氧化微桿菌以及利用該氧化微桿菌製備光學純手性芳基仲醇的方法

2023-10-06 02:31:44 3

專利名稱：氧化微桿菌以及利用該氧化微桿菌製備光學純手性芳基仲醇的方法
技術領域：
本發明涉及一種微桿菌及其用途，更具體地說是涉及一種氧化微桿菌以及利用該氧化微桿菌製備光學純手性芳基仲醇的方法。
背景技術：
光學活性手性芳基仲醇是手性藥物、農用化學品、外激素、調料、香料、液晶及手性輔料合成的重要中間體，目前通常採用製備方法包括兩大類方法即潛手性酮的不對稱還原以及消旋體醇的動力學拆分。例如，利用酯酶或脂肪酶催化的外消旋仲醇的對映選擇性酯化或轉酯化拆分以及外消旋酯的對映選擇性水解拆分是製備光學活性手性芳基仲醇方法之一，這種方法的主要優點在於商品脂肪酶的種類較多，針對特定的底物能比較容易地選出具有高活力和高對映選擇性的酶。但該方法目標對映體產物的最高收率不超過50％，另外對於脂肪酶催化的外消旋酯的水解拆分，必須事先合成外消旋的底物酯，對於工業化生產而言，不僅增加了操作步驟，而且增加了額外的成本。潛手性酮的不對稱還原是製備光學活性手性醇的另一種重要方法，該方法理論上能將底物酮100％地轉化為單一對映體的手性醇，具有較高的工業應用價值。化學法對潛手性酮的不對稱還原通常使用手性氨基醇或過渡金屬配合物等作為催化劑實現酮的還原。化學法催化的酮不對稱還原雖然具有較高的產率，但反應的立體選擇性往往不夠理想，產品的光學純度常常不能達到製藥行業的要求，而且手性催化劑的製備和回收比較困難，價格比較昂貴。生物法催化的潛手性酮不對稱還原具有立體專一性高的優勢，還原產物仲醇的光學純度通常很高，是當前的一個研究熱點。生物法催化酮不對稱還原所使用的生物催化劑一般包括脫氫酶製劑和微生物活性整細胞，目前最主要的缺點是反應體系中需要再生還原型輔酶NADH或NADPH，這些輔酶非常昂貴，因此難以用於大規模產品生產。高效低成本的解決輔酶再生問題是這類方法產業化成功的關鍵。利用生物催化方法選擇性地將外消旋芳基仲醇的一個對映體氧化為芳基酮，同樣可以得到光學活性的另一種對映體芳基仲醇。這其中涉及到的輔酶主要為NAD+或NADP+，其價格要遠低於輔酶NADH或NADPH。因此利用此方法有望以較低的輔酶再生成本得到高光學純度的芳基仲醇。生物脫氫反應生成的芳基酮可作為對映選擇性互補的生物還原反應的底物，通過生物氧化與生物還原反應的串聯，即可以100％的理論產率得到光學純的芳基醇。例如，TetrahedronAsymmetry 2006，171769-1774，楊巍等曾報導紅酵母Rhodotorula sp.AS2.2241，可將苯乙酮不對稱還原為(S)-1-苯乙醇。將氧化微桿菌與紅酵母催化的反應組合即可實現消旋1-苯乙醇的去消旋化為(S)-1-苯乙醇。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種新篩選的氧化微桿菌，該菌株是從土壤中分離並經過多輪篩選後獲得的，於2006年11月29日在中國普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCC1875，並利用該氧化微桿菌的催化作用選擇性氧化反應製備光學純手性芳基仲醇，以較低的成本製備出高光學純度(＞99％)的手性芳基仲醇。
本發明採用的技術方案氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCC NO.1875。
採用上述氧化微桿菌作為催化劑製備光學純手性芳基仲醇的方法，包括下列步驟a.培養氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCCNO.1875，然後取上述氧化微桿菌細胞置於緩衝溶液中；b.向上述緩衝溶液中加入消旋體芳基仲醇，經催化對映選擇性氧化產生相應的酮和(S)-仲醇，其中所述消旋體芳基仲醇的結構通式為R1CH(OH)R2，取代基R1選自-C6H5或-C6H4X，取代基R2為-CH3，取代基X選自-CH3、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NH2或-NO2其中之一；c.反應液經分離、純化得到目標產物光學純(S)-芳基仲醇。
製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於反應體系中所述氧化微桿菌細胞濃度為5～100g(溼重)/L。
製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於反應體系中所述所述消旋體芳基仲醇的濃度為10～200mM。
製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於步驟b的反應溫度控制為20～50℃，反應時間為3～96小時。
製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於所述緩衝溶液為pH值為6～8的磷酸鉀緩衝溶液或Tris-HCl緩衝溶液。
製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於反應體系中可加入質量為反應體系質量0.2％～10％的有機助溶劑，所述有機助溶劑選自甲醇、乙醇、二甲基亞碸、二甲基甲醯胺中的一種或一種以上的混合物。
製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於步驟b中所述消旋體芳基仲醇為1-苯基乙醇。
製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於在步驟b反應結束後可向反應體系中加入紅酵母(Rhodotorula sp.)ECU316-1 CGMCC NO.1735。
本發明的有益效果，本發明採用新的氧化微桿菌作為催化劑對消旋體芳基仲醇進行對映選擇性氧化反應製備出高光學純度(＞99％)的手性芳基仲醇，催化劑易於製備、反應條件溫和，具有一定的工業應用開發前景。在實施例中(S)-1-苯乙醇的產率可達90％，對映體過量值大於99％。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明進一步詳細描述本發明的氧化微桿菌細胞(Microbacterium oxydans)ECU2010是一種屬於細菌類桿菌屬的菌株，該菌株是從土壤中分離，並經過多輪篩選後獲得的，於2006年11月29日在中國普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCC1875。本發明的菌種具有如下的微生物學特徵1.形態特徵該菌株為黃色菌落，表面光滑半透明，邊緣整齊，對光看有光澤。
2.生理生化特徵(1)革蘭氏陽性杆狀菌；好氧菌；(2)接觸酶實驗陽性；(3)氧化酶實驗陰性；(4)澱粉水解試驗陰性；(5)明膠液化試驗陰性；(6)硝酸鹽還原試驗陰性(7)糖醇類發酵試驗陽性甘露糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、澱粉和肌醇陰性D-葡萄糖、D-甘露醇、乳糖、阿拉伯糖、山梨醇、鼠李糖(8)賴氨酸脫羧酶試驗陰性；(9)脲酶試驗陰性；(10)生長最適宜溫度25～35℃；根據以上生理生化試驗和《常見細菌系統鑑定手冊》、《伯傑細菌鑑定手冊》，該菌為氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)，根據16SrDNA分子生物學鑑定，該細菌與氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)的同源性為99％。
採用上述氧化微桿菌作為催化劑製備光學純手性芳基仲醇的方法，包括下列步驟a.培養氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCC NO.1875，然後取上述氧化微桿菌細胞置於緩衝溶液中；b.向上述緩衝溶液中加入消旋體芳基仲醇，經催化對映選擇性氧化產生相應的酮和(S)-仲醇，其中所述消旋體芳基仲醇的結構通式為R1CH(OH)R2，取代基R1選自-C6H5或-C6H4X，取代基R2為-CH3，取代基X選自-CH3、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NH2或-NO2其中之一；c.反應液經分離、純化得到目標產物光學純(S)-芳基仲醇。反應體系中所述氧化微桿菌細胞濃度為5～100g(溼重)/L。反應體系中所述所述消旋體芳基仲醇的濃度為10～200mM。步驟b的反應溫度控制為20～50℃，反應時間為3～96小時。所述緩衝溶液為pH值為6～8的磷酸鉀緩衝溶液或Tris-HCl緩衝溶液。反應體系中可加入質量為反應體系質量0.2％～10％的有機助溶劑，所述有機助溶劑選自甲醇、乙醇、二甲基亞碸、二甲基甲醯胺中的一種或一種以上的混合物，優選二甲基亞碸。步驟b中所述消旋體芳基仲醇優選1-苯基乙醇。
在步驟b反應結束後可向反應體系中加入紅酵母(Rhodotorula sp.)ECU316-1 CGMCC NO.1735，紅酵母細胞與氧化微桿菌細胞的質量比(溼重/溼重)最好為2∶1～100∶1。紅酵母細胞可以催化第一步反應產生酮將其選擇性還原為(S)-仲醇，經過上述兩步選擇性互補的氧化還原反應，可提高將消旋體仲醇去消旋化轉化為(S)-仲醇的產率。
實施例1培養基配方為葡萄糖15.0g/L，酵母膏5.0g/L，蛋白腖5.0g/L，KH2PO41.0g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO40.5g/L，pH7.0。取4℃保存的氧化微桿菌斜面菌種，挑取一環接種至裝有50ml培養基的250ml搖瓶中，在30℃下，160rpm振搖培養48h，離心收穫細胞。發酵液酶活力約為20～40U/L，細胞濃度約10～20g(溼重)/L，單位細胞的酶活力為2U/g溼細胞。細胞活力單位的定義為在30℃，pH7.0的條件下，每分鐘催化1-苯乙醇氧化生成1.0μmol苯乙酮所需的細胞量。
實施例2取溼重1.0g的上述氧化微桿菌細胞，懸浮於9.5ml磷酸鈉鹽緩衝溶液中(0.1M，pH7.5)，加入24mg 1-苯乙醇和0.5ml二甲基亞碸，反應混合物在30℃、160r/min的恆溫搖床上振搖反應，間歇取樣以乙酸乙酯萃取，用手性氣相色譜(色譜柱為β-DEX120毛細管手性氣相色譜柱)分析剩餘底物的對映體過量值和產率，反應24小時後，剩餘(S)-1-苯乙醇的產率為47％，對映體過量值(e.e.)為98％。
實施例3取溼重1.0g的上述氧化微桿菌細胞，懸浮於9.5ml磷酸鈉鹽緩衝溶液中(0.1M，pH7.5)，加入31mg 1-(4-甲基苯基)乙醇和0.5ml二甲基亞碸，反應混合物在30℃、160r/min的恆溫搖床上振搖反應，間歇取樣以乙酸乙酯萃取，用手性氣相色譜(色譜柱為β-DEX120毛細管手性氣相色譜柱)分析剩餘底物的對映體過量值和產率，反應72小時後，剩餘(S)-1-(4-甲基苯基)乙醇的產率為46％，對映體過量值(e.e.)為97％。
實施例4取溼重1.0g的上述氧化微桿菌細胞，懸浮於9.5ml磷酸鈉鹽緩衝溶液中(0.1M，pH7.5)，加入31mg 1-(2-氯苯基)乙醇和0.5ml二甲基亞碸，反應混合物在30℃、160r/min的恆溫搖床上振搖反應，間歇取樣以乙酸乙酯萃取，用手性氣相色譜(色譜柱為β-DEX120毛細管手性氣相色譜柱)分析剩餘底物的對映體過量值和產率，反應60小時後，剩餘(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的產率為48％，對映體過量值(e.e.)為96％。
實施例5取溼重1.0g的上述氧化微桿菌細胞，懸浮於9.5ml磷酸鈉鹽緩衝溶液中(0.1M，pH7.5)，加入28mg 1-(2-氟苯基)乙醇和0.5ml二甲基亞碸，反應混合物在30℃、160r/min的恆溫搖床上振搖反應，間歇取樣以乙酸乙酯萃取，用手性氣相色譜(色譜柱為β-DEX120毛細管手性氣相色譜柱)分析剩餘底物的對映體過量值和產率，反應48小時後，剩餘(S)-1-(2-氟苯基)乙醇的產率為45％，對映體過量值(e.e.)為98％。
實施例6按實施例1所述的培養基配方，取4℃保存的保藏號為CGMCC1875氧化微桿菌斜面菌種和保藏號為CGMCC1735的紅酵母(Rhodotorula sp.ECU316-1)斜面菌種，挑取一環分別接種至裝有100ml培養基的500ml搖瓶中，在30℃、160r/min振搖培養48h，離心收穫細胞置於4℃冰箱保存。取溼重1.0g的氧化微桿菌細胞，懸浮於9.5ml磷酸鈉鹽緩衝溶液中(0.1M，pH7.5)，加入24mg 1-苯乙醇和0.5ml二甲基亞碸，反應混合物在30℃、160r/min的恆溫搖床上振搖反應12小時後，加入4.0g溼重的紅酵母細胞繼續反應18小時，得到(S)-1-苯乙醇的產率為90％，對映體過量值大於99％。
以上所述內容僅為本發明構思下的基本說明，而依據本發明的技術方案所作的任何等效變換，均應屬於本發明的保護範圍。
權利要求
1.氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCC NO.1875。
2.以權利要求1所述氧化微桿菌作為催化劑製備光學純手性芳基仲醇的方法，包括下列步驟a.培養氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCCNO.1875，然後取上述氧化微桿菌細胞置於緩衝溶液中；b.向上述緩衝溶液中加入消旋體芳基仲醇，經催化對映選擇性氧化產生相應的酮和(S)-仲醇，其中所述消旋體芳基仲醇的結構通式為R1CH(OH)R2，取代基R1選自-C6H5或-C6H4X，取代基R2為-CH3，取代基X選自-CH3、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NH2或-NO2其中之一；c.反應液經分離、純化得到目標產物光學純(S)-芳基仲醇。
3.根據權利要求2所述製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於反應體系中所述氧化微桿菌細胞濃度為5～100g(溼重)/L。
4.根據權利要求2所述製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於反應體系中所述所述消旋體芳基仲醇的濃度為10～200mM。
5.根據權利要求2所述製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於步驟b的反應溫度控制為20～50℃，反應時間為3～96小時。
6.根據權利要求2所述製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於所述緩衝溶液為pH值為6～8的磷酸鉀緩衝溶液或Tris-HCl緩衝溶液。
7.根據權利要求2所述製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於反應體系中可加入質量為反應體系質量0.2％～10％的有機助溶劑，所述有機助溶劑選自甲醇、乙醇、二甲基亞碸、二甲基甲醯胺中的一種或一種以上的混合物。
8.根據權利要求2所述製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於步驟b中所述消旋體芳基仲醇為1-苯基乙醇。
9.根據權利要求2～8任何一項所述製備光學純手性芳基仲醇的方法，其特徵在於在步驟b反應結束後可向反應體系中加入紅酵母(Rhodotorulasp.)ECU316-1CGMCC NO.1735。
全文摘要
本發明公開了一種氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCC NO.1875，以及利用該氧化微桿菌作為催化劑製備光學純手性芳基仲醇的方法。所述方法將氧化微桿菌細胞置於緩衝溶液中向其中加入消旋體芳基仲醇，經催化對映選擇性氧化產生相應的酮和(S)－仲醇，反應液經分離、純化得到目標產物光學純(S)－芳基仲醇。本發明的催化劑易於製備、反應條件溫和，在實施例中(S)－1－苯乙醇的產率高達90％，對映體過量值大於99％，具有相當的工業應用開發前景。
文檔編號C12P1/02GK101016526SQ20061014796
公開日2007年8月15日 申請日期2006年12月26日 優先權日2006年12月26日
發明者徐毅, 張伶娜, 許建和, 陳曉夏, 歐玲 申請人:華東理工大學