal.Homologousrecombinationinmonkeycellsandhumancell-freeextracts.ColdSpringHarborSymposiaonQuantitativeBiology49,191-197(1984))。但是，用於敲除基因、引入點突變或敲入基因的基於同源重組(HR)的基因靶向的主要限制之一是獲得正確重組事件的效率低，通常在106–107個細胞中1個的範圍中。此外，這些修飾在自然中通常是單等位基因的，需要第二輪靶向用於雙等位基因(純和)修飾。在缺少真正的胚胎幹細胞(ESC)的豬和其他家畜物種中，體細胞，通常胎兒成纖維細胞用於基因靶向，並且將修飾的細胞用作核轉移中的供體細胞或克隆以產生遺傳修飾(GM)的動物。當使用體細胞作為前體時基因靶向效率相對較低，這進一步加上成纖維細胞的相對早期衰老，排除實驗過程中期望的敲入(KI)或其他遺傳改變的表徵。隨著豬和其他大型動物的長妊娠長度和成熟至生殖年齡，通過核轉移產生純和敲入(或「KI」，其中將核酸序列插入在特定基因座)動物或克隆以產生重組豬是技術上挑戰和成本高昂的。這裡示出一種改良的在受精卵中靶向基因組編輯的方法，其允許在動物中基因組靶向，包括具有光密度從而因為細胞質中幹擾觀察的脂質顆粒而原核模糊的受精卵的動物。這使得難以用人的裸眼視覺上鑑定受精卵的原核並將核酸分子注射入核。原核是性細胞的單倍體核，在卵母細胞(卵)通過精子細胞(精子)受精之後這裡存在雄性和雌性原核。原核的膜溶解並且染色體對齊，然後成為單個二倍體核的部分並且細胞分裂發生。本領域技術人員理解可以在原核形成核之前確定時間框架。利用同源重組技術，利用直接注射入這類動物受精卵細胞，核酸分子精確靶向至基因組的位置現在是可能的，其中注射發生在受精之後和原核形成核之前。利用這種方法已發現核酸分子會有效重組入核。一實施方案提供在受精之後至多18-24小時注射。在一實施方案中，時間框架在一實施方案中至多5小時，而在另一實施方案中至多12小時。一實施方案提供注射發生在受精後3、4或5小時。對於受精後約3-5小時，細胞通常保持在受精培養基中，並且會在去除培養基之後注射。在另一實施方案中，注射發生在受精後約至多16小時，在一實施方案中為受精後3-4-5-6-7-8-9-10-12-13-14-15小時至多16小時，並且在另一實施方案中為受精後8-12小時。這避免需要使用胎兒成纖維細胞或核轉移系統或克隆。將所關注的核酸序列與將所述序列靶向至基因組中期望的靶基因座且提供在該位點同源重組的組分一起注射。在一實施方案中這類組分包括用於切割靶基因座的核酸酶，連同將核酸酶引導至靶向基因座的指導RNA。在所述方法中可以利用提供將所關注的核酸分子(NOI)靶向至靶基因的靶位點的任何方法。以實例而不是限制的方式提供以下方法。指導核酸分子是將核酸酶引導至基因組中的特定切割位點的核酸分子，無論通過使用結合結構域、識別結構域、指導RNA或其他機制。在適合在引導切割靶基因座中操作指導核酸分子的條件下將指導核酸分子引入細胞。本領域技術人員可獲得許多可以使用的方法，切割基因靶區域的最常用的核酸酶，連同會識別靶基因座的序列並引導切割該基因座的序列。在本文描述的方法中可以使用可以切割多核苷酸鏈的磷酸二酯鍵的任何核酸酶。通過實例而不是限制的方式，可用的系統包括利用位點特異性核酸酶(SSN)的那些系統，如ZFN(鋅指核酸酶)，(Whyte,J.J.etal.GenetargetingwithzincfingernucleasestoproduceclonedeGFPknockoutpigs.MolReprodDev78,2(2011)；Whyte,etal.CellBiologySymposium:Zincfingernucleasestocreatecustom-designedmodificationsintheswine(Susscrofa)genome.JAnimSci90,1111-1117(2012))；TALEN(轉錄激活因子樣效應子核酸酶)(參見，Carlson,D.F.etal.EfficientTALEN-mediatedgeneknockoutinlivestock.ProcNatlAcadSciUSA109,17382-17387(2012)；Tan,W.etal.Efficientnonmeioticalleleintrogressioninlivestockusingcustomendonucleases.ProcNatlAcadSciUSA110,16526-16531(2013)；Lillico,S.G.etal.Livepigsproducedfromgenomeeditedzygotes.Scientificreports3,2847(2013))，以及相對容易允許編輯動物基因組如豬基因組的CRISPR(成簇的規律間隔的短回文重複)–相關的(Cas)核酸酶系統(Hai,T.,Teng,F.,Guo,R.,Li,W.&Zhou,Q.One-stepgenerationofknockoutpigsbyzygoteinjectionofCRISPR/Cassystem.CellRes24,372-375(2014))。使用重組酶如美國專利第6,720,475號中描述的FLP/FRT或美國專利第5,658,772號中描述的CRE/LOX可以用來將多核苷酸序列整合入特定的染色體位點。如Puchtaetal.,PNASUSA93(1996)pp.5055-5060所述，大範圍核酸酶已用於將供體多核苷酸靶向入特定的染色體位置。ZFN與結合至因為使用鋅離子而具有穩定結構的結合結構域的蛋白或蛋白結構域一起工作。TALEN利用可以特異性地識別DNA序列中的鹼基對的具有胺基酸重複的結構域。對於兩個系統的討論，參見Voytas等人美國專利第8,697,853號，其整體援引加入本文。這些系統利用為每個靶序列準備的酶。CRISPR/Cas核酸酶系統在古細菌和細菌中已演變為作為基於RNA的適應性免疫系統以檢測並切割入侵的病毒和質粒。(Horvath,P.&Barrangou,R.CRISPR/Cas,theimmunesystemofbacteriaandarchaea.Science327,167-170(2010)；Wiedenheft,etal.RNA-guidedgeneticsilencingsystemsinbacteriaandarchaea.Nature482,331-338(2012))。不像需要組裝DNA結合結構域(DBD)以將核酸酶引導至靶位點的ZFN和TALEN，CRISPR/Cas系統利用RNA作為指導。CRISPR基因座是細菌基因中識別的一類不同的分散短序列重複(SSR)。該重複是成簇存在的短元件，其由具有基本恆定長度的獨特的間插序列規律間隔。觀察到它們為免疫系統，其中將與病毒或質粒序列同源的核酸分子整合入CRISPR基因座。靶向並切割外源DNA或RNA。該系統適合在明確的基因座靶向插入核酸分子。一般來說，CRISPR系統的特徵在於促進在設計指導序列具有互補性的靶序列位點處形成CRISPR複合物的元件，這裡靶序列和指導序列之間的雜交促進CRISPR複合物的形成。不一定要求完全互補性，只要有足夠的互補性以引起雜交並促進CRISPR複合物的形成。在CRISPR系統中，一種酶CRISPR酶用於利用短RNA分子靶向。兩種基本組分用於該系統，指導RNA和內切核酸酶。指導RNA是指定靶位點和tracrRNA的內源序列，需要結合至酶。指導序列提供靶標特異性，而tracrRNA提供支架特性。這些指導序列通常為約15多達20-25個鹼基對(bp)，其與靶位點雜交並引導CRISPR複合物結合至靶序列。可以在相同或不同載體上提供編碼CRISPR相關酶的序列。Cas蛋白的非限制性實例包括Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也稱作Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4，它們的同源物，或者它們的修改版本。在一實施方案中，酶為II型CRISPR系統酶，並且為Cas9或者其變體或修改。這些酶是已知的；例如，化膿性鏈球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白的胺基酸序列可以在SwissProt資料庫中於登錄號Q99ZW2下找到。酶或Cas9蛋白可以用作切口酶或核酸酶並切割DNA的一條或兩條鏈。Cas9具有兩個功能結構域RuvC和HNH，並且在使用兩者時切割兩條鏈。Cas9核酸酶與靶CRISPRRNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)形成核糖核酸酶複合物，並且使用嵌合RNA以靶向基因組序列並誘導DSB。CRISPR/Cas核酸酶和其他SSN可以將基因組DNA中的靶向雙鏈斷裂引入靶基因座，這在單鏈(SS)DNA寡核苷酸或雙鏈(DS)靶向載體的存在下，分別導致所選核苷酸的基於同源重組(HR)的改變或轉基因的KI。在另一實施方案中，具有所關注的核酸分子的SS寡核苷酸可以與Cas9mRNA和sgRNA一起使用以靶向特定靶基因區域的修飾。在另一實施方案中，靶基因與gRNA序列互補，並且具有前間區序列鄰近基序或PAM序列。這輔助Cas9結合。對於CRISPR/Cas系統細節的討論，參見Congetal.,美國專利號8,932,814；8,871,445和8,906,616，它們整體援引加入本文。基因組中的斷裂可以通過非同源末端連接DNA修復途徑(NHEJ)或通過同源介導的修復途徑(HDR)修復。NHEJ可以通過引起移碼或提前終止密碼子發生來擾亂基因。HDR是提供避免這類問題的核酸分子插入的實施方案。向雙鏈斷裂提供DNA修復模板，其中提供與切割位點兩側的基因組序列具有同源性並雜交的序列(同源臂)。在一實施方案中，將DNA模板或側翼序列轉染入具有CRISPR/Cas載體的細胞。雖然基於HDR的基因靶向事件非常罕見，但是效率可以通過在靶基因座引入DSB來提高几個數量級(>1000-倍)(Moehle,E.A.etal.Targetedgeneadditionintoaspecifiedlocationinthehumangenomeusingdesignedzincfingernucleases.ProcNatlAcadSciUSA104,3055-3060(2007))。DSB之後，與DSB兩側的末端具有同源性的SSoligo或DS載體可以產生具有靶向基因組改變或轉基因整合的動物(Cui,Letal.Thepermissiveeffectofzincdeficiencyonuroguanylinandinduciblenitricoxidesynthasegeneupregulationinratintestineinducedbyinterleukin1alphaisrapidlyreversedbyzincrepletion.TheJournalofNutrition133,51-56(2003)；Meyer,Metal.Genetargetingbyhomologousrecombinationinmousezygotesmediatedbyzinc-fingernucleases.ProcNatlAcadSciUSA107,15022-15026(2010))。在發明人實驗室中，CRISPR/Cas通過直接注射入豬受精卵介導HDR和核苷酸編輯和基因KI，避免需要核轉移/克隆以產生遺傳修飾(GM)的動物。每個同源臂的長度會根據對基因組修飾的大小而變化。這裡，發明人已發現可以利用比以前不使用本發明時採用的小得多的同源臂。以前需要與靶基因側翼序列同源的序列具有6000bp區域中的大小。但是，這裡使用雙鏈斷裂和位點特異性核酸酶系統時，證實所述方法需要少於6000bp同源區，並且僅操作至少約40bp，至少約50bp和之間的量，或者更多上遊和約40bp，至少約50bp和之間的量，或者更多下遊序列用於單鏈oligo和約至少300bp，至少500bp多達1000bp和之間的量，或者更多用於雙鏈靶向載體。在製備這類序列中這提供較不費力的過程，將製備靶載體的時間減少至1-2周或更少而不是6個月。與SS寡核苷酸或DS載體一起提供這些同源臂。本方法提供基因編輯中的擴展應用以提供更高的效率，增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、多達100％，以及獲得的重組事件數量的之間的量。恢復的事件的增加倍數多達1000倍或更多。這導致高效率、在大型動物基因編輯中的實用性以及在許多設置中使用。關於靶基因，是指期望如所描述地進行修飾的動物基因組內的任何核酸分子或者其中期望插入核酸分子的任何核酸分子。靶多核苷酸可以是編碼基因產物(例如，蛋白)的序列或非編碼序列(例如，調節多核苷酸或無用DNA)。所述方法可用於敲入和敲除。例如，可以通過插入轉錄激活物上調基因轉錄，或者利用轉錄阻遏物抑制表達。不希望受到限制，在基因編輯的各種應用中包括修飾(例如，缺失、插入、易位、失活、激活、突變)多種細胞類型中的靶多核苷酸。在一些實施方案中，可以修飾表達的多肽。在例如基因療法、藥物篩選、疾病診斷、預後、增加或減少生長和身體組成以及提高動物產品的質量或組成中有廣譜應用。所述方法可用於期望修飾疾病基因的任何位置。其他實例包括改進的飼料使用和肉組合物、增強的繁殖性能、改變動物產品如奶的組分含量(如乳糖含量)以及減少或消除表型如公豬羶味表型。所述方法可用於所謂的敲入，其中將序列插入基因組，或者用於所謂的敲除，其中基因表達減少或消除或中斷。這允許理解和控制基因及其下遊影響。靶核苷酸可以包括許多疾病相關基因和多核苷酸以及信號生化途徑相關基因和多核苷酸。靶多核苷酸的實例包括與信號生化途徑相關的序列，例如，信號生化途徑相關基因或多核苷酸。靶多核苷酸的實例包括疾病基因或多核苷酸。「疾病」基因或多核苷酸包括與影響動物中的疾病相關的任何基因或多核苷酸，並且可以包括在源自疾病影響的組織的細胞中產生與非疾病對照的組織或細胞相比異常水平或異常形式的轉錄或翻譯產物的基因或多核苷酸。疾病基因是與患有或發展疾病的風險增加或減少或者從疾病恢復相關的任何基因。其可以是變得以異常高水平表達的基因；其可以是變得以異常低水平表達的基因，其中改變的表達與疾病的發生和/或發展相關。疾病基因還指具有直接負責疾病病因或者與負責疾病病因的基因連鎖不平衡的突變或遺傳變化的基因。轉錄或翻譯產物可以是已知或未知的，並且可以是正常或異常水平。通過使用本文的方法用與疾病相關的基因或編碼的蛋白可以治療、預防或研究大量動物疾病。一些實例包括提供對傳染性海綿狀腦病的抗性的PRNP基因；在防護PRRSV中免疫應答基因的SOCS1、SOD2、RBP4、HLA-B、HLA-G、PPP2R1A和TAP1基因的上調或者IL18、TF、C4BPA、C1QA、C1QB和TYROBP基因的下調；KI誘餌對抗人畜共患的流感疾病，消除負面表型如公豬羶味，以及基因滲入農業有益的性狀。潛在用途的另一實例提供引入幹擾核酸分子的動物細胞。例如，可以採用雙鏈RNA分子(dsRNA)。在這種方法中，總的來說，基於靶核酸分子的序列部分或完全產生雙鏈的RNA。產生dsRNA的方式的細節可以如本領域技術人員理解的變化，並且通過實例而不是限制的方式，包括Graham等人，美國專利第6,573,099號的方法，其中使用對應於靶序列的兩個拷貝的序列，或者Fire等人，美國專利6,326,193的方法(兩者援引加入本文)，其中第一鏈是對應於靶核酸的RNA序列，而第二鏈是與靶序列互補的RNA序列，每個專利整體援引加入本文。這些鏈互相雜交以形成抑制dsRNA。對應於靶核酸分子的鏈可以對應於其全部或部分，只要形成dsRNA。當使用靶核酸的互補(反義)鏈時，其可以與靶核酸分子的全部或部分互補，只要形成的dsRNA幹擾靶核酸分子。dsRNA觸發應答，其中RNAseIIIDicer酶將dsRNA加工為約21–23個核苷酸的小幹擾RNAs(siRNA)，其形成破壞同源mRNA的RNA誘導的沉默複合物RISC。(參見，Hammond,S.M.,etal.,Nature(2000)404:293-296).一般來說，可以使用多達10個核苷酸、20個核苷酸、30個核苷酸、40個核苷酸、50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸、300、500、550、500、550或更多以及之間的任何量。本領域技術人員會理解有許多可用的用途以及哪個可用於本文所述的方法。所述方法可以用於任何動物。它們大多數可用於在受精之後具有原核的動物，所述原核至少部分視覺上模糊，使得難以注射入原核。這樣的原核不可以通過人類肉眼視覺上觀察，即，用人眼和用顯微鏡觀察，不藉助對比，或者其他方法以允許觀察。這類動物包括「大型馴養動物」，即豬、牛、馬、狗、貓，以及其他反芻動物如綿羊、山羊、公牛、麝牛、美洲駝、羊駝、原駝、鹿、野牛、羚羊、駱駝和長頸鹿、公牛、麝牛、美洲駝、羊駝、原駝、鹿、野牛、羚羊、駱駝和長頸鹿。家畜包括在可以使用所述方法的動物中。此外，在其中細胞質透明的其他動物模型如靈長類、兔、水貂和其他模型中，所述方法仍是有吸引力的選擇，因為其允許不必猜測何時形成原核，並且取而代之可以將材料注射入細胞質。所述方法特別可用於豬。豬是經濟上重要的農業動物。此外，人們渴望豬的生物醫學應用。與人和小鼠相似，豬是單胃的，因此在營養吸收、運輸和代謝的研究中發揮主要作用。(Patterson,etal.Thepigasanexperimentalmodelforelucidatingthemechanismsgoverningdietaryinfluenceonmineralabsorption.Experimentalbiologyandmedicine233,651-664(2008))。動物基因組編輯領域中的進展包括豬基因組的測序。(Groenen,M.A.etal.Analysesofpiggenomesprovideinsightintoporcinedemographyandevolution.Nature491,393-398(2012)).總的來說，根據需要解決的生物學問題，合適的豬模型可用於研究。但是，到目前為止缺少用豬作為「優選模型」的動機，這是由於落後與小鼠模型的GM模型。本方法針對這些缺點。最近幾年中，有越來越多的共識，小鼠雖然仍是強大的遺傳模型物種，但是具有局限性，並且不可以滿足全方位的生物醫學需要以應對預防醫學(肥胖、不育、心血管病症)、鑑定新的或改進的診斷以及農場衍生的人畜共患疾病的模型。作為替代，大型馴養動物如豬獲得青睞，因為它們在解剖學、生理學和免疫學上與人更相似，同時保持作為產多胎物種以及允許長期研究的相對長壽命的優勢。小鼠模型由於解剖學或生理學差異而不符合預期的實例包括囊性纖維化、眼部和心臟疾病。(Rogers,C.S.etal.DisruptionoftheCFTRgeneproducesamodelofcysticfibrosisinnewbornpigs.Science321,1837-1841(2008)；Welsh,Metal.Developmentofaporcinemodelofcysticfibrosis.TransactionsoftheAmericanClinicalandClimatologicalAssociation120,149-162(2009)；Zhou,L.etal.Differentiationofinducedpluripotentstemcellsofswineintorodphotoreceptorsandtheirintegrationintotheretina.StemCells29,972-980(2011)；Whyte,J.J.etal.Vascularendothelium-specificoverexpressionofhumancatalaseinclonedpigs.TransgenicRes20,989-1001(2011))。因為幾乎所有的家豬都是雜種，來自這些動物模型的所得表型比近交小鼠品系更可靠，並且可應用於人類疾病。同樣地，家豬更適合人畜共患或傳染性疾病研究，其中它們用作疾病的儲備或載體，或者是病原體的天然宿主。除了用作人類疾病的模型，家豬是這樣的研究夢寐以求的，其中相對長的壽命、與人的身體大小和生理學的密切相似性提供優勢。簡單地說，豬是營養研究的優選模型。關於注射是表示將裝置插入細胞並且核酸分子進入細胞的任何方便的方法。通過實例而不是限制的方式，這可以用注射移液管完成，所述注射針可以包括裝有核酸分子的注射器。移液管穿過透明帶。與現有技術相反，不需要能夠視覺上觀察原核以使注射裝置與原核接觸。取而代之，僅需要將核酸分子引入受精的卵母細胞，不需要關心是否接觸原核，並且引入細胞質是足夠的。注射在受精之後和原核形成核之前進行。在受精之前，雌性DNA處於中期II階段並且尚未完成減數分裂。精子刺激減數分裂和核的最終形成。這裡注射發生在核形成之前。一實施方案提供注射發生長達16小時，並且在一實施方案中，受精後12-16小時，在另一實施方案中，受精後3、4、5或6-12小時，並且在另一實施方案中，受精後16小時。如本文中指出的，本領域技術人員可以確定在特定動物中何時會形成核，並且在此之前注射。例如，在豬和牛中，時間框架為受精後12-16小時。不希望受到任何理論的束縛，據信這提供足夠時間以驅散細胞質中的分子，並且提供核酸酶重組組分以將核酸分子整合入最終的核。這不僅允許將核酸分子引入其中難以注射原核的大型動物，而且還提供高事件恢復，這裡，多達100％，並且避免如果在DNA複製之後發生重組可能發生的產生嵌合體的問題。如本文所用，除非另有說明，術語核酸或多核苷酸指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它們的聚合物。因此，該術語包括RNA和DNA，其可以是基因或其部分，cDNA，合成的多脫氧核糖核酸序列等，並且可以是單鏈或雙鏈的，以及DNA/RNA雜合體。除非另有說明，特定核酸序列還暗中涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡併密碼子取代)和互補序列以及明確指明的序列。具體地，簡併密碼子取代可以通過產生這樣的序列獲得，其中用混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代一個或多個所選(或全部)密碼子的第三部分(Batzeretal.(1991)NucleicAcidRes.19:5081；Ohtsukaetal.(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；Rossolinietal.(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)。術語核酸與基因、cDNA和基因編碼的mRNA可交換使用。「多肽」一般指肽和蛋白。在某些實施方案中，多肽可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多個胺基酸或者更多或之間的任何量。一般認為肽是超過50個胺基酸。當提到本發明的多肽時，術語「片段」、「衍生物」和「同源物」表示基本上保留與所述多肽相同的生物學功能或活性的多肽。可以基於保留多肽的一種或更多種生物學活性的能力選擇這類片段、衍生物或同源物。多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽。因此，當提到所關注的核酸分子(NOI)時，表示期望引入動物細胞核的核酸分子。因此，通過實例而不是限制的方式，NOI可以是靶基因，並且可以是修飾的；RNA；幹擾RNA；可以對靶基因或另一基因具有各種影響的核酸分子，如本文討論的；新插入基因組並且可以在基因組內產生額外的多肽的核酸分子，或者任何這些的組合。期望引入動物細胞基因組的任何核酸分子都可以是NOI。「密碼子優化」可以用來優化序列用於在動物中表達，並且定義為通過用更經常或最常用於該動物基因的密碼子代替天然序列的至少一個、一個以上或大量密碼子來修改核酸序列用於在所關注的動物如豬的細胞中增強表達。各種物種表現出對特定胺基酸的某些密碼子的特定偏好。Cas9可以是密碼子優化用於提高表達的序列之一。在一方面，可以產生RNA的包含密碼子優化的編碼區的核酸片段的多核苷酸用適合在給定動物細胞中優化表達的密碼子使用編碼多肽或者其片段、變體或衍生物。通過將優選用於所關注的宿主基因的密碼子併入DNA序列來製備這些多核苷酸。「異源」核酸分子是在相鄰核酸分子旁邊未天然發現的任何核酸分子。異源多核苷酸或異源核酸或外源DNA片段指源自與特定宿主細胞無關的來源的多核苷酸、核酸或DNA片段，或者，如果來自相同來源，通過人為幹預在組成和/或基因組基因座中修改其原始形式。宿主細胞中的異源基因包括特定宿主細胞的內源基因，但是已修改或引入宿主。因此，該術語指細胞外源或異源的核酸分子，或者與細胞同源但是在其中通常未發現該元素的宿主核酸內的位置中的核酸分子。然後可以通過使用載體、質粒或構建體等將核酸引入動物宿主細胞。「載體」是用於將核酸轉移入宿主細胞的任何方式。載體可以是單鏈、雙鏈或部分雙鏈的，可以具有游離末端或沒有游離末端，可以是DNA、RNA或兩者。已知各種多核苷酸可用作載體。質粒是環狀雙鏈DNA環。關於一個或多個表達載體是指包含必需的調節元件用於適當表達可操作地連接的核酸分子的一個或多個載體。載體可以是另一DNA片段可以連接的複製子，以便帶來所連接片段的複製。複製子是任何遺傳元件(例如，質粒、噬菌體、粘粒、染色體、病毒)，其功能為體內DNA或RNA複製的自主單元，即能夠在其自身的控制下複製。術語「載體」包括用於在體外、離體或體內將核酸引入細胞的病毒和非病毒方式。病毒載體包括但不限於腺伴隨病毒、慢病毒、甲病毒、逆轉錄病毒、梅毒、杆狀病毒、痘苗病毒、單純皰疹病毒、埃巴病毒、狂犬病病毒和水泡性口炎病毒。非病毒載體包括但不限於質粒、染色體、帶電荷的脂質(細胞轉染劑)、DNA-或RNA蛋白複合物以及生物聚合物。除了核酸，載體還可以包含一個或多個調節區，和/或可用於選擇、測量和監測核酸轉移結果(轉移至哪個組織、表達的持續時間等)的選擇標記。可以例如通過質粒上包含的基因如amp、kan、gpt、neo和hyg基因所賦予的對抗生素的抗性來選擇轉化的細胞。用來將這樣的序列插入病毒載體並在病毒DNA中產生醚改變如插入接頭序列等的技術是本領域技術人員已知的。(參見例如，Sambrooketal.,2001.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition.ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NY)。「盒」指可以在特定限制性位點插入載體的DNA片段。DNA片段編碼所關注的多肽或產生RNA，並且設計盒和限制性位點以確保盒插入正確的閱讀框用於轉錄和翻譯。可以將核酸分子在5'端可操作地連接至合適的啟動子，並且在3'端可操作地連接至終止信號和poly(A)信號。如本文所用，術語「可操作地連接」表示包含表達控制序列如轉錄啟動子和終止序列的核酸分子位於載體或細胞中，從而核酸分子產生的多肽或RNA的受到表達控制序列的調節。克隆和可操作地連接這類序列的方法是本領域公知的。啟動子可以指導組成型表達或組織優選的表達。組織優選(有時稱作組織特異性)的啟動子可以用來靶向特定細胞或組織內增強的轉錄和/或表達。這類啟動子在特定細胞區域或組織中以比細胞或組織的其他部分高的水平表達，並且可以主要在細胞區域或組織中表達。實例包括分泌至細胞壁、在內質網中保持表達或者靶向液泡或其他細胞器的啟動子。其他可以指導主要表達至肌肉、神經元、骨、皮膚、血液或者特定器官或細胞類型。這類啟動子還可以指導以時間方式表達，在發育或細胞周期的特定階段表達。用於一實例的啟動子可以是聚合酶(pol)I、polII或polIII啟動子。polI啟動子的實例包括雞RNApolI啟動子。polII啟動子的實例包括但不限於巨細胞病毒立即早期(CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒長末端重複(RSV-LTR)啟動子和猿猴病毒40(SV40)立即早期啟動子。polIII啟動子的實例包括U6和H1啟動子。可以使用誘導型啟動子如金屬硫蛋白啟動子。啟動子的其他實例包括T7噬菌體啟動子、T3噬菌體啟動子、β-半乳糖苷酶啟動子和Sp6噬菌體啟動子。具有終止和poly(A)信號的DNA的實例是SV40晚期poly(A)區。這些可商購的表達載體和系統的使用是本領域公知的。載體可以包含多拷貝的所關注的核酸分子或者核酸分子的組合；而且可以將多個載體同時或順序引入細胞。其他組分可以包括於載體或也引入細胞的多個載體中，如多腺苷酸化序列、增強子、信號肽、誘導元件、內含子、翻譯控制序列等。如上文提到的，可以使用允許具有載體的細胞存活或者具有載體的細胞的其他鑑定的選擇標記。當其插入細胞時將核酸分子引入細胞。當這樣的DNA或RNA已引入細胞時，細胞已被外源或異源DNA或RNA「轉染」。當提到核酸分子整合入細胞時表示分子已重組並成為基因組的部分。所關注的核酸分子的存在可以通過任何方便的技術確定，如鑑定標記基因的存在；通過PCR等檢測插入序列的存在；檢測來自動物細胞、組織或流體的表達產物；RNA印跡或蛋白印跡分析；或者任何其他容易獲得的方法。本文引用的所有參考文獻均援引加入本文。提出的實例通過說明的方式提供，並不表示限制本發明的範圍。實施例CRISPR介導的基因敲入：在發明人的實驗室中，主要朊蛋白(PRNP)已用作所謂的「安全港」基因座用於轉基因的靶向KI。在小鼠中，通常將轉基因敲入Rosa26基因座，其在所有靶組織中廣泛表達，並且已顯示如果缺失，對後代的存活不是至關重要的。(SEQIDNO:1為PRNP蛋白基因ID:494014)。因此，Rosa26是插入轉基因的優選位點以防止：a)轉基因的無意沉默；以及b)將轉基因隨機插入基因組中的脫靶位點所引起的插入誘變。在小鼠中，除了Rosa26，PRNP是另一廣泛表達的基因，並且不是生存力需要的，因此鑑定為安全港基因座。這樣的安全港基因是滿足通過在該位點引入載體或核酸分子對細胞沒有已知的不利影響的標準並且具有跨細胞類型的轉錄能力的基因。除了小鼠，PRNP-/-牛也是健康的。(Richt,J.A.etal.Productionofcattlelackingprionprotein.NatBiotechnol25,132-138(2007))。任何安全港基因可以在需要時用於核酸分子的敲入。在豬和其他大型動物中，Rosa26基因座尚未充分表徵。因此，選擇PRNP作為安全港基因座用於轉基因的靶向KO和KI以及建立重組豬。結果在下文中討論。A)靶向載體的組裝：產生基因靶向載體，其由與鄰近PRNP基因外顯子-3的Cas9切割位點同源的500bp上臂和1000bp下臂(分別為SEQIDNO:2和3)組成。利用包含獨特的限制性序列AscI和XhoI的引物，將上臂的1000bp序列克隆入表達GFP(綠色螢光蛋白；參見SEQIDNO:4和GenBankU73901)的piggyBac載體中的相應序列。(SEQIDNO:5、6)。同樣地，利用由BsiWI和MluI組成的引物，將切割位點下遊的1000bp序列擴增並克隆入相同的GFPpiggyBac載體。(SEQIDNO:7、8)。通過用AscI和HpaI消化載體產生最終的靶向載體，並且將沒有原核序列的線性化的載體注射入胚胎。B)豬胚胎中CRISPR介導的靶向基因敲入：我們研究了是否可以通過直接注射入胚胎來完成基因靶向，從而避免需要在中間細胞類型中靶向並且通過克隆實驗產生GM動物。如圖2a和2B中指出的，通過共注射靶向載體和CRISPR(用於產生DSB)，我們已證實GFP轉基因成功KI入胚胎中的PRNP基因座。在圖2中，UBC指(人泛素C啟動子)，GFP指綠色螢光蛋白；bPA(牛多腺苷酸化轉錄終止序列)；PGK/EM7–驅動新黴素(或者真核的G418)和卡那黴素抗性(原核)選擇標記Neo/kan的表達的混合真核(磷酸甘油激酶)和原核(EM7，使得能夠在大腸桿菌中組成型表達抗生素抗性的源自T7啟動子的合成細菌啟動子，專利/US7244609)RNA聚合酶II啟動子序列。在圖中「上」中指Cas9切割位點側翼的上遊500bp同源序列，而「下」指切割位點側翼的1000bp下遊序列。簡單地說，來自母豬的成熟卵母細胞購自ARTInc.(Madison,WI)，並且在它們的商業成熟培養基#1中過夜運輸至實驗室。置於成熟培養基#1(由ART提供)中24小時之後，將50-75個卵丘-卵母細胞複合體(COC)置於500μl包含0.14％PVA、10ng/ml表皮生長因子、0.57mM半胱氨酸、0.5IU/ml豬FSH和0.5IU/ml羊LH的組織培養基199(TCM199)中，並且在38.5℃和空氣中5％CO2、100％溼度下培養額外的20小時。(Abeydeera,Letal.Maturationinvitroofpigoocytesinprotein-freeculturemedia:fertilizationandsubsequentembryodevelopmentinvitro.BiolReprod58,1316-1320(1998))。將COC在包含0.01％PVA的HEPES緩衝培養基中的0.1％透明質酸酶中渦旋4分鐘以去除成熟後的卵丘細胞。將30-35個成熟、裸露的卵母細胞的組置於100μl改進的Tris緩衝培養基(mTBM)中，並且利用新鮮公豬精液根據建立的方案(Abeydeera,L.R.&Day,B.N.Fertilizationandsubsequentdevelopmentinvitroofpigooytesinseminatedinamodifiedtris-bufferedmediumwithfrozen-thawedejaculatedspermatozoa.BiolReprod57,729-734(1997))受精。將1-2ml精液與包含1mg/mlBSA的達爾伯克磷酸緩衝鹽水(DPBS)混合至10ml的最終體積，並且在1000xg、25℃下離心4分鐘；將精子在DPBS中洗滌總計3次。最後洗滌之後，將精子重懸於mTBM培養基中，以5x105個精子/ml的最終濃度添加至卵母細胞，並且在38.5℃和5％CO2下共溫育5小時。受精之後5小時，利用EppendorfTransjector用100ng/ul的Cas9mRNA連同50ng/ulsgRNA靶向PRNP和2ng/ul線性化的靶向載體注射推斷的受精卵。大約，將50nl的混合物注射入豬受精卵，並且在豬體外培養PZM3培養基中培養(Yoshioka,Ketal.Birthofpigletsderivedfromporcinezygotesculturedinachemicallydefinedmedium.BiolReprod66,112-119(2002))額外的6天。篩選現在已生長至胚泡階段的注射的胚胎中插入的GFP盒的表達。在圖3A和3B中，在體外培養的第6天，GFP的表達在擴大的胚泡中顯而易見。還通過利用靶向載體之內和之外的引物PCR擴增胚泡DNA證實GFP的靶向整合(圖4)。(SEQIDNO:9、10)。通過PCR擴增子的測序獲得最終證實。我們已進行這些GFPKI胚胎轉移至受體母豬，動物在懷孕的第60天妊娠，並且可能誕生活動物。胚胎中單鏈oligo介導的基因組編輯：通過動物基因組測序，現在鑑定可以影響討論中的表型的數量性狀基因座(QTL)以及在某些情況下數量性狀核苷酸(QTN)是可能的。測試這些QTL和QTN勢在必行。特異性地改變核苷酸以準確反映優勢或疾病基因型的能力分別是改進畜牧業和產生疾病模型的有力方法。我們已研究是否可能改變核苷酸以獲得期望的表型。這種方法對畜牧業具有最直接的適用性，其中以高精確度改變負面性狀如公豬羶味、角表型、疾病易感性和其他參數以使動物受益。我們已測試是否可以靶向特定基因座用於通過利用包含期望的核苷酸修飾的單鏈oligo引入核苷酸。在這種情況下，我們已研究我們是否可以靶向PRNP基因座以修改現有核苷酸之一以產生新的EcoR1限制性酶(圖5A)。使用的啟動子為CMV和T7，HA指_HA標籤，NLS是用來促進核定位的核定位信號。此外，為了易於分析，34個核苷酸LoxP位點(SEQIDNO:11已工程化在oligo上(圖5A)。如圖5B所示，我們能夠通過注射包含LoxP和EcoR1限制性酶的oligo連同Cas9mRNA和靶向ZBED6的sgRNA來改變候選ZBED6基因座。(SEQIDNO:12)。ZBED6是調節豬中胰島素樣生長因子2表達的鋅指蛋白。參見Markljungetal.,「ZBED6,anoveltranscriptionfactorderivedfromadomesticatedDNAtransposonregulatesIGF2expressionandmusclegrowth.PLoSBiol.7(12)e1000256。如上文提到的，工程化的ZBED6基因座可以通過PCR產物的長度增加34個核苷酸而看到，然後通過EcoR1消化證實。最終證實來自靶向基因座的測序，其中限制性位點如下劃線所示(圖6)。我們能夠用PRNP重複該結果(見圖7。以100ng/ul引入Cas9；sgRNA為50ng/ul，並且LoxPoligo為2ng/ul)。通過消除中間步驟和在胚胎中直接進行基因靶向，我們已建立非常有效的產生轉基因和/或編輯動物的方法。我們方法的優勢是雙重的，一是在產生靶向載體中，第二是在構建體遞送中。關於靶向載體，主要優勢是對靶向構建體中的冗長同源臂的要求較不嚴格。在我們的實驗中，基因靶向可以用每個靶向臂上小至300、多達500、多達1000bp的同源性完成，通過基因座DNA的PCR容易獲得或者可以合成為G-塊並獲得自IDTInc.的DNA片段(圖2A)。這與豬胎兒成纖維細胞(PFF)中基因靶向需要的至少6kb的同源性形成鮮明對比。關於DNA構建體的遞送，我們已鑑定受精後的時間窗口，其中可以將DNA和CRISPR/Cas注射入原始豬受精卵的細胞質，允許DNA在核膜形成時包裝在原核中，從而允許胚胎中同源重組介導的基因靶向。這種策略消除在豬中產生轉基因動物中的另一主要瓶頸，其中定位受精卵中的原核用於注射轉基因已成為限制性因素。此外，對於所有篩選的胚泡，基因靶向的效率為80-100％，表現出胚胎中KI構建體的準確靶向。最後的優勢是在胚胎中精確編輯僅幾個核苷酸的能力，其具有改變表型用於農業應用和用於產生生物醫學模型的能力。總的來說，我們已開發了技術以將大型動物生物技術引入基因組時代。序列表SEQIDNO:1PRNP蛋白NCBI參考序列：NC_010459.4ACGTACGCGGCCAAAAGAGTCTCAACTCCCTCCCAGAGACTCAGATTTCCGACCAGCTTGGCAGATCCCGGGCGCCGGAGCGCCAGAGCGCGCGCGCGCGCCGCCGCCGCCTCCCTTCCCCGCCCGCGCGCCTCGCCACCCCTCGGCGCCAGACACTGACAGCCCCGGAGCTGCGAGCGTCTTCTGTTCCAGCGGTGGCAGGTAAACAGCCGGG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