一種多肽類物質及其製備方法和用途的製作方法
2023-10-11 03:16:49
專利名稱：一種多肽類物質及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種醫藥中間體化合物，特別是一種多肽類物質(IV)的化學結構及其製備方法和用途。
一種多肽類物質(IV)，其特徵是由多種胺基酸聚合組成，其胺基酸的排列序列為REPRGSDIAGTTSTLQEQI*WMTGNPP**PVG***IYKK其中*為胺基酸A(丙氨酸)或胺基酸N(天冬醯氨)**為胺基酸V(纈氨酸)或胺基酸I(異亮氨酸)***為胺基酸D(天冬氨酸)或胺基酸E(穀氨酸)多肽類物質(IV)的製備方法(一)化學合成法在自然界中每一種多肽或蛋白質都是由游離的胺基酸通過多肽鍵的形式聚合而成。在蛋白質的翻譯過程中，多肽鏈的延伸總是由氨基端(N-端)向羧基端(C-端)進行。在化學合成開始時，往往是先將羧基端的第一個胺基酸固定到活化的樹脂上，然後經過氨基基團的去保護，再將羧基端的第二個胺基酸加入到反應器中，二個胺基酸經過相互反應後即可形成肽鍵。然後依照多肽的胺基酸排列序列依次加入第三個、第四個胺基酸等等，直到最後一個胺基酸結合到肽鏈上為止。
在多肽類物質(IV)的化學合成中，每個胺基酸的氨基可以由以下化學基團加以保護①苄酯基(Carbobenzoxyl)②叔-丁基羧基(t-Butyloxycarbonyl)③甲苯磺醯基(Tosyl)④9-亞芴基甲酯基(Fmoc9-Fluorenylmethoxycarbonyl)多肽類物質(IV)的化學合成步驟，具體操作如下1、合成先用氯乙醚將樹脂活化，然後在樹脂中加入第一個胺基酸(氨基已被保護)，從而固定到樹脂上。經過二氯甲烷洗滌後，氨基的保護基團可以由六氫吡啶脫保護。與此同時，將第二個胺基酸經過活化後，加入到結合有第一個胺基酸的樹脂中，二個胺基酸反應後即形成肽鍵。然後按照多肽的胺基酸排序，依次加入相應的胺基酸，重複上述的洗滌，氨基去保護，胺基酸的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最後第一個胺基酸結合到肽鏈上為止。
2、分離合成後的多肽仍然與樹脂結合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(IV)從樹脂上游離下來。分離液可以採用苯酚，苯硫基甲烷以及二氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取適量的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(IV)的樹脂，在室溫下攪拌，然後經過過濾便可得到多肽類物質(IV)。游離的多肽類物質(IV)經過沉澱後，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(IV)溶解在水或適當濃度的鹼溶液中(鹼可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然後用常規的色譜方法，即可將完整的多肽類物質(IV)進行純化。
4、鑑定純化後的多肽類物質(IV)，可以通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(IV)的胺基酸序列是否正確。(二)基因重組法將多肽類物質(IV)的基因序列利用化學合成法合成之後，克隆到預先被內切酶(BamHI和EcoRI)處理過的PGEX-2載體中。重組的質粒再轉化到BL21受體菌中，然後在培養基中大量繁殖、誘導。最後將細菌離心收集，再依靠層析柱將多肽類物質(IV)與GST(穀胱甘肽-S-轉移酶)的融合蛋白純化出來。
多肽類物質(IV)可以通過凝血因子蛋白酶從GST融合蛋白上切割下來。最後再濃縮即可製得多肽類物質(IV)的純品。
2、分離合成後的多肽仍然與樹脂結合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(IV)從樹脂上游離下來。分離液可以採用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(IV)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然後經過過濾便可得到多肽類物質(IV)混合液。游離的多肽類物質(IV)經過沉澱後，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(IV)溶解在水或10-40％的鹼溶液中(鹼可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然後用常規的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(IV)進行純化。
4、鑑定純化後的多肽類物質(IV)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度並可通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(IV)的胺基酸序列是否正確。多肽製備實施例二多肽的胺基酸序列為REPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTGNPPVPVGEIYKK根據上述胺基酸的序列參照下列方法製備。
1、合成首先將樹脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，並且用量可以變化±5％)，然後將羧基端的第一個胺基酸的氨基用氨基保護基團(苄酯基)保護起來後(用量10-80克/克)，再加入到樹脂中，從而使其固定到樹脂上。經過二氯甲烷洗滌後，氨基的保護基團可以用六氫吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脫保護。與此同時，將第二個胺基酸的羧基經過HBTU活化和二異丙基乙胺中和後，加入到結合有第一個胺基酸的樹脂中，二個胺基酸反應後即可形成肽鍵。然後按照多肽類物質(IV)的胺基酸排序，依次加入相應的胺基酸，重複上述的洗滌，氨基去保護，胺基酸羧基的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最後一個胺基酸結合到肽鏈上為止。
2、分離合成後的多肽仍然與樹脂結合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(IV)從樹脂上游離下來。分離液可以採用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(IV)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然後經過過濾便可得到多肽類物質(IV)混合液。游離的多肽類物質(IV)經過沉澱後，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(IV)溶解在水或10-40％的鹼溶液中(鹼可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然後用常規的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(IV)進行純化。
4、鑑定純化後的多肽類物質(IV)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度並可通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(IV)的胺基酸序列是否正確。多肽製備實施例三多肽的胺基酸序列為REPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTGNPPIPVGEIYKK根據上述胺基酸的序列按下列方法製備。
1、合成首先將樹脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，並且用量可以變化±5％)，然後將羧基端的第一個胺基酸的氨基用氨基保護基團(叔-丁基羰基)保護起來後(用量10-100克/克)，再加入到樹脂中，從而使其固定到樹脂上。經過二氯甲烷洗滌後，氨基的保護基團可以用六氫吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脫保護。與此同時，將第一個胺基酸的羧基經過HBTU活化和二異丙基乙胺中和後，加入到結合有第一個胺基酸的樹脂中，二個胺基酸反應後即可形成肽鍵。然後按照多肽類物質(IV)的胺基酸排序，依次加入相應的胺基酸，重複上述的洗滌，氨基去保護，胺基酸羧基的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最後一個胺基酸結合到肽鏈上為止。
2、分離合成後的多肽仍然與樹脂結合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(IV)從樹脂上游離下來。分離液可以採用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(IV)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然後經過過濾便可得到多肽類物質(IV)混合液。游離的多肽類物質(IV)經過沉澱後，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(IV)溶解在水或10-40％的鹼溶液中(鹼可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然後用常規的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(IV)進行純化。
4、鑑定純化後的多肽類物質(IV)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度並可通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(IV)的胺基酸序列是否正確。多肽製備實施例四多肽的胺基酸序列為REPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTGNPPIPVGDIYKK根據上述胺基酸的序列按下列方法製備。
1、合成首先將樹脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，並且用量可以變化±5％)，然後將羧基端的第一個胺基酸的氨基用氨基保護基團(甲苯磺醯基)保護起來後(用量20-50克/克)，再加入到樹脂中，從而使其固定到樹脂上。經過二氯甲烷洗滌後，氨基的保護基團可以用六氫吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脫保護。與此同時，將第二個胺基酸的羧基經過HBTU活化和二異丙基乙胺中和後，加入到結合有第一個胺基酸的樹脂中，二個胺基酸反應後即可形成肽鍵。然後按照多肽類物質(IV)的胺基酸排序，依次加入相應的胺基酸，重複上述的洗滌，氨基去保護，胺基酸羧基的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最後一個胺基酸結合到肽鏈上為止。
2、分離合成後的多肽仍然與樹脂結合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(IV)從樹脂上游離下來。分離液可以採用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(IV)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然後經過過濾便可得到多肽類物質(IV)混合液。游離的多肽類物質(IV)經過沉澱後，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(IV)溶解在水或10-40％的鹼溶液中(鹼可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然後用常規的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(IV)進行純化。
4、鑑定純化後的多肽類物質(IV)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度並可通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(IV)的胺基酸序列是否正確。多肽製備實施例五多肽的胺基酸序列為REPRGSDLAGTTSTLQEQINWMTGNPPVPVGDIYKK根據上述胺基酸的序列按照「多肽製備實施例一」的方法製備得到。多肽製備實施例六多肽的胺基酸序列為REPRGSDIAGTTSTLQEQINWMTGNPPVPVGEIYKK根據上述胺基酸的序列，按照「多肽製備實施例二」的方法製備得到。多肽製備實施例七多肽的胺基酸序列為REPRGSDIAGTTSTLQEQINWMTGNPPIPVGDIYKK根據上述胺基酸的序列，按照「多肽製備實施例一」的方法製備得到。多肽製備實施例八多肽的胺基酸序列為REPRGSDIAGTTSTLQEQINWMTGNPPIPVGEIYKK根據上述胺基酸的序列，按照「多肽製備實施例三」的方法製備得到。多肽製備實施例九分別按照「多肽製備實施例一」至「多肽製備實施例八」的多肽胺基酸的排列序列，利用化學合成多肽類物質(IV)的基因序列之後，克隆到預先被內切酶處理過的PGEX-2載體中。重組的質粒再轉化到受體菌中，然後在培養基中大量繁殖、誘導。最後將細菌離心收集，再依靠層析柱將多肽類物質(IV)和與其結合的蛋白質純化出來。
多肽類物質(IV)可以通過蛋白酶從與其融合的GST(穀胱甘肽-S-轉移酶)的融合蛋白上切割下來。最後再濃縮即可製得多肽類物質(IV)的純品。
上述製備的多肽類物質(IV)在臨床上可以用於檢測、診斷病毒性疾病，特別是愛滋病等一些由病毒引起的疾病，也可以用作製備藥物製劑的原料。
權利要求
1.一種多肽類物質(IV)，其特徵是由多種胺基酸組成，其胺基酸的排列序列為REPRGSDIAGTTSTLQEQI*WMTGNPP**PVG***IYKK其中*為胺基酸A(丙氨酸)或胺基酸N(天冬醯氨)**為胺基酸V(纈氨酸)或胺基酸I(異亮氨酸)***為胺基酸D(天冬氨酸)或胺基酸E(穀氨酸)
2.權利要求1所述的多肽類物質(IV)，其特徵是用化學方法製備得到，合成的步驟為(1)合成先用氯乙醚將樹脂活化，然後在樹脂中加入第一個胺基酸(氨基已被保護)，從而固定到樹脂上。經過二氯甲烷洗滌後，氨基的保護基團可以由六氫吡啶脫保護。與此同時，第二個胺基酸經過活化後，加入到結合有第一個胺基酸的樹脂中，二個胺基酸反應後即形成肽鍵。然後按照多肽的胺基酸排序，依次加入相應的胺基酸，重複上述的洗滌，氨基去保護，胺基酸的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最後第一個胺基酸結合到肽鏈上為止。(2)分離合成後的多肽仍然與樹脂結合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(IV)從樹脂上游離下來。分離液可以採用苯酚、苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取適量的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(IV)的樹脂，在室溫下攪拌，然後經過濾便可得到多肽類物質(IV)。游離的多肽類物質(IV)經過沉澱後，即可分離出來。(3)純化將分離出來的多肽類物質(IV)溶解在水或適當濃度的鹼溶液中(鹼可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然後用常規的色譜方法，即可將完整的多肽類物質(IV)進行純化。(4)鑑定純化後的多肽類物質(IV)，可以通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(IV)的胺基酸序列是否正確。
3.根據權利要求2所述的多肽類物質(IV)的化學合成方法，其特徵是胺基酸的氨基可以由以下化學性基團加以保護①苄酯基(Carbobenzoxyl)②叔-丁基羰基(t-Butyloxycarbonyl)③甲苯磺醯基(Tosyl)④9-亞芴基甲酯基(Fmoc9-Fluorenylmethoxycarbonyl)
4.根據權利要求2所述的多肽類物質(IV)的化學合成方法，其特徵是在分離過程中使用的分離液可以採用苯酚、苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物。
5.根據權利要求2所述的多肽類物質(IV)的化學合成方法，其特徵是純化過程的的鹼溶液可以選用；碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉的溶液。
6.根據權利要求1所述的多肽類物質(IV)，其特徵是用基因重組的方法製備得到，其製備的步驟為(1)將多肽類物質(IV)的基因序列利用化學合成法合成之後，克隆到預先被內切酶(BamHI和EcoRI)處理過的PGEX-2載體中。重組的質粒再轉化到BL21受體菌中，然後在培養基中大量繁殖、誘導。最後將細菌離心收集，再依靠層析柱將多肽類物質(IV)與GST(穀胱甘肽-S-轉移酶)的融合蛋白純化出來。(2)多肽類物質(IV)可以通過凝血因子蛋白酶從GST融合蛋白上切割下來。最後再濃縮即可得到多肽類物質(IV)的純品。
7.一種權利要求1所述的多肽類物質(IV)，其用途是在臨床的檢測、診斷愛滋病病毒方面的應用，或者作為藥物製劑的生產原料。
全文摘要
本發明公開了一種多肽類物質(IV)的結構、用途和製備方法，這類多肽物質在臨床上用於檢測、診斷病毒性疾病。特別是愛滋病等一些由病毒引起的疾病，也可以用以用做製備藥物製劑的原料，多肽類物質(IV)可以用人工合成的方法製備得到，也可以用基因重組的方法製備得到。
文檔編號C07K14/00GK1458165SQ02115480
公開日2003年11月26日 申請日期2002年1月26日 優先權日2002年1月26日
發明者許衛東, 魏勳斌, 潘勇 申請人:北海新升技術開發有限責任公司