胸腺素alpha原在製備乳腺癌診斷標記物中的應用的製作方法

2023-10-05 19:50:24 1

胸腺素alpha原在製備乳腺癌診斷標記物中的應用的製作方法
【專利摘要】胸腺素alpha原在製備乳腺癌診斷標記物中的應用，涉及腫瘤標記物。採用斑點雜交法和ELISA方法檢測乳腺癌患者尿液中胸腺素alpha原蛋白的水平，探討胸腺素alpha原與乳腺癌生物學行為的關係。採用免疫檢測方法，只需要檢測尿液中的胸腺素alpha原水平，並能快速地證明乳腺癌病人尿液中的胸腺素alpha原水平明顯高於正常人，對乳腺癌進行初步判斷，為進一步診斷提供依據。所需尿液樣品容易獲取，不需要有任何創傷，不需要昂貴的儀器設備，方便操作，容易推廣應用。
【專利說明】胸腺素 alpha原在製備乳腺癌診斷標記物中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及腫瘤標記物，尤其是涉及胸腺素 alpha原在製備乳腺癌診斷標記物中 的應用。

【背景技術】
[0002] 乳腺癌是女性惡性腫瘤中常見的一種，全球乳腺癌發病率自20世紀70年代末開 始一直呈上升趨勢[Yang L, Parkin DM, Ferlay J, et al. Estimates of cancer incidence in China for 2000 and projections for 2005 [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005, 14(1) :243-250]。8名婦女中就會有一人患乳腺癌，中國不是乳腺癌的高發國 家，但不宜樂觀，今年我國乳腺癌發病率的增長速度高出發達國家1?2個百分點。據國家 癌症中心和衛生部疾病預防控制局2012年公布的的乳腺癌發病數據顯示：全國腫瘤登記 地區乳腺癌發病率位居女性惡性腫瘤的第1位[全國腫瘤防治研究辦公室，全國腫瘤登記 中心，衛生部疾病防禦控制局.全國第三次死因回顧抽樣調查[M].北京：人名衛生出版 社，2012:120-131]。
[0003] 目前，乳腺癌已成為當前社會的重大公共衛生問題，究其原因，1 :早期乳腺 癌往往不具備典型的症狀和體徵，不易引起重視；2 :在乳腺門診，醫生了解病史後首 先會進行體檢，檢查雙側乳腺，結合影像學檢查，包括乳腺學檢查，包括乳腺X線攝 影（乳腺鑰祀照相）[Armstrong K，Handorf EA，Chen J，et al.Breast cancer risk prediction and mammography biopsy decisions: a model-based study[J]. Am J Prev Med，2013, 44:15-22]、彩超，必要時還要進行乳腺磁共振檢查[王鵬.保乳手術治療早期乳 腺癌86例療效觀察[J] ·當代軍醫，2012, 18 (9) : 107-108]，以上檢測手段費用高，時間長， 更加頻繁的輻射使乳腺癌的風險顯著增加。
[0004] 為了補充乳腺癌篩選方法，我們嘗試使用腫瘤標記物水平來診斷乳腺癌。
[0005] 腫瘤標誌物是由腫瘤組織產生的存在於腫瘤組織，或分泌至血液，或其他體液，或 因腫瘤組織刺激，由宿主細胞產生而含量明顯高於正常參考值的一類物質。隨著醫學的發 展，近年來，許多學者致力於發現腫瘤特徵性的標記物，為惡性腫瘤的早期診斷提供新的方 向。
[0006] 胸腺素 alpha原是一種在體內廣泛表達的強酸性蛋白質，其功能與細胞免疫調節、 細胞增殖和細胞凋亡有關[Wu C L，Shiau A L, Lin C C. Prothymosin alpha promotes cell proliferation in NIH3T3 cells [J]· Life Sci, 1997, 61:2091-2099]，作為一種典型的腫 瘤相關蛋白，在細胞增殖和凋亡調控方面的深入研究有助於發現細胞癌變的發生機理，曾 在多種癌症中檢測到了 PTMA水平的升高[鄭金來，劉個辛，高蘭興.胸腺素 α原研究進展 [J].國外醫學免疫學分冊，1998, 21 (4) :210-214]，這種在癌細胞中高水平的ΡΤΜΑ蛋白產 物不僅維持細胞處於高度增殖狀態，還保護細胞避免進入凋亡途徑[Evatafieva a G，Belov C A, Rubtsov Y P, et al.Apoptosis-related fragmentation, translocation and properties of human prothymosinalpha[J].Exp Cell Res，2003,284(2):211_223]，有報 導指出，乳腺癌患者體內β族胸腺素含量增高[蘭海燕等.胸腺素 β 4和β 10及β 15在 乳腺癌中的表達及意義[J].中國腫瘤臨床與康復，2009, 16 (1) : 22-24]，可作為術後復發 標記物，但乳腺癌體內胸腺素 alpha原表達情況卻鮮見報導[徐雅莉等.中國女性乳腺癌 發病相關危險因素病例對照研究[J].協和醫學雜誌，2011，2:7-14]。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的在於提供胸腺素 alpha原在製備乳腺癌診斷標記物中的應用。
[0008] 本發明檢測了正常人、乳腺癌尿液中胸腺素 alpha原蛋白的水平，以證明和評價 胸腺素 alpha原作為腫瘤診斷新標記物的可行性提供依據，其結果為廣大女性提供一種更 方便快捷的診斷方法，並為進一步研究胸腺素 alpha原在腫瘤發生和治療中的生物學功能 提供依據。本發明為此提供了以下免疫學實驗：
[0009] 1) D0T-BL0T法檢測胸腺素 alpha原在樣本中的水平；
[0010] 2) ELISA法檢測胸腺素 alpha原在樣本中的水平。
[0011] 本發明採用斑點雜交法和ELISA方法檢測乳腺癌患者尿液中胸腺素 alpha原蛋白 的水平，探討胸腺素 alpha原與乳腺癌生物學行為的關係。
[0012] 本發明所述胸腺素 alpha原作為乳腺癌診斷標記物，尤其是通過檢測人體尿液中 的胸腺素 alpha原水平來進行乳腺癌診斷，迄今尚未見有相關報導。
[0013] 本發明通過人體尿液中的胸腺素 alpha原水平檢測，對乳腺癌的診斷提供依據， 為乳腺癌的治療和預後判斷提供科學依據，同時也為乳腺癌的治療方法的篩選及療效判斷 提供依據。此外，通過本發明的實施，還為胸腺素 alpha原在參與腫瘤細胞的遷移、生長過 程在其中發揮的重要調控功能，闡明胸腺素 alpha原與腫瘤發生發展的相關性，為今後乳 腺癌新靶點的治療提供一種新的治療途徑。
[0014] 本發明的優點與積極效果在於，採用免疫檢測方法，只需要檢測尿液中的胸腺素 alpha原水平，並能快速地證明乳腺癌病人尿液中的胸腺素 alpha原水平明顯高於正常人， 對乳腺癌進行初步判斷，為進一步診斷提供依據。本發明所需尿液樣品容易獲取，不需要有 任何創傷，不需要昂貴的儀器設備，方便操作，容易推廣應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為胸腺素 alpha原在乳腺癌病人與正常人尿液中的斑點雜交法檢測結果。
[0016] 圖2為乳腺癌病人與正常人尿液ELISA檢測後0D45(I值統計結果。在圖2中，橫坐 標：正常，代表健康人；病人，代表乳腺癌病人；縱坐標：〇D值，代表吸光度；P = 0. 003代表 統計結果，**代表極顯著。

【具體實施方式】
[0017] 以下實施例僅為幫助所屬領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制 本發明。
[0018] 實施例1 D0T-BL0T法定性檢測胸腺素 alpha原在腫瘤人與正常人尿液中的水平。
[0019] 用製備的胸腺素 alpha原多克隆抗體，採用斑點雜交方法，以腫瘤病人尿液為檢 測對象，檢測其中胸腺素 alpha原水平，以正常健康人尿液為對照（尿液樣品均來自廈門大 學附屬中山醫院，由主管技師梁賢明提供）。
[0020] 1)將尿液按表1滴（2 μ L)於NC膜上，待乾燥之後用封閉液37°C封閉2h ;
[0021] 2)兔抗胸腺素 alpha原（1 : 1000)孵育，4°C過夜；
[0022] 3)用PBST洗膜3次，搖床震蕩，每次5min ;
[0023] 4)HRP標記羊抗兔二抗（1 : 1000)室溫孵育lh ;
[0024] 5)用PBST洗膜，3次，每次lOmin，然後用DAB顯色。
[0025] 採用實施例1中所述的方法，檢測胸腺素 alpha原在尿液中的表達水平（參見圖 1和表2)，其結果表明正常人檢出率為9 %，而乳腺癌病人的檢出率為73 %，腫瘤病人中陽 性率遠遠高於正常人，而IL-2、IFN-γ、PBS空白對照則沒有陽性反應。可以證明，本實驗作 為乳腺癌診斷具有明顯的特異性，可以用於乳腺癌的診斷。
[0026] 實施例2 ELISA法定量檢測胸腺素 alpha原在腫瘤人與正常人尿液中的水平。
[0027] 用製備的胸腺素 alpha原單克隆抗體，採用間接ELISA方法，以實施例1中尿液為 檢測對象，正常健康人尿液和PBS為對照，檢測其中胸腺素 alpha原水平。
[0028] 1)包被：抗原按照表1用Coating buffer稀釋成2X，200 μ L/well包板，避光，4°C 過夜。
[0029] 2) PBST 洗板 3 次。
[0030] 3)Blocking buffer(5% 脫脂奶粉）按 200μ L/Well 加入，25°C 封閉 2h。
[0031] 4) PBST洗板3次，最後1次甩幹但不扣幹。
[0032] 5)小鼠抗胸腺素 alpha原單克隆抗體（1 : 1000)200μ L/well，25°C避光2h。
[0033] 6) PBST洗板3次，最後1次甩幹但不扣幹。
[0034] 7)HRP-羊抗鼠二抗稀釋（1 : 1000)200yL/well快速上樣，25°C避光孵育lh。
[0035] 8) PBST洗板3次，最後1次甩幹但不扣幹。
[0036] 9)加入100 μ 1/孔的TMB，室溫、避光顯色lh。
[0037] 10)加入100 μ L/孔的2NH2S04終止顯色並測0D45Q值。
[0038] 表1乳腺癌病人與正常人尿液編號
[0039]

【權利要求】
1. 胸腺素 alpha原在製備乳腺癌診斷標記物中的應用。
2. 如權利要求1所述應用，其特徵在於採用檢測尿液中的胸腺素 alpha原水平。
【文檔編號】G01N33/574GK104142397SQ201410383719
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月6日 優先權日:2014年8月6日
【發明者】周克夫, 崔若辰, 梁賢明, 王世媛, 陳越月, 段瑩, 陳豔芳, 張長弓, 陳雪飛, 孫雨涵, 胡鑫炎 申請人:廈門大學