一種基因晶片及其應用的製作方法
2023-09-17 12:30:45
專利名稱：：一種基因晶片及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，尤其涉及一種含有特異性地針對小核糖核酸的探針的基因晶片及其相關應用。
背景技術：
：肝癌是東南亞和南非的最常見腫瘤之一，其死亡率也非常高。人類疾病很多是由於一些基因表達紊亂或失控所引起的。小核糖核酸(小RNA，microRNA,miRNA)是一類長度約2卜25nt的不編碼蛋白質的單鏈小分子RNA，廣泛存在於真核生物中，通過核酸序列互補性結合到特定的靶mRNA上來調節靶mRNA翻譯或降解靶mRNA，是一種起負調控作用的分子。目前研究顯示許多miRNA參與了生物體發育、分化、生長、免疫應答等生理過程，且其表達及功能失調可能導致腫瘤發生，白血病以及病毒感染等多種病理現象。儘管目前有報導顯示miRNA可能在生物體發育、腫瘤發生等過程中發揮重要作用。本領域仍然迫切需要了解在肝癌中的miRNAs表達譜。
發明內容本發明旨在提供一種含有特異性地針對小核糖核酸的探針的晶片，所述小核糖核酸是肝癌組織中所特有的。本發明的另一個目的是提供一種試劑盒，所述試劑盒中包括上述的晶片。本發明的再一個目的是提供上述晶片的用途，所述用途是製備鑑別肝癌組織、癌旁組織、和/或正常組織的試劑盒。本發明的第四個目的是提供一種小核糖核酸的用途。本發明的第五個目的是提供一種體外非診斷性檢測核酸樣品中小核糖核苷酸的方法。本發明的第六個目的是提供一種檢測肝癌的方法。本發明的第七個目的是提供一種篩選與肝癌的小核糖核苷酸表達譜相關的潛在物質的方法。在本發明的第一方面，提供了一種晶片，它含有特異性地針對小核糖核酸的探針，所述小核糖核酸的序列如SEQIDNO:1—10所示。在另一優選例中，所述的晶片還含有特異性地針對一種或多種序列如SEQIDNO:11一41所示的小核糖核酸的探針；更佳地，所述晶片還含有特異性地針對一種或多種序列如SEQIDNO:42—84所示的小核糖核酸的探針。在本發明的第二方面，提供了一種試劑盒，所述的試劑盒包含一容器；位於所述容器中的特異性地針對小核糖核酸的探針，所述小核糖核酸的序列如SEQIDNO:1—10所示；以及說明書；並且每種探針與可檢測的標誌物相連，不同探針上相連的可檢測標誌物也不同；優選地，所述的標誌物是螢光微球、B引哚菁染料。在另一優選例屮，所述的試劑盒中還含有陽性對照品，所述的陽性對照品是含有特異性地針對小核糖核酸的探針，所述小核糖核酸的序列如SEQIDNO:1—10所示；每種探針與可檢測的標誌物相連，所述的標誌物是CY3。在另一優選例中，所述試劑盒中還含有特異性地針對一種或多種序列如SEQIDNO:11—41所示的小核糖核酸的探針；優選地，所述試劑盒中還含有特異性地針對一種或多種序列如SEQIDNO:42—84所示的小核糖核酸的探針。'在本發明的第三方面，提供了一種用於檢測肝癌的試劑盒，所述的試劑盒含有如上述的晶片和說明書。在本發明的第四方面，提供了一種如上述的晶片的用途，所述晶片用於製備鑑別肝癌組織、癌旁組織、和/或正常組織的試劑盒。在本發明的第五方面，提供了一種小核糖核酸的用途，其中所述的小核糖核酸包括序列如SEQIDNO:1—10所示的寡核苷酸，所述的小核糖核酸用於製備(a)鑑別肝癌組織、癌旁組織、和/或正常組織的試劑或試劑盒；或(b)檢測肝癌的試劑或試劑盒；優選地所述的試劑是特異性地針對所述小核糖核酸的探針。在本發明的第六方面，提供了一種體外非診斷性檢測核酸樣品中小核糖核苷酸的方法，所述方法包括步驟(i)將核酸樣品與特異性地針對小核糖核酸的探針接觸，所述小核糖核酸的序列如SEQIDNO:1—10所示；和(ii)根據樣品與小核糖核酸的探針的雜交情況，獲得所述小核糖核酸的表達譜。優選地，所述的探針位於晶片上；更佳地，所述的核酸樣品是抽提核酸。在本發明的第七方面，提供了一種檢測肝癌的方法，所述方法包括步驟(i)將待檢體系和含有特異性地針對小核糖核酸的探針接觸，所述小核糖核酸的序列如SEQIDNO:1—IO所示；(ii)觀察待檢體系與所述探針的雜交情況，其中，如果所述待檢體系可與探針雜交，則表明該待檢體系存在肝癌的可能性；所述待檢體系選擇組織、細胞體系、或抽提的核酸。在本發明的第八方面，提供了一種篩選候選物質的方法，所述方法包括步驟5(a)將待篩選物質與實驗組的肝癌細胞培養物接觸，然後檢測所述肝癌細胞中小核糖核酸，其中所述的小核糖核酸的序列如SEQIDNO:1—IO所示，從而獲得實驗組肝癌細胞中所述小核糖核苷酸的表達譜；(b)將實驗組肝癌細胞中所述小核糖核苷酸的表達譜與空白對照組表達譜及正常肝細胞中所述小核糖核苷酸的表達譜進行比較，所述空白對照組表達譜是來自不加入待篩選物質的肝癌細胞培養物；其屮，如果實驗組表達譜與空白對照組表達譜的一致率<70%，說明該待篩選物質足與肝癌的小核糖核苷酸表達譜相關的潛在物質，可以作為進一步篩選的基礎；較佳地，一致率<50%，更佳地，一致率<20%。據此，本發明提供了在肝癌中的miRNAs表達譜，並以此完成了上述發明。圖1顯示了在肝癌、癌旁和正常肝組織中差異表達的miRNA的表達譜。圖2顯示了實時RT-PCR驗證晶片的結果；其中al到a8分別是8個miRNA的結果；X軸代表不同的樣品，Y軸代表癌和癌旁相對的表達水平，數據均以癌旁表達值為參照作了倍數轉換；b的X軸代表不同的miRNAs的晶片和實時RT-PCR檢測的結果，Y軸代表8個miRNAs用晶片和實時RT-PCR檢測所得表達值的癌/癌旁比值。具體實施例方式發明人經過廣泛N0:1—10所示序列)具有SEQIDNO具有SEQIDNO具有SEQIDNO具有SEQIDNO具有SEQIDNO具有SEQIDNO具有SEQIDNO具有SEQIDNO具有SEQIDNO具有SEQIDNO而深入的研究，驚奇地發現了一些miRNA，這些miRNA(如SEQID在肝癌、癌旁和正常肝組織每兩種組織間的表達都有顯著差異1所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-101)，(has—miR—148a),2所示核酸序列的小核糖核酸3所示核酸序列的小核糖核酸4所示核酸序列的小核糖核酸5所玩核酸序列的小核糖核酸6所示核酸序列的小核糖核酸7所示核酸序列的小核糖核酸8所示核酸序列的小核糖核酸9所示核酸序列的小核糖核酸10所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-181a),(has-miR-214),(has-miR-221)'(has-miR-222)，(has-miR-25)，(has-miR-29c)，(has-miR-34a)，禾口(has-miR—424)。基於本發明的上述新發現，發明人完成了一系列的發明，例如但不限於1、獲得一種基因晶片(微列陣晶片)，晶片上含有能特異性地同上述miRNA結合的探針；2、製備一種用於鑑別肝癌組織、癌旁組織、和/或正常組織的試劑或試劑盒；3、製備一種初步檢測肝癌的試劑或試劑盒；4、檢測能同上述miRNA特異性結合的物質的方法；5、用於進行肝癌的初步分型、鑑別診斷、和/或易感性分析；6、用於初步評估相關人群肝癌的患病風險，早期監測、早期預防；7、用於初步評估相關人群的肝癌治療藥物、藥物療效、預後，以及選擇合適的治療方法。本發明包括可用於檢測miRNA的表達水平，進而鑑別肝癌組織、癌旁組織、和/或正常組織的的試劑盒，所述的試劑盒屮可包括特異性地針對miRNA的探針。優選的，所述探針攜帶可檢測信號。所述的探針可固定在微陣列(microarray)或基因晶片上。本發明還涉及定量和定性檢測miRNA水平，從而判斷肝癌的發生或發展的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，例如包括(但不限於)實時螢光定量PCR,聚類分析，非參數Mann-Whitney檢驗，Spearman相關性分析等。一種檢測待測組織或樣品中是否存在所述miRNA及其存在量的方法是利用實時螢光定量PCR進行檢測，它包括製備各miRNA的特異性探針(所述探針優選攜帶可檢測信號)，製備各miRNA的特異性引物，進行PCR，然後通過檢測PCR結束後的可檢測信號的強弱來判斷所述miRNA的水平。作為本發明的優選方式，基於TaqMan螢光技術，即以TaqMan螢光探針為基礎進行檢測。TaqMan螢光探針為一種寡核苷酸，其兩端分別標記一個螢光發射基團(作為可檢測信號)和一個螢光淬滅基團。當探針完整時，螢光發射基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使螢光發射基團和螢光淬滅基團分離，從而通過螢光檢測系統可接受到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，即螢光信號的累計與PCR產物形成的完全同步，從而實現定性和定量。所述的小核糖核酸特異性的引物和/或探針也包含在本發明內，用於檢測樣品中是否存在所述小核糖核酸及其存在量，從而用於判斷受試者是否患有肝癌或患病風險。所述的探針可固定在微陣列(microarray)或基因晶片上，用於分析組織或樣品中miRNA的差異表達分析和基因診斷。本發明提供的晶片含有特異性地針對miRNA的探針，所述miRNA如SEQIDNO:l—IO所示序列；較佳地，所述晶片還含有特異性地針對如SEQIDNO:11—41所示序列的miRNA的探針；更佳地，所述晶片還含有特異性地針對如SEQIDNO:42—84所示序列的miRNA的探針。在本發明的一種優選方式中，提供一種篩選方法，所述的方法包括將候選物質與如SEQIDNO:1—10所示序列的探針接觸；觀察候選物質與所述探針的雜交情況，其中，若所述候選物質可與探針雜交，則表明該候選物質是治療肝癌的潛在物質。更優選的，可通過設置對照組來觀察候選物質與所述探針的雜交情況；所述對照組是不添加所述候選物質的體系。本發明提到的上述特徵，或實施例提到的特徵可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特徵可與任何組合物形式並用，說明書中所揭示的各個特徵，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特徵取代。因此除有特別說明，所揭示的特徵僅為均等或相似特徵的一般性例子。本發明的主要優點在於1、首次揭示和證明了一類小核糖核酸與肝癌密切相關，找到了可作為肝癌臨床診斷的重要生物標誌物，為該疾病的診斷或防治提供了新的靶點2、首次揭示如SEQIDNO:1—84所示序列的miRNA表達譜及其同肝癌的相關性，為相關疾病的防治提供了有效途徑；3、木發明人分析了大量的肝癌患者'l'小核糖核酸的水平，並與正常人作了細緻的比較，因此結果準確可靠。下面將結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外.任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1驗證實施例材料與方法病例組織78對癌和癌旁組織來自於原發性肝癌患者的手術切除標本，這些標本去自於浙江大學第一附屬醫院病理科和啟動肝癌研究所。10例正常肝來自意外死亡者。所取得所有組織標本均通過上海市政府授權的世界衛生組織合作組織倫理委員會的同意。手術切除標本均經過了病理學分析，病理分級依照Edmonson標準。臨床資料包括年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、淋巴結轉移、肝硬化狀態、HBV和HCV感染情況，這些資料都來自於患者的病例記錄。所有患者術前都沒有接受化療，術後隨訪最長達48小時。MicroRNA晶片探針設計針對成熟miRNAs序列，miRNAs序列從Sanger資料庫下載(httpV/microrna.Sanger,ac.uk;miRBaseRelease7.0,accessedJune,2005).耙序列包含人類miRNAs435個，122個預測miRNAs序列和75個大鼠和小鼠的序列，總計晶片上包括了509個靶向於成熟miRNAs探針。除此之外我們設計了8個己知的RNA沒有互補結合的寡核苷酸序列作為陰性對照。其它的靶miRNAs探針採用Ambion公司的miRNAProbeConstructionKit(Atnbion,Austin,TXUSA)合成。RNA抽提和樣品準備富含miRNA的用Arnbion公司的miRNAs抽提試劑盒抽提獲得，具體操作按照相應說明書小RNA。樣品用T4RNA連接酶標記步驟依照Thomson'的方法(11)。簡而言之，化g小RNA和500ng5'-磷酸鹽-胞噴啶-尿嘧啶-cy3-3'(Dhar薩on,Chicago,USA)及2單位2unitsT4RNAligase(NEB,Ipswich,USA)，於4'C孵育2小時，對miRNA進行標記。每份miRNA樣品均設等量的相應陰性對照。標記的RNA用0.3M醋酸鈉和2.5體積乙醇進行沉澱，再用15W含3XSSC、0.2%SDS和15%甲醯胺的雜交液重懸，所有的雜交重複兩次，雜交用LifterSlipT"(Erie,PAUSA)以保證雜交液在晶片和蓋片之間均勻流動。將雜交室放在雜交儀BioMixerTMII上(CapitalBioCorp,Beijing,China)於42'C水浴雜交過夜，之後用洗液洗兩遍。實時RT-PCR驗證晶片結果RNA樣品用TaqManMicroRNA逆轉錄試劑盒合成單鏈cDNA(AppliedBiosystems,Foster,USA)。我們用ABI公司合成的miRNA和U43MGB探針檢測PCR產物，以U43作為內參進行相對定量分析。每個逆轉錄反應用1-10ngmiRNA,靶基因和U43在同一反應體系中進行逆轉錄。相對定量real-timePCR反應用ABI7300系統進行反應(AppliedBiosystems'Foster,USA)。本研究運用looped-primer進行特異的逆轉錄的反應確保檢測的目的基因僅為成熟miRNAs。晶片資料的統計分析晶片雜交的圖像用LuxScan10K掃描儀掃描獲得，並通過LuxScanT"軟體定量。數據的預處理包括背景扣除，數據過濾和標化，表達水平的數值進行log轉化。這些處理都是用R軟體包完成的。將信號雜交值在三分之一的樣品高於100的microRNA作後續的分析。用多項量表法(Multi-dimensionalscaling,MDS)來分析所有miRNAs在所有標本的表達譜型。之後我們用四種方法(Student'st檢驗，Wilcoxon檢驗，eBayes檢驗和微陣列顯著性分析(SAM))分析了癌與癌旁，癌與正常，癌旁與正常的差異，在其中三種方法中差異均有統計學意義者定義為差異表達microRNAs.在所有的分析中錯誤發現率設為小於0.01(FDR<0.01)有統計學意義。結果不同miRNA表達譜型鑑別肝癌、癌旁及正常肝組織我們用miRNAs寡核苷酸晶片(包含509個探針)分析78對肝癌和癌旁組織及10例正常肝的miRNA的表達譜。發現84個miRNAs在肝癌、癌旁或者正常肝之間表達有明顯差異。其中有10個miRNAs在肝癌、癌旁和正常肝組織每兩種組織之間表達都有顯著差異，詳見表1。上述結果詳見表1，圖1。之後用支持向量機的留一交叉驗證法分析愛和癌旁差異的69個miRNAs的區分能力，89.70%的肝癌和癌旁可以被正確區分。因此此譜型的可以作為診斷分子標記。表184個miRNA在肝癌組織(HCC)、癌旁組織(N)和正常肝組織(NL)中的差異表達(p<0.05)_目錄MiRs數量miRNA表達水平的Log比值T檢驗的p值HCCvsNHCCvsNLNvsHCCvsNHCCvsNLNvsNLI.10hsa-miR-101-0.958-2.236-1.2780.000O扁O扁9tableseeoriginaldocumentpage10hsa-miR-30c-0.234-0.599O扁o細hsa-miR-30d0.3391.042O細0.001hsa-miR-3310.5240,856O扁o細hsa-miR-422a-0.527-1.074O扁o扁hsa扁miR-422b-0.825-1.110O扁0.000hsa-miR-451-0.587-1.506O扁0.000CategoryNum-bcrofmiRsmiRNA表達水平的Log比值T檢驗的p值HCC對NHCC對NLN對NLHCC對NHCC對N對NLhsa-miR-520b-0.415-1.025O細O據hsa-miR-520d-0.444-1.1820.000o細hsa-miR-520f-0.410-1.2070.0000,011hsa-miR-920.2580.9230.0060.004hsa-miR-930.9641.158O細0.000hsa-miR-980.3820.5740.000o扁PREDICTED一MIR165-0.565-1.243O扁o扁PREDICTED—MIR166-0.758-1.338o扁0.000PRED1CTED_MIR1890.8831.494o細o細m.HCC對NL和N對12hsa-let-7b0.9240.979o據0.004hsa-miR-125a1.0121.321o細0.000hsa-miR-146b1.0531.047o皿O扁hsa-miR-1501.1551.360o扁0,000hsa-miR-192-0.782-0.651o扁o細hsa-miR-19b-0.924-0.979o掘0,003hsa-miR-200b0.8720.729o扁0.000hsa-miR-215-1.618-1.531o細o扁hsa-miR-26b-1.148-0.917o扁0.00011tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage14PREDICTED—MIR166UCGAAGCCUUGGGUGUGGGAGGSE(5IDNO:38PREDICTED一MIR189UGCUGGUGAGGGAGCCCUGCUGSEC)IDNO:39hsa-miR-100AACCCGUAGAUCCGAACUUGUGSEC)IDNO:40hsa-miR-103AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGASECIDNO:41hsa-let-7bUGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUUSEQIDNO:42hsa-miR-125aUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGSEgIDNO:43hsa-miR-146bUGAGAACUGAAUUCCAUAGGCUSECIDNO:44hsa-miR-150UCUCCCAACCCUUGUACCAGUGSEGIDNO:45hsa-miR-192CUGACCUAUGAAUUGACAGCCSEQIDNO:46hsa-miR-19bUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGASEgIDNO:47hsa-miR-200bUAAUACUGCCUGGUAAUGAUGASE<3IDNO:48hsa-miR-215AUGACCUAUGAAUUGACAGACSE<5IDNO:49hsa-miR-26bUUCAAGUAAUUCAGGAUAGGUUSEQIDNO:50hsa-miR-29bUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUSE(IDNO:51hsa-miR-342UCUCACACAGAAAUCGCACCCGUCSEQIDNO:52PREDICTED_MIR191CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUSEQIDNO:53hsa-miR-106aAAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGCSEQIDNO:54hsa-miR-17-5pCAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGUSEQIDNO:55hsa-miR-20aUAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAGSEQIDNO:56hsa-miR-20bCAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAGSEQIDNO:57hsa-miR-10aUACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUGSEQIDNO:58hsa-miR-122aUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUSEQIDNO:59hsa-miR-125bUCCCUGAGACCCUAACUUGUGASEGIDNO:60hsa-miR-126UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGSE(JIDNO:61hsa-miR-130aCAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAUSEGIDNO:62hsa-miR-130bCAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAUSEQIDNO:63hsa-miR-154UAGGUUAUCCGUGUUGCCUUCGSE(JIDNO:64hsa-miR-148bUCAGUGCAUCACAGAACUUUGUSEQIDNO:65hsa-miR-194UGUAACAGCAACUCCAUGUGGASE(JIDNO:66hsa-miR-195UAGCAGCACAGAAAUAUUGGCSEQIDNO:67hsa-miR-199aCCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCSEQIDNO:6815tableseeoriginaldocumentpage16用實時RT-PCR法驗證晶片結果:我們採用Real-timeRT-PCR法驗證晶片結果。本檢測用ABI公司的miRNAs檢測試劑盒，其中包含miRNA特異性的逆轉錄引物和MGB探針，以確保檢測到的目的產物僅為成熟miRNAs，而不包含前體，檢測的準確性很高，1個鹼基的差異都可以區分。我們挑選了8個癌和癌旁表達差異顯著的miRNAs,每個miRNAs分析它們在5對組織的表達情況。我們以U43為內參進行了相對定量分析，結果用配對t檢驗統計分析。Real-timeRT-PCR結果顯示6個microRNAs在癌組織表達上調，2個表達下調，與晶片結果完全相符，具體結果見圖2。。結果表明，晶片檢測方法準確性很好。實施例2肝癌易感性檢測試劑盒如實施例l所述，如序列SEQIDNO:1—84所示的小核糖核酸與肝癌密切相關。因此，可基於這個抽提病人的miRNA進行檢測。製備一試劑盒(100人次)，它含有miRNA晶片，晶片上固定有特異性地針對小核糖核酸的探針，所述小核糖核酸分別如序列SEQIDNO:1—84所示。隨機挑選100個人構成的測試組，其中包括未知是否患肝癌的對象、已知患肝癌的病人和經檢測無肝癌的正常人。獲得測試組中待檢測對象的肝組織，使用如實施例1的方法抽提RNA和製備檢測樣品，並同肝癌檢測試劑盒中的晶片雜交，獲得表達譜。檢測結果對於表達譜同實施例l中的相近的對象，進一步通過常規方法檢測以確認是否患有肝癌。檢測結果表明，表達譜同實施例l中的相近程度越高(一致率》90%)的檢測對象的肝癌易感性比例明顯高於相近程度低(一致率<70%)的人群。因此，這表明通過本發明提供的晶片和試劑盒，可進行肝癌的輔助性檢測。實施例3肝癌易感性輔助性檢測重複實施例2的檢測，不同點在於隨機選取了70個人(檢測前不知道是否有肝癌症狀)進行檢測。製備一試劑盒(100人次)，它含有miRNA晶片，晶片上固定有特異性地針對小核糖核酸的探針，所述小核糖核酸分別如序列SEQIDNO:l—84所示。獲得測試組中待檢測對象的肝組織，使用如實施例1的方法抽提RNA和製備檢測樣品，並同肝癌檢測試劑盒中的晶片雜交，獲得表達譜。結果同樣證實了，表達譜同實施例1中的相近程度越高(一致率》90%)的檢測對象的肝癌易感性比例明顯高於相近程度低(一致率<70%)的人群。實施例4基於支持向量機和留一交叉驗證法的預測用實施例l所述的方法發現，在84個microRNAs中，有69個microRNAs在肝癌和癌旁肝組織(HCCvs.N)中的表達水平差異顯著，進而發明人構建支持向量機(SVM，supportvectormachine)預測模型，用留一交叉驗證法(leave-one-outcross-validationpredictionmodels)根據69個差異表達micro腿s的表達譜預測組織為肝癌或者癌旁肝組織的正確率。結果顯示89.70%的肝癌和癌旁肝組織可以被正確區分。在癌旁肝和正常組織間，有27個microRNAs表達顯著差異表達。用支持向量機和留一交叉法分析，結果顯示97.7%的癌旁肝和正常組織可以被正確區分。在肝癌和正常組織間有55個microRNAs存在差異表達。用支持向量機和留一交叉驗證模型，結果顯示100%的肝癌和正常組織可以被正確區分。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。序列表<110〉上海市腫瘤研究所<120〉一種基因晶片及其應用<130〉080198〈160〉84<170〉Patentlnversion3.3<210〉122RNA<213〉智人(Homosapiens)<400〉1uacaguacugugauaacugaag<210〉2<211〉22RNA<213〉智人(Ho圖sapiens)2ucagugcacuacagaacuuugu3<211〉23<212〉腿<213〉智人(Homosapiens)3aacauucaacgcugucggugagu4<211〉21隨<213〉智人(Homosapiens)<■〉4acagcaggcacagacaggcag<210〉523<212〉隨<213〉智人(Homosapiens)5agcuacauugucugcuggguuuc<210〉6<211〉24<212〉隨<213〉智人(Homosapiens)<400〉6agcuacaucuggcuacugggucuc<210〉722222321232418<211〉<212〉<213〉<400〉腿智人(Homosapiens)cauugcacuugucucggucuga820<212〉RNA<213〉智人(Homosapiens)<400〉8uagcaccauuugaaaucggu20<210〉923<212〉隨<213〉智人(Homosapiens)〈400〉9uggcagugucuuagcugguuguu2310<211〉22瞧<213〉智人(Homosapiens)<400〉10cagcagcaauucauguuuugaa2211<211〉21RNA智人(Homosapiens)<400〉11ugagguaguaguuugugcugu21<210〉12<211〉21<212〉隱智人(Homosapiens)〈400〉12uaaagugcugacagugcagau211323<212〉RNA<213〉智人(Homosapiens)13agcagcauuguacagggcuauca23<210〉14<211〉21薩智人(Homosapiens)14ugugeicugguugaccagaggg211522RNA智人(Homosapiens)<400〉15uuaaugcuaaucgugauagggg22<210〉1622腿智人(Homosapiens)16uagcagcacaucaugguuuaca221722RNA<213〉智人(Homosapiens)17uggagagaaaggcaguuccuga2218<211〉22腿<213〉智人(Homosapiens)<400〉18caucccuugcaugguggagggu2219腿<213〉智人(Homosapiens)19uaaggugcaucuagugcagaua22<210〉2022<212〉,智人(Homosapiens)20caacggaaucccaaaagcagcu22<210〉2120隨20智人(Homosapiens)21agagguauagggcaugggaa2222<212〉腿<213〉智人(Homosapiens)22cugugcgugugacagcggcuga<210〉2323隨<213〉智人(Homosapiens)<400〉23caagucacuagugguuccguuua2421<212〉腿<213〉智人(Homosapiens)<400〉24uagcaccaucugaaaucgguu〈210〉2523<212〉隱<213〉智人(Homosapiens)<400〉25ugua33cauccuacacucucagc26<211〉22<212〉醒<213〉智人(Homosapiens)<400〉26uguaaacauccccgacugga3g2721<212〉隱<213〉智人(Homosapiens)<400〉27gccccugggccuauccuagaa<210〉28<211〉22<212〉腿<213〉智人(Homosapiens)cuggacuuagggucagaaggcc〈210〉2922■〈213〉智人(Homosapiens)29cuggacuuggagucagaaggcc30<211〉23<212〉RNA<213〉智人(Homosapiens)30a33CCgUU3CC3UU3CUg3guuu31<2U〉21<212〉腿智人(Homosapiens)31aaagugcuuccuuuuagaggg〈210〉32<211〉23腿<213〉智人(Homosapiens)32aaagugcuucucuuugguggguu3322<212〉RNA智人(Homosapiens)33aagugcuuccuuuuagaggguu3421隱智人(Horaosapiens)34uauugcacuugucccggccug<210〉35〈211〉22<212〉腿智人(Homosapiens)<400〉352222232123222122imageseeoriginaldocumentpage23<210〉4323隨智人(Homosapiens)43ucccugagacccuuuaaccugug<210〉44<211〉22<212〉RNA<213〉智人(Homosapiens)<400〉44ugagaacugaauuccauaggcu<210〉4522腿<213〉智人(Homosapiens)45ucucccaacccuuguaccagug46<211〉21<212〉腿<213〉智人(Homosapiens)<400〉46cugaccuaugaauugacagcc<210〉47<211〉23<212〉腿<213〉智人(Homosapiens)<400〉47ugugcaaauccaugcaaaacuga<210〉4822<212〉RNA<213〉智人(Homosapiens)<400〉48uaauacugccugguaaugauga49<211〉21<212〉腿<213〉智人(Homosapiens)<400〉49augaccuaugaauugacagac23222221232221<210〉50〈211〉22<212〉腿<213〉智人(Homosapiens)〈400〉50uucaaguaauucaggauagguu<210〉51<211〉23<212〉腿〈213〉智人(Homosapiens)<400〉51uagcaccauuugaaaucaguguu5224<212〉RNA<213〉智人(Honiosapiens)52ucucacacagaaaucgcacccguc<210〉53<211〉22<212〉隱<213〉智人(Homosapiens)〈400〉53caacggsaucccaaaagcagcu〈210〉54<211〉24<212〉隨<213〉智人(Homosapiens)54aaaagugcuuacagugcagguagc<210〉55〈211〉24<212〉隨智人(Homosapiens)<400〉55caaagugcuuacagugcagguagu<210〉56<211〉23<212〉RNA智人(Homosapiens)56uaaagugcuuauagugcagguag<210〉5722232422242423<211〉23腿<213〉智人(Homosapiens)<400〉57caaagugcucauagugcagguag5823隨<213〉智人(Homosapiens)<400〉58uacccuguagauccgaauuugug5923隱智人(Homos叩iens)<400〉59ugg柳gugeic肌ugguguuugu<210〉6022<212〉隨<213〉智人(Homosapiens)<400〉60ucccugagacccuaacuuguga<210〉6122<212〉RNA<213〉智人(Homosapiens)61ucguaccgugaguaauaaugcg<210〉62<211〉22<212〉醒智人(Homosapiens)62cagugcaauguuaaaagggc3U63<211〉22<212〉隨<213〉智人(Homosapiens)<400〉63cagugcaaugaugaaagggcau<210〉64<211〉2223232322222222瞧<213〉智人(Homosapiens)64uagguuauccguguugccuueg6522<212〉隨〈213〉智人(Homosapiens)65ucagugcaucacagaacuuugu<210〉66<211〉22腿智人(Homosapiens)<400〉66ugimacagcaacuccaugugga<210〉67_<211〉21腿智人(Homosapiens)67uagcagcacagaaauauuggc<210〉6823<212〉■智人(Homosapiens)68cccaguguucagacuaccuguuc6922<212〉腿智人(Homosapiens)69acaguagucugcacauugguua70<211〉22RNA智人(Homosapiens)<400〉70Bagcugccaguugaagaacugu<210〉71<211〉21<212〉歸22222221232222智人(Homosapiens)71uucacaguggcuaaguucugc<210〉7221<212〉腿智人(Homos叩iens)<400〉72agggcccccccucaauccugu7320隨<213〉智人(Homosapiens)<400〉73uguaaacauccuugacugga<210〉74<211〉22<212〉RNA<213〉智人(Honiosapiens)<400〉74agcucggucugaggccccucag7521<212〉腿智人(Homosapiens)<400〉75cagcagcacacugugguuugu76<211〉18隱<213〉智人(Homosapiens)<400〉76ugcuuccuuucagagggu7721<212〉隱<213〉智人(Homosapiens)<400〉77aacgcgcuucccuauagaggg78〈211〉22<212〉腿<213〉智人(Homosapiens)212120222118212878aacccguagauccgaucuugug<210〉79<211〉22RNA<213〉智人(Homosapiens)79cacccguagaaccgaccuugeg〈210〉80<211〉22RNA<213〉智人(Homosapiens)<400〉80acuuugugcuggugccggggaa8122<212〉腿智人(Homosapiens)<400〉81uauugccacaacuuugggguga<210〉8222<212〉RNA<213〉智人(Homosapiens)82ugagguaguagauuguauaguu83<211〉22<212〉隨<213〉智人(Homosapiens)83uaeiugccccu33a^auccuusu<210〉8422RNA智人(Homosapiens)84uggcucaguucagcaggaacag2222222222222229權利要求1.一種晶片，其特徵在於，它含有特異性地針對小核糖核酸的探針，所述小核糖核酸的序列如SEQIDNO1-10所示。2.如權利要求1所述的晶片，其特徵在於，它還含有特異性地針對一種或多種序列如SEQIDNO:11_41所示的小核糖核酸的探針；優選地，它還含有特異性地針對一種或多種序列如SEQIDNO:42—84所示的小核糖核酸的探針。3.—種試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒包含一容器；位於所述容器中的特異性地針對小核糖核酸的探針，所述小核糖核酸的序列如SEQIDNO:1—10所示；以及說明書；並且每種探針與可檢測的標誌物相連，不同探針上相連的可檢測標誌物也不同；優選地，所述的標誌物是螢光微球、吲哚菁染料。4.如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中還含有特異性地針對一種或多種序列如SEQIDNO:11—41所示的小核糖核酸的探針；優選地，所述試劑盒中還含有特異性地針對一種或多種序列如SEQIDNO:42—84所示的小核糖核酸的探針。5.—種用於檢測肝癌的試劑盒，其特徵在於，它含有如權利要求1所述的晶片和說明書。6.—種如權利要求1所述晶片的用途，其特徵在於，所述晶片用於製備鑑別肝癌組織、癌旁組織、和/或正常組織的試劑盒。7.—種小核糖核酸的用途，其中所述的小核糖核酸包括序列如SEQIDNO:1—10所示的寡核苷酸，其特徵在於，用於製備(a)鑑別肝癌組織、癌旁組織、和/或正常組織的試劑或試劑盒；或(b)檢測肝癌的試劑或試劑盒；優選地所述的試劑是特異性地針對小核糖核酸的探針。8.—種體外非診斷性檢測核酸樣品中小核糖核苷酸的方法，其特徵在於，所述方法包括步驟(i)將核酸樣品與特異性地針對小核糖核酸的探針接觸，所述小核糖核酸的序列如SEQIDNO:1—10所示；(ii)根據樣品與小核糖核酸的探針的雜交情況，獲得所述小核糖核酸的表達譜；優選地，所述的探針位於晶片上；更佳地，所述的核酸樣品是抽提核酸。9.一種檢測肝癌的方法，其特徵在於，所述方法包括步驟(i)將待檢體系和含有特異性地針對小核糖核酸的探針接觸，所述小核糖核酸的序列如SEQIDNO:1—10所示(ii)觀察待檢體系與所述探針的雜交情況，其中，如果所述待檢體系可與探針雜交，則表明該待檢體系存在肝癌的可能性所述待檢體系選擇組織、細胞體系、或抽提的核酸。10.—種篩選候選物質的方法，其特徵在於，所述方法包括步驟(a)將待篩選物質與實驗組的肝癌細胞培養物接觸，然後檢測所述肝癌細胞中小核糖核酸，其中所述的小核糖核酸的序列如SEQIDN0:1—10所示，從而獲得實驗組肝癌細胞中所述小核糖核苷酸的表達譜；(b)將實驗組肝癌細胞中所述小核糖核苷酸的表達譜與空白對照組表達譜及正常肝細胞中所述小核糖核苷酸的表達譜進行比較，所述空白對照組表達譜是來自不加入待篩選物質的肝癌細胞培養物；其中，如果實驗組表達譜與空白對照組表達譜的一致率<70%，說明該待篩選物質是與肝癌的小核糖核苷酸表達譜相關的潛在物質，可以作為進一步篩選的基礎；較佳地，一致率<50%，更佳地，一致率<20%。全文摘要本發明公開了一種基因晶片及其應用，本發明公開了在肝癌組織中特異性表達的小核糖核酸，本發明還公開了有關這些小核糖核酸的用途。所述的基因晶片是含有特異性地針對所述小核糖核酸的探針的晶片，所述基因晶片可用於製備鑑別肝癌組織、癌旁組織、和/或正常組織的試劑或試劑盒，用於製備檢測肝癌的試劑或試劑盒，以及輔助性診斷肝癌等。文檔編號C12N15/11GK101555519SQ200810035840公開日2009年10月14日申請日期2008年4月10日優先權日2008年4月10日發明者萬大方,何祥火,李文晰,楊勝利,顧健人申請人:上海市腫瘤研究所