利用d－胺基酸的選擇性植物生長的製作方法

2023-10-07 01:56:14

專利名稱：利用d－胺基酸的選擇性植物生長的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有外源遺傳物質的植物細胞、植物組織或維管植物的選擇性生長。
植物需要大量的氮作為礦質營養素。植物生長，特別是在農業中，通常受到可獲得氮量的限制。
傳統上一直認為植物僅能利用銨和/或硝酸鹽作為氮源。這些化合物要麼由如有機氮的礦化和共生的原核生物固氮作用的自然過程提供，要麼通過施用含有經工業固定的氮的肥料提供。
然而最近的研究表明，植物也可以利用某些有機氮化合物以及無機氮(Nholm，T.等(1998)，Nature，392914-916；Nholm，T.等，(2000)，Ecology，811155-1161；Nholm，T.和Persson，J.(2001)，Physiol Plant，111419-426；Lipson，D.和Nholm，T.(2001)，Oecologia 128305-316)。特別是，從土壤中吸收和代謝胺基酸似乎是植物的普遍特徵。
在所有用作構建蛋白質的胺基酸中，發現除一種胺基酸(甘氨酸)外所有的胺基酸均具有兩種異構體形式，這兩種異構體利用其旋轉偏振光的能力進行區分。自然界中使光左旋的異構體的量最多，並將其命名為L-或左旋的，而較少見的異構體形式命名為D-或右旋的。
雖然在自然界中存在D-胺基酸，但它們僅以極低的濃度存在，並且僅存在於如細菌細胞壁蛋白質的特定化合物中(如在化合物肽葡聚糖中)。
儘管植物胺基酸轉運蛋白介導D-和L-兩種形式的胺基酸的運輸(Soldal，T.和Nissen，P.(1978)，Physiol.Plant.43181-188，Boorer，K.J.等.1996.J.Biol.Chem 2712213-2220，Montamat等，1999，Plant Mol.Biol.41259-268)，但是植物缺乏將D-胺基酸轉換成在可用於植物體內合成反應的氮形式所必需的酶。因此植物不能利用D-胺基酸作為氮源。
然而細菌、真菌和動物中普遍存在著代謝D-胺基酸的能力。導致生物體內D-胺基酸分解代謝的幾種反應已得到描述(參見圖2)(Friedman，M(1999)J.Agric.Food Chem.473457-3479，Pilone，M.S.(2000)CMLS 571732-1747，Yurimoto等，(2000)Yeast 16(13)1217-1227)。
本發明者已經發現，表達編碼代謝D-胺基酸的酶的異源基因的植物能夠利用該D-胺基酸作為氮源，並能夠在不能使野生型植物生長的培養基上生長。
通常，僅需要一種D-胺基酸代謝酶即可將D-胺基酸轉換成可參與普通植物氮代謝路徑的化合物(即非右旋化合物)。例如，可應用D-絲氨酸脫水酶將D-絲氨酸轉換成氨、丙酮酸和水，可應用D-胺基酸氧化酶將D-胺基酸轉換成氨、酮酸(由D-胺基酸底物決定)和過氧化氫。因此，組成D-胺基酸的否則無法利用的氮能被酶促轉化成植物可易於利用的形式。
本發明的一個方面是提供了一種包含有編碼具D-胺基酸代謝活性的多肽的序列的分離核酸，該序列可操作地連接到一種或多種植物特異的調節元件。
在本發明的一些實施方案中，分離核酸可由編碼具有D-胺基酸代謝活性的多肽的序列和一種或多種與該序列可操作地連接的植物特異的調節元件組成。
在一些實施方案中，D-胺基酸可用作選擇性標記。上述的分離核酸可進一步包含編碼目的多肽的異源核酸序列。例如，該多肽的表達可以有利方式改變植物的表型或產生其它有利的影響。具有D-胺基酸代謝活性的多肽的表達允許包含該異源核酸序列的轉化株的有效篩選，如此處所描述的。
具有D-胺基酸代謝活性的多肽意指這樣的多肽，所述多肽將D-胺基酸底物轉化成的產物用作內源植物酶的底物(即該底物可由植物進行代謝)。由植物進行代謝的產物包括非右旋化合物，即非手性或L-化合物。因此，D-胺基酸代謝多肽催化D-胺基酸底物向產物的生物化學轉化，所述產物如非右旋產物，這些產物可以被植物用作營養源，特別是用作氮源。
適宜的D-胺基酸代謝多肽可為真核生物酶，例如來於酵母(例如纖細紅酵母(Rhodotorula Gracilis))、真菌或動物的酶，或為原核生物酶，例如來於細菌如大腸桿菌的酶。代謝D-胺基酸的適宜多肽的示例在表1和表2中顯示。
如上所述，還未報導在植物內發現內源的D-胺基酸代謝活性。
用於D-胺基酸代謝多肽的底物可為D-arg、D-glu、D-ala、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-asn、D-phe、D-pro、D-ser、D-thr、D-trp、D-tyr或D-val。
其它作為D-胺基酸代謝酶的適宜底物包括非蛋白的右旋胺基酸、右旋胺基酸前體及右旋胺基酸衍生物。此類底物僅在由D-胺基酸代謝酶使之轉化成適宜的可代謝形式之後才可能被用作植物氮源。適宜的前體包括D-鳥氨酸和D-瓜氨酸。
優選地用於D-胺基酸代謝多肽的底物為D-ser，D-asn，D-ala，D-ile，D-glu，D-arg，D-lys，D-his或D-asp中的一種，更優選地為D-ala，D-ile或D-ser。
在D-胺基酸中非手性醯胺基團的存在可能導致少量的植物生長，這是由於該基團通常能夠由植物代謝並用作氮源。例如，在含D-gln的培養基上，內源的穀氨酸合成酶作用於非手性醯胺基團並產生D-glu。因為該非手性活性的產物是其它的自身不能被內源的植物酶代謝的D-氨基化合物，利用這些D-胺基酸生長的生長速率很低，儘管一些氮是可用的。
D-胺基酸代謝多肽可為如氧化酶、消旋酶、脫羧酶、轉氨酶、脫水酶(也稱作氨裂解酶)。氧化酶催化D-胺基酸轉化成NH4+、酮酸(取決於D-胺基酸底物)和H2O2(參見圖2)。消旋酶將D-胺基酸轉化成相應的L-胺基酸形式。L-胺基酸可用作植物氮源。脫羧酶將D-胺基酸轉化成可由植物代謝的γ-胺基酸。轉氨酶將D-胺基酸轉化成不同的L或D胺基酸形式。L-胺基酸能直接被代謝，而D-胺基酸則需進一步轉化成可代謝的形式。脫水酶催化D-胺基酸轉化成NH4+、酮酸(取決於D-胺基酸底物)和H2O(參見圖2)。適宜的氧化酶、消旋酶、脫羧酶、轉氨酶和脫水酶的示例在表1和表2中顯示。
在優選的實施方案中，D-胺基酸代謝多肽為脫水酶，例如D-ser氨裂解酶(以前稱作D-ser脫水酶)，或為氧化酶，如D-胺基酸氧化酶。
採用常規技術，技術人員能夠容易地確定多肽是否具有D-胺基酸代謝活性(即其為D-胺基酸代謝酶)，如上所述。
適宜的D-胺基酸代謝多肽也包括該多肽的片段、突變體、衍生物、變體和等位基因，所述多肽在表1和表2進行示例。
適宜的片段、突變體、衍生物、變體和等位基因保留了D-胺基酸代謝多肽的功能特性，即其催化D-胺基酸底物轉化成植物可代謝形式的反應。產生突變體、變體或衍生物的序列變化可為核酸中一處或多處一個或多個核苷酸的添加、插入、缺失或替換，導致所編碼多肽中出現一個或多個胺基酸的添加、插入、缺失或替換。當然，也包括不使所編碼胺基酸的序列發生變化的核酸改變。
代謝D-胺基酸底物的多肽可包含與表1或表2中所示序列的同一性大於約30％、大於約35％、大於約40％、大於約45％、大於約55％、大於約65％、大於約70％、大於約80％、大於約90％或大於約95％的胺基酸序列。該序列與表1或表2中所示序列的相似性可大於約30％、大於約40％、大於約50％、大於約60％、大於約70％、大於約80％或大於約90％。
序列相似性和同一性，通常參考GAP(Genetics Computer Group，麥迪遜，WI)算法進行定義。GAP用Needleman和Wunsch算法進行兩條完整序列的比對，以達到最大匹配數和最小化缺口(gap)數。通常應用默認參數，其缺口創建罰分＝12，缺口延伸罰分＝4。
儘管應用GAP為優選，但也可應用其它算法，例如BLAST(該算法應用Altschul等，(1990)J.Mol.Boil.215405-410的方法)、FASTA(該算法應用Pearson和Lipman，(1988)PNAS USA 852444-2448的方法)或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.Mol.Boil.147195-197)或前述的Altschul等人(1990)的TBLASTN程序，所述程序通常應用默認參數。特別是，可應用psi-Blast算法(Nucl.AcidsRes.(1997)25 3389-3402)。
相似性允許「保守變異」，例如將如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的疏水殘基替換為另一疏水殘基，或將一極性殘基替換為另一極性殘基，如精氨酸替換為賴氨酸、穀氨酸替換為天冬氨酸或穀氨醯胺替換為天冬醯胺。特定的胺基酸序列變體可能與此處描述的已知多肽的序列不同，所述變體通過插入、添加、替換或缺失1、2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50或多於50個胺基酸而形成。
植物特異的調控序列或元件是指相對於其它細胞類型而言優選地指導植物細胞內核酸表達(即轉錄)的序列。
例如，該序列在非植物細胞如細菌或哺乳動物細胞內的表達可降低或失效。例如，適宜的調控序列可來自植物病毒如花椰菜花葉病毒35(Cauliflower Mosaic Virus 35)。
調控序列優選地異源或外源於編碼D-胺基酸代謝酶的基因。這種調控序列可在植物細胞內提供有效的表達。
術語「異源的」可用於指出所研究的核苷酸基因/序列已導入到該植物細胞或其祖先，所述導入利用基因工程或重組方法，也即通過人工幹預進行。
對植物細胞而言異源的或外源的核苷序列在所述類型、品系或種類的細胞內可為非天然存在。例如，未見報導植物細胞內含有D-胺基酸代謝酶(即將D-胺基酸轉化成植物可代謝形式的酶)，且因此編碼具有該活性的多肽的核酸對於用其進行轉化的植物細胞而言是「異源的」。
除了與編碼D-胺基酸代謝多肽的基因異源的調控序列之外，核酸可包含一個或多個源自D-胺基酸代謝多肽的內源啟動子的順式元件。
「啟動子」意指這樣的核苷酸序列，即該序列可啟動與其可操作地連接的下遊(即雙鏈DNA有意鏈上的3』方向)DNA的轉錄。
「可操作地連接」是指作為同一核酸分子的一部分進行連接、置於適宜的位置並正確導向以使其可由啟動子啟動而進行轉錄。可操作地連接到啟動子的DNA置於啟動子的「轉錄啟動調節之下」。
適宜的調節元件可包括與核酸編碼序列可操作地連接的誘導型啟動子。本發明也提供了用該基因構建體轉化的植物細胞和方法，所述方法包括將該構建體導入植物細胞和/或誘導構建體在植物細胞內表達，例如通過施用適宜的刺激而實現。
本領域內的技術人員充分理解用於啟動子的術語「可誘導的」。本質上而言，對施加的刺激(該刺激可為細胞內產生或外源提供)作出響應時在誘導型啟動子控制下的表達得以「打開」或增加。在不同啟動子間刺激的本質存在差異。無論缺乏刺激時的表達水平如何，在恰當的刺激存在時，源自任何誘導型啟動子的表達均得以提高。優選的情形是，在有效量的相關刺激存在下的表達水平提高改變了表型特徵，即增強D-胺基酸的耐受。因此誘導型(或「可開啟的」)啟動子可用於在缺乏刺激時引起基礎水平的表達，所述水平太低(且實際上有可能為零)以至於不能導致產生所需的D-胺基酸耐受表型。在施加刺激後，表達提高(或開啟)到可引起D-胺基酸耐受增強的水平。
誘導型啟動子的多種示例為本領域內的技術人員已知。
其它的適宜啟動子可包括實際上在所有植物組織中均以高水平表達的花椰菜花葉病毒35S(CaMV 35S)基因啟動子(Benfey等，(1990)EMBO J91677-1684)；在蔬菜頂端分生組織及一些植物體的局限部位如內韌皮部、花原基、根和新芽的發枝點表達的花椰菜meri 5啟動子(Medford，J.I.(1992)Plant Cell 4，1029-1039；Medford等，(1991)Plant Cell 3，359-370)，以及在花發育非常早期表達的鼠耳芥LEAFY啟動子(Weigel等，(1992)細胞(Cell)69，843-859)。其它示例在下述出版物的第120頁公開，Lindsey和Jones(1989)，「農學植物生物技術(PLANT BIOTECHNOLOGY inAGRICULTURE)」，OU Press出版，Milton Keynes，英國。
本發明提供了包含如上所述的核酸的載體，例如質粒或病毒表達載體。
如此處所描述的，從編碼核酸表達具有D-胺基酸代謝活性的多肽可被用於篩選含有如此處描述的核酸構建體或載體的轉化株。
在一些實施案例中，載體另外包括由嵌合基因組成的選擇性遺傳標記，所述嵌合基因賦予載體可選擇的表型，例如抗生素的抗性，如卡那黴素、潮黴素、膦絲菌素、綠黃隆(chlorsulfuron)、氨甲蝶呤、慶大黴素、壯觀黴素、咪唑啉酮類和草甘膦抗性。如果需要，除應用D-胺基酸代謝多肽的表達進行篩選之外，上述標記允許進行二級篩選。
本發明的另一方面提供了如此處所描述的核酸在產生轉基因植物中的應用。該方法可允許進行下述轉基因植物的篩選或選擇性繁殖，所述轉基因植物包含外源遺傳物質或可用於提高植物對D-胺基酸的耐受。優選地通過將植物或植物細胞培養在下述的培養基中進行篩選，所述培養基具有包含D-胺基酸的詳細定義的氮含量，即培養基中的氮全部或部分以D-胺基酸形式存在。
培養基中D-胺基酸的特性通過植物或植物細胞表達的異源D-胺基酸代謝多肽的專一性確定，即培養基含有異源D-胺基酸代謝多肽的D-胺基酸底物。例如，當植物表達異源D-絲氨酸脫水酶時，培養基中需存在D-絲氨酸。
根據本發明的核酸可提供為從自然環境中分離和/或純化而獲得的核酸，為相當純的或均質的形式，或其不含或基本不含來源於該物種的其它核酸。這裡用到的術語「分離的」包含所有的這些可能性。
當然，核酸可為雙鏈或單鏈的cDNA、基因組DNA或RNA。因此可在適宜的條件下在適宜的宿主植物細胞內由編碼核酸進行表達製備表達產物。
核酸分子可為全部或部分合成的分子。特別是，核酸分子可為重組體，其中在自然中並不共同存在(並非鄰近存在)的核酸序列已經被連接或人工組合。備選地，可直接合成核酸分子，例如應用自動合成儀進行合成。
本領域內那些技術人員能夠很好地構建載體，並為重組基因表達設計方案，特別是在植物細胞內中的表達。可選擇或構建包含適宜調控序列的適宜載體，所述調控序列包括啟動子序列、終止子片斷、聚腺苷酸化序列、增強子順序、標記基因和其它適宜的序列。更多的細節參見，例如分子克隆實驗手冊第三版，Sambrook和Russell，2001，冷泉海港實驗室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
「載體」定義為其中包括雙鏈或單鏈的線型或環型的任何質粒、粘粒、噬菌體或農桿菌雙元載體，載體可是或不是可自身傳遞的或可移動的，且其可轉化原核或真核宿主，特別是植物宿主，所述轉化通過整合到細胞基因組中或存在於染色體外(例如具有複製起點的自主複製質粒)實現。
特別地包括穿梭載體，該載體是指其天然具有或通過設計而具有在兩種不同生物體內進行複製的能力的DNA載體，該載體可篩選自於放線菌及相關物種、細菌和真核(例如高等植物、哺乳動物、酵母或真菌)細胞。
用於操縱核酸的多種已知技術和方法如核酸構建體的製備、誘變、測序、將DNA導入細胞以及基因表達和蛋白分析在以下中詳細描述，分子生物學方法(Protocols in Molecular Biology)，第二版，Ausubel等編輯，JOHN WILEY SONS，1992。
Bevan等(Bevan等，核酸研究(Nucl Acids Res.)(1984)12，8711-8721)以及Guerineau和Mullineaux(Guerineau和Mullineaux(1993)植物轉化與表達載體，在Plant Molecular Biology Labfax(Croy RRD編輯)牛津，BIOS Scientific Publishers，121-148頁)描述了之前已用於植物並獲得廣泛成功的具體方法和載體。
當將核酸構建體導入細胞時，必須考慮為本領域內技術人員所熟知的因素。必須有可將該構建體導入細胞的可用方法。一旦該構建體位於細胞膜內，將發生或不發生與內源染色體物質的整合。D-胺基酸代謝基因的表達產物可定向於細胞內的特定小室，例如過氧化物酶體或胞質，也或者產物在細胞的任何地方表達。最後，就植物而言，靶細胞類型必須是能夠再生成整個植株的細胞。
可應用本領域內的技術人員熟知的技術將核酸構建體和載體導入植物細胞以產生具有適當D-胺基酸耐受表型的轉基因植物。
農桿菌轉化是本領域內的技術人員廣泛應用的轉化植物細胞特別是雙子葉物種植物細胞的方法。對幾乎所有的經濟學相關的單子葉植物，其穩定、可繁殖的轉基因植物的產生目前均為常規操作(Toriyama等，(1988)BIO/TECHNOLOGY 6，1072-1074；Zhang等，(1988)Plant Cell Rep.7，379-384；Zhang等，(1988)Theor Appl Genet 76，835-840；Shimamoto等，(1989)Nature 338，274-276；Datta等，(1990)BIO/TECHNOLOGY8，736-740；Christou等，(1991)BIO/TECHNOLOGY 9，957-962；Peng等，(1991)國際水稻研究所(International Rice Research Institute)，菲律賓馬尼拉，563-574；Cao等，(1992)Plant Cell Rep.11，585-591；Li等，(1993)Plant Cell Rep.12，250-255；Rathore等，(1993)植物分子生物學(Plant Molecular Biology)21，871-884；Fromm等，(1990)BIO/TECHNOLOGY 8，833-839；Gordon-Kamm等，(1990)植物細胞(Plant Cell)2，603-618；D′Halluin等，(1992)植物細胞(Plant Cell)4，1495-1505；Walters等，(1992)植物分子生物學(Plant MolecularBiology)18，189-200；Koziel等，(1993)Biotechnology 11，194-200；Vasil，I.K.，(1994)植物分子生物學(Plant Molecular Biology)25，925-937；Weeks等，(1993)植物生理學(Plant Physiology)102，1077-1084；Somers等，(1992)BIO/TECHNOLOGY 10，1589-1594；WO92/14828)。特別是，農桿菌介導的轉化目前是一種高效的用於單子葉植物的轉化方法(Hiei等.(1994)植物學雜誌(The Plant Journal)6，271-282)。
本發明的諸方面提供了用於該轉化方法的表達載體和包含該表達載體的根瘤農桿菌，所述表達載體為卸甲農桿菌Ti質粒。
用此方法已在穀物大米、玉米、小麥、燕麥和大麥中產生了可繁殖的轉基因植物(參見Shimamoto，K.(1994)Current Opinion in Biotechnology5，158-162.；Vasil等，(1992)BIO/TECHNOLOGY 10，667-674；VAIN等，1995，Biotechnology Advances 13(4)653-671；Vasil，1996，NatureBiotechnology 14，702頁)。Wan和Lemaux(1994)植物生理學(PlantPhysiol.)10437-48中描述了能夠用於產生大量獨立轉化的可繁殖大麥植物的技術。
當農桿菌轉化效率低或無效時，可優選應用其他方法，如微投射或粒子轟擊(US 5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)、電穿孔(EP 290395，WO 8706614)、顯微注射(WO 92/09696，WO 94/00583，EP 331083，EP175966，Green等.(1987)植物組織和細胞培養(Plant Tissue and CellCulture)，學院出版社(Academic Press)、直接的DNA攝入(DE 4005152，WO 9012096，US 4684611)、脂質體介導的DNA攝入(例如Freeman等，植物細胞生理學(Plant Cell Physiol)，291353(1984))或渦旋方法(如Kindle，PNAS U.S.A.871228(1990d))。
特別地，可應用粒子轟擊技術進行裸子植物如針葉樹的轉化(Clapham，D.等.2000.Scan.J.For.Res.15151.160)。用於植物細胞轉化的物理方法在Oard，(1991)Biotech.Adv.91-11中綜述。
備選地，可應用不同技術的組合來提高轉化方法的效率，例如用農桿菌包被的粒子轟擊(EP-A-486234)或用微投射轟擊來誘導產生傷口隨後與農桿菌共培養(EP-A-486234)。
轉化後，可由如單細胞、愈傷組織或葉盤進行植物再生，上述為領域內的表標準技術。幾乎所有的植物均可通過其細胞、組織和器官獲得完全再生。可應用的技術在以下中綜述，Vasil等，植物的細胞培養與體細胞遺傳學(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)，第I、II和III卷，實驗方法及其應用(Laboratory Procedures and TheirApplications，)，學院出版社，1984以及WEISSBACH與Weissbach，植物分子生物學方法(Methods for Plant Molecular Biology)，學院出版社，1989。
具體轉化技術的選擇由其轉化靶植物種的效率以及掌握特定方法的使用者的經驗及偏愛決定。對技術人員而言顯而易見的是，將核酸導入植物細胞的轉化系統的特定選擇並非本發明的關鍵或限制，對植物再生技術的選擇也是如此。
本發明的另一方面提供了產生細胞特別是產生植物細胞的方法，該方法包括應用轉化方法將分離的核酸或含該核酸的載體摻入細胞，所述核酸包含與植物特異調控序列可操作地連接的編碼D-胺基酸代謝多肽的序列。這種產生細胞的方法可包括該核酸與細胞基因組核酸的重組以將該核酸穩定摻入其中。植物可由此處描述一個或更多個經轉化細胞中再生。
D-胺基酸代謝多肽、編碼核酸和/或包含核酸的載體可與用其轉染的細胞異源，即為外源的。
產生植物細胞的方法可包括表達核酸以及引起或允許由其表達的D-胺基酸代謝多肽在該植物細胞的胞質、過氧化物酶體、葉綠體和/或其它胞內小室內進行積聚。
製備該植物細胞的方法可包括將該核酸序列或包括該核酸的適宜載體導入植物細胞並引起或允許在載體與植物細胞基因組間發生重組以將核酸序列導入基因組內。
方法還可進一步包括有性或無性繁殖或產生由上述植物細胞再生的植物的下一代或後裔。
本發明進一步包含經上述的核酸序列或載體轉化的宿主細胞，即細胞包含以上描述的核酸或載體，宿主細胞特別地為植物細胞如高等植物細胞，或微生物植物細胞。因此，提供了包含如此處所述的核苷酸序列的宿主細胞，如植物細胞。在細胞內，核苷酸序列可整合到染色體，也可能位於染色體之外。每個單倍染色體可能存在不只一種的異源核苷酸序列。例如，與內源水平相比前述情形可提高基因產物的表達，如下所述。植物細胞內包含編碼序列的核酸可位於植物特異的調控元件的調控之下，例如所述調控元件為外部可誘導的基因啟動子以將表達置於使用者的控制之下。
D-胺基酸代謝多肽可存在於植物細胞的胞質、過氧化物酶體或其它細胞內小室。通過下述方法可獲得D-胺基酸代謝多肽的小室區域化，所述方法將編碼D-胺基酸代謝多肽的核酸序列與編碼轉運肽的序列融合以產生融合蛋白。不含有該轉運肽的基因表達產物通常在胞質內積聚。
穩定整合到植物基因組上的核酸一代又一代地遺傳給植物後代，後代細胞可表達所編碼的D-胺基酸代謝多肽，並因此可增強對D-胺基酸的耐受。
將核酸序列導入祖先細胞的結果是，植物細胞可包含與植物特異調控元件可操作地連接的編碼D-胺基酸代謝多肽的核酸序列。
此處所描述的植物細胞可包含在植物、植物部分、植物繁殖體、植物提取物或衍生物之內，如下所述。
本發明也提供了包含如此處所描述的植物細胞的植物，以及提供了該植物的任何部分或繁殖體、種子、自花受精或雜交的後代及後裔。本發明特別提供了轉基因單子葉植物、雙子葉植物、裸子植物以及藻類、蕨類和蘚類。其中值得關注的是轉基因高等植物尤其是農作物和森林作物，例如穀類、樹木和觀賞花卉，這些植物均經過改造以攜帶有上述的核酸構建體。
適宜的植物的示例包括菸草、葫蘆、胡蘿蔔、蔬菜芸苔、瓜類、辣椒、葡萄藤、萵苣、草莓、油種芸苔、甜菜、小麥、大麥、玉米、大米、大豆、豌豆、高粱屬植物、向日葵、番茄、土豆、胡椒、菊、香石竹、白楊、桉樹、棉花、亞麻籽、大麻、雲杉、樺樹、花生、黑麥和松樹。
根據本發明的植物可在一種或多種特性上不為純育。可將一些植物變種排除在外，特別是根據植物繁殖條款(Plant Breeders Rights)可註冊的植物變種。有人指出，不應僅因為植物基因組內穩定含有由於導入植物細胞或其祖先而存在的轉基因就將該植物判定為「植物變種」。
除了植物，本發明提供了該植物、種子、自花受精體或雜交後代及後裔的任意克隆，以及上述任何一項中的任意部分或繁殖體如插條及種子，可用於有性或無性的繁殖或再生。本發明也包含由該植物、該植物的任意部分或繁殖體、後代、克隆或後裔經有性或無性繁殖而獲得的後代、克隆或後裔。
本發明的其它方面提供了應用D-胺基酸選擇性地培養、再生或繁殖包含如上所述的異源D-胺基酸代謝多肽的轉基因植物細胞、植物組織或維管植物。
產生轉基因植物的方法可包括用包含編碼多肽的序列的核酸或載體轉化植物細胞，所述多肽代謝如這裡所述的D-胺基酸底物；以及在包含特定氮源的培養基上將細胞再生為植物，其中所述的特定性氮源包含該D-胺基酸底物或由其組成。
經轉化的植物細胞能夠利用存在於培養基中的D-胺基酸作為氮源。未經轉化或不含具有D-胺基酸代謝活性多肽的細胞不能利用這種氮源，且因此細胞的生長受到限制。此外，培養基中的D-胺基酸對未轉化的植物(該植物不具有D-胺基酸代謝活性)可能具有毒性作用。
培養基中適合用作D-胺基酸代謝酶底物的適宜D-胺基酸可包括D-arg、D-ser、D-glu、D-ALA、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-phe、D-pro、D-asn、D-thr、D-trp、D-tyr和D-val。優選地應用D-ser、D-ala、D-glu、D-asn、D-arg、D-lys、D-His或D-asp其中之一，更優選地應用D-ala或D-ser。這些D-胺基酸對於不含有適宜D-胺基酸代謝酶的植物來說具有毒性。
用於D-胺基酸代謝酶的其它適宜底物包括非蛋白胺基酸、胺基酸前體及胺基酸衍生物。
氮通常是農業系統中限制植物生長的元素。對於表達代謝D-胺基酸的酶的轉基因植物而言，應用下述組合物作為優選的或可選擇的肥料，所述組合物中的部分或全部氮含量以一種或多種D-胺基酸的形式存在(即肥料的氮含量部分或全部為一種或多種D-胺基酸的形式)。不表達該酶的非轉基因植物從該肥料組合物中的獲益將降低。在一些實施方案中，D-胺基酸對該植物具有毒性並明顯阻礙或限制其生長。例如，D-ser對野生型植物具有毒性(圖3)。
本發明的另一個方面提供了用作下述轉基因植物的選擇性培育的組合物；所述轉基因植物包含此處描述的代謝D-胺基酸底物的多肽；所述組合物包含該D-胺基酸底物。
組合物中氮含量的全部或部分可為D-胺基酸底物形式(即其為組合物中的唯一氮源或多種氮源之一)。組合物中以D-胺基酸形式存在的可用氮的比例可為0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
適合用於組合物中的D-胺基酸底物包括D-arg、D-ser、D-glu、D-ala、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-phe、D-pro、D-asn、D-thr、D-trp、D-tyr或D-val。
優選地應用D-ser、D-ala、D-glu、D-arg、D-lys、D-his、D-asn或D-asp其中之一，更優選地應用D-ala或D-ser。這些D-胺基酸對於不含有代謝該D-胺基酸的異源多肽的植物來說具有毒性，因而起到既促進目標植物的生長又抑制不需要的植物生長的「雙重」作用。
用於D-胺基酸代謝多肽的其它適宜底物包括非蛋白D-胺基酸、D-胺基酸前體和D-胺基酸衍生物。
產生如上所述的肥料的方法可包括提供缺乏或實質上缺乏氮源的植物肥料組合物，以及將該組合物與此處描述的D-胺基酸底物混合。
本發明的另一個方面提供了含有如上所述的D-胺基酸的選擇性除草劑組合物。
該除草劑將抑制或限制不含有適宜D-胺基酸代謝酶的植物的生長，而能夠代謝D-胺基酸的轉基因植物的生長將不會受到影響，或優選地，生長得到提高或促進。
組合物可包含0.1％(w/w)或更多、1％(w/w)或更多、5％(w/w)或更多、10％(w/w)或更多、15％(w/w)或更多、20％(w/w)或更多、25％(w/w)或更多、30％(w/w)或更多的D-胺基酸。
該除草劑組合物可用於控制植物生長的方法中，所述方法包括應用該組合物處理一種或多種植物。
產生該除草劑組合物的方法可包括將D-胺基酸與基質、載體或賦形劑混合物。
用於農業特別是除草劑組合物中的適宜基質、載體或賦形劑為本領域內公知。
D-胺基酸通過胺基酸氧化酶代謝產生過氧化氫(H2O2)。該化合物用作植物中誘導防禦反應的信號。該反應通常由環境壓力引發，所述環境壓力如過量光線、寒冷或病原體感染。
含D-胺基酸氧化酶的植物對添加的D-胺基酸作出響應，產生增加的H2O2並由此觸發防禦反應。這就提供這樣的一種機制，即通過該機制植物的防禦反應可由培養者特異地觸發。將D-胺基酸添加到表達D-胺基酸氧化酶基因的植物內，導致內源的H2O2產物突現，該產物在這些植物內誘導產生正常的防禦反應。當將植物從戶內移動到戶外環境時培養者可引發該防禦反應以提高植物的逆境耐性，當存在霜凍害危險時可引發該防禦反應以增加植物的冰凍耐性，當已知害蟲和病原體積聚或處於其它的情況時，植物體內積極防禦反應具有潛在好處。
產生具有可誘導的應激反應的轉基因植物的方法可包括將編碼D-胺基酸氧化酶的核酸序列轉化植物細胞；以及由該植物細胞再生轉基因植物。
刺激轉基因植物的逆境耐性的方法可包括在該植物內表達氧化D-胺基酸底物的多肽；以及用D-胺基酸底物處理該植物。
適宜的D-胺基酸氧化酶多肽在以上描述並在表1和表2中示例。
適當劑量的D-胺基酸刺激應激反應而不引起永久的細胞損害。儘管精確劑量根據植物類型、生長階段、土壤類型、溫度和氣候條件的不同而存在差異，但也可容易地由技術人員應用常規方法學測定出用於特定情形的劑量。
在一些優選實施方案中，可應用高水平的D-胺基酸誘導逆境耐性，例如培養基中的D-胺基酸濃度為從0.1到50mM，更優選地從1到10mM。
與正常的、未處理的植物相比，逆境耐性的改善可提高或增強對環境壓力的耐性，所述環境壓力如紫外線UV輻射、極端溫度、輻射和/或病原體感染，如細菌或真菌感染，特別是引起壞死的病原體的感染。
如果存在下述情況則如上所述的由D-胺基酸氧化酶產生的H2O2或D-胺基酸代謝產物的積聚對轉基因植物可能是有害的，即如果產率高和/或如果產物產生在對H2O2或其它代謝產物敏感的細胞小室內時。
因此本發明的方法可用於從混合群體中選擇性地移除轉基因植物，或甚至從天然群體中移除轉基因植物與野生型間的雜合體。
如此處描述的使表達氧化D-胺基酸底物的多肽的轉基因植物的生長或生存能力受到抑制的方法可包括用D-胺基酸底物處理該植物。
D-胺基酸氧化酶在過氧化物酶體內的定位表達使得產生的H2O2能夠可迅速由H2O2降解酶即過氧化氫酶代謝掉。因此需要高水平的D-胺基酸以產生破壞性水平的H2O2。在過氧化氫酶活性較低的胞質內，D-胺基酸氧化酶的表達降低了所需的產生有破壞性水平H2O2的D-胺基酸的量。
可通過移除編碼核酸序列中的過氧化酶體靶向信號或轉運肽來獲得D-胺基酸氧化酶在胞質內的表達。
因此添加D-胺基酸可用於抑制或降低其胞質內具有D-胺基酸氧化酶活性的轉基因植物的生長或生存能力。
在此描述的使得表達氧化D-胺基酸底物的多肽的轉基因植物的生長或生存能力受到抑制的方法可包括引起或允許在該植物胞質內積聚該多肽；以及用D-胺基酸底物處理該植物。
下述D-胺基酸特別適用於該方法，即該D-胺基酸對野生型植物呈現出低毒性，但當其在含有外源D-胺基酸氧化酶的轉基因植物內進行代謝之後導致產生H2O2產物或其它的有毒代謝產物，所述D-胺基酸如D-ile、D-asn或D-gln。
可在此處描述的方法中進行適宜的對照試驗。本領域內的技術人員具有足夠的能力來進行適宜的對照試驗。
由本公開來看，本發明的多種進一步的方面和實施方案對於那些領域內的技術人員而言是顯而易見的。本說明書中所有提及的文件在此全部引入作為參考。
本發明的某些方面和實施方案將通過以下描述的實施例和圖的參考進行闡述。


圖1顯示鼠耳芥植物在無菌瓊脂培養基上且提供以不同的N源生長20天的鮮重。對照植物不提供任何氮源進行培養。
圖2顯示生物體內D-胺基酸的潛在代謝轉化的示例。
圖3顯示野生型植物(Wt；黑色柱)和經編碼細菌酶D-絲氨酸脫水酶的細菌基因轉化的植物(dsdA21，淺灰色柱)的鮮重，前述植物培養在無菌瓊脂上並提供以帶有(MS)或不帶有(MS-N)標準氮源、硝酸鹽的不同濃度(2.5，30，3和0.3mM)的D-絲氨酸。
圖4顯示萌芽後培養14天所收穫的鼠耳芥的生物量(a)與氮含量(b)。植物培養於除了D-絲氨酸外不含其它氮源的半強度MS培養基上。空白柱為表達dsdA的轉基因植物，陰影柱為野生型植物。柱代表平均值±標準差，n＝4。
圖5顯示萌芽後培養鼠耳芥14天所收穫的生物量(a)與氮含量(b)。植物培養在3mM硝酸鹽作為基本N源並以不同的D-絲氨酸濃度作為改良的半強度MS培養基上。空白柱為表達dsdA的轉基因植物，陰影柱為野生型植物。柱代表平均值±標準差，n＝4。
表1和表2顯示具有可根據本發明使用的具有D-胺基酸代謝活性的多肽的例子。
實驗方法鼠耳芥屬轉化應用引物5』-AATGGATCCTCATCTAAGCGCAAAGAGACGTACTATGG和5』-ATTGGATCCATGCTGCGTTGAAACGTTATTAACGG通過PCR擴增大腸桿菌基因dsdA(D-絲氨酸脫水酶(D-絲氨酸脫氨酶)[EC4.3.1.18]NCBI編號J01603)。將PCR產物亞克隆到pT-easy(Promega)中並用DYEnamics循環測序試劑盒(Amersham Pharmacia biotech)進行測序。應用資料庫序列進行的比對分析確認成功獲得了dsdA的全長克隆。隨後將克隆連接到雙元載體pPCV702Km的CAMV 35S表達盒的BamH1位點以產生載體pPCV702dsdA，其中所述雙元載體為根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的卸甲Ti-質粒。用核酸內切酶對該載體的限制性分析確定了插入方向。
鼠耳芥植物，生態型Col-0，用根瘤農桿菌菌株(GV3101pMP90 RK)通過真空浸潤轉化(Clough，S.J.和Bent，A.F.植物雜誌(Plant Journal)，16，735-743(1998))。在含卡那黴素的平板上篩選轉化子，並應用Northern印跡在分子水平上進行確認。應用轉基因特性純合的品系進行所有的分析。
表達D-胺基酸氧化酶的轉基因植物的構建與上述dsdA植物基本相同，改變之處在於以下述cDNA文庫作為模板通過PCR克隆源自酵母菌中纖細紅酵母(Rhodosporidium toruloides)的daol基因(EC1.4.3.3NCBIU60066)，所述文庫從在含D-丙氨酸培養基上進行培養以誘導靶基因表達的酵母中進行製備。PCR引物為5』-ATTAGATCTTACTACTCGAAGGACGCCATG和5』-ATTAGATCTACAGCCACAATTCCCGCCCTA。
用另一套引物進行PCR擴增，其中的一條引物位於如上列出的開放讀碼框5』末端的外側且和3′引物不包括最後6個核苷酸。後9個核苷酸編碼信號肽SKL，該信號肽將蛋白質引導到過氧化物酶體亞細胞器上。
產生的擴增序列所編碼的蛋白質具有相同的胺基酸序列在其在細胞內的定位不同。不帶有信號肽的截短多肽在胞質中表達，而全長多肽在過氧化物酶體表達。
植物培養來自未經轉化植物和經D-絲氨酸氨裂解酶轉化的植物鼠耳芥種子用70％乙醇和0.1％吐溫80進行10分鐘的表面消毒並用95％乙醇快速漂洗。每個平板上接種10粒種子，而後培養皿用空氣透過型帶密封。生長培養基為半強度MS(Murashige，T.和Skoog，F.Physiol Plant 15，310-313(1962))(含0.5％(W/V)蔗糖和0.8％(W/V)瓊脂)，培養基加有或不加有3mM硝酸鹽作為氮源。培養基高壓蒸汽滅菌後，將過濾除菌的D-絲氨酸加入到培養基中。植物萌芽後以16小時光周期於24℃培養14天。從培養皿中取出植物，在0.5mM的CaCl2中漂洗3次，然後於40℃乾燥48小時，之後測乾重。乾燥植物的N含量用元素分析儀(PerkinElmer 2400CHN)進行測定。測量基於每個平板的生物量和氮含量，且每個平板有10株植物。對6種單獨的轉基因品系在D-絲氨酸上的生長能力進行評估，儘管根據RNA印跡分析發現dsdA轉錄水平存在相當大的變化，但未在品系間發現實質性差異。
用於雲杉轉化時，表達載體具有含35S表達盒的pUC8骨架，所述表達盒具有dsdA和用於basta篩選目的的pUbi-Bar(泛素啟動子，具有賦予basta抗性的Bar基因)盒。應用的轉化方法為細胞懸液的粒子轟擊法。
結果D-胺基酸對野生型植物生長的影響觀察野生型鼠耳芥植物應用不同氮源在無菌瓊脂培養基中的生長。結果在
圖1中顯示。觀察到培養於D-胺基酸培養基上的植物很少或沒有生長。
對來自茄(Solanum esculentum)、大麥(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)、山楊(Populus tremuloides)、菸草(Nicotiana tabacum)和鼠耳芥的種子進行表面消毒，並在瓊脂培養基上生長2到3周，其中所述的瓊脂培養基與上述無硝酸鹽培養基完全相同並補充以0、0.3、3和30mM的D-絲氨酸。觀察到番茄(Lycopersicon esculentum)、山楊、菸草和鼠耳芥的生長在培養基中D-絲氨酸濃度為3mM時受抑制，而玉米和大麥的生長則在30mM時受抑制。
觀察了D-絲氨酸和幾種其它的D-胺基酸對野生型鼠耳芥和其它物種的生長抑制。對於鼠耳芥，生長培養基中D-絲氨酸濃度為0.3mM時觀察到明顯的生長抑制，且濃度為3mM時生長完全受到抑制(圖2)。
歐洲雲杉(Picea abies)的體胚細胞懸浮培養物應用其濃度範圍為0、0.3、3和30mM的D-絲氨酸進行培養。D-絲氨酸在3mM及高於3mM對細胞是致死性的。發現在含3mM D-絲氨酸的D-絲氨酸培養基上篩選經dsdA-轉化的胚芽是可能的。
這些結果證明了D-胺基酸對於野生型植物的除草劑特性。
表達大腸桿菌D-絲氨酸氨裂解酶的鼠耳芥用大腸桿菌基因dsdA轉化鼠耳芥，所述基因編碼D-絲氨酸氨裂解酶[EC4.3.1.18]並位於CAMV 35S啟動子控制之下。D-絲氨酸氨裂解酶將D-絲氨酸轉化成容易被植物利用的產物銨、丙酮酸和水，且經轉化的植物能夠以D-絲氨酸作為其唯一N源進行生長。
表達編碼D-絲氨酸脫水酶的基因的轉基因鼠耳芥植物在無菌瓊脂上與野生型植物一同培養20天，所述瓊脂培養基為標準MS培養基並補充以不同濃度D-絲氨酸(30mM、3mM、0.3mM)作為唯一N源，對照則不含任何氮源。
觀察到在缺乏氮的對照培養基上轉基因和野生型植物均為最小生長。觀察到轉基因植物的生長和N含量隨著D-絲氨酸濃度增加都顯著提高(方差分析，p＜0.0001)(圖4a，b)。未觀察到野生型植物生長的提高(圖3)。在存在基礎水平硝酸鹽的情況下，轉基因植物的生長和N含量隨著D-絲氨酸濃度的增加也得以顯著提高(P＜0.0001)，而野生型植物存在相反的反應(圖5)。這表明D-絲氨酸對於野生型植物具有毒性作用，而對轉基因植物則無毒。在觀察的D-Ser範圍內，轉基因植物未表現出中毒症狀。
無論轉基因植物是否施加基礎供應量的硝酸鹽，其對於增加D-絲氨酸濃度所作出的相關生長反應是類似的(圖4a和5a)。然而，在既提供D-絲氨酸又提供硝酸鹽的植物中，植物N含量的相應反應提高(圖4b和5b)。在相同濃度時，植物在硝酸鹽上的生長顯著高於在D-絲氨酸上的生長(圖4a和5a)。然而，在3mM的D-絲氨酸上生長的植物的N濃度顯著低於在3mM硝酸鹽上生長的植物(ANOVA，p＜0.0001)。在D-絲氨酸上較低生長的原因還不清楚，但D-絲氨酸培養植物的N濃度相對較低可能提示與硝酸鹽相比該N形式的吸收率較低。
通過在一周內往土壤中生長的鼠耳芥種苗上噴灑3次30mM的D-絲氨酸，也成功篩選出轉基因鼠耳芥植物。
表達大腸桿菌D-穀氨酸消旋酶的鼠耳芥表達大腸桿菌D-穀氨酸消旋酶的鼠耳芥植物的製備方法與上述方法基本相同。NCBI編號為AAC76949的基因murI編碼消旋酶EC5.1.1.3。根據資料庫序列設計用於克隆基因的引物，並將引物設計為位於開放讀碼框兩側。
觀察轉基因植物在常規培養基和常規氮源上的生存與生長。
代謝D-胺基酸並同時產生過氧化氫的鼠耳芥製備出表達纖細紅酵母D-胺基酸氧化酶兩個變種的鼠耳芥植物，所述製備按如上所述方法進行。
觀察這些轉基因植物在常規培養基和常規氮源上的生存和生長。
當在鼠耳芥中表達編碼酵母(纖細紅酵母)D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)的基因時，獲得了與描述表達D-絲氨酸氨裂解酶的植物相似的結果，即在含有D-胺基酸的培養基上轉基因植物的生長和N含量與野生型植物相比有所增加。
D-胺基酸氧化酶存在多種D-胺基酸底物，且以D-丙氨酸和D-絲氨酸進行的試驗證實D-胺基酸氧化酶也能將這些N形式轉換成可接受的N源，並因此減輕由D-丙氨酸和D-絲氨酸所引起的毒性。
觀察到30mM D-Asn有效地終止了表達D-胺基酸氧化酶的植物在無菌瓊脂培養基上的生長。未觀察到表達D-胺基酸氧化酶的植物出現萌芽，表明其生長受到完全抑制。觀察到野生型植物萌芽並緩慢長出細小綠枝。因此，野生型植物的生長僅部分地受到抑制，然後將野生型植物置於土壤中並進行恢復救治。
發現D-ile對於抑制表達dao1的轉基因植物的生長甚至更為有效，而對野生型植物則無明顯的抑制作用。發現在檢測的濃度範圍(0.3到30mM)內，野生型鼠耳芥的生長隨著D-ile濃度的增加而增加。
儘管未觀察到由胞質和過氧化物酶所表達D-胺基酸氧化酶存在有顯著差異，但對於抑制D-胺基酸氧化酶植物在30mM D-Asn條件下的萌芽而言，發現過氧化物酶體構建體較之胞質構建體或多或少更為有效。然而，這兩種構建體比野生型植物受到更顯著的抑制，因此可用於條件性陰性篩選。
表達大腸桿菌基因dsdA(D-絲氨酸脫水酶)的白楊和菸草應用與以上描述的用於轉化鼠耳芥的相同載體和轉化方法進行白楊和菸草的轉化。
觀察到，當將白楊和菸草置於根誘導培養基上時，3mM和30mM的D-Ser足以分別終止野生型白楊和菸草所有根系的形成。然而，發現經dsdA轉化的菸草和白楊在D-Ser濃度超過30mM時產生了D-Ser抗性。
如此處描述而產生的轉基因植物，其代謝的N形式為其它植物無法獲得的N形式。這就允許將N靶向添加給混合植物環境中的該植物。所施用的D-胺基酸有著雙重作用，即促進轉基因植物生長並抑制其它植物的生長，當其用於農業時可產生協同作用。直接控制N源可降低良好生長所需要的N量，潛在地降低了由不需要的高N載量所引起的環境壓力。此外，在作物植物具有競爭優勢的農業系統中，通過使用特異的N源可減少雜草控制的需求，並降低除草劑的總需要量。
表1
表2D-胺基酸轉移酶/D-胺基酸轉氨酶P54692 D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)DATP54693 D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)DATP19938 D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)芽孢桿菌屬的某些種(YM-1株)DAT007597 D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)DAT085046 D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)單核細胞增生桿菌DAT。
P54694 D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)(DAAT)溶血葡萄球菌(Staphylococcus heamolyticus)DATD-天冬氨酸氧化酶P31228 D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(DASOX)(DDO)Bos taurus(牛)DDOQ99489 D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(DASOX)(DDO)Homo sapiens(人)DDOQ9UJ09 DJ 261 KS.2(D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1))Homo sapiens(人)DDOQ9TRA3 D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)(片段)Bos taurus(牛)D-絲氨酸脫水酶P54555 可能的D-絲氨酸脫水酶(EC4.2.1.14)(D-絲氨酸脫氨酶)枯草芽孢桿菌YQJRP00926 D-絲氨酸脫水酶(EC4.2.1.1 4)(D-絲氨酸脫氨酶)大腸桿菌.DSDA
Q9KL72 D-絲氨酸脫水酶霍亂弧菌(Vibrio cholerae)VCA0875Q9KC12 D-絲氨酸脫水酶(EC4.2.1.14)Bacillus halodurans.DSDAD-胺基酸氧化酶Q19564 推定的D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Caenorhabditis elegans F18E3.7P24552 D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)腐皮鐮孢(亞種，豌豆)(Fuarium solani(subsp.pisi))(Nectriahaematococca)P14920 D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Homo apiens(人)DAO或DAMOXP18894 D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Mus musculus(小鼠)DAO或DAO1P00371 D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Sus scrofa(豬)DAOP22942 D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Oryctolagus cuniculus(兔)DAOO35078 D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)Rattus norvegicus(大鼠)DAOP80324 D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)(酵母)(纖細紅酵母)DAOQ99042 D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAO)(DAAO)三角酵母(Trigonopsis variabilis)DAO1Q9Y7N4 推定的D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)(DAMOX)(DAAO)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(裂殖酵母)SPCC1450O01739 類似於D-胺基酸氧化酶Caenorhabditis elegans F20H11.5Q28382 D-胺基酸氧化酶(片段)Sus scrofa(豬)DAOO33145 推定的D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprae)AAOQ9X7P6 推定的D-胺基酸氧化酶天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)SC5F2A.23C
Q9JXF8 推定的D-胺基酸氧化酶黃素蛋白，腦膜炎奈瑟氏球菌(B血清組)(Neisseria meningitidis(serogroup B))NMB2068Q9Z302 D-胺基酸氧化酶Cricetulus griseus(中國倉鼠)Q9Z1M5 D-胺基酸氧化酶Cavia porcellus(豚鼠)消旋酶O68006 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)地衣芽孢桿菌BACAQ9L870 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)魚腥藻屬的某些種(Anabaena sp)(PCC 7120株)MURIO66662 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Aquifex aeolicus MURI或AQ 325P56868 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Aquifex pyrophilus MURIO31332 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)MURI或GLRO82826 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)枯草桿菌變種natto(Bacillus subtilis var.Natto)MURI或GLRP52972 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus.)MURI或GLR。
P94556 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)枯草桿菌，RACEO51127 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Borrelia burgdorferi(萊姆病螺旋菌)MURI或BB0100Q9XDZ7 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)MURIP57619 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Buchnera aphidicola(subsp.Acyrthosiphon pisum)Acyrthosipmupi或BU554Q9PM24 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Campylobacter jejuni.MURI或CJ1652Q9L4V5 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)棒桿菌的某些種(Carnobacterium sp.)(ST2株)MURI或GLRQ9RU10 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)Deinococcus radiodurans.MURI或DR1586。
P22634 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)大腸桿菌.MURI或DGA或GLRP52973 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)流感嗜血桿菌MURI或HI1739.2Q9ZLTO 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)幽門螺旋桿菌J99(Helicobacter pylori J99)(幽門彎曲桿菌J99(Campylobacter pylori J99))MURI或GLR或HP0549P56068 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)幽門螺旋桿菌(幽門彎曲桿菌(Campylobacter pylori))MURI或GLR或HP0549P48797 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)短乳桿菌(Lactobacillus brevis)MURIQ03469 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)MURIP46705 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprae)MURI或B1549_C2_210Q10626 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis.)MURI或RV1338或MTCY130.23或MTCY02B10.02Q9RQW7 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)腦膜炎奈瑟氏球菌(A血清組)和MURI或GLR或NMA2026或NMB0458Q08783 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)戊糖片球菌MURIP40723 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)(片段) 鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium.)MURIP52974 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)MURI或DGA.
P73737 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)集胞藻屬的某些種(Synechocystis sp.)(PCC 6803株)MURI或SLR1746O83421 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)蒼白密螺旋體(Treponema pallidum.)MURI或TP0406Q9KVI7 穀氨酸消旋酶(EC5.1.1.3)霍亂弧菌(Vibrio cholerae.)MURI或VC0158
權利要求
1.分離的核酸，其包含編碼具有D-胺基酸代謝活性的多肽的核苷酸序列，所述序列被可操作地連接至植物特異的調控元件。
2.根據權利要求1的核酸，其中D-胺基酸代謝活性選自氧化酶、消旋酶、羧化酶、轉氨酶和脫水酶活性。
3.根據權利要求2的核酸，其中多肽在表1或表2中顯示。
4.根據前述權利要求中任意一項所述的核酸，其中所述D-胺基酸選自D-ser、D-ala、D-glu、D-arg、D-lys、D-his、D-asp、D-asn或D-gln。
5.根據權利要求1到4中任意一項所述的核酸，其還包含編碼異源多肽的核苷酸序列。
6.根據權利要求1到5中任意一項所述的核酸，其中具有D-胺基酸代謝活性的所述多肽包含轉運肽，所述轉運肽指導所述酶在所述植物細胞的胞內小室中進行積聚。
7.表達載體，其包含根據權利要求1到6中任意一項所述的核酸。
8.包含根據權利要求7的表達載體的植物細胞。
9.包含根據權利要求8的植物細胞的植物。
10.根據權利要求9的植物，其為單子葉植物、雙子葉植物、裸子植物、藻類、蕨類或蘚類。
11.產生轉基因植物的方法，該方法包括用根據權利要求7的表達載體轉化植物細胞；以及，在包含D-胺基酸的培養基上由所述細胞再生出所述植物。
12.根據權利要求11的方法，其中培養基包含唯一氮源，所述氮源由D-胺基酸組成。
13.用於對根據權利要求9或10的植物進行選擇性施肥的肥料組合物；所述肥料包含D-胺基酸。
14.具有除草劑活性且包含一種或多種D-胺基酸的組合物。
15.控制植物生長的方法，該方法包括應用根據權利要求13的組合物處理植物。
16.刺激植物的逆境耐性的方法，其包括在所述植物中表達氧化D-胺基酸底物的多肽；以及用所述D-胺基酸底物處理所述植物。
17.抑制表達氧化D-胺基酸底物的氧化酶多肽的轉基因植物生長的方法；該方法包括允許所述多肽在植物胞質溶膠中積聚；以及用D-胺基酸底物處理植物。
18.根據權利要求17的方法，其中D-胺基酸底物為D-ile或D-asn。
19.根據權力要求1到6中任意一項所述核酸的用途，用在篩選經轉化的植物細胞的方法中。
全文摘要
本發明涉及表達異源D－胺基酸代謝酶並且因此可利用D－胺基酸作為氮源的植物和植物細胞。提供了應用D－胺基酸選擇性調控此類植物的生長和逆境耐性的方法和手段。
文檔編號C05F11/10GK1620506SQ03802344
公開日2005年5月25日 申請日期2003年1月13日 優先權日2002年1月17日
發明者T·內斯霍爾姆, O·埃裡克松, M·赫茨貝裡 申請人:巴斯福植物科學有限公司, 瑞典植物技術有限公司