鹽、乾旱和UV‑B脅迫下苦蕎總黃酮含量的測定方法與流程
2023-10-06 16:32:04
本發明屬於農業生產技術領域，尤其涉及一種鹽、乾旱和UV-B脅迫下苦蕎總黃酮含量的測定方法。
背景技術：
生物總黃酮是指黃酮類化合物，是一大類天然產物，廣泛存在於植物界，是許多中草藥的有效成分。近年來國內外對茶多酚、銀杏類黃酮等的藥理和營養性的廣泛深入的研究和臨床試驗，證實類黃酮既是藥理因子，又是重要的營養因子為一種新發現的營養素，對人體具有重要的生理保健功效。經試驗研究苦蕎中總黃酮含量豐富。
現有的黃酮含量測定方法有NaNO2-Al(NO3)3法、高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳法等。但這些方法多存在價格昂貴、處理時間較長、偏差高等缺點。徐寶才、丁霄霖採用NaNO2-Al(NO3)3法測定苦蕎黃酮含量，得到了偏高的測定結果，且其認為產生該結果的原因為苦蕎含有的原兒茶酸等物質對測定結果造成了幹擾。羅光宏等認為雖然高效液相色譜法(HPLC)具有分析精度高等特點，但其價格昂貴，且前處理時間較長。劉璐等認為毛細管電泳法具有高效快速等優點，但此方法所需設備較昂貴，且難以尋找組分標準樣品。苦蕎在不同環境下不同時期各器官總黃酮含量不一樣，且各器官產生的影響總黃酮含量測定的幹擾物質的含量也不同，因此，現有技術很難低價高效去測定逆境脅迫下不同生長期苦蕎的各器官總黃酮含量。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種鹽、乾旱和UV-B脅迫下苦蕎總黃酮含量的測定方法，旨在解決苦蕎在不同環境下不同時期總黃酮含量不一樣，現有技術很難低價高效去測定其含量等問題。
本發明是這樣實現的，一種鹽、乾旱和UV-B脅迫下苦蕎總黃酮含量的測定方法，所述鹽、乾旱和UV-B脅迫下苦蕎總黃酮含量的測定方法為以提取的苦蕎總黃酮為材料，用AlCl3法分別測定鹽，乾旱和UV-B不同脅迫條件下芽期、苗期、成熟期的苦蕎各器官中的總黃酮含量。
進一步，所述鹽、乾旱和UV-B對苦蕎總黃酮含量的測定前需進行苦蕎的栽培和處理；具體包括：
苦蕎的栽培：將苦蕎種子萌發後12天的苦蕎定為芽期；萌發後23天為苗期；萌發後72天為成熟期；
鹽處理：分別在苦蕎芽期、苗期和成熟期各選取長勢一致的植株，分為對照組CK和處理組，每組由9盆組成；處理組用100mM NaCl溶液澆灌植株，對照組用自來水澆灌；
乾旱處理：分別在苦蕎各生長期選取長勢一致的植株，分為對照組CK和處理組，每組由9盆組成；處理組用30％PEG-6000溶液澆灌植株，對照組用自來水澆灌；
UV-B處理：分別在苦蕎各生長期選取長勢一致的植株，分為對照組CK和處理組，每組由9盆組成；處理組用UV-B 302nm的燈管照射植物12h，24h，輻射強度為0.1mW/cm2；對照組自然光照射。
進一步，苦蕎的栽培和處理後需進行：
樣品採集：選取處理後12h，24h的芽期、苗期、成熟期苦蕎的器官，各3份置於60℃恆溫箱烘至恆重，用於提取苦蕎總黃酮；所述器官包括根、莖、葉、種子。
進一步，苦蕎總黃酮的提取方法包括：
分別收集UV-B、乾旱和鹽脅迫的不同時期苦蕎器官樣品，60℃烘至恆重，粉碎過60目篩；
精確稱0.100g樣品至10mL EP，加入3mL 65％乙醇，用膠帶密封；
超聲波破碎細胞，輸出功率20％，20min，再12000r/min離心5min，然後將上清液轉移至另一EP中，再加2mL 65％乙醇，繼續超聲波10min，12000r/min離心5min，將上清液轉移和合併；
為排除樣品中葉綠素的幹擾，用等體積石油醚萃取至無色後，收集下層液體，過0.45um濾膜所得樣品即為苦蕎總黃酮提取液。
進一步，AlCl3法測定總黃酮含量的方法包括：
蘆丁標準曲線的製作：取7個10mL容量瓶，首先，依次加入不同體積的蘆丁標準品0mL、0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL；然後，分別加入2mL 0.1mol/L AlCl3溶液，混勻後靜置10min；最後，分別加入3mL 1mol/L的KOAc溶液，並用65％乙醇定容至10mL，混勻後室溫放置30min；此時溶液中蘆丁濃度依次為0mg/ml、0.00125mg/ml、0.0025mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml，于波長425nm下分別測定吸光度；以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，建立標準曲線、回歸方程和相關係數；
樣品測定：分別取每個處理點的3個黃酮提取樣品於10mL容量瓶中，並編號；測定其A425吸光度值並對照標準曲線求得總黃酮濃度，按下式求出總黃酮含量：
式中：Y—樣品總黃酮含量(g/100g,％)；
c一依據標準曲線計算出被測液中黃酮濃度(mg/ml)；
m一試樣的質量(g)；
v一待測液分取的體積(mL)；
n一待測液稀釋倍數。
進一步，蘆丁標準曲線的制定中，配製蘆丁標準溶液，進行蘆丁標準溶液的顯色反應，並測定蘆丁標準溶液在OD425處的吸光度A值，測定結果；根據蘆丁標準溶液對應的吸光值A，繪製蘆丁標準曲線，並以最小二乘法求得回歸方程：
Y＝34.352+0.0103，相關係數R2＝0.9993。
本發明提供的一種鹽、乾旱和UV-B脅迫下苦蕎總黃酮含量的測定方法，首次系統的分析了不同逆境(鹽、乾旱、UV-B)對不同生長期苦蕎總黃酮含量變化的分析。
本發明分別使用鹽、乾旱和UV-B脅迫處理不同生長期的苦蕎，結果顯示，各器官的總黃酮含量從高到低依次為葉子、籽粒、莖、根。
本發明不同脅迫處理對不同生育期苦蕎各器官的總黃酮含量的影響不盡相。在不同脅迫處理下，苦蕎根和莖的黃酮含量變化不大，分別維持在1.5％和2.4％左右，成熟期種子也維持在2.6％左右。
附圖說明
圖1是本發明實施例提供的苦蕎總黃酮的提取方法流程圖。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。
本發明實施例提供的鹽、乾旱和UV-B脅迫下苦蕎總黃酮含量的測定方法，以提取的苦蕎總黃酮為材料，用AlCl3法分別測定鹽，乾旱和UV-B不同脅迫條件下芽期芽期、苗期、成熟期的苦蕎各器官中的總黃酮含量。
進一步，所述鹽、乾旱和UV-B對苦蕎總黃酮含量的測定前需進行苦蕎的栽培和處理；具體包括：
苦蕎的栽培：將苦蕎種子萌發後12天的苦蕎定為芽期；萌發後23天為苗期；萌發後72天為成熟期；
鹽處理：分別在苦蕎芽期、苗期和成熟期各選取長勢一致的植株，分為對照組CK和處理組，每組由9盆組成；處理組用100mM NaCl溶液澆灌植株，對照組用自來水澆灌；
乾旱處理：分別在苦蕎各生長期選取長勢一致的植株，分為對照組CK和處理組，每組由9盆組成；處理組用30％PEG-6000溶液澆灌植株，對照組用自來水澆灌；
UV-B處理：分別在苦蕎各生長期選取長勢一致的植株，分為對照組CK和處理組，每組由9盆組成；處理組用UV-B 302nm的燈管照射植物12h，24h，輻射強度為0.1mW/cm2；對照組自然光照射。
進一步，苦蕎的栽培和處理後需進行：
樣品採集：選取處理後12h，24h的芽期、苗期、成熟期苦蕎的器官，各3份置於60℃恆溫箱烘至恆重，用於提取苦蕎總黃酮；所述器官包括根、莖、葉、種子。
如圖1所示，苦蕎總黃酮的提取方法包括：
S101:分別收集UV-B、乾旱和鹽脅迫的不同時期苦蕎器官樣品，60℃烘至恆重，粉碎過60目篩；
S102:精確稱0.100g樣品至10mL EP，加入3mL 65％乙醇，用膠帶密封；
S103:超聲波破碎細胞，輸出功率20％，20min，再12000r/min離心5min，然後將上清液轉移至另一EP中，再加2mL 65％乙醇，繼續超聲波10min，12000r/min離心5min，將上清液轉移和合併；
S104:為排除樣品中葉綠素的幹擾，用等體積石油醚萃取至無色後，收集下層液體，過0.45um濾膜所得樣品即為苦蕎總黃酮提取液。
AlCl3法測定總黃酮含量的方法包括：
蘆丁標準曲線的製作：取7個10mL容量瓶，依次加入0mL、0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL不同濃度的蘆丁標準品；2mL 0.1mol/L AlCl3溶液混勻後靜置10min。加入3mL 1mol/L的KOAc溶液並使用65％乙醇定容至10mL，混勻後室溫放置30min，波長425nm測定吸光度；以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，建立標準曲線、回歸方程和相關係數；
樣品測定：分別取每個處理點的3個黃酮提取樣品於10mL容量瓶中，並編號；測定其A425吸光度值並對照標準曲線求得總黃酮濃度，按下式求出總黃酮含量：
式中：Y—樣品總黃酮含量(g/100g,％)；
c一依據標準曲線計算出被測液中黃酮濃度(mg/ml)；
m一試樣的質量(g)；
v一待測液分取的體積(mL)；
n一待測液稀釋倍數。
蘆丁標準曲線的制定中，配製蘆丁標準溶液，進行蘆丁標準溶液的顯色反應，並測定蘆丁標準溶液在OD425處的吸光度A值，測定結果；根據蘆丁標準溶液對應的吸光值A，繪製蘆丁標準曲線，並以最小二乘法求得回歸方程：
Y＝34.352+0.0103，相關係數R2＝0.9993。
下面結合具體實施例對本發明的應用原理作進一步的描述。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1植物材料
苦蕎種子「川蕎3號」。
1.1.2主要試劑和藥品
液相RNase清除劑、柱式植物RNAout 3.0試劑盒(購自天澤基因工程有限公司)；逆轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBRR Premix Ex TaqTM‖購自Takara公司。八聯管、1.5mL Ep、200μL Ep、1mL Ep、200μL Ep、10μL Ep均為RNase free的一次性製品(購自BIO-RAD公司)。一次性注射器、一次性濾膜、液氮等耗材均為國產。蘆丁標準(C27H30O16·3H2O)、AlCl3、CH3COOK、無水乙醇、乙醚、氯仿等藥品均為國產分析純。
1.1.3主要儀器
PCR儀(BIO-RAD，S1000TM Thermal Cycler)，螢光定量PCR(Bio Rad)，-80℃冰箱(Thermo，Forma-86ULT Freezer)，Eppendorf(USA)，高速臺式冷凍離心機(Thermo，IEC MICROLITE RF)，核酸蛋白檢測儀(BIO-RAD，SmartSpecTM Plus Spectrophotometer)，電泳設備、凝膠成像系統(BIO-RAD)，UV-B燈管(北京光電所)。
1.2方法
1.2.1苦蕎的栽培及處理
供試材料系「川蕎3號」，2013年3月27日種於四川農業大學農場氣象站內，土壤肥力中等。將種子萌發後12天的苦蕎定為芽期(子葉盛開)；萌發後23天為苗期(四葉期)；萌發後72天為成熟期(50％以上的籽粒成熟)。
鹽處理：分別在芽期、苗期和成熟期各選取長勢一致的植株，分為對照組(CK)和處理組，每組由9盆組成。處理組用100mM NaCl溶液澆灌植株，對照組用自來水澆灌。
乾旱處理：分別在各生長期選取長勢一致的植株，分為對照組(CK)和處理組，每組由9盆組成。處理組用30％PEG-6000溶液澆灌植株，對照組用自來水澆灌。
UV-B處理：分別在各生長期選取長勢一致的植株，分為對照組(CK)和處理組，每組由9盆組成。處理組用UV-B(302nm)燈管照射植物12h，24h，輻射強度為0.1mW/cm2。對照組自然光照射。
1.2.2樣品採集
選取處理後12h，24h的芽期、苗期、成熟期苦蕎的器官(根、莖、葉、種子)，各3份置於60℃恆溫箱烘至恆重，用於提取總黃酮。
1.2.3苦蕎總黃酮的提取和測定
使用AlCl3法測定總黃酮含量。
1.2.3.1苦蕎總黃酮提取
分別收集UV-B、乾旱和鹽脅迫的不同時期苦蕎器官樣品，60℃烘至恆重，粉碎過60目篩。精確稱0.100g樣品至10mL EP，加入3mL 65％乙醇，用膠帶密封。超聲波破碎細胞，輸出功率20％，20min，再12000r/min離心5min，然後將上清液轉移至另一EP中，再加2mL 65％乙醇，繼續超聲波10min，12000r/min離心5min，將上清液轉移和合併。為排除樣品中葉綠素的幹擾，用等體積石油醚萃取至無色後，收集下層液體，過0.45um濾膜所得樣品即為苦蕎總黃酮提取液。
1.2.3.2 AlCl3法測定總黃酮含量
1.蘆丁標準曲線的製作：取7個10mL容量瓶，按表3中依次加入不同濃度的蘆丁標準品，2mL 0.1mol/L AlCl3溶液混勻後靜置10min。加入3mL 1mol/L的KOAc溶液並使用65％乙醇定容至10mL，混勻後室溫放置30min，波長425nm測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，建立標準曲線、回歸方程和相關係數。
2.樣品測定：分別取每個處理點的3個黃酮提取樣品於10mL容量瓶中，編號8-10。測定其A425吸光度值並對照標準曲線求得總黃酮濃度，按下式求出總黃酮含量：
式中：Y—樣品總黃酮含量(g/100g,％)；
c一依據標準曲線計算出被測液中黃酮濃度(mg/ml)；
m一試樣的質量(g)；
v一待測液分取的體積(mL)；
n一待測液稀釋倍數；
表1 AlCl3法測定總黃酮含量
2結果與分析
2.1蘆丁標準曲線的制定
按表1配製蘆丁標準溶液，按1.2.3.2進行蘆丁標準溶液的顯色反應，並測定其在OD425處的吸光度A值，測定結果如表2。蘆丁標準溶液對應的吸光值A，繪製蘆丁標準曲線，並以最小二乘法求得回歸方程Y＝34.352+0.0103，相關係數R2＝0.9993。
表2蘆丁標準溶液吸光值
Table 7Absorbance of Rutin Standard Solution
2.2鹽，乾旱和UV-B脅迫下不同生長期苦蕎總黃酮含量的測定
2.2.1鹽，乾旱和UV-B脅迫下芽期苦蕎總黃酮含量
以1.2.3.1中提取的苦蕎總黃酮為材料，用AlCl3法分別測定不同脅迫條件下芽期苦蕎各器官中的總黃酮(mg/100mg乾重，％)。苦蕎芽期中的總黃酮主要集中在葉子中，莖次之，根中最低。逆境脅迫前，對照組葉子的總黃酮含量為7.56％，其含量約為莖中的3倍，為根中的6倍。鹽脅迫後，芽期苦蕎葉子中的總黃酮含量顯著升高(P<0.05)，根、莖中的總黃酮含量顯著下降(P<0.05)。乾旱處理後，芽期苦蕎根、莖中的總黃酮含量顯著下降(P<0.05)，葉子中的總黃酮含量變化不顯著。UV-B脅迫後，芽期苦蕎葉子中的總黃酮含量極顯著升高(P<0.01)，根、莖中的總黃酮含量顯著下降(P<0.05)。在不同逆境中芽期苦蕎根、莖中總黃酮含量顯著下降，然而在葉子中的總黃酮含量(除乾旱脅迫)均顯著上升(P0.05)，無「*」的代表顯著(P<0.05)。
2.2.2鹽，乾旱和UV-B脅迫下苗期苦蕎總黃酮含量
苦蕎苗期中總黃酮含量主要集中在葉子中，莖次之，根中最低。逆境脅迫前，對照組葉子的總黃酮含量為3.66％，其約為根、莖總黃酮含量的5倍。鹽處理後，苗期苦蕎根、莖、葉中的總黃酮含量均顯著升高(P<0.01)，葉子、莖、根的總黃酮含量分別增加了1.7％、0.75％、0.34％。乾旱處理後，苗期苦蕎根、莖、葉中的總黃酮含量均極顯著升高(P<0.01)，葉子、莖、根的總黃酮含量分別增加了1.5％、0.74％、0.28％。UV-B處理後，苗期苦蕎葉子中的總黃酮含量極顯著的升高(P0.05)，在UV-B處理12h後，根中總黃酮含量變化不顯著，處理24h後，根中總黃酮含量增加了0.1％。在不同逆境中苗期苦蕎根、莖、葉均顯著升高(P0.05)，無「*」的代表顯著(P0.05),no"*"on behalf of a significant(P<0.05).
2.2.4鹽，乾旱和UV-B脅迫下成熟期苦蕎總黃酮含量
苦蕎成熟期中總黃酮含量主要集中在葉子中，種子、莖次之，根中最低。逆境脅迫前，對照組中葉子的總黃酮含量為7.90％，種子為1.35％。鹽脅迫處理後，成熟期苦蕎根、莖、葉、種子的總黃酮含量均極顯著升高(P<0.01)，脅迫24h後，根、莖、葉、種子中的總黃酮含量分別比對照組的總黃酮含量增加了2.05％，3.24％，2.55％，2.45％。乾旱脅迫處理後，成熟期苦蕎根、莖、種子中的總黃酮含量均顯著升高(P<0.05),葉子中的總黃酮含量顯著下降(P<0.05)。根、莖、種子中的總黃酮含量分別比對照組的總黃酮含量增加了0.62％、2.24％、2.45％，葉子中的總黃酮下降了1.15％。UV-B脅迫處理後，成熟期苦蕎根、莖、葉、種子中的總黃酮含量均顯著升高(P<0.05)，脅迫12h後，根、莖、葉、種子的總黃酮含量分別比對照組的總黃酮含量增加了1.31％、1.2％、2.16％、1.35％。在不同逆境中成熟期苦蕎根、莖、種子中的總黃酮含量均顯著升高(P0.05)，無「*」的代表顯著(P<0.05)。
3討論
3.1逆境脅迫下不同生長期苦蕎各器官的總黃酮含量
植物中的黃酮類物質廣泛的參與了其抗逆應答。我國苦蕎主要種植於高緯度、高寒、乾旱、紫外輻射強烈的邊遠山區，環境相對惡劣。為了適應惡劣的環境，苦蕎可能通過調控黃酮和其它物質的合成來預防高鹽、乾旱UV-B等對生長發育的不利影響。
苦蕎可通過調控黃酮來吸收UV-B的輻射，由此形成一種自我保護機制，有效的免受UV-B帶來的損傷。Kreft等為了檢測三種不同程度的UV-B輻射對苦蕎蘆丁含量的影響，發現苦蕎蘆丁含量在環繞UV-B下最高，其次是增強UV-B，然後是減弱UV-B，同時發現苦蕎的葉子比花對UV-B脅迫處理要敏感，在環繞UV-B輻射下葉子的蘆丁含量增加了97％，花的蘆丁含量增加了19％。Suzuki等分別採用UV-B、寒冷和乾旱脅迫處理苦蕎葉子，發現苦蕎葉子蘆丁含量在UV-B、寒冷和乾旱脅迫處理下分別增加了129％，190％和122％，同時還增加蘆丁糖苷酶的活性。Jeong-Ho Lim等利用不同濃度的NaCl處理苦蕎芽，結果顯示苦蕎芽的黃酮類物質有著不同程度的增加，其中100mM NaCl處理7天後，苦蕎芽的黃酮含量增加了153％。蔡娜等水分脅迫苦蕎，結果顯示水分脅迫能促使苦蕎總黃酮和蘆丁的合成與積累。
在營養生長期(芽期、苗期)，苦蕎各器官的黃酮含量由高到低依次是葉、莖、根。本發明中，芽期苦蕎的葉子對外界壞境的變化和脅迫較其它器官敏感，導致葉子中總黃酮的含量變化與根、莖中的總黃酮含量變化存在一定差異。在鹽、乾旱和UV-B 3種不同脅迫處理下，根和莖中總黃酮含量均下降，其中根中總黃酮的含量下降極顯著(P<0.01)，而葉子中的總黃酮含量則顯著的上升(P<0.05)，其中乾旱和UV-B處理24h後，葉子中的總黃酮含量有所下降。原因可能在於：在面對鹽、乾旱脅迫時，雖然苦蕎的根是最先受到刺激，但由於植物的根主要是吸收和供給礦物質等，而不是合成代謝的主要區域，只能消耗總黃酮來克服鹽和乾旱脅迫造成氧自由基等升高所造成的傷害。由於莖面臨鹽、乾旱和UV-B脅迫是次要的，其主要是起營養傳輸功能，因此莖中的總黃酮含量下降不是很明顯。由於葉子是合成代謝的主要區域，在受到外界刺激，如鹽、乾旱、UV-B脅迫時，葉子會快速合成相關物質來抵禦這種不良的刺激，因此，在面臨不同逆境時葉子中總黃酮含量會顯著上升。當葉子長期在UV-B、乾旱下，會因葉面被灼傷，氧化脅迫等而引起有關光合作用的酶失活或變性，導致總黃酮的合成下降，同時其合成的部分黃酮類物質會被傳送到其他器官中，從而引起乾旱、UV-B處理24h後葉子中總黃酮的含量下降。
在鹽、乾旱和UV-B 3種不同脅迫處理下，苦蕎苗期的根、莖、葉中總黃酮含量均顯著上升(P<0.05)，其中葉子經UV-B脅迫後總黃酮含量提高極為顯著(P<0.01)，達到8.47％。通過對比脅迫前對照組與脅迫後的處理組的總黃酮含量表明：鹽、乾旱和UV-B均可刺激苦蕎的黃酮合成和積累，且葉中總黃酮的含量變化要較莖、根中的顯著。造成這種現象的原因可能是：根主要是吸收和供給礦物質等，基本不含色素類物質；莖主要是起營養傳輸功能，其蛋白質含量和色素類物質的含量都比葉子中的低；因此，葉片中抗逆相關的蛋白或黃酮類物質必須被高效的合成並積累以此來抵抗不同逆境帶來的損傷。
4結論
本發明首次系統的分析了不同逆境(鹽、乾旱、UV-B)對不同生長期苦蕎總黃酮含量變化的分析，
(1)分別使用鹽、乾旱和UV-B脅迫處理不同生長期的苦蕎，結果顯示，各器官的總黃酮含量從高到低依次為葉子、籽粒、莖、根。
(2)不同脅迫處理對不同生育期苦蕎各器官的總黃酮含量的影響不盡相同。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。