一種桔青黴菌株及其應用的製作方法

2023-10-06 00:07:09

專利名稱：一種桔青黴菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物及其應用領域，特別是涉及一種新的桔青黴菌株，以及其在生 產纖維素降解酶方面的應用。
背景技術：
纖維質燃料乙醇是第二代燃料乙醇，是一種可再生的清潔能源。而能夠產生活性 高、穩定性好的天然纖維素酶的纖維素分解菌是獲得纖維質燃料乙醇的關鍵因素之一。近年研究表明，青黴屬(Penicillium)真菌中的一些種類不僅能分泌組成齊全、 酶活較高的木質纖維素降解酶系，還具有易培養和生長快的優勢(Herming J0rgensen, etc.2006. Production of cellulases by Penicillium brasilianum IBT 20888-Effect of substrate onhydrolytic performance. Enzyme and Microbial Technology,38 381-390)。桔青黴是一種空氣傳播的絲狀真菌，可產生許多種胞外水解酶，如纖維素酶、澱粉 酶、脂酶和酯酶等，可以降解纖維素、有機磷、芳香烴類石油碳水化合物、澱粉、果膠等物質。關於桔青黴纖維素酶的報導較少。文獻(J. Kevin Polman, etc. 1994. Bioconversion of coal, lignin, and dimethoxybenzyl alcohol by Penicillium citrinum. Journal of Industrial Microbiology,13 292~299 ；Tanmay Dutta,etc. 2008. Novel cellulases from an extremophilic filamentous fungiPeniciIlium citrinum production and characterization. J Ind Microbiol Biotechnol. 35 275~282)認為 桔青黴在纖維素分解領域將有著重要的研究應用價值和前景。J. Kevin等1994年報導 了具有煤炭、木質素等降解能力的一株桔青黴菌株(Strain 26)，並研究了其作用特性。 TanmayDutta等2008年報導了產纖維素酶的桔青黴菌株MTCC6489，能夠產生耐鹼且熱穩定 性的纖維素酶，初步結果認為其可能具有大小分別為90KDa和38KDa的兩個內切葡聚糖酶。

發明內容
本發明的目的是提供一種培養周期短，易於擴大培養的纖維素降解酶生產菌；本 發明的直接目的是提供一種新的桔青黴菌株。本發明的另一個目的是提供一種方法，利用該新的桔青黴菌株生產纖維素降解 酶。本發明提供的新菌株是桔青黴(Penicillium citrinum) CR-2，該菌株已於2009 年4月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.3024。本發明所述的桔青黴CR-2的特徵為菌株的菌落在PDA平板上起初菌落白色，後變為灰綠色，茸毯狀，菌落背面微黃 色。菌絲無色，0.8 1.4iim寬。分生孢子梗短，柱狀，有分支，一般長5 15iim，寬 1. 0 1. 5 y m ；分生孢子梗下部不分支，瓶梗多3 5個生於分生孢子梗頂端，密集，3. 1 7. 1 X 1. 6 2. 8 ii m，燒瓶狀，近基部最寬，頂部寬0. 5 1. 2 y m ；分生孢子近圓形，分散。見 圖1 圖4。提取此菌的DNA，以ITS5-ITS4為引物，擴增rDNA的ITS區域(核糖體-DNAITS)。 核糖體-DNAITS序列如SEQ ID NO 1所示。將該序列進行Blast比較，與桔青黴(Penicillium citrinum)僅在ITS1區有僅 3個鹼基的差異，相似性大於99%。該菌屬青黴屬真菌，生長繁殖速度快，可以在短時間內培養出大量、均一的纖維素 降解酶產生菌培養液。該菌還可在短期內(2-3天)形成大量分生孢子。極大地節約了生 產用時間和能源消耗。利用該菌生產纖維素降解酶可以極大地降低生產成本。本發明所述的利用桔青黴CR-2生產纖維素降解酶的方法，是將桔青黴CR-2接種 到液體產酶培養基中培養，得到內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。所述液體產酶培養基包括碳源、氮源、無機鹽和水。其中，所述碳源選自下述化合物中一種或幾種玉米秸稈、小麥秸稈、甘蔗渣、高粱 秸稈、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、可溶性澱粉、蔗糖；所述氮源選自下述化合物中一種或幾種尿素、蛋白腖、酵母粉、硫酸銨、酪蛋白、 牛肉膏；所述無機鹽選自KH2P04、MgS04、CaC03,所述KH2P04的終濃度為3. Og/L ；所述MgS04 的終濃度為0. 05g/L ；所述CaC03的終濃度為0. 6g/L ；蒸餾水1000mL。所述水可為蒸餾水、自來水或井水等無汙染的清潔水。所述碳源的終濃度優選為23g/L。優選碳源為玉米秸稈粉；所述氮源的終濃度優選為2. 5g/L。優選氮源為硫酸銨。所述無機鹽中，MgS04的終濃度優選為0. 05g/L ；K H2P04的終濃度優選為3. 0g/L ； CaC03的終濃度優選為0. 6g/L。所述桔青黴(Penicillium citrinum) CR-2的接種量無特別限制，一般為104 106
個孢子/mL培養基。所述培養溫度是25 32°C，優選28 30°C。所述培養方式是可以150 200rpm的轉速振蕩培養2 7天，也可靜置培養3 15天。本申請給出了多種不同條件下，利用桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2生產纖 維素降解酶的實例，詳見實施例2 5。由桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2發酵上述培養基得到的發酵製品也屬於 本產品的保護範圍。所述發酵製品可為發酵產品本身、經稀釋過的發酵產品或經純化的發酵產品；所 述發酵製品可採用顆粒、粉末、片劑等固體外形或是液體、糊狀、膠狀等流體外形。本發明的桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2的優點如下1、生長繁殖迅速；2、較高的內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的生產能力；3、發酵工藝簡單、穩定；4、產酶快(搖床培養4天即可達到產酶高峰)、酶活性高分別達到49. 91IU/mL和26. 9IU/ml，較Tanmay等2008報導的同種菌株纖維素酶活高出約20倍。5、成本低廉。因此，桔青黴((Penicillium citrinum))CR-2菌株是理想的研究、改造應用的出 發材料菌株。在纖維素降解酶的生產領域中具有實現其工業化生產的極大可能，並具有廣 闊的工農業應用和市場前景。


圖 1 為桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2 菌落形態圖；圖2、圖3為桔青黴(Penicillium citrinum) CR-2分生孢子梗形態圖；圖4為桔青黴(Penicillium citrinum) CR-2菌株剛果紅染色NaCl脫色5、圖6表示桔青黴(Penicillium citrinum) CR-2菌株產酶進程，圖中橫座標為 培養天數，縱座標分別為酶活。生物材料保藏信息名稱桔青黴(Penicilliumcitrinum)CR-2保藏編號CGMCCNo. 3024保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏時間2009年4月16日。
具體實施例方式以下實施例僅用於舉例說明本發明的方法，並不限制本發明的範圍。實施例1桔 青黴(Penicillium citrinum)CR-2 的分離篩選培養基PDA綜合培養基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白腖10g, KH2P04 3g，Mg S04 1. 5g， VB1 10mg，瓊脂20g，水1000ml，pH自然(不控制pH值)。新鮮馬鈴薯去皮後切成邊長0. 5cm 的小方塊，加水1000ml，煮沸後再加熱10分鐘，然後，用四層紗布過濾，得土豆營養液，添加 除VB1外的其他成分，補足水至1000ml，121°C滅菌20min，VB1單獨配成溶液用0. 22 y m的 微孔濾膜過濾除菌後加入，使其終濃度為10mg/L，混勻後鋪平板或製作斜面培養基。富集培養基:CMCNa 1 % ；K2HP04 0. 1 % ；Na2C 030 . 5 % ；MgS04 7H20 0. 01 % ； FeS04 『7H20 0. 015% ；Mn S045X 10-5% ；蛋白腖 1. 0% ；酵母膏 1. 0%，121°C滅菌 20min。滅 菌後鋪平板。復篩培養基CMCNa1 % ； (NH4) 2S04 0 . 4% ；K2HP04 0.2% ；MgS04 『 7H20 0. 01 % ； 蛋白腖0. ；酵母膏1.0% ；瓊脂粉1.5%，121°C滅菌20min。滅菌後鋪平板。桔青黴 (Penicillium citrinum)CR-2 的分離篩選步驟一、分離純化1、桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2的分離樣品取自我國雲南某土壤樣品，對 採集到的土壤樣品採用初篩分離法和復篩分離法相結合的方法進行分離純化。將採集到 的樣品先置於無菌三角瓶中，加入10倍體積無菌水打散均勻後，取5ml懸液加入盛有50ml 富集培養基的三角瓶，在28°C和150r/min下，振蕩培養後3 5d，移取5ml培養液至另一 盛有新鮮培養基的三角瓶中繼續培養。取富集後的培養液做一系列的稀釋梯度100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，分別塗布篩選平板，倒置恆溫28°C培養，分離能夠旺盛生長菌株。2、將得到的純菌種轉移接種到斜面培養基(PDA綜合培養基)上，4°C保存。二、纖維素降解酶產生能力的篩選1、採用剛果紅平板脫色法，根據菌株在培養過程中纖維素降解酶類的產生情況， 從中篩選出產酶快，酶活高的菌種。剛果紅平板脫色法將培養適當時間的平板，用0. 的剛果紅水溶液浸染一段 時間後，再用lmol/L的NaCl水溶液脫色，剛果紅將未被降解CMCNa染成紅色，而對已被降 解的小分子低聚糖類無作用，因此在產CMCase的菌落周圍留下了清晰地透明圈。在剛果紅 染色、NaCl脫色後可以觀察到菌落周圍有明顯透明水解圈的菌株為纖維素分解菌。CR-2在培養1天後即產生了明顯的脫色圈；培養2天後，CR-2產生了直徑約為 3. 0cm的明顯脫色圈。生長和脫色情況如圖4所示。顯然，CR-2不僅生長速度迅速，而且具有迅速強力的纖維素分解能力，說明該菌種 具有快速產生較高活力的纖維素酶力，是纖維素降解酶生產的理想菌種。三、菌種分類地位的鑑定對篩選出的CR-2菌株的表型特徵和核酸特徵進行系統地鑑定，結果如下培養特徵和形態特徵為菌落在PDA平板上起初菌落白色，後變為灰綠色，茸毯 狀，生長緩慢，一般30°C培養10d直徑不超過2cm，菌落背面微黃色。菌絲無色，0. 8 1.4iim寬。分生孢子梗短，柱狀，有分支，一般長5 15 iim，寬1.0 1.5 iim;分生孢子梗 下部不分支，瓶梗多3 5個生於分生孢子梗頂端，密集，3. 1 7. 1 X 1. 6 2. 8 y m，燒瓶 狀，近基部最寬，頂部寬0. 5 1. m ；分生孢子近圓形，分散。分生孢子形態如圖2所示。 提取此菌的DNA，以ITS5-ITS4為引物，擴增rDNA的ITS區域(核糖體-DNA ITS)。序列進 行Blast比較，與Penicillium citrinum相似性大於99%。序列如SEQ ID NO :1所示。實施例2桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2的發酵培養利用桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2生產纖維素酶，包括以下步驟1、桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2 的孢子培養產孢培養基酵母浸粉10g，葡萄糖20g，水1000ml，pH自然，121°C滅菌20min。用接種鏟從斜面挖取一塊邊長為0. 5cm左右的菌絲塊接種於產孢培養基平板中， 30°C培養3 4天，即可產生大量綠色孢子。2、發酵生產纖維素降解酶產酶培養基(/L)玉米秸稈粉2. 3%, (NH4)2S04 0. 25%,KH2P04 0. 3%,MgS04.7H20 0. 05%, CaC03 0 . 06%，121°C滅菌 20min，自然 pH 值。內切葡聚糖酶活性(羧甲基纖維素酶活(CMCase))的測定方法DNS法——參 照 Hardin M T, Mitchell D A, Howes T. 2006. Approach to designing rotating drum bioreactors forsolid-state fermentation on the basis of dimensionless design factors[J], Biotechnol, Bioeng. 67(3) :274_282 禾口 Ghose T K, 1987. Measurement of celluloseactivities[J]. Pure and Apple. Chem. 59(2) :257_268.在容積為25ml的試管中，加入1ml適當稀釋的酶液於50°C恆溫水浴中預熱2min。 加入3ml pH4. 8的0. 5% CMCNa溶液。50°C恆溫水浴準確反應30min。加入1ml濃度為 Imol/LNaOH溶液，搖勻，終止反應。加入3ml DNS試劑，同時於沸水浴中準確反應5min。用流動的冷水終止反應。離子水定容至25ml，於540nm處測定光吸收值。對照標準曲線後測算酶活力。在上述條件下，酶活力按國際單位規定定義每分 鍾催化纖維素水解生成lumol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位IU(IU/ml)。以上酶活力均 扣除發酵液中的糖含量，以葡萄糖作標準溶液，以每分鐘生成1 P g葡萄糖作為一個酶活單 位。外切葡聚糖酶活性(濾紙酶活(FPA))測定方法DNS法——參照Taillisz P， etc. 1989. Enhanced cellulose fermentation by an asprogenous and ethanol~to1erant mutant ofClostridium ermocellum[J]. Appl, Environ. Microbiol. 55 :207_211.在容積為25ml的試管中，加入lcmX 6cm的whatman NO. 1濾紙條和1ml的 0. 05MpH4. 8檸檬酸緩衝液；加入0. 5ml適當稀釋的酶液，50°C恆溫水浴反應lh ；加入 3mlDNS試劑，同時於沸水浴中準確反應5min ；用流動的冷水終止反應；用離子水定容至 25ml，於540nm處測定光吸收值。對照標準曲線後測算酶活力。在上述條件下，酶活力按國際單位規定定義每分 鍾催化纖維素水解生成lumol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位IU(IU/ml)。以上酶活力均 扣除發酵液中的糖含量，以葡萄糖作標準溶液，以每分鐘生成1 P g葡萄糖作為一個酶活單 位。按步驟1培養孢子，用無菌水將孢子洗下，用血球計數法計數後用無菌水調整孢 子濃度，使每毫升孢子懸液中含有約2. 5X107個孢子，然後接種0. 5mL孢子懸液入50mL產 酶培養基中(裝在250mL三角瓶中)，使接種的孢子終濃度2. 5X 105個/mL培養基，30°C 靜置培養7天。發酵結束後測定發酵液中CMCase的活性為36. 71IU/ml, FPA的的活性為 19.13IU/ml。實施例3 桔青黴(PeniciIlium citrinum)CR-2 的發酵生產(一)利用桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2生產纖維素內切葡聚糖酶，包括以下步 驟1、桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2 的孢子培養同實施例2。2、發酵生產纖維素降解酶產酶培養基配方和內切葡聚糖酶活性、外切葡聚糖酶活性的測定方法同實施例2。 按實施例2的方法和濃度接種孢子懸液入200mL產酶培養基中，30°C，200rpm培養5天，測 定發酵液中CMCase的最高活性為49. 91IU/ml, FPA的的最高活性為26. 9IU/ml (如下圖所 示)°實施例4 桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2 的發酵生產(二 )利用桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2生產纖維素降解酶，包括以下步驟1、桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2 的孢子培養同實施例2。2、發酵生產纖維素降解酶產酶培養基(/L)小麥秸稈粉2.3%，(NH4)2S04 0. 25 %, K H2 P04 0.3 %, MgS04 7H20 0. 05%, CaC03 0 . 06%，121°C滅菌 20min，，自然 pH 值。內切葡聚糖酶活性和外切葡聚糖酶活性的測定方法同實施例2。按實施例2的方法和濃度接種孢子懸液入200mL產酶培養基中，30°C，200rpm培養5天，測定發酵液中 CMCase的最高活性為47. 93IU/ml, FPA的的最高活性為23. 73IU/ml (見圖5、圖6)。實施例5桔青黴(PeniciIlium citrinum) CR-2的發酵生產(三)利用桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2生產纖維素降解酶，包括以下步驟1、桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2 的孢子培養同實施例2。2、發酵生產纖維素降解酶產酶培養基(/L)高粱秸稈粉2.3%，(NH4)2S04 0. 25 %, K H2 P04 0.3 %, MgS04 7H20 0. 05%, CaC03 0 . 06%，121°C滅菌 20min，自然 pH 值。內切葡聚糖酶活性和外切葡聚糖酶活性的測定方法同實施例2。按實施例2的 方法和濃度接種孢子懸液入200mL產酶培養基中，30°C，200rpm培養5天，測定發酵液中 CMCase的最高活性為43. 92IU/ml, FPA的的最高活性為21. 71IU/ml。實施例6桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2的發酵生產(四)利用桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2生產纖維素降解酶，包括以下步驟1、桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2 的孢子培養同實施例2。2、發酵生產纖維素降解酶產酶培養基(/L)蔗渣2. 1 %, (NH4)2S04 0. 25 %, K H2 P04 0.3 %, MgS04 7H200. 05%, CaC03 0 . 06%，121°C滅菌 20min,自然 pH 值。內切葡聚糖酶活性和外切葡聚糖酶活性的測定方法同實施例2。按實施例2的 方法和濃度接種孢子懸液入200mL產酶培養基中，30°C，200rpm培養5天，測定發酵液中 CMCase的最高活性為45. 63IU/ml, FPA的的最高活性為22. 73IU/ml。SEQUENCE LISTING中國農業科學院作物科學研究所 一種桔青黴菌株及其應用1PatentIn version 3. 1 1
520DNA 桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2
1
GGGCCCTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGTTGCCCGAACCTATGTTGCC TCGGCGGGCC60
CCGCGCCCGCCGACGGCCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGTTGCAGTCTGAG ACCTATAACG120
AMTTAGTTAMACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGA AGAACGCAGC180
GMATGCGATMCTAATGTGMTTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCT TTGMCGCAC240
ATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCT GCCCTCMGC300
CCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCCCGCCGGGGGGACGGGCCCGAA AGGCAGCGGC360
GGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTAGT AGGCCCGGCC420
GGCGCCAGCCGACCCCCAACCTTTAATTATCTCAGGTTGACCTCGGATCA GGTAGGGATA480
CCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAMCGG ATGAATACCG520
權利要求
桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2CGMCC 3024。
2.權利要求1所述的桔青黴，其特徵在於其菌株的核糖體-DNAITS序列如SEQ IDNO 1所示。
3.用權利要求1或2所述的桔青黴生產纖維素降解酶的用途。
4.一種生產纖維素降解酶的方法，將桔青黴CR-2CGMCC 3024接種到液體產酶培養基 中培養，得到內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。
5.權利要求4所述的方法，所述液體產酶培養基包括碳源、氮源、無機鹽和水。
6.權利要求5所述的方法，所述碳源選自玉米秸稈、小麥秸稈、甘蔗渣、高粱秸稈、微晶 纖維素、羧甲基纖維素鈉、可溶性澱粉或蔗糖中一種或幾種；所述氮源選自尿素、蛋白腖、酵 母粉、硫酸銨、酪蛋白或牛肉膏中一種或幾種；所述無機鹽選自KH2P04、MgSO4或&0)3。
7.權利要求5所述的方法，所述碳源選自玉米秸稈粉、小麥秸稈粉、甘蔗渣、高粱秸稈 粉中一種或幾種，終濃度為23g/L ；所述氮源為硫酸銨，終濃度為2. 5g/L。
8.權利要求6所述的方法，所述MgSO4的終濃度為0.05g/L ；KH2PO4的終濃度為3. Og/ L ；CaCO3的終濃度為0. 6g/L。
9.權利要求4所述的方法，所述桔青黴的接種量為IO4 IO6個孢子/mL培養基，培養 溫度是25°C 32°C，振蕩培養2 7天或靜置培養3 15天。
10.用權利要求1或2所述的桔青黴得到的發酵培養製品。
全文摘要
本發明涉及桔青黴(Penicillium citrinum)CR-2CGMCC 3024及其應用。該菌為青黴屬真菌，培養周期短，生長繁殖速度快，可以在短時間內培養出大量、均一的纖維素降解酶產生菌培養液。本發明還提供利用該菌株在液體產酶培養基中發酵培養生產內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的方法，可在短時間內生產較高活力的內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，且其發酵工藝簡單、穩定、成本低廉、產量高。
文檔編號C12N1/14GK101864366SQ20091008221
公開日2010年10月20日 申請日期2009年4月20日 優先權日2009年4月20日
發明者張保明, 曲小爽, 李桂英, 路明, 頓寶慶 申請人:中國農業科學院作物科學研究所