減小樣品中分析物品種的濃度範圍的方法
2023-10-11 17:32:09 2
專利名稱：減小樣品中分析物品種的濃度範圍的方法
技術領域：
本發明涉及組合化學、蛋白質化學和生物化學的領域。
背景技術：
蛋白質組學的目的在於完成生物體全套蛋白質組的同一性圖譜，並通過分析該信息從而鑑定可能的診斷性和治療性實體。目前用於分離蛋白質混合物的方法包括兩維凝膠電泳和多維液相色譜法。所有這些方法均可以與質譜法結合。該途徑的一個實例是酵母中1,484種蛋白質的分離和鑑定(Washburn et al.，Nat.Biotechnol.19(3)242-2471(2001))。分離和鑑定蛋白質的方法學另一實例是由Uetz等(Uetz etal.，Nature 403(6770)623-627(2000))和Ito等(Ito et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(8)4569-4574(2001))發展的酵母雙雜交篩選法的改良方法，該方法已在釀酒酵母中鑑定了超過4,000種蛋白質-蛋白質相互作用。蛋白質分離和鑑定的定量方法是由Aebersold及其同事(Smolka et al.，Anal.Biochem.297(1)25-312(2001))發展的同位素編碼親和標記(isotope coded affinity tag(ICAT))。ICAT包括採用普通或重同位素性試劑對蛋白質進行位點特異性的、共價的標記從而定量蛋白質表達的水平。
複合蛋白質混合物還可以在組合產生的配體文庫上分離。實體分子與組合文庫接觸後，該實體分子可與文庫中的配體結合。當採用純化的、放射性標記的初始實體時，可以實施對結合的實體的檢測(Mondorf et al.，J.Peptide Research 52526-536(1998))。其它方法包括通過針對實體的抗體進行的檢測(Buettner et al.，InternationalJournal of peptide Protein Research 4770-83(1996)；Furka et al.，International Journal Peptide Protein Research 37(6)487-493(1991)；和Lam et al.，(1991)如上)。採用固定在粘著物上的珠聯合使用刪減篩選法可以檢測多種實體的配體。這被稱為QuASAR法(國際(PCT)專利申請WO 01/40265)，其已被用於檢測結合病毒和朊病毒蛋白質的配體。
FIoNA檢測技術(Hammond等國際(PCT)專利申請WO04/007757)和其他組合技術能夠鑑定配體實體相互作用。FIoNA檢測技術基於化學、物理、生物學，和/或生物化學功能從混合物中鑑定蛋白質，而不僅僅是基於其與文庫中配體的結合能力。因此，FioNA的目的在於採用現有的蛋白質組學方法，鑑定結合所需物質的配體-載體，然後在適宜的珠上解碼配體，以及合成適宜量的珠以便純化一種，或若干具有所需活性的蛋白質。
各分析物之間濃度的巨大差異會妨礙對複合生物提取物中分析物的完全分析。在大多數生物混合物中，某些分析物的濃度很高，而其它分析物則僅為痕量水平。結果，分析物的濃度可能並不適應給定分析方法的動態範圍。也就是說，由樣品中最大豐度和最小豐度分析物品種所產生的信號強度差異一般比分析方法檢測和精確測定的能力寬。例如，高度濃縮的蛋白質可能會飽和檢測系統，而非常低的濃度可能會低於分析方法的靈敏度，人血清即是如此，人血清中最大豐度蛋白質(白蛋白-數十mg/ml)與最小豐度(例如，IL-6-小於1pg/ml)之間的濃度差異可能會高達幾億倍。
目前存在兩種方式解決這一巨大差異第一種是設計適應性更好的裝置而第二種是改變用於分析的樣品。
改變樣品的一種方法是減少樣品的較高豐度的品種，由此使得較低豐度的品種更易於檢測。例如，該方法包括使用接頭部分(linkermoieties)，諸如針對樣品中特定品種的抗體和特異性染料。例如，對於血漿而言，豐度高的蛋白質包括白蛋白、免疫球蛋白、纖維蛋白原和α-1蛋白酶抑制劑。免疫親和柱非常昂貴，很少完全特異性地針對其靶物質，而且會除去與靶蛋白質相關的蛋白質。而且，最大豐度的蛋白質一旦被除去，另一組即成為最大豐度，其隨即需要建立另外的親和柱。此外，來自相同物種的不同組織和不同物種的組織的生物樣品可能具有的完全不同的最大豐度蛋白質組。該方法還受到如下事實的影響，即除去某些分析物品種同樣會除去與它們發生相互作用的品種。因此，會除去某些可能的興趣品種。雖然除去高豐度的蛋白質在某些情況下會有幫助，但該方法並不能檢測那些濃度始終低於檢測設備靈敏度的非常低豐度的蛋白質。而且，若干種蛋白質(在某些情況下甚至是數十種)表現為高豐度品種，因此不得不對大量特異性方法進行設計以便尋找每一種不同的高豐度品種。因此，該方法基本上不能壓縮剩餘分析物品種之間的濃度範圍。
另一方法是對樣品進行分級分離(通常通過色譜法)。該方法根據相似的生物化學特性將分析物種類區分為不同的級分。例如，離子交換色譜法能夠根據電荷從而將蛋白質區分為級分，而分子排阻色譜法根據分子大小來區分蛋白質。因此，這些方法可以減小分析物的濃度範圍，但其代價是在每次區分中實質上降低了分析物品種的群體多樣性。
發明概述[10]本發明提供了一種壓縮複合樣品中不同分析物品種間的濃度範圍同時基本上保持樣品中分析物品種的群體多樣性的方法。更具體地，相對於低豐度品種的濃度而言，所述方法基於物理-化學特性降低了高豐度品種的濃度，但基本上不會消除樣品分析物品種。
如上述，各種分析技術均具有檢測動態範圍。當樣品中分析物的量高於動態範圍時，其信號將飽和檢測系統，故無法準確測定其量。當樣品中分析物的量低於檢測系統的靈敏度範圍時，該分析物也無法得以檢測，而且，即使低豐度分析物處於檢測動態範圍內，來自高豐度分析物的信號也會干擾檢測低豐度分析物的能力。本發明的方法壓縮了樣品中分析物品種之間的濃度範圍。這可以為檢測器系統提供數量增加的分析物分子以便高於檢測的靈敏度閾值，而同時降低了進行檢測的高豐度分析物的量因此由高豐度分析物導致的檢測系統的飽和度顯著降低，因此降低了對檢測高於靈敏度閾值的低豐度品種的能力的幹擾。其結果是具有了檢測樣品中更多分析物品種的能力。採用該方法，可以檢測的品種數量至少是通過質譜法從血清中檢測的品種數量的1.5倍。通常，該數量介於可檢測的品種數量的2-4倍。
本發明的方法與檢測樣品的其它處理方法相反。例如，除去經選擇的高豐度品種並不能顯著降低樣品中大量品種的濃度範圍。分級分離降低了分析物的濃度範圍，但其代價在於實質上降低了分級物種群中的品種多樣性。
本發明通過將複合樣品與經選擇量的文庫相接觸而實現該結果，所述文庫中包含多種不同的結合部分。可對所有變量(文庫組分的多樣性和所用文庫的量)進行操作以便有益於本發明。通過操作樣品所接觸的不同結合部分的多樣性，有可能結合遍及所有濃度範圍的品種，亦即，無論是高豐度的品種還是稀少的品種。而且，使用的不同結合部分的量越大，樣品群體中能夠俘獲的品種量就越大。
文庫的量同樣必須進行選擇以便使得結合部分被至少樣品中的高豐度品種飽和。通過這種方式，樣品中所俘獲的高豐度品種和稀少品種的相對量將非常接近於原始樣品中它們的相對濃度。這導致濃度範圍的壓縮，使得在檢測期間由高豐度品種和稀少品種所產生的處於經選擇檢測系統的動態範圍之內的信號量增大。
本發明的目的在於顯著增加樣品中可檢測的品種的量，亦即尤其是，發現樣品中的新品種。優選特定種類的結合部分的文庫來實現該目的。尤其，最好通過使用大量不同結合部分的文庫來實現該目的，所述結合部分預先未對其結合樣品中特定分析物的能力進行選擇。在本文中將所述文庫稱為「非選擇性」文庫。(在使用文庫後會明確地顯示出所述文庫中某些結合部分的結合特異性這一事實並不會導致相同文庫具有「選擇性」)使用所述文庫增加了無差別地俘獲完整種群的品種的可能性。例如，因此，抗體文庫(其中各抗體針對已知結合位點)僅能選擇各抗體所針對的品種，相反地，相同規模的生殖系抗體文庫並不包含與預先選擇的分析物相結合的抗體。所述文庫更有可能選擇出樣品中存在的未知品種。通過實施組合化學或通過隨機組裝化學部分可以創建非選擇性文庫。此外，通過增加文庫(選擇性或非選擇性)的規模，可以增加樣品中所俘獲的和所檢測的不同分析物品種的數量。結合部分的非選擇性文庫的實例包括生殖系抗體文庫、重組結合蛋白質的噬菌體展示文庫、染料文庫或非組合性文庫，其中成員的結合特異性為非預先選擇的、多種類型的組合文庫及其部分。
還應當注意到，濃度壓縮的量依賴於結合部分和樣品中分析物的相對量。一種極端情況是，結合部分相對分析物的相對量可能非常大以至於結合部分能夠俘獲樣品中所有分析物。在這種情況下，分析物濃度範圍不會出現壓縮。其它極端情況是，結合部分相對分析物的相對量可能非常小，以至於每一種分析物品種均能飽和結合部分的結合能力。在這種情況下，理論上，所俘獲的各個分析物品種的量是相同的，分析物濃度範圍被壓縮至相等。該極端情況在目的是儘可能多地檢測品種時尤為有用。在這兩種極端情況之間是如下情況，該情況中高豐度品種飽和了結合部分，而低豐度品種不能飽和結合部分。在這種情況下，高豐度分析物濃度範圍之間的差異非常小，而低豐度分析物的濃度差異則得以保留。該結果在用於比較兩種不同樣品種類之間分析物品種的相對濃度時尤為有用。例如，在探索生物標記時，對取自具有兩種不同表型狀態(例如癌對比非癌)的生物體的樣品進行比較以便鑑定兩種狀態之間存在不同的分析物品種。通過保留稀少品種之間的濃度差異，本發明的方法能夠用於發現這些稀少品種中的生物標記。在一個實施方式中，結合部分與樣品中分析物品種的比值最大為1∶500，更優選地，最大為1∶50或最大為1∶5。
本發明提供了一種縮小複合樣品中不同分析物品種之間的濃度範圍同時基本上保持樣品中分析物品種的群體多樣性的方法。在本發明優選的實施方式中，提供了一種方法，其包括以下步驟(a)提供第一樣品，該樣品中包含多個不同的分析物品種，所述分析物品種以第一濃度範圍存在於所述第一樣品中；(b)將所述第一樣品與包含至少100種不同的結合部分的一定量文庫接觸；(c)以不同的結合部分從所述第一樣品中俘獲一定量的不同分析物品種以及除去未結合的分析物品種；和(d)從所述結合部分上分離所述俘獲的分析物品種從而產生第二樣品，該樣品中包含多個不同的分析物品種，所述分析物品種以第二濃度範圍存在於所述第二樣品中。其中所述文庫的量經過選擇以便俘獲一定量的不同的分析物品種從而所述第二濃度範圍低於所述第一濃度範圍。
所述第一樣品包含至少100、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000種不同的分析物品種。在某些實施方式中，所述文庫包括至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000種不同的結合部分。
優選地，所述結合部分包括生物有機聚合物。優選地，所述生物有機聚合物選自肽、寡核苷酸和寡糖。在本發明的其它實施方式中，所述結合部分選自抗體和核酸適體(aptamer)。
在本發明的優選實施方式中，所述結合部分與固體載體或多個固體載體(a solid support or supports)結合。優選地，所述固體載體或多個固體載體是珠或顆粒的集合。各個珠或顆粒可連結於基本上不同的結合部分。而且，多個不同的結合部分可連結於相同的珠或顆粒。優選地，所述珠或顆粒的直徑小於1μm。可採用選自粉碎、磨碎和聲波破碎的方法將所述珠或顆粒製成磨碎的微粒化珠。在該方法的優選實施方式中，所述顆粒與第二固體載體連結從而形成陣列或試紙條(dipstick)。優選的微粒化珠是由天然或合成聚合物形成的聚合物基質。
在本發明其它優選實施方式中，所述固體載體或多個固體載體選自纖維、整體柱(monolith)、膜和塑料條帶。
在本發明優選實施方式中，與第一樣品接觸的所述文庫是非選擇性文庫。可以採用多種非選擇性文庫實施本發明的方法。優選的非選擇性文庫可選自生殖系抗體文庫、重組結合蛋白質的噬菌體展示文庫、染料文庫或非組合性文庫，其中成員的結合特異性為非預先選擇的、組合文庫及其部分。
優選地，所述不同的結合部分包含在完全或不完全的組合文庫中。優選的組合文庫是六肽文庫。
在本發明的一個實施方式中，所述第二樣品所具有的分析物品種多樣性基本上與所述第一樣品的相同。
可以採用多種樣品實施本發明的方法。在本發明優選的實施方式中，所述樣品選自羊水、血、腦脊液、關節內液、眼內液、淋巴液、乳液、汗液、唾液精液、精漿、血清、痰液、滑液、淚液、臍帶液、尿液、活檢組織勻漿液、細胞培養液、細胞提取物、細胞勻漿液、條件培養液、發酵液、組織勻漿液及其衍生物。
在一個實施方式中，本發明的方法包括檢測所述第二個樣品中分析物品種的步驟。優選地，通過採用選自比色、光度、磁共振、橢偏光、質譜、電泳、色譜、酶性和序列分析的方法對所述分析物進行檢測。
任選地，本發明的方法進一步包括基於物理或化學特性分級分離所述第二樣品中所述分析物的步驟或鑑定至少一種所分離的分析物的步驟。優選地，對所述分析物的分級分離包括採用選自色譜法、電泳、毛細電泳、過濾和沉澱的方法分離所述分析物。
在本發明的一個實施方式中，所述方法進一步包括將生物特異性結合部分與所述第二樣品接觸以及測定所述生物特異性結合部分是否從所述第二樣品中俘獲了分析物品種的步驟。
未結合的分析物的除去可包括採用洗滌緩衝液洗滌所述俘獲的分析物。
可採用不同的分析物實施本發明的方法。在本發明優選的實施方式中，所述分析物選自多肽、核酸、複合糖、複合脂質、合成無機化合物和合成有機化合物。
本發明還提供了鑑定診斷性生物標記的方法。在優選的實施方式中，所述方法包括以下步驟(a)提供來自具有第一表型的第一組生物體的第一組生物樣品；(b)提供來自具有第二表型的第二組生物體的第二組生物樣品；(c)對各個所述的生物樣品實施如本文(權利要求1)所述的減小樣品中不同分析物品種的濃度範圍的方法，由此分別產生第三和第四組生物樣品；(d)在所述第三和第四組生物樣品的各個樣品中檢測分析物品種；和(e)鑑定在所述第三和第四組樣品中存在不同的至少一種分析物品種，由此所述最少一種分析物品種為用於區分所述第一表型和第二表型的生物標記。在優選的實施方式中，該方法的步驟(e)包括鑑定生物標記圖譜以便提供較所述圖譜中任一生物標記單獨所具有的預測力更佳的預測力。
本發明進一步提供了用於減小樣品中分析物相對量的方法。在本發明優選的實施方式中，所述方法包括以下步驟(a)提供第一樣品，該樣品包含第一的多種不同的分析物，所述分析物具有第一量方差(a first variance in amounts)；(b)將所述第一樣品與多種不同的結合部分接觸，各結合部分的存在量均為已確定的；(c)以所述不同的結合部分從所述第一樣品中俘獲一部分所述第一的不同的分析物以及除去未俘獲的分析物；和(d)從所述結合部分上分離所述俘獲的分析物從而產生第二樣品，該樣品中包含第二的多種不同的分析物，所述分析物具有第二量方差(a second variance in amounts)。多種不同結合部分的各結合部分的所述已確定的量經過選擇以便俘獲一定量的所述不同的分析物由此所述第二量方差小於所述第一量方差。
本發明還提供了用於檢測樣品中多種分析物的試劑盒。在本發明優選的實施方式中，試劑盒包括含有至少100種不同的結合部分的文庫的容器和使用所述文庫實施本發明方法的說明書。優選地，所述結合部分與固體載體或多個固體載體連結。所述文庫可包括六肽組合文庫或其部分，其中所述六肽與顆粒連結。
任選地，本發明的試劑盒包括用於以所述結合部分俘獲分析物的結合緩衝液或用於從所述結合部分上洗脫俘獲的分析物的洗脫緩衝液。本發明的其它試劑盒實施方式包括能夠允許本領域技術人員實施本文所述任何方法變型的任選的功能性組分。
本發明還提供了包含結合部分的文庫。在本發明優選的實施方式中，文庫包含至少100種不同的結合部分，其中多種不同的結合部分與相同的固體載體或多個固體載體連結。優選地，所述結合部分包括組合六肽文庫或其部分。
附圖簡介[36]
圖1顯示了展示本發明的組合配體文庫與血漿孵育結果的分析。根據實施例2中所述方法將所述文庫與血漿孵育。
圖2是在與文庫孵育之前除去或不除去IgG的血漿的比較。按照實施例3中所述實施該試驗。
圖3顯示了本發明的組合配體文庫與血漿孵育的結果。按照實施例4實施該試驗。
圖4是Protein G柱留存物的PAGE分析。左欄是考馬斯藍染色；右欄是用Silver Quest染色的相同凝膠。
圖5是對血液級分的圖解說明(基於質量)，其中著重顯示了大量低豐度蛋白質的痕量特性。
圖6是用均一化珠處理之前和之後的樣品的質譜比較。質量範圍是2.5kDa-10kDa。根據實施例1實施該試驗。
圖7是用均一化珠處理之前和之後的樣品比較。質量範圍是2kDa-30kDa。根據實施例1實施該試驗。
圖8是用均一化珠處理之前和之後的樣品比較。質量範圍是30kDa-180kDa。根據實施例1實施該試驗。
圖9是對本發明均一化珠概念的一個實施方式的圖解說明。
定義[45]除非另有定義，此處所用的所有技術與科學術語具有本發明所屬領域的技術人員通常所理解的意義。下列參考文件為所屬領域技術人員提供了本發明中所使用的多個術語的一般定義Singleton etal.，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.，1988)；The Glossary of Genetics，5th Ed.，R.Rieger et al.(eds.)，SpringerVerlag(1991)；以及Hale Marham，The Harper Collins Dictionay ofBiology(1991)。如此處所使用的，除非另有定義否則下列術語具有所描述的意義。
「分析物」是指能夠與本發明的結合部分相結合的任何分子部分，其結合的方式是不會通過與本文所述洗滌液的接觸而完全被斷裂的方式。「俘獲的分析物」是在接觸洗滌液後由本發明的結合部分所結合的任何分析物。
「吸附劑」是指能夠結合分析物(例如靶多肽)的任何物質。「色譜吸附劑」是指通常用於色譜法中的物質。例如，色譜吸附劑包括離子交換物質、金屬螯合劑、疏水作用吸附劑、親水作用吸附劑、染料和複合型吸附劑(例如，疏水吸引/靜電排斥吸附劑)。「生物特異性吸附劑」是指包含生物分子，例如核苷酸、核酸分子、胺基酸、多肽、單糖、多糖、脂肪酸、脂質、類固醇或其結合物(例如糖蛋白、脂蛋白、糖脂)的吸附劑。在特定情況下，生物特異性吸附劑可以是大分子結構諸如多蛋白質複合體、生物膜或病毒。生物特異性吸附劑的實例是結合了抗體、受體蛋白質、凝集素和核酸的固體載體。生物特異性吸附劑針對靶分析物的特異性通常高於色譜吸附劑。SELDI中使用的吸附劑的其它實例可見於美國專利6,225,047(Hutchens and Yip，″Use of retentate chromatography to generate difference maps，″May 1，2001)。
結合部分可在適於形成分子相互作用的任何物理狀態(包括氣體、水性和有機懸浮物和乳狀物，最優選地是液態)中存在並與可採用本發明進行檢測的分析物發生相互作用。
「固體載體」是指包括顆粒(例如珠)、纖維、整體柱、膜、濾器、塑料條帶等等的任何不溶性物質。
「蛋白質生物晶片」是指適於俘獲多肽的生物晶片。在現有技術中記載了多種蛋白質晶片。其包括，例如，由賽弗吉生物系統公司(Ciphergen Biosystems)(Fremont，CA)、Packard BioScience公司(Meriden CT)、Zyomyx公司(Hayward，CA)以及Phylos公司(Lexington，MA)生產的蛋白質生物晶片。所述蛋白質晶片的實例可見於下列專利或專利申請中美國專利6,225,047(Hutchens and Yip，″Use of retentatechromatography to generate difference maps，″May 1，2001)；國際公開WO 99/51773(Kuimelis and Wagner，″Addressable protein arrays，″October 14，1999)；國際公開WO 00/04389(Wagner et al.，″Arrays ofprotein-capture agents and methods of use thereof，″July 27，2000)以及國際公開WO 00/56934(Englert et al.，″Continuous porous matrix arrays，″September 28，2000)。
「表面增強淨解吸(Surface-Enhanced Neat Desorption)」或「SEND」是SELDI的變型，其包括使用包含能量吸收分子層的探針(「SEND探針」)，所述能量吸收分子結合在探針表面。例如，可以通過共價或非共價化學鍵進行結合。與傳統的MALDI不同的是，SEND中的分析物不需要在用於解吸/電離的能量吸收分子的晶體基質中俘獲。「能量吸收分子(Energy absorbing molecules)」(「EAM」)是指能夠吸收來自雷射解吸/電離源的能量並隨後將與其接觸的分析物分子解吸和電離的分子。該用語包括MALDI中使用的分子(通常稱為「基質」)，且明確地包括肉桂酸(cinnamic acid)衍生物、芥子酸(sinapinic acid)(「SPA」)、氰基-羥基-肉桂酸(「CHCA」)和二羥基苯甲酸、阿魏酸、羥基苯乙酮衍生物，以及其它。其還包括SELDI中所使用的EAM。在特定實施方式中，能量吸收分子組成線形或交聯的聚合物，例如聚甲基丙烯酸酯。例如，構成可以是α-氰基-4-甲基丙烯醯氧基肉桂酸和丙烯酸酯的共聚物。在另一實施方式中，構成是α-氰基-4-甲基丙烯醯氧基肉桂酸、丙烯酸酯和3-(三-甲氧基)矽基丙基甲基丙烯酸酯的共聚物。在另一實施方式中，構成是包含α-氰基-4-甲基丙烯醯氧基肉桂酸和甲基丙烯酸十八烷基酯(octadecyl methacrylate)(「C18 SEND」)的共聚物。SEND可進一步見於美國專利5,719,060和WO 03/64594(Kitagawa，″Monomers And Polymers Having EnergyAbsorbing Moieties Of Use In Desorption/Ionization Of Analytes″，August 7，2003)。
SEAC/SEND是SELDI的變型，其中結合部分和能量吸收分子均結合於樣品呈遞表面。因此，SEAC/SEND探針能夠通過親和性俘獲和解吸而無需提供外部基質即可俘獲分析物。C18 SEND生物晶片是SEAC/SEND的變型，其包括C18部分，該部分的功能在於作為結合部分，而CHCA部分的功能在於作為能量吸收部分。
由賽弗吉生物系統公司製造的蛋白質生物晶片包含具有色譜性或生物特異性吸附劑的表面，所述色譜性或生物特異性吸附劑連結於所述表面的可尋址位置。賽弗吉ProteinChip陣列包括NP20、H4、H50、SAX-2、Q10、WCX-2、CM-10、IMAC-30、LSAX-30、LWCX-30、IMAC-40、PS-10以及PS-20。這些蛋白質晶片包含條帶形鋁基質。該條帶的表面上塗覆二氧化矽。
對於NP-20生物晶片，氧化矽的功能在於作為親水性吸附劑俘獲親水性蛋白質。
H4、H50、SAX-2、WCX-2、IMAC-3、PS-10以及PS-20生物晶片進一步包含水凝膠形式的官能化、交聯聚合物，該聚合物以物理方式連結於生物晶片表面，或通過矽烷以共價方式連結於生物晶片表面。H4生物晶片具有用於疏水性結合的異丙基官能基。H50生物晶片具有用於疏水性結合的壬基苯氧基-多(乙二醇)甲基丙烯酸酯。SAX-2生物晶片具有用於陰離子交換的四級銨官能基。WCX-2生物晶片具有用於陽離子交換的羧酸鹽官能基。IMAC-3生物晶片具有通過胺乙酸(nitriloacetic acid)或IDA固定的用於配位共價結合的銅離子。PS-10生物晶片具有醯基-咪唑(acyl-imidizole)官能團，其能與蛋白質上用於共價結合的基團進行反應。PS-20生物晶片具有用於與蛋白質共價結合的環氧官能團。PS系列生物晶片用於將生物特異性吸附劑，如抗體、受體、凝集素、肝素、蛋白質A、生物素/抗生蛋白鏈菌素等，結合至可發揮其特異性俘獲樣本中分析物功能的晶片表面。LSAX-30(陰離子交換)、LWCX-30(陽離子交換)及IMAC-40(金屬螯合物)生物晶片在其表面具有功能性乳膠珠(latex bead)。所述生物晶片可進一步見於WO00/66265(Rich et al.(″Probes for a Gas Phase Ion Spectrometer，″November 9，2000)；WO 00/67293(Beecher et al.，″Sample Holder withHydrophobic Coating for Gas Phase Mass Spectrometer，″November 9，2000)；美國專利申請09/908,518(Pohl et al.，″Latex Based AdsorbentChip，″July 16，2002)以及美國專利申請60/350,110 (Um etal.，″Hydrophobic Surface Chip，″November 8，2001)。
「氣相離子光譜儀」是指檢測氣相離子的裝置。氣相離子光譜儀包括提供氣相離子的離子源。例如，氣相離子光譜儀包括質譜儀、離子移動光譜儀及總離子流測定裝置。「氣相離子光譜法」是指使用氣相離子光譜儀檢測氣相離子。
「質譜儀」是指檢測可被轉化成氣相離子質荷比的參數的氣相離子光譜儀。質譜儀一般包括離子源和質量分析儀。質譜儀的實例是飛行時間(time-of-flight)式、扇形磁場(magnetic sector)式、四極子濾過(quadrapole filter)式、離子阱(ion trap)式、離子迴旋共振(ion cyclotronresonance)式、靜電扇形分析器，以及這些形式的組合。「質譜法」是指使用質譜儀檢測氣相離子。
本發明文中的「探針」或「質譜儀探針」是指可用於將來自分析物的離子導入氣相離子光譜儀(諸如質譜儀)的裝置。「探針」一般包括含有樣品呈遞表面的固體基質(撓性的或剛性的)，分析物在所述樣品呈遞表面上被呈遞至電離能量源。「SELDI探針」是指包含結合於表面的吸附劑(又稱「結合部分」)的探針。「吸附劑表面」是指吸附劑所結合的表面。「化學選擇性表面」是指吸附劑或者能夠例如通過反應形成共價或配合共價鍵的方式與結合部分相結合的反應部分所結合的表面。
「SELDI MS探針」是指包含結合於表面的吸附劑的探針。
本發明文中的「方差」是指在試驗樣品中分析物濃度的數學方差。方差減少是指具有統計學顯著性(p＞0.05)的情況。用最簡單的術語表示，方差是通過至少一種檢測方法所檢測的試驗樣品中所有分析物濃度的標準差的平方。優選的檢測方法是質譜法，其中可檢測分析物的量是由檢測器所鑑定的質峰下方的區域面積。
「洗滌緩衝液」是指可用於洗滌並從吸附劑表面除去未結合物質的溶液。洗滌緩衝液通常包括鹽(可以將其或者也可以不將其pH緩衝至特定的範圍內)，去汙劑並且任選地可包括可用於從表面或複合物上除去偶髮結合物質的其它成份。
「洗脫緩衝液」是指能夠將結合部分和所結合的分析物解離的溶液。在某些情況下，當亞基在複合物中相結合時，洗脫緩衝液能夠斷裂亞基間的相互作用。如同洗滌緩衝液，洗脫緩衝液可包括單獨使用或作為混合物使用的去汙劑、鹽、有機溶劑等。通常，後面這些試劑在洗脫緩衝液中的濃度要高於在洗滌緩衝液中的濃度，以便使洗脫緩衝液更易於斷裂分子的相互作用。斷裂分子的相互作用的這種能力稱為「嚴緊性」，而洗脫緩衝液的嚴緊性高於洗滌緩衝液的嚴緊性。
發明詳述[63]本發明提供了試劑盒和方法，該試劑盒和方法能使本領域技術人員減小在複合混合物中發現的興趣分析物的濃度範圍。比較採用分析物特異性試劑的現有技術方法而言，此處所述的方法尤為有益，因為這些方法能夠減小樣品中分析物的濃度範圍，所述樣品含有未知組分並且是複合物，該複合物中不僅存在大量不同的分析物(大於103種)，而且存在濃度的動態範圍(數量級大於103)。結果，採用所主張的發明能夠同時分析「深蛋白質組(Deep Proteome)」，其包括來自生物來源(包括血、血漿和血清)的多種液體中所存在的大量低豐度蛋白質。(參見圖5)。由此本發明具有用於分子複合混合物，諸如生物樣品的分析性製備的用途。
分析物濃度範圍或濃度方差的減小是通過使用結合部分文庫實現的，所述文庫具有確定的規模和多樣性，所述文庫優選在惰性載體上合成或被結合於惰性載體上。當導入包含分析物多樣性的溶液中時，所主張的發明的結合部分將結合溶液中的分析物。高豐度分析物的存在量遠遠高於飽和其各自結合部分的能力所需要的量；因此，這些高豐度分析物總量的高百分比將保持未結合。相反地，痕量分析物的量較低意味著這些分子無法飽和所有適於它們的結合部分；因此，與高豐度分析物相比，痕量分析物起始量的較高百分比將保持與其各自的結合部分相結合。未結合的分析物可通過洗滌而被除去。當從結合部分上洗脫結合的分析物時，相對起始物質而言，洗脫物質中高豐度分析物的相對量降低。相反，相對起始物質而言，洗脫物質中痕量分析物的量增加。分析物相對濃度的這種同時發生的改變會導致在單一分析，或者比採用起始物質時數目更少的分析中檢測洗脫物質中眾多(既便不是全部)存在於溶液中的分析物。以血清為例，白蛋白是高豐度的，多種補體相關蛋白、激素結合蛋白具有中間濃度，而旁分泌因子和細胞標記物可能具有微小的濃度。使用本發明，血清中所檢測到的分析物豐度範圍可被降低，這能夠使眾多(既便不是大多數或甚至全部)興趣分析物得以分析。
採用所主張的發明製備樣品是簡單易行的。在吸附了興趣分析物之後，任選地洗滌該分析物從而除去未結合的分析物。隨後採用例如通過施以洗脫緩衝液的方式從結合部分上洗脫吸附的分析物。所得溶液包含全部興趣分析物，而不包含結合部分；但是，與初始複合混合物不同的是，由於相對於初始複合混合物而言高豐度分析物的濃度降低而低豐度分析物的濃度增加，故所得溶液中存在的分析物濃度範圍相對較小。分析物的濃度範圍或分析物之間的濃度範圍所發生的這種改變能夠在無須重新校準檢測裝置的情況下使得所得溶液中分析物的較大百分比得以檢測，而對含有非常不同濃度組分的複合混合物直接分析時則必需進行所述重新校準。
在本發明某些實施方式中，可以將與結合部分結合的分析物直接洗脫至適用於質譜儀的探針或蛋白質晶片上。為有助於分析，在這些實施方式中使用的洗脫緩衝液可包括適用於質譜儀的基質物質。可選地，可在分析物沉積於探針或晶片之後，將該基質物質導入分析物。在這種情況的優選實施方式中，使用SEND或SEAC/SEND生物晶片，該生物晶片上包含基質物質。這些優選實施方式緩解了對在洗脫緩衝液包含基質物質或在沉積於生物晶片之上後的某些時間點將基質物質導入分析物的需求。
通過提供多種結合部分(每種結合部分識別複合混合物中存在的單一或較小百分比的興趣分析物)，本發明可以在最低限度地或無須重新校準檢測裝置的情況下使複合混合物的組成得以檢測。這包括對那些除此以外將無法得到檢測的品種(其由於被高豐度分析物掩蔽，或者存在的濃度非常低以至於無法通過分析法得到檢測)的檢測。這為高通量分析技術提供了非常大的益處，否則由於眾多複合混合物中存在大濃度範圍分析物而不得不需要多次重新校準、和/或多個通道、和/或多個檢測步驟或昂貴且浪費的分級分離技術，故此高通量分析技術將在檢測步驟上受到上述需要的限制。此外，通過增加低豐度分析物的相對濃度，本發明能夠檢測樣品中僅以痕量存在的分析物。以血清為例，未濃縮血清中僅存在痕量的特定分析物諸如某些激素。其它分析物，諸如白蛋白是高豐度的，存在量為微摩爾至毫摩爾。相對於高豐度分析物而言，本發明能夠濃縮低豐度分析物。因此，採用本發明製備示例性血清樣品時，相對於白蛋白和其它高豐度分析物的濃度而言，激素濃度增加。通過將血清中低和高豐度分析物的濃度相靠近，就可僅採用檢測分析物的分析裝置的一項或若干項靈敏度設定而定性且定量地檢測分析物組成。
通過相同的方法，本發明能夠測定生物樣品中存在的痕量蛋白質，諸如純化的治療性蛋白質，其中對蛋白質雜質含量的容許量非常有限。例如來自細胞培養物上清的純化抗體可包含痕量的不同蛋白質，該蛋白質來自用於表達抗體的細胞。後者這些蛋白質是不應該存在的，通常可用特異性ELISA檢測法進行檢測。但是，當雜質的濃度非常低時，免疫化學試驗是無效的。如果首先根據本發明對要分析的樣品進行處理，痕量蛋白質雜質則可被顯著地濃縮，由此可通過常規化學或免疫化學方法進行檢測。
1.減小樣品中的相對分析物濃度A.適宜的試驗樣品[69]本發明的試驗樣品可以是能使該試驗樣品中的分析物與本發明的結合部分相接觸(如本文所述)的任何形式。適宜的試驗樣品包括氣體、粉末、液體、懸液、乳液、可透過的或粉末化的固體，等等。優選地，試驗溶液是液體。試驗樣品可直接取自來源並用於本發明的方法中，而無須任何預先操作。例如，水樣品可直接取自含水層並採用本文所述方法直接進行處理。
可選地，初始樣品可用多種方法進行製備以便增強其對檢測的適應性。所述樣品製備包括除去特定分析物、濃縮、磨碎、提取、滲濾等。例如，固體樣品可被粉末化成為粉末，然後採用水或有機溶劑進行提取。然後對來自粉末的提取物實施本發明的方法。在對液體實施本發明的方法之前，可將氣體樣品通過溶液進行發泡或滲濾以便將該氣體的組分在液體中溶解和/或濃縮。
試驗樣品優選包含至少四種興趣分析物，更優選地至少8、15、20、50、100,1000、100,000、1,000,000、10,000,000或更多種興趣分析物。在某些情況下，適於採用本發明的方法進行操作的試驗樣品可包含數百種或數千種興趣分析物。優選地，試驗樣品中的分析物濃度至少跨越數量級，更優選地，至少兩個、三個、四個或更多個數量級。本發明的方法一經實施，可通過至少一種檢測法進行檢測的分析物的該濃度範圍將減小至少兩倍、更優選地，10、20、50、100、1000或更多倍。
可以採用任何適宜的方法收集試驗樣品。例如，可以採用浸漬、挖取、舀取、吸取或捕集來收集環境樣品。可以採用抽取、刮取、手術切除或用皮下針等來收集生物樣品。各種情況中的收集方法高度依賴於樣品來源和狀態，而多種可選的適宜收集技術是本領域技術人員眾所周知的。
1.生物試驗樣品[73]試驗樣品可以取自潛在地包含興趣分析物任何來源，包括環境樣品，諸如空氣、水、土、提取物等。本發明優選的試驗樣品是生物樣品，優選是生物液體。可採用本發明的方法操作的生物樣品包括羊水、血、腦脊液、關節內液、眼內液、淋巴液、乳液、汗液、唾液精液、精漿、血清、痰液、滑液、淚液、臍帶液、尿液、活檢組織勻漿液、細胞培養液、細胞提取物、細胞勻漿液、條件培養液、發酵液、組織勻漿液及其衍生物。生物樣品中的興趣分析物包括蛋白質、脂質、核酸和多糖。更具體地，興趣分析物是動物中通常存在的，或是與疾病或感染狀態諸如癌症、病毒感染、寄生蟲感染、細菌感染等相關的細胞代謝產物。特別地，興趣分析物是針對細胞應激的標記物。顯示動物處於應激中的分析物是多種疾病狀態(包括特定心理疾病、心肌梗死和感染)的早期指示物。
興趣分析物還包括那些對動物異源的，但在動物組織中發現的物質。特別地，在此意義下的興趣分析物包括治療性藥物(包括抗生素)，其中的很多種以可由感染性生物體產生的，或來源於環境隱匿於動物內的不同對映體和毒素存在。例如，實例可以是蛋白(eggwhite)或E.Coli提取物。
2.環境試驗樣品[75]環境樣品是用於本發明的另一類優選試驗樣品。優選的環境樣品包括土、塵、皮屑、天然和合成纖維、水、植物材料、動物糞便等。環境樣品中優選的分析物包括天然和合成毒素、肥料、除草劑和殺蟲劑，以及用於細菌和病毒劑的標記，諸如所述興趣劑的結構蛋白特徵。特別地，在環境試驗樣品中尋找的優選分析物是毒素，特別是諸如肉毒素、蓖麻毒素、炭疽毒素等的毒素。環境試驗樣品中存在的疾病相關的興趣分析物包括完整病毒體以及肉毒桿菌、伊波拉病毒(ebola)、HIV、SARS、炭疽、鼠疫、瘧疾、天花、牛海綿樣腦病相關的蛋白酶傳染因子、綿羊搔癢症、變異體CJD等的特徵性蛋白質和核酸。
示例性環境樣品可獲自多種來源，包括自然環境，諸如天然存在的水體。天然存在的水體例如可以是洋、湖泊、海、河流、沼澤、水塘、三角洲或灣。可選地，環境提取物可以是來自水處理中心的提取物。
可選地，環境樣品可取自人造環境，諸如建築物。該建築物可以是任何人造建築物。優選地，所述建築物已受到一種或多種生物病原體諸如天花、炭疽，或一種或多種毒劑，諸如沙林、梭曼、神經毒劑、爆炸性化學劑、殺蟲劑、VX和糜爛性毒劑的汙染。獲取該環境樣品的方法包括採用本領域技術人員已知的適宜溶劑從建築物表面上乾燥抹取，或從建築物表面上潮溼抹取。
B.適宜的結合部分[78]本發明適宜的結合部分包括小有機分子，諸如染料和三嗪，以及生物聚合物諸如肽、蛋白質、多核苷酸、寡糖或脂質。本發明的結合部分可以是分子量為100KDa或更高的分子，諸如抗體，但優選是分子量在10KDa範圍內的較小的分子，更優選是1KDa左右，期望是小於1KDa，例如小於750、500或250Da。理想上，本發明的結合部分與不溶性顆粒化物質結合。各個不溶性顆粒優選攜帶有若干拷貝的相同結合部分，而各個顆粒類型結合不同的結合部分。
本發明的結合部分可以是在溶液、懸液，或在能使所述結合部分與分析物(包括置於固體載體上的)相接觸的任何其它狀態中。
結合部分可以是「噬菌體展示文庫」(其中肽作為噬菌體外膜的部分而呈遞)的一部分。(例如參見，Tang，Xiao-Bo，et al.；J.Biochem；1997；pp.686-690；vol.122，No.4)。在噬菌體顆粒的表面上呈遞肽能夠實現小肽的組合文庫快通量篩選，該方法還有益於篩選組合抗體文庫。噬菌體展示文庫由噬菌體製成，所述噬菌體已經通過重組操作從而將結合部分作為噬菌體蛋白外膜的部分進行表達。採用噬菌體展示，可以方便地構建結合部分的文庫。
結合部分還可以是可溶性組合分子。可溶性組合分子優選包括俘獲部分，該部分能使所述結合部分與互補固體載體相連結。可溶性結合部分實施方式通常是在通過將該結合部分結合至或連結至固體載體從而分離所得複合物之前與樣品接觸並與興趣分析物結合。組合文庫可以由構建塊組成，所述構建塊包含手性原子諸如19種天然存在的胺基酸。
本發明的結合部分可以採用本領域技術人員已知的任何技術進行製備。例如，結合部分可以通過化學合成、從天然來源中收集(在此情況下結合部分是生物有機聚合物)、採用重組技術製備。對於該後者情況，具有不多於15、10、8、6或4個胺基酸的肽尤為有益，因為它們易於採用重組或固相化學技術進行製備。此外，化學合成文庫可見於，例如Fodor et al.，Science 251767-773(1991)和Houghten etal.，Nature 35484-86(1991)。在裂解-連結-重組固相組合合成(Lamet al.，Nature 354，82-84(1991))中，結合部分的補體的多樣性是不同胺基酸的數目與結合部分的長度(在單個結合部分中胺基酸的數目)相乘的結果。
核酸是另一種優選的生物有機聚合物結合部分。與肽相同，可以採用本領域技術人員眾所周知的合成或重組技術製備核酸。本發明優選的核酸結合部分的長度為至少4個，更優選6、8、10、15或20個核苷酸。核酸結合部分包括能夠與特異性分子靶(諸如蛋白質或代謝物)結合的單鏈或雙鏈DNA或RNA分子(例如，核酸適體)。
本發明還包括寡糖結合部分。寡糖結合部分的長度優選是至少5個單糖單位，更優選是8、10、15、20、25或更多個單糖單位。
生物聚合物結合部分可以是脂質。如此處所使用的，術語「脂質」是指疏水性或兩親性部分。由此，結合部分的脂質文庫同樣可用於本發明的方法和試劑盒中。適宜的脂質包括C14至C50脂肪族、芳基、芳烷基、芳稀基或芳炔基部分，其可包括至少一種雜原子，該雜原子選自氮、硫、氧和磷。其它適宜的脂質包括磷酸甘油酯、糖基甘油脂、鞘脂、固醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯丙醇胺。結合部分的脂質文庫的長度優選是至少5個單位，更優選至少8、10、15、20、25、50或更多個單位。
本發明也可以使用小有機分子作為結合部分。通常，所述分子具有能使其與分析物發生離子性、疏水性或親和相互作用的特性。小有機結合部分包括通常用於色譜方法中的化學基團，諸如單-、二-和三-甲基氨基乙烷基基團，單-、二-和三-乙烷基氨基乙烷基基團，磺醯基，磷醯基，苯基，羧甲基基團等。例如，文庫使用苯二氮卓(例如參見，Bunin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914708-4712(1994))和類肽(例如Simon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899367-9371(1992))。在其它實施方式中，結合部分使染料或三嗪衍生物。該列表並非是窮舉的，因為本領域技術人員可以很容易地識別數以千計的化學官能團，這些基團具有離子性、疏水性或親和特性，適宜用作本發明的結合部分。以下將更詳細地描述組合結合部分文庫的製備和使用。
結合部分可以是購買的預先連結於載體的、在載體上合成的，或者可以是採用標準方法直接連結於或直接固定在載體上的(例如參見，Harlow and Lane，Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1988)；Biancala et al.，Letters in PeptideScience 7(291)297(2000)；MacBeath et al.，Science 2891760-1763(2000)；Cass et al.，ed.，Proceedings of the Thirteenth AmericanPeptide Symposium；Leiden，Escom，975-979(1994)；美國專利5,576,220；Cook et al.，Tetrahedron Letters 356777-6780(1994)；和Fodor et al.，Science 251(4995)767-773(1991))。
組合文庫[88]在本發明的一個實施方式中，結合部分的文庫是組合文庫或其部分。組合化學文庫是通過將多個化學「構建塊」組合成所有可能的組合方式，以化學合成或生物合成方式形成的化合物的集合。例如，完全線形組合化學文庫，諸如多肽文庫，是通過將一組化學構建塊(胺基酸)以每一種可能的方式組合成給定的化合物長度(即，多肽化合物中胺基酸的數目)從而形成的。舉例來說，如果構建塊的數目是5且構建體由五個成員組成，則可能的線形組合的數目是55或3,125個成員。在該情況下，構建塊(A、B、C、D和E)是線形組合的，諸如A-A-A-A-A；A-A-A-A-B；A-A-A-A-C；A-A-A-B-A；A-A-A-B-B；A-A-A-B-C；.....；A-A-B-A-A；A-A-B-A-B；A-A-B-A-C；.....；E-E-E-E-C；E-E-E-E-D；E-E-E-E-E。
組合文庫的另一種形式是以支架為基礎的。該構建體的基礎是單個中心分子或核心，其中包含可被構建塊取代的位置。三氯-三嗪(三個可取代位點)即為一種實例，其上可結合若干取代基。如果取代基的數目是三，則可能的組合數目即為10。還可以考慮各取代基的相對定位，在這種情況下組合的數目會更大。
[90]作為第三水平，可以將線性組合文庫與以支架為基礎的文庫進行組合，其中後者文庫的取代基是組合的線性序列。
可以通過化學構建塊所述組合性混合從而合成數百萬種化學化合物。對於肽結合部分而言，所述長度優選限於15、10、8、6或4個胺基酸。本發明核酸結合部分的優選長度是至少4個，更優選6、8、10、15，或至少20個核苷酸。寡糖長度優選為至少5個單糖單位，更優選8、10、15、20、25或更多個單糖單位。
組合文庫可以是完全的或不完全的。生物聚合物的完全組合文庫是這樣一些文庫，該文庫中包含具有給定聚合物長度和組合的每一種可能的單體排列方式的代表方式。不完全文庫是這樣一些文庫，該文庫中缺少具有給定聚合物長度的一種或多種可能的單體排列方式。
肽結合部分是所主張的本發明的優選實施方式。生成適用於所主張的本發明的肽結合部分的方法是本領域技術人員眾所周知的，例如「裂解、結合和重組」方法(例如參見，Furka et al.，Int.J.PeptideProtein Res.，37487-493(1991)；Houghton et al.，Nature 35484-88(1991)；Lam et al.，Nature，35482-84(1991)；國際專利申請WO92/00091；和美國專利5,010,175、5,133,866和5,498,538)和本領域中已知的其它方法。肽文庫的表達還可見於Devlin et al.，Science，249404-406(1990)。
本領域眾所周知的組合和合成化學技術可以生成包含數百萬種成員的文庫(Lam et al.，Nature 35482-84(1991)和國際專利申請(PCT)WO 92/00091)，各文庫具有獨有的結構。例如，由18種天然胺基酸製備的線性六聚物配體文庫包含34×106種不同的結構。當還包括胺基酸類似物和異構體時，可能的結構數目事實上是無限的。此外，所述文庫的每一成員均有可能具有結合不同分子的能力。組合文庫的成員可在固體載體上合成或與固體載體連結，所述固體載體諸如珠，其中各珠的表面上基本上含有文庫成員的數百萬個拷貝。由於可將不同的珠與不同的文庫成員結合以及用於結合文庫成員的珠的總數目非常大，故能夠與珠所結合的文庫成員相結合的不同分子的可能數目非常巨大。
Hammond等，US 2003/0212253(2003年11月13日)公開了組合文庫，如下所述。肽結合部分文庫可以由胺基酸合成，所述胺基酸能夠提供相對於天然胺基酸而言增加的穩定性。例如，半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸可從文庫中省略而包括非天然胺基酸諸如2-萘丙氨酸和正亮氨酸。N-端胺基酸可以是D-異構體或可以被乙醯化以在存在氨基肽酶時提供更好的生物化學穩定性。結合部分的密度必須足以提供對靶分子充分的結合力，但又不能太高以防止結合部分與其自身相互反應而不與靶分子相互反應。結合部分的所需密度是0.1μmole-500μmole/g載體乾重，更優選地，結合部分的所需密度是10μmole-100μmole/g載體。六聚肽文庫在Toyopearl-AF Amino 650M樹脂(Tosohaas，Montgomeryville，Pa)上合成。樹脂珠的大小為60-130mm/珠。通過與Fmoc-Ala-OH和Boc-Ala-OH的混合物(1∶3.8摩爾比)相結合從而完成起始樹脂的初始置換。結合後，完全淨TFA除去Boc保護基團。然後對所得去保護的氨基進行乙醯化。然後通過樹脂珠上殘留的Fmoc-Ala-OH位點組裝肽鏈。採用標準Fmoc合成策略。在典型試驗的一種實施方式中，採用20％哌啶/DMF將六克Fmoc-Ala-(Ac-Ala-)Toyopearl Resin去保護(2×20分鐘)，然後用DMF洗滌(8次)，然後等分為18個獨立反應管。在各獨立管中，單個Fmoc-胺基酸與樹脂(BOP/NMM，過量5-10倍)結合4-7小時。然後洗滌各樹脂並採用「裂解/混合」文庫技術(Furka et al.，Int.J.Peptide Protein Res.，37，487-493(1991)；Lam et al.，Nature，354，82-84(1991)；國際專利申請WO 92/00091(1992)；美國專利號5,010,175；美國專利號5,133,866；和美國專利號5,498,538)進行組合。重複去保護和結合的循環直至完成胺基酸序列(六聚物文庫需六個循環)。在最後的結合循環中，在獨立的反應管中採用20％哌啶/DMF從肽中除去最終Fmoc。採用TFA處理(TFA∶H.sub.20∶Phenol，90∶5∶5)2小時以除去側鏈保護基團。充分洗滌樹脂然後真空乾燥。所得的肽密度通常為0.06-0.12mmol/g樹脂。所述胺基酸可以是L或D-立體異構體或外消旋混合物。
測序並證實肽配體-樹脂珠複合物的肽組成，通過Commonwealth Biotechnologies，Inc.，Richmond，Va進行定量胺基酸分析從而計算樹脂的置換度。通過採用Hewlett PackardG1005A的Edman降解於Protein Technologies Laboratories，Texas AM University進行測序。
用於製備組合文庫的裝置是商業上可獲得的(例如參見，357MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，多種組合文庫本身即可從商業上獲得(例如參見，ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Colnmbia，MD，等)。
在某些肽文庫實施方式中，肽在重組噬菌體的表面上表達從而產生大規模、易於篩選的文庫。採用「噬菌體」方法(Scott and Smith，Science 249386-390，1990；Cwirla，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，876378-6382，1990；Devlin et al.，Science，49404-406，1990)，可以構建非常大規模的文庫(106-108種化學實體)。第二種方法主要使用化學方法，其實例是Geysen法(Geysen al.，Molecular Immunology 23709-715，1986；Geysen et al.J.Immunologic Method 102259-274，1987；和Fodor等的方法(Science 251767-773，1991)。Furka等(14th International Congress of Biochemistry，Volume#5，Abstract FR013，1988；Furka，Int.J.Peptide Protein Res.37487-493，1991)，Houghton(美國專利號4,631,211,1986年12月公布)和Rutter等(美國專利號5,010,175，1991年4月23日公布)公開了用於製備作為激動劑或拮抗劑而得以檢測的肽混合物的方法。
還可以使用其它用於生成化學多樣性文庫的化學物質。所述化學物質包括，但不限於肽(例如，PCT申請號WO 91/19735)，編碼的肽(例如，PCT申請號WO 93/20242)，隨機生物寡聚物(例如，PCT申請號WO 92/00091)，苯二氮卓類(例如，美國專利號5,288,514)，diversomer諸如乙內醯脲、苯二氮卓類和二肽(Hobbs etal.，Proc.Nczt.Acad.Sci.USA 906909-6913(1993))，插烯醯多肽(vinylopgous polypeptide)(Hagihara et al.，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))，具有葡萄糖支架的非肽性肽模擬物(Hirschmann et al.，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))，小化合物文庫的類似有機合成(Chen et al.，J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))，寡碳胺酯(oligocarbamates)(Cho et aL.，Science 2611303(1993))，和/或肽基磷酸酯(Campbell et al.，J.Org.Chem.59658(1994))，核酸文庫(參見Ausubel，Berger and Sambrook，均如上述)，肽核酸文庫(例如參見，美國專利5,539,083)，抗體文庫(例如參見，Vaughnet al.，Nature Biotechnology，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)，糖文庫(例如參見，Liang et al.，Science，2741520-1522(1996)和美國專利5,593,853)，小有機分子文庫(例如參見，苯二氮卓類，Baum CEN，Jan 18，page 33(1993)；類異戊二烯，美國專利5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinones)和間噻嗪烷酮(metathiazanones)，美國專利5,549,974；吡咯烷，美國專利5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，美國專利5,506,337；苯二氮卓類，5,288,514，等等)。
接頭部分[100]本發明的結合部分任選地包括接頭部分，該部分使結合部分靶向地和/或可逆地連結至固體載體。示例性接頭部分包括表位和his-標籤，其可以與所要俘獲的生物分子連結從而形成融合蛋白。在這些情況下，可剪切的接頭序列，諸如特異性針對Factor XA或腸激酶的那些序列(Invitrogen，San Diego，Calif.)可任選地被包含在生物分子和俘獲部分之間以便於融合分子組分的分離和/或分開。特異性識別設計配體的蛋白域也可被用作接頭部分(例如參見，Deisenhofer，J.，Biochemistry 20(1981)2361-2370)。本領域中已知多種其它等效的接頭部分。例如參見，Hochuli，Chemisclze Irzdustrie，1269-70(1989)；Hochuli，Genetic Engineering，Principle and Methods，1287-98(1990)，Plenum Press，N.Y.；and Crowe，et al.(1992)OIAexpressTHe HighLevel Expression Protein Purgfication System，QIAGEN，Inc.Chatsworth，Calif.；上述文件引入此處作為參考。需要吸附的生物分子的抗原決定簇以及其它特徵也可用作俘獲部分標籤。示例性接頭部分包括聚-組氨酸(聚-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(聚-his-gly)標籤；flu HA標籤多肽及其抗體12CA5[Field et al.，Mol.Cell.Biol.，82159-2165(1988)]；c-myc標籤及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體(Evan et al.，Molecular and CeLlular Biology，53610-3616(1985))；和單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標籤及其抗體(Paborsky et al.，ProteinEngineering，3(6)547-553(1990))。其它標籤多肽包括Flag-肽(Hopp et a1.，BioTechnology，61204-1210(1988))；KT3表位肽(Martinet al.，Science，255192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner etal.，J.Biol.Chem.，26615163-15166(1991))；和T7基因10種蛋白質肽標籤(Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876393-6397(1990))。
C.採用結合部分從試驗樣品中俘獲分析物[101]通過在能使各結合部分與其對應分析物相結合的條件下將試驗樣品與結合部分接觸可以俘獲試驗樣品中存在的分析物。如上所述，結合部分可以與試驗樣品直接接觸，或者結合部分可以首先與固體載體，諸如試紙條、SELDI探針和不溶性聚合珠、膜或粉末相連結。
在結合部分是珠文庫的一部分的情況中，珠體積與複合樣品諸如血清的樣品體積的比率可以是介於例如，1∶150和1∶1之間。珠與樣品的比率越小，增加低豐度或稀少分析物品種的相對濃度的能力即越強。在恆定珠∶樣品體積為1∶10時，血清所使用的珠體積可以是至少介於0.0005ml和15mL的珠之間(包括0.020ml)。
在一個實施方式中，在與試驗樣品接觸之前，將結合部分與固體載體結合。在該可選的實施方式中，將固體載體僅與試驗樣品接觸一段時間，該時間足以使結合部分與分析物結合，然後將固體載體撤離試驗樣品，而分析物通過在分析物和結合部分之間形成複合體而被結合在固體載體上。
在一個實施方式中，結合部分包含接頭部分。在該實施方式中，以能使試驗樣品中存在的分析物與結合部分結合的方式將結合部分與試驗樣品直接接觸。經過足夠的時間之後，包含針對結合部分的俘獲部分的互補俘獲部分的固體載體與試驗樣品接觸。這使得結合部分通過俘獲部分與固體載體結合，而保留了結合的分析物。
將結合部分與試驗樣品接觸可通過如下步驟實施，將二者混合，將試驗樣品拭抹在結合部分上，使試驗樣品流經其上結合了結合部分的固體載體，以及對本領域技術人員而言顯而易見的其它方法。將結合部分與分析物持續接觸一段時間，所述時間足以使得結合部分達到與樣品的結合平衡。在一般實驗室條件下，該時間至少是10分鐘。
固體載體[106]用於本發明的可接受的載體的種類非常廣泛。載體可以是可透過性的或不可透過性的。其可以是連續性的或非連續性的，撓性的或非撓性的。載體可以由多種材料製成，所述材料包括陶瓷、玻璃、金屬、有機高分子材料，或其組合。
優選的載體包括有機聚合物載體，諸如顆粒化或珠化載體、編織網和非編織網(諸如纖維網)、微孔纖維、微孔膜、空心纖維或空心管。還可以使用聚丙烯醯胺和礦物質載體諸如矽酸鹽和碳酸鹽(例如，羥基磷灰石)。編織網和非編織網可以具有規則或不規則的表面物理構型。尤為優選的實施方式包括球形的載體或不規則形狀的珠或顆粒。
可以使用多孔材料，因為其能夠提供大的表面積。多孔載體可以是合成的或天然的、有機的或無機的。具有多孔結構的適宜固體的孔徑是至少大約1.0納米(nm)而其孔體積是至少大約0.1立方釐米/克(cm3/g)。優選地，孔徑是至少大約30nm，因為較大的孔對擴散的限制較小。優選地，孔體積是至少大約0.5cm3/g，因為孔周圍較大的表面積會產生較大可能容量。優選的多孔載體包括顆粒載體或珠載體，諸如瓊脂糖、親水性聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、礦物質氧化物和Sepharose，包括球形和不規則形狀的珠和顆粒。
為獲得顯著的優點，結合部分的載體優選是親水性的。優選地，親水聚合物是可水膨脹的以便使分析物得以更好的滲透。所述載體的實例包括天然多糖諸如纖維素、變性纖維素、瓊脂糖、交聯的葡聚糖、氨基變性的交聯葡聚糖、瓜爾膠、變性瓜爾膠、黃胞膠、豆角膠和水凝膠。其它實例包括交聯的合成親水聚合物諸如聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇(PVA)和修飾的聚乙二醇。
可以通過多種機制實施結合部分與固體載體的連結。可以通過將預先製備的結合部分與固體載體連結從而用完全製備的結合部分衍生固體載體。可選地，可以通過將前體分子與固體載體連結以及隨後在生長鏈(其通過第一前體分子與固體載體連結)中加入另外的前體分子，從而在固體載體上形成結合部分。當結合部分是聚合物，尤其是生物聚合物諸如多肽、多核苷酸或多糖分子時，這種將吸附劑構建在固體載體上的機制尤為有用。可以採用本領域已知的方法，通過連續地將單體組分(例如，胺基酸、核苷酸或單糖)添加至與固體載體相連的第一單體組分，從而得到生物聚合物吸附劑。例如參見，美國專利號5,445,934(Fodor et al.)。
例如，在特定實施方式中，組合文庫，各固體載體，例如各個珠，可僅具有一種結合部分與其連結(受組合化學的限制)。
但是，在另一實施方式中，各固體載體可結合多種不同的結合部分。例如，可以採用裂解-和-合併的方法製備肽組合文庫。可以將這些肽從其結合的珠上剪切下來，混合，然後與新的珠組結合，而不通過珠對肽進行任何分選。以這種方法，各個珠可結合多種不同的結合部分。由此，本發明提供了結合部分的組合文庫，其中組合文庫的多種不同成員與相同的固體載體相結合。少至一種而多至10、100、1000、10,000、1,000,000、1,000,000,000或更多種不同的結合部分可與單個固體載體相結合。在特定的實施方式中，固體載體的形式是珠，而單個的、不同類型的結合部分與各個珠相結合。例如，在肽結合部分文庫中，代表一種可能的胺基酸排列的肽與一個珠結合，而代表另一種可能的胺基酸排列的肽與另一個珠結合，等等。
可採用可逆性或不可逆性相互作用將結合分子與固體載體連結。例如，可以採用下述載體來實現不可逆的相互作用，所述載體包括與結合部分化學連結的(任選地通過間隔基團)至少一個反應官能團，諸如羥基、羧基、巰基或氨基。適宜的官能團包括N-羥基琥珀醯亞胺酯、磺醯酯、碘代乙醯基、醛、環氧、咪唑基氨基甲酸酯和溴化氰以及其它滷素活性載體。可以通過多種已知技術將所述官能團裝備至載體。例如，可通過已知的方式採用氨基丙基三乙烯乙醚衍生玻璃表面。在某些實施方式中，結合部分在合成期間與固體載體結合，如本領域技術人員所已知的(例如，固相肽和核酸合成)。
可選地，可以採用與固體載體和/或結合部分相連結的接頭部分，來實現固體載體與結合部分之間的可逆性相互作用。適用於本發明的多種接頭部分均是已知的，其中某些在上面已經描述過。對本領域技術人員而言，接頭部分用於連結不同的試劑的用途是眾所周知的，本領域技術人員能夠使用該公知技術僅通過常規試驗即可製備適用於本發明的固體載體/結合部分結合物。
微粒化固體載體[115]本發明優選的實施方式採用小型、珠化、微粒化固體載體，其直徑小於1000μm，優選小於100、10、1或0.1μm。所述載體通常通過機械碾磨或其它將較大珠減小為粉末一致性的方式製得。微粒化固體載體是合乎需要的，因為相對於較大的珠而言，微粒化固體載體的表面積和體積的比率增大。微粒化固體載體還減小了包含本發明的組合文庫時所需要的載體體積，由此可以使用更為複雜和有效的文庫。然而採用現有的設備，由於受到所用濾器系統的原料大小的限制，故難以在非常小(＜10μm)的珠上合成組合文庫。為了克服這一問題，可以在珠上大批量合成組合文庫，然後通過機械碾磨、粉碎或聲粉碎將其碎裂化，從而形成粉末或微粒的集合。
使用這些技術，可以製備與不同結合部分相連結的微粒化固體載體。這又可以廣泛地進行混合從而形成相對於混合更大或多種大小的不同珠而言，更為均一的組成。
微粒化固體載體可與活性表面共價連結，通過環氧基團、N-羥基琥珀醯亞胺、二甲基3，3′-二硫代丙亞氨酸酯(dithiopropionimidate)或戊二醛以形成與組合文庫的配體形成化學鍵或與聚合物(配體在其上合成)的基礎基質形成化學鍵，從而製成「試紙條「或晶片。這可以通過與肽文庫的N-端氨基交聯而得以實現。
在表面上的非反應的交聯基團可與小化學物質諸如巰基乙醇進行反應從而防止進一步的反應性。此外，還可對表面作進一步處理從而防止蛋白質的非特異性結合。
與微粒化固體載體所連結的結合部分相結合的靶分子可採用一種或多種方法進行洗滌，所述方法例如採用具有不同鹽濃度和pH的緩衝液而結合的蛋白質被洗脫至具有低pH、低或高離子強度的溶液、強離液劑、乙腈/甲酸等中。
可以採用多種方法根據分子量針對洗脫的靶分子分析蛋白質組成，所述方法例如包括，但不限於質譜法、SDS-PAGE、毛細管電泳，或通過等電聚焦進行pI。
可選地，可以通過電泳洗脫靶分子。在該實施方式中，可用適宜的溶液諸如Laemmli緩衝液浸泡包含結合的靶分子的微粒化固體載體，並用SDS-PAGE分析確定蛋白質。可選的緩衝液可以包含脲，而蛋白質可通過在等電聚焦凝膠中的電泳進行分離。
可選地，微粒化固體載體可與填充劑混合併被壓製成片劑形式。以這種形式，可以將其直接加入樣品溶液或可替換地首先將其在緩衝液中懸浮。
可將微粒化固體載體置於溶液諸如瓊脂糖或丙烯醯胺中，並通過纖維上的交聯劑的聚合反應而與凝膠自身交聯或彼此交聯從而形成整體柱物質。
可選地微粒化固體載體可固定在粘合劑薄膜上。
另一方法是將微粒化固體載體包埋在多孔基質中。所述基質可包括能夠使顆粒在融解充氣階段整合至其中的非編織纖維或網。
可根據需要將微顆粒整合至單張膜或層疊膜之中以便獲得適宜的所需結合能力；其中微粒化固體載體通過壓延或水纏繞(hydroentanglement)而被包埋在層之間。
膜組成可以選自天然或合成來源，包括聚酯聚丙烯纖維網。當然，本領域技術人員能夠理解本節所描述的多種技術通常可用於本發明的其它實施方式。
1.除去未結合的分析物[128]本發明的一個特徵是根據本文所述方法的分析物的處理優選除減小分析物濃度之間的差異之外濃縮並部分純化了結合的分析物。該特徵的完全實現包括任選地將未結合的分析物與固體載體上的結合部分所結合的分析物洗滌分離。
優選通過將結合部分所結合的分析物與溫和洗滌溶液相接觸來實施洗去未結合的分析物。溫和洗滌溶液意在除去通常見於初始包含分析物的試驗樣品中的汙染物和未結合分析物。通常，洗滌溶液具有生理pH和離子強度而且在環境溫度和壓力條件下實施洗滌。
本領域技術人員無須過度試驗即可實施適用於本發明的洗滌溶液的製備。除去汙染物的方法，包括低嚴緊性洗滌方法，已有報導，例如見於Scopes，ProteinPurificationPrinciples and Practice(1982)；Ausubel，et al.(1987和定期增刊)；Current Protocols in MolecularBiology；Deutscher(1990)″Guide to ProteinPurification″in Methods inEnzymology vol.182，以及該系列中的其它卷。
D.從結合部分分離俘獲的分析物[131]可以採用多種方法，優選採用能夠破壞結合部分和分析物之間相互作用的水洗脫緩衝液從結合部分洗脫結合的分析物並進行分離。任何適宜的洗脫緩衝液均可用於此目的，包括變性劑諸如離液劑和有機溶劑。示例性洗脫緩衝液包括具有非常低或高離子強度的鹽水溶液、去汙劑溶液和有機溶劑。競爭性結合本發明的結合部分的試劑的溶液和懸液也可用於洗脫緩衝液，只要所述競爭性結合試劑不妨礙隨後興趣分析物的收集或分析。所選擇的洗脫緩衝液具有高度的應用特異性，而且本領域技術人員通過公眾領域中一般可獲得的材料或通過常規試驗即可很容易地對其進行鑑別(例如參見，ProteinPurificationPrinciplesand Practice(1982)；和Deutscher(1990)″Guideto Protein Purification″in Methods in Enzymology vol.182，以及該系列中的其它卷)。
典型的順序包括用氯化鈉洗滌(以便通過優勢離子交換作用收集蛋白質)，然後使用乙二醇(主要通過疏水締合針對蛋白質相互作用的洗脫液)，然後將pH降低至2.5(變性緩衝液)而最後使用鹽酸胍。
適宜的洗脫緩衝液的實例包括修飾分析物和/或結合部分的表面電荷的那些緩衝液，諸如pH緩衝溶液。用於通過修飾酸度而破壞表面電荷的PH緩衝溶液優選是強緩衝液，足以將溶液的pH保持在酸性範圍，即，pH小於7，優選小於6.8、6.5、6.0、5.5、5.0、4.0或3.0；或保持在鹼性範圍內pH大於7，優選大於7.5、8.0、8.3、8.5、9.0、9.3、10.0或11.0。在特定實施方式中，洗脫緩衝液可包含9M脲pH為3、9M脲pH為11或6.66％MeCN/13.33％IPA/79.2％H20/0.8％TFA的混合物。一種方法對比另一種方法的選擇要依賴於用於均衡樣品的分析方法。
可選地，可以使用高鹽濃度溶液，該溶液具有充分的離子強度以便遮蔽分析物和/或結合部分的電荷特性。此時，尤為優選的是具有多價離子的鹽，例如鹼土金屬或過渡金屬平衡離子的硫酸鹽和磷酸鹽，雖然解離為一個或多個單價的鹽也適用於本發明，假若所得溶液的離子強度為至少0.1，優選0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.75、1.0mol1-1或更高。舉例來說，多種蛋白質分析物/結合部分相互作用對其環境的離子強度改變敏感。因此，可通過結合的分析物與鹽溶液(優選無機鹽溶液諸如氯化鈉)接觸而將分析物與結合部分分離。這可以採用多種方法來完成，所述方法包括在洗脫緩衝液中水浴、浸透或浸漬固體載體，該載體上結合了分析物，或通過用洗脫緩衝液對固體載體衝洗、噴霧或洗滌。所述處理能夠從與固體載體結合的結合部分上釋放分析物。然後可以從洗脫緩衝液中回收所述分析物。
離液劑，諸如胍和脲，破壞圍繞結合部分和所結合分析物的水封結構，這導致分析物和結合部分之間的複合解離。適於用作本發明的洗脫緩衝液的離液鹽溶液是應用特異性的且本領域技術人員可通過常規實驗進行製備。例如，適宜的離液洗脫緩衝液可包含濃度範圍為0.1-9M的脲或胍。
基於去汙劑的洗脫緩衝液從表面張力以及分子複合結構的方面修飾親和性分子的選擇性。適宜用作洗脫緩衝液的去汙劑包括離子型和非離子型去汙劑。非離子型去汙劑通過修飾溶液的介電常數而破壞分子間的疏水性相互作用，而離子型去汙劑通常以傳遞均一電荷的方式遮蔽感受性分子，這導致被遮蔽的分子排斥相似地被遮蔽的分子。例如，離子型去汙劑十二烷基硫酸鈉(SDS)以傳遞均一負電荷的方式遮蔽蛋白質。非離子型去汙劑的實例包括Triton X-100、TWEEN、NP-40和辛基-糖苷。兩性離子去汙劑的實例包括CHAPS。
另一類通過修飾溶液的介電常數而破壞疏水性相互作用的去汙劑類化合物包括乙二醇、丙二醇和有機溶劑諸如乙醇、丙醇、乙腈和甘油。
本發明優選的洗脫緩衝液包括適用於質譜儀的基質物質。基質物質可包括洗脫緩衝液中。本發明的某些實施方式可任選地包括將分析物從結合部分上直接洗脫至質譜儀探針，諸如蛋白質或生物晶片。在本發明其它實施方式中，所述基質可與從結合部分上洗脫之後的分析物混合。而其它實施方式包括將分析物直接洗脫至SEND或SEAC/SEND蛋白質晶片，該晶片包括預先置於蛋白質晶片上的能量吸收基質。在後者這些實施方式中，洗脫緩衝液中即無須存在其它基質物質。
適用於本發明的其它洗脫緩衝液包括上述緩衝液組分的組合。由兩種或多種上述洗脫緩衝液組分所製成的洗脫緩衝液能夠基於多種洗脫特性而修飾複合物亞單位之間分子相互作用的選擇性。
採用本發明分離的分析物所具有的分析物濃度範圍或分析物之間的濃度方差低於試驗樣品中初始存在的分析物濃度範圍或濃度方差。例如，相對於針對試驗樣品實施本文所述的任何方法之前試驗樣品中所存在的相同分析物之間的濃度方差而言，在採用本發明的方法進行操作後，分離的分析物所具有的分析物濃度範圍或與其它分離的分析物的濃度方差降低至少兩倍，更優選地降低10、20、25、50、100、1000或更多倍。優選地，本發明的方法以最小限量的洗脫緩衝液進行實施，以確保洗脫緩衝液中分離的分析物的濃度最大化。更優選地，洗脫緩衝液中至少一種分離的分析物的濃度大於先前在試驗樣品中的濃度。
在分離俘獲的分析物之後，可對該分析物進一步進行基於某些化學或物理特性諸如分子量、等電點或對化學或生物化學配體的親和力的濃縮或分級分離處理。用於核酸、蛋白質和多糖的分級分離方法是本領域眾所周知的，例如可見於Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice(1982)；Sambrook et al.，Molecular Cloning-ALaboratory Manual(2nd ed.)Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，(Sambrook)(1989)；以及CurrentProtocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel et al.，eds.，CurrentProtocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley Sons，Inc.，(1994 Supplement)(Ausubel)。
E.檢測分離的分析物[142]在已將分析物洗脫並分離以使其不含結合部分之後，可以採用本領域技術人員可獲得的任何技術對分析物進行檢測、定量或其它特徵分析。將本發明的分析技術施用於複合試驗樣品的特徵是相對於在初始試驗樣品中所檢測的大範圍的分析物濃度而言，所分離的分析物的濃度範圍發生動態性方差減小。分析物濃度範圍的這種減小能使，比較使用初始試驗樣品自身的分析物檢測可用的百分比而言，初始試驗樣品中所檢測的分析物大得多的百分比得以檢測和特徵分析，而不需要重新校準設備。實現分析物濃度範圍的實際減小需要依賴多種因素，所述因素包括包括初始試驗樣品的性質和所用結合部分的性質和多樣性。一般地，採用本文所述技術對分析物濃度方差的減小足以使至少25％，更優選至少30％、40％、50％、60％、70％、75％或80％分離的分析物得以檢測，而不需要重新校準設備。理想上，本發明能使至少90％、95％、98％或更多分離的分析物得以檢測，而不需要重新校準設備。
可以採用本領域技術人員已知的任何適宜方法實施對採用本文所述技術分離的分析物的檢測。例如，使用染料的比色測定的適用範圍非常廣泛。可選地，可通過光譜法實施檢測。光譜檢測儀依靠的是反射率、紫外線和/或可見光吸收，或用適宜波長激發後的螢光中的變化來檢測反應組分。示例性檢測方法包括螢光分析法，吸光度、反射率和透光度光譜法。雙折射、反射率或衍射中的變化還可用於監測複合物形成或反應進程。檢測分子相互作用尤為有用的技術包括表面等離子共振、橢率檢測法、共振鏡技術、光柵偶聯波導技術和多極共振光譜法。這些技術以及其它技術是本領域技術人員眾所周知的，而且在無須過度試驗的情況下，本領域技術人員可以很容易地將其應用於本發明。例如，這些技術以及其它技術的多種方式可見於″Spectrochemical Analysis″Ingle，J.D.和Crouch，S.R.，Prentice HallPubl.(1988)以及″Analytical Chemistry″Vol.72，No.17。
優選的檢測方法是質譜分析法。質譜分析技術包括(但不限於)離子化(I)技術諸如基質輔助雷射解吸(MALDI)，連續或脈衝電噴霧(ESI)和相關方法(例如，IONSPRAY或THERMOSPRAY)，或大集束撞擊(massive cluster impact(MCI))；這些離子源可與檢測形式相匹配，所述檢測形式包括線形或非非線形反射飛行時間(TOF)、單個或多個四極子、單個或多個扇形磁場、傅立葉變換離子迴旋共振(FTICR)、離子阱，及其組合(例如，離子阱/飛行時間)。可以實施多種基質/波長組合(MALDI)或溶劑組合(ESI)以便用於離子化。例如，採用ESI(Valaskovic，G.A.et al.，(1996)Science 2731199-1202)或MALDI(Li，L.et al.，(1996)J.Am.Chem.Soc.1181662-1663)質譜法檢測分析物的Subattomole水平。ES質譜法已經由Fenn等(J.Phys.Chem.88，4451-59(1984)；PCT申請號WO 90/14148)提出而且在當前綜述文章(R.D.Smith et al.，Anal.Chem.62，882-89(1990)以及B.Ardrey，Electrospray Mass Spectrometry，SpectroscopyEurope，4，10-18(1992))中已經總結了目前的用途。Hillenkamp等已經提出了MALDI-TOF質譜法(″Matrix Assisted UV-LaserDesorption/IonizationA New Approach to Mass Spectrometry of LargeBiomolecules，″Biological Mass Spectrometry(Burlingame andMcCloskey，editors)，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，pp.49-60，1990)。採用ESI，由於存在可用於質量計算的多個離子峰，故可以在飛克分子量的樣品中非常精確地測定分子量。本發明優選的分析法使用表面增強淨解吸雷射解吸/離子化(SELDI)，例如參照美國專利號6,020,208中所述。質譜法是本發明的實施方式中尤其優選的檢測方法，其中分析物的洗脫物直接置於質譜儀的探針或生物晶片上，或其中洗脫緩衝液包含基質物質或在從結合部分上洗脫分析物之後與基質物質結合。
另一種廣泛使用的檢測方法是基於興趣分析物的一種或多種物理特性的電泳分離。分析多肽和蛋白質分析物的特別優選的實施方式是二-維電泳。優選的應用是通過在第一維中的等電點，以及通過第二維中的大小來分離分析物。用於分析物電泳分析的方法隨所研究的分析物而廣泛地變化，但用於鑑定適用於給定分析物的特定電泳方法的技術是本領域技術人員眾所周知的。
II.鑑定生物標記[146]本發明的其它實施方式是採用上述珠化的結合部分來鑑定用於診斷疾病、感染或汙染的生物標記。生物標記可以在上述任何樣品中鑑定，但優選是從取自活體(最優選是人)的諸如血、尿、腦脊液等的樣品中鑑定。可以採用多種方法來鑑定生物標記。
「生物標記」事實上可以是在生物樣品中存在的且可被分離的或可在生物樣品中檢測的任何生物化合物，諸如蛋白質及其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖、脂質、核酸、有機或無機化合物、天然結合物和小分子。此外，生物標記可以是整個的完整分子，或者其可以是完整分子的一部分，該部分可具有部分功能或例如可被抗體或其它特異性結合蛋白質所識別。生物標記可以是表位特異性抗體。如果生物標記的可檢測方面與給定表型(諸如生命體中的特定疾病狀態，或水體中的汙染水平)相關，則生物標記即被視為有益的。例如，所述可檢測方面可以包括來自個體的生物樣品中生物標記的存在、缺失或濃度，和/或其作為生物標記圖譜一部分的呈現。生物標記的所述可檢測方面在本文中稱為「特徵」。例如，特徵還可以是生物標記的兩個或多個可檢測方面的比率，所述生物標記可以具有或可以不具有已知的識別性。「生物標記圖譜」包括至少兩種所述特徵，其中所述特徵可與生物標記(諸如核酸和糖)的相同或不同分類相對應。生物標記圖譜還可包括至少3、4、5、10、20、30或更多種特徵。在一個實施方式中，生物標記圖譜包括數百種，或甚至數千種特徵。在其它實施方式中，生物標記圖譜包括至少一種內標的至少一種可檢測的方面。
「表型」是生物體的可觀測的物理和生物化學特性，其由遺傳構成和環境影響二者所決定。可選地，在本發明的文中，表型還可以與自然的無生命方面相關聯，例如水體的表型包括水體可(物理地或化學地)檢測的那些方面。例如，湖泊的表型包括水溫、酸度、礦物質含量、氧含量，無論其是否能夠維持生命以及何種生命形式。
「表型改變」是一種可以檢測的與給定表型相關的參數的改變。例如，表型改變可包括體液中生物標記的增加或減少，，其中所述變化與疾病狀態相關。表型改變可進一步包括患者的給定狀態的可檢測方面的改變，所述患者在生物標記的可檢測方面無改變。例如，表型的改變可包括體溫、呼吸率、脈搏、血壓或其它生理學參數的可檢測改變。所述改變可藉助臨床觀察和檢測採用本領域技術人員眾所周知的常規技術進行測定。如本文所使用的，「常規技術」是指可根據表型改變對個體進行分類但不會獲得根據本發明的生物標記圖譜的那些技術。
採用所主張的發明來鑑定物種或組織中的診斷性生物標記需要至少兩種生物樣品的可用性。所提供的生物樣品可以是如下形式對照組和試驗組、對照組和試驗個體，在不同的時間取自相同的個體或對本領域技術人員來說顯而易見的任何其它排列形式。
按照本文所述用珠化的結合部分文庫處理所得到的各個樣品。以這種方式，能夠檢測更多的推定生物標記，如下面實施例部分所述。其發生的原因是因為所述結合部分縮窄了樣品中存在的分析物濃度範圍的方差，由此使低豐度和高豐度分析物均能得以檢測。
在用本發明的結合部分文庫處理之後，對於各個生物樣品，分別針對與所述結合部分相結合的分析物進行洗脫和合併。然後分析合併的樣品以確定樣品中的任何共同分析物是否表現出差異表達(一種樣品中的表達增強比對其它樣品)，或者在一種樣品中表達而在其它樣品中無表達。表現出所述差異表達的分析物即可被視為針對在各生物樣品源之間觀察到的表型改變或差異的推定生物標記。然後可以實施進一步的統計學和分析檢測以便以所需確定度將該生物標記與表型改變相關聯。
用於鑑定生物標記的優選分析性分析法是與上述用於一般鑑定分析物的那些方法相同的方法，所述分析物與本發明的結合部分相結合。
III.試劑盒[154]本發明還包括試劑盒，其含有能夠使本領域技術人員實施本文所述技術的組分。為此目的，試劑盒最基本的要素是提供多種結合部分，每一種結合部分具有經選擇的量以便俘獲預先確定量的不同分析物。在本發明的某些試劑盒實施方式中，提供了與固體載體，優選不溶性珠結合的結合部分。在其它實施方式中，分別提供固體載體和結合部分。當分別提供時，結合部分和/或固體載體包括俘獲部分，該部分能夠使本發明的操作者在實施本文所述發明期間將結合部分結合於固體載體。分別提供結合部分和固體載體的試劑盒可任選地提供實施結合部分與固體載體的結合反應所需的其它試劑。
本發明的試劑盒還包括多種容器，該容器中含有用於樣品製備和分析物分離的組分。具有該特性的示例性組分包括一種或多種洗滌溶液，該溶液足以從特異性結合分析物的結合部分上除去未結合物質，和至少一種洗脫溶液，該溶液足以釋放與結合部分特異性結合的分析物。
試劑盒實施方式可任選地包含在本發明的方法中使用結合部分的文庫的說明書。
雖然為了清楚和便於理解而通過例證和實施例的方式對上述發明給出了某些詳細的描述，但對本領域技術人員來說，在本發明的教導下，在不背離本發明的精神和範圍的情況下，作出等同物的特定變型、改變、修飾和替換是顯而易見的。故此，本文所描述的實施方式涉及的是多種修飾、改變等等，而本發明的範圍單獨地參照所附權利要求而確定。本領域技術人員能夠很容易地識別多種能夠變化、改變或修飾而產生基本上相似的結果的非關鍵參數。
雖然本文所描述的本發明的各個元素包含多個實施方式，但是應當理解的是(除非另有描述)，所給出的本發明的元素的各個實施方式能夠與本發明的其它元素的各個實施方式一同使用，所述各個使用方式的目的在於構成本發明獨特的實施方式。
根據上述內容可以理解，本發明的應用非常廣泛的。通過以下實施例進一步描述本發明，所述實施例僅為描述性的，並不意在以任何方式對本發明的定義和範圍進行限制。
實施例實施例1人血清蛋白濃度範圍的減小[160]本實施例舉例說明了上述本發明的一種實施方式如何施用於複合生物樣品(在此例中是人血清)。在本實施例中，通過選擇性地將血清蛋白吸附至與不溶性珠結合的六肽來實現血清蛋白濃度方差的減小。在本例的結合部分群體(其形式為分拆、重組和合併的珠組合文庫)中，可以呈遞超過1×106種可能的六肽排列方式。以這種形式，高豐度血清分析物(諸如白蛋白)與六肽結合部分相結合，但其僅能達到與特定結合部分的飽和度相等的水平。相反，由於識別低豐度分析物的結合部分的量是非限制性的，故低豐度血清分析物幾乎全部被結合。該選擇性結合的結果導致由所用結合部分所識別的蛋白質的分析物濃度範圍減小，而不會出現在意在選擇性地除去高豐度分析物的方法中，丟失固有的低豐度分析物的風險。因此，使用所述方法分離的血清分析物的大部分可以在一種批量分析中進行檢測，而無需重新校對檢測裝置。這與下述情況相反，即當必須反覆重新校準檢測裝置以便檢測未處理的血清中相同分析物，從而在血清試驗樣品中檢測相同分析物時所出現的情況。在本實施例中，以4℃，14,000rpm離心30mL血清15分鐘，然後從上層小心地除去全部脂質物質。將所餘血清通過0.8μm濾器過濾，然後通過0.45μm濾器過濾。保留500μl該過濾的血清作為非均一化對照樣品。將大約1mL六肽文庫(在20％甲醇中溶脹過夜，然後以含有140mM氯化鈉的20mM檸檬酸鈉緩衝液pH7過夜，然後洗滌3次以除去細小顆粒物質)等分加入三個重力流動柱的各個柱中。六肽文庫的各個等份與7.6mL等份的過濾血清於室溫下溫和攪動孵育2小時。孵育後，排乾柱，收集的體積代表流通液(flow-through)。保留1mL的流通液用於分析。然後立即用20mL檸檬酸鹽緩衝液(20mM檸檬酸鈉，140mM氯化鈉，pH＝7)洗柱。另外收集第一個1mL的洗出液用於分析。洗滌後，從三個柱重複份的每個中除去若干個200uL等份的樹脂，然後按下述進行處理。針對來自各個重複份的第一個200μL等份的樹脂，用200uL 2×LDS緩衝液+DTT還原劑(通過混合500uL 4×LDS，200uL 10×DTT，和300uLdH20製備)於90℃加熱該樣品10分鐘。該樣品冷卻後，將其以2,000rpm離心1分鐘。收集上清液，然後保存於-20℃以備1D-凝膠分析。針對來自各個重複份的第二個200μL等份的樹脂，用400uL 6M尿素以批量形式孵育該樣品1小時，伴以溫和攪動。然後2,000rpm離心該樣品1分鐘以形成片狀六聚物配體珠文庫，然後收集上清液用SELDI-質譜儀進行分析。針對來自各個重複份的第三個200μL等份的樹脂，用400uL 6M GuHCl以批量形式孵育樣品1小時，伴以溫和攪動。然後2,000rpm離心該樣品1分鐘以形成片狀六聚物配體珠文庫，然後收集上清液用SELDI-質譜儀進行分析。
隨後在IMAC-Cu ProteinChip Arrays上對為了SELDI-質譜儀分析而保留的全部樣品進行處理。首先使用50uL 100mM CuSO4孵育5分鐘以便用Cu使表面帶電來製備IMAC陣列。在室溫下持續搖動從而完成孵育。孵育階段過後，用蒸餾水衝洗陣列以便除去過剩的CuSO4。然後用pH4.0 100mM醋酸鈉於室溫下持續搖動中和帶電的IMAC-Cu陣列5分鐘。孵育期過後，除去醋酸鈉並用蒸餾水衝洗IMAC-Cu陣列。然後對IMAC-Cu陣列預處理兩次，採用150ul結合緩衝液(0.1M NaPO4，0.5M NaCl，pH7)於室溫下持續搖動5分鐘。預處理後，除去這種緩衝液然後加入新的90ul等份的結合緩衝液，隨後加入10ul的來自均一化試驗的樣品(總孵育體積為100ul)。然後在IMAC-Cu陣列上持續搖動孵育樣品30分鐘。孵育後，除去過剩的樣品體積，然後用150uL結合緩衝液洗滌陣列三次；每次洗滌5分鐘並持續搖動。最終洗滌之後，用150uL蒸餾水衝洗IMAC-Cu陣列兩次，然後乾燥。作為最終步驟，將1uL 50％飽和SPA(在50％乙腈，0.5％三氟乙酸中)加至各點，乾燥，然後用額外的1ul 50％SPA重複添加基質。該陣列隨後即可用於SELDI-質譜儀的分析。
圖6-8中描述了均一化前後過濾血清的SELDI-質譜的對比。樣品的質譜分析顯示出，由於高豐度分子的減少還降低了能夠隱匿初始樣品中的峰的離子抑制作用，故此峰高度平緩增加而且可見峰的數目增加。預期這種方法將增加複合溶液(諸如血清)中可檢測分析物的數量，該增加的數量超過使用原始複合溶液(未施以本發明方法)的可檢測分析物數量至少0.5，更為可能的是1、2、3或更大的數量級。
已經發現，具有700,000種不同成員的六肽文庫對血清所產生的結果與具有6400萬種成員或300萬種成員的文庫所產生的結果相似。
表1蛋白的峰檢測，所述蛋白(S/N比＞3)來自未經均一化珠處理的血清。所檢測的全部峰＝191M/z質量 TOF 強度 MZ面積TOF面積 S/N2015.662014.6517.1776.4172127.900.542949.022036.482035.4717.2655.3084143.630.603840.642088.132087.1217.4822.244348.87 0.203317.282158.142157.1417.7711.12938.45 0.03468.762236.712235.7118.0901.459619.01 0.076511.412274.252273.2418.2402.647659.30 0.236720.782297.372296.3618.3321.759325.74 0.102113.842348.052347.0518.5321.194016.12 0.06329.442387.062386.0618.6851.054910.47 0.04088.382433.772432.7618.8651.12219.13 0.03528.952510.492509.4819.1591.170113.0S 0.04979.412548.372547.3619.3021.487917.14 0.064512.012588.132557.1319.4511.125324.23 0.09039.122645.662644.6519.6650.80166.61 0.02446.532672.542671.5319.7640.71007.81 0.02875.802701.932700.9219.8720.60591.89 0.00694.962714.042713.0319.9160.79675.25 0.01926.532744.232743.2220.0261.575315.67 0.056912.962765.832764.8220.1051.993335.32 0.127716.432798.602797.6020.2231.811417.06 0.061414.982822.572821.5620.3092.250528.31 0.101318.662841.992840.9820.3781.051513.66 0.04878.732874.682873.6820.4941.350116.29 0.057811.252882.132881.1220.5211.08527.18 0.02549.052986.192985.1920.8861.621816.72 0.058213.663008.503007.5020.9640.71472.51 0.00876.033035.733034.7221.0580.65884.37 0.01515.583051.053050.0421.1110.39481.66 0.00573.353069.953068.9521.1760.47391.33 0.00464.023092.473091.4721.2531.191816.40 0.056110.143114.573113.5621.3280.49971.64 0.00564.263151.053150.0521.4520.65135.28 0.01795.573164.533163.5221.4980.979311.19 0.03788.393232.233231.2221.7251.581318.92 0.063313.633243.483242.4721.7630.77216.38 0.02136.663298.213297.2121.9453.465436.61 0.121230.073313.893312.8821.9975.113576.84 0.253744.433333.833332.8222.0632.543237.75 0.124222.143384.923383.9122.2302.143265.06 0.212918.753407.633406.6322.3041.082412.54 0.04089.493429.513428.5122.3750.60493.05 0.00995.313452.913451.9022.4510.82047.29 0.02367.223476.393475.3822.5270.53344.42 0.01424.713503.263502.2522.6140.55242.93 0.00944.893511.643510.6322.6410.47322.83 0.00914.193528.973527.9622.6960.46205.10 0.01634.103546.063545.0622.7510.59736.70 0.02145.303568.263567.2522.8211.00349.59 0.03058.933590.143589.1422.8911.035632.09 0.10189.233623.823622.8122.9980.43373.89 0.01233.883637.243636.2323.0400.45136.62 0.02084.043694.923693.9123.2210.56095.95 0.01865.053729.433728.4223.3290.46382.79 0.00874.193764.533763.5223.4380.41741.51 0.00473.783805.093804.0923.5630.845910.90 0.03367.693823.323B22.3123.6191.705228.82 0.088615.543848.083847.0723.6951.086914.13 0.04339.933855.693854.6923.7190.84248.51 0.02607.703898.883897.8723.8502.373228.05 0.085421.773921.253920.2523.9191.157612.73 0.038710.643942.173941.1623.9820.56286.01 0.01825.183966.533965.5224.0560.55957.51 0.02275.163980.763979.7624.0990.49523.90 0.01184.58
4027.934026.9324.2400.38132.66 0.00803.544058.524057.5224.3320.51595.65 0.01694.804076.904075.8924.3861.261821.950.065311.774161.264160.2524.6369.0816189.47 0.558885.344187.944186.9424.7153.958098.130.288237.284211.394210.3824.7841.975320.070.058818.654225.324224.3124.8241.766217.900.052416.694237.594236.5824.8601.075410.500.030710.184259.144258.1324.9231.128315.930.046410.704277.214276.2024.9760.99699.99 0.02909.474306.314305.3125.0601.492228.790.083514.214317.274316.2725.0921.447727.750.080313.804387.424386.4125.2940.51693.99 0.01144.964421.284420.2725.3910.638510.890.03116.144476.554475.5525.5491.652525.130.071415.984498.634497.6225.6110.830312.410.03528.044524.124523.1125.6830.54235.72 0.01625.274545.864544.8525.7450.765515.040.04247.454574.444573.4325.8250.20260.70 0.00201.984589.434588.4225.8670.21341.61 0.00452.084610.074609.0725.9250.15640.29 0.00081.534632.984631.9725.9890.935210.710.02999.174653.414652.4026.0460.36562.90 0.00813.594673.984672.9726.1040.22270.95 0.00262.194705.094704.0826.1900.12660.60 0.00171.254721.344720.3326.2350.58557.57 0.02095.794746.554745.5526.3050.50418.28 0.02284.994760.714759.7026.3440.40234.44 0.01223.994776.824775.8126.3880.58458.39 0.02315.814795.964794.9526.4410.891714.070.03868.874817.654816.6426.5000.785315.130.04147.834900.934899.9226.7270.51875.56 0.01515.214946.354945.3526.8500.30603.20 0.00863.094963.564962.5526.8970.41236.74 0.01824.165010.785009.7827.02412.5885 211.54 0.5681127.695031.995030.9927.0815.853184.840.227359.485053.195052.1827.1373.084747.310.126531.415074.185073.1727.1931.789333.970.090618.255109.705108.6927.2881.418637.780.100414.525174.525173.5227.4600.45706.47 0.01714.705215.365214.3627.5680.73937.91 0.02087.645234.385233.3827.6180.54429.17 0.02415.635273.445272.4327.7200.21111.10 0.00292.195340.595339.5827.8950.51335.40 0.01405.365504.235503.2228.3180.31303.85 0.00993.325525.795524.7928.3730.30484.10 0.01053.245584.595583.5828.5230.493816.840.04295.275710.825709.8128.8420.29896.40 0.01613.235758.225757.2128.9610.30752.85 0.00713.335832.215831.2029.1460.40034.57 0.01144.375871.675870.6629.2440.35284.17 0.01033.865885.145884.1329.2770.30287.90 0.01953.326013.846012.8329.5950.707119.420.04777.846034.066033.0629.6440.43445.55 0.01364.836396.046395.0330.5173.0543118.14 0.281435.066455.266454.2530.65726.1287 771.78 1.8272301.526477.396476.3830.71012.0491 218.47 0.5159139.326499.006497.9930.7617.2773135.33 0.319084.316521.196520.1830.8135.301297.810.230261.546542.806541.7930.8644.267588.660.208349.636638.046637.0331.08720.2348 631.52 1.4750237.366654.306653.2931.12519.0952 360.62 0.8401224.326675.856674.8431.1759.8609187.44 0.4359116.076698.426697.4131.2276.2424112.83 0.262073.636718.016717.0031.2734.254483.960.194650.276739.456738.4431.3222.726746.030.106532.286765.346764.3431.3821.997639.640.091623.706810.676509.6631.4872.066479.460.183124.626858.736857.7331.5971.8896104.59 0.240022.617151.497150.4832.2620.951422.940.051611.697172.927171.9132.3101.033343.310.097112.727472.887471.8732.9770.456013.010.02865.777617.947616.9333.2940.469311.510.02516.027654.147653.1333.3731.331467.510.146517.127827.967826.9633.7480.28027.57 0.01633.66
7926.907925.8933.9602.4904114.750.245032.857958.237957.2334.0271.352731.25 0.066517.898133.318132.3034.3987.5286658.021.3865101.228303.108302.0934.7540.815544.66 0.093111.148365.088364.0734.8830.542219.48 0.04057.458612.188611.1835.39310.6716 1028.00 2.1038150.068774.368773.3535.7232.1558178.910.362530.788940.048939.0336.0584.2497277.170.557061.659028.239027.2236.2350.51319.18 0.01847.519116.519115.5036.4110.611414.83 0.02959.029162.729161.7136.5030.826359.88 0.118912.259307.469306.4536.7890.585223.46 0.04628.809454.109453.0937.0771.5935140.290.274124.309585.089584.0737.3320.17464.40 0.00852.709683.689682.6737.5230.23916.15 0.01193.739743.779742.7637.6390.434527.31 0.05256.8210072.71 10071.70 38.2670.276015.39 0.02914.4711533.88 11532.87 40.9400.241019.15 0.03394.5611691.05 11690.04 41.2170.251835.15 0.06174.8412454.78 12453.77 42.5380.577857.72 0.098312.1213574.94 13573.93 44.4051.1111178.320.291026.7513715.41 13714.41 44.6330.447342.34 0.068610.9713866.02 13865.01 44.8770.338435.35 0.05708.4614034.19 14033.19 45.1480.295153.00 0.08497.5514392.29 14391.28 45.7190.5330106.020.167614.3215118.66 15117.65 46.8550.362757.41 0.088610.8315313.34 15312.33 47.1550.152718.28 0.02804.7015870.49 15869.48 48.0030.148334.49 0.05194.9916659.22 16658.21 49.1780.115223.78 0.03504.4517261.53 17260.53 50.0570.218248.44 0.07029.4917403.26 17402.25 50.2620.273594.70 0.135612.2622185.18 22184.17 56.7320.6056798.591.013649.9728054.19 28053.18 63.7810.2571107.680.122139.2729051.79 29050.78 64.9030.103074.85 0.083216.0433245.74 33244.73 69.4211.66011750.64 1.8258281.4334281.46 34280.45 70.4920.5196597.670.602589.9639898.16 39897.15 76.0380.025711.52 0.01104.9844457.39 44456.39 80.2580.3417989.320.891769.7749939.53 49938.52 85.0550.022619.83 0.01694.9151350.04 51349.03 86.2460.049994.72 0.079210.8555656.75 55655.74 89.7840.0711186.880.151415.4759215.94 59214.93 92.6070.1083250.620.196723.6366317.60 66316.59 97.9952.27836680.56 4.9211498.3972737.16 72736.15 102.622 0.1259350.290.245627.6175001.97 75000.96 104.206 0.1127216.040.148824.7380013.65 80012.64 107.627 0.0678279.890.186914.9188591.36 88590.35 113.242 0.0472171.170.109310.4199724.32 99723.31 120.139 0.0857436.660.262418.82110663.70 110662.70 126.550 0.0315123.510.07057.11115751.09 115750.08 129.423 0.039284.89 0.04779.03116910.94 116909.93 130.069 0.0411256.880.14139.53132576.48 132575.47 138.501 0.20151519.36 0.786749.62175561.80 175560.79 159.360 0.0192204.640.09275.21表2蛋白的峰檢測，所述蛋白(S/N比＞3)來自採用均一化珠處理後的血清。所檢測的全部峰＝271M/z質量 TOF 強度 MZ面積TOF面積 S/N2021.842020.8317.2070.637612.12 0.05038.962067.932066.9317.3980.66016.51 0.02679.312087.132086.1217.4760.72017.41 0.030310.182106.092105.0917.5540.48643.56 0.01456.892180.242179.2317.8530.53823.23 0.01297.672221.862220.8518.0191.41708.54 0.033920.272240.962239.9618.0950.55896.06 0.02408.012266.942265.9318.1980.54943.98 0.01577.892293.082292.0718.3000.37792.12 0.00835.442339.182338.1818.4800.98687.77 0.030114.262378.632377.6218.6320.63374.75 0.01839.192396.272395.2718.7000.57285.76 0.02218.322439.972438.9618.8671.04086.19 0.023515.172467.122466.1218.9690.97068.52 0.032214.18
2497.922496.9219.0860.96007.480.028114.062526.242525.2319.1920.80887.310.027311.882553.872552.8619.2952.951230.44 0.113243.442625.362624.3519.5590.51172.400.00887.582655.342654.3319.6690.97769.380.034314.512683.622682.6219.77219.4999 144.76 0.5259290.172706.162705.1519.8532.695027.91 0.101040.182729.042728.0319.9361.11929.740.035116.722801.032800.0320.1941.43727.800.027821.602841.722840.7120.3385.306138.45 0.135980.012864.832863.8220.4200.95919.760.034414.492889.552888.5520.5073.517027.58 0.096753.242930.162929.1520.6490.66065.110.017810.032946.662945.6620.7061.451312.23 0.042522.072991.412990.4120.8611.011611.76 0.040615.443068.433067.4221.1252.669227.74 0.094641.003091.473090.4721.2040.57136.740.02298.793104.333103.3221.2472.797723.84 0.080843.103128.843127.8421.3300.43613.910.01326.733159.533158.5321.4341.10238.520.028617.063186.783185.7821.5250.29982.510.00844.653203.523202.5121.5810.69125.440.018210.733224.183223.1721.6502.494724.72 0.082338.813237.123236.1121.6931.22289.750.032419.043247.563246.5521.7280.45393.690.01227.073289.313288.3021.86613.5948 102.60 0.3383212.583311.943310.9321.9401.960214930.049130.713336.823335.8122.0224.730236.91 0.120974.253346.263345.2522.0531.282910.27 0.033620.153358.473357.4622.0930.62223.290.01089.783373.643372.6322.1420.53144.590.01498.373385.053384.0422.1790.81396.980.022712.823415.173414.1722.2770.44513.750.01217.033427.493426.4822.3172.310915.05 0.048736.533438.793437.7822.3531.09378.770.028317.313447.053446.0422.3800.82805.940.019113.113459.903458.9022.4210.32911.870.00605.223467.203466.1922.4450.25471.290.00424.043485.273484.2622.5030.96426.740.021615.313495.203494.2022.5350.47763.130.01007.593506.273505.2622.5700.77665.560.017812.353524.493523.4822.6280.62435.340.01709.953530.573529.5722.6480.85646.820.021713.653552.773551.7622.7180.20991.070.00343.353573.003572.0022.7831.746412.44 0.039427.933642.533641.5323.0020.80324.850.015212.923660.133659.1223.0571.798814.34 0.044928.963683.853682.8423.1310.53194.380.01378.583702.013701.0023.1882.507918.21 0.056740.523746.513745.5023.3260.48423.690.01147.853774.173773.1623.4121.193113.41 0.041419.383789.413788.4023.45920.8035 191.08 0.5886338.383811.603810.5923.5273.554739.12 0.120157.923833.143832.1323.5934.218638.90 0.119268.853848.993847.9823.6421.914724.85 0.076031.293887.003885.9923.7570.22880.810.00253.753907.373906.3623.8190.37201.410.00436.113916.173915.1623.8461.16859.340.028319.193931.923930.9223.8941.114111.11 0.033618.323946.053945.0423.9376.498554.40 0.1644106.993960.153959.1423.9791.324916.05 0.048421.843979.743978.7324.0380.80356.650.020013.263996.403995.3924.0881.451616.40 0.049223.994013.734012.7224.1400.56425.430.01639.344037.174036.1624.2101.10699.510.028418.354079.334078.3224.3360.50522.250.00678.404101.884100.8724.4030.37962.870.00856.334116.364115.3524.4461.28807.310.021721.494123.414122.4024.4671.514314.62 0.043225.274147.474146.4624.5387.615967.57 0.1993127.354161.384160.3824.57931.9075 291.83 0.8593534.104181.814180.8124.6399.1974127.91 0.3757154.194205.754204.7424.7095.589174.72 0.218993.874227.414226.4124.7722.062029.87 0.087334.694249.764248.7524.8380.930310.38 0.030215.68
4272.774271.7624.9054.385239.310.114374.034295.304294.2924.9701.798415.140.043930.414316.144315.1325.0301.021313.600.039317.304334.004332.9925.0822.646626.850.077544.894356.554355.5425.1470.66085.66 0.016311.234367.674366.6725.1793.570434.890.100460.714386.584385.5725.2330.88099.31 0.026715.004412.414411.4125.3080.60812.58 0.007410.384435.684434.6725.3740.0322-1.50 -0.00430.554445.904444.8925.4030.25720.77 0.00224.404494.154493.1525.5405.170262.470.177288.764516.894515.8925.6050.46593.11 0.00888.014540.004538.9925.6700.42986.56 0.01857.404573.914572.9025.7660.34214.53 0.01275.914607.334606.3325.8600.53947.83 0.02199.344622.344621.3425.9020.86866.78 0.019015.064651.234650.2225.9820.55814.93 0.01389.704680.474679.4626.0640.794011.050.030713.824717.864716.8626.1680.34053.24 0.00905.944737.634736.6226.2221.683016.140.044629.434746.034745.0226.2460.75214.57 0.012613.164759.22475821 26.2820.31193.05 0.00845.464787.604786.6026.3600.18020.99 0.00273.164816.824815.8226.4410.35862.73 0.00756.314829.314828.3026.4750.54497.60 0.02089.594849.724848.7126.5310.96989.32 0.025517.104869.864868.8526.5860.37553.13 0.00856.634899.444898.4426.6660.49795.97 0.01 62 8.814918.114917.1126.7170.39384.58 0.01246.984963.854962.8426.8411.118516.740.045319.895062.615061.6027.1071.452517.550.047026.025094.275093.2627.1911.194617.480.046721.455108.245107.2327.2291.521320.680.055127.355128.795127.7927.2832.538426.470.070445.705145.895144.8827.3290.736810.950.029113.285173.865172.8527.4030.735913.560.036013.295187.505186.4927.4390.70467.49 0.019812.745205.845204.8327.4880.62918.47 0.022411.395274.335273.3227.6680.41294.92 0.01297.515315.835314.8227.7771.273019.000.049723.245341.105340.0927.8430.21762.07 0.00543.985359.345358.3327.8900.25312.97 0.00774.645402.175401.1628.0021.050416.140.041919.305433.215432.2028.0821.166714.370.037221.485454.455453.4428.1370.21162.89 0.00753.905504.705503.7028.2671.022319.860.051118.935546.415545.4028.3740.49396.77 0.01739.175609.125608.1128.5340.47369.68 0.02478.835624.765623.7628.5740.41854.48 0.01147.825682.495681.4928.7200.19581.06 0.00273.675733.385732.3728.8491.760031.180.078633.145755.155754.1428.9040.868212.820.032216.375797.905796.8929.0111.393336.060.090426.365847.405846.3929.1351.280124.840.062024.305874.145873.1329.2011.838862.450.155434.985934.725933.7229.3520.557912.730.031510.665978.505977.4929.4600.38537.29 0.01807.396013.906012.9029.5480.35522.90 0.00716.836032.856031.8529.5940.40933.60 0.00897.886133.826132.8129.8410.58656.96 0.017011.376162.346161.3329.9111.355320.480.049826.336184.576183.5629.9650.65889.78 0.023812.826216.026215.0130.0410.921919.680.047717.986236.006235.0030.0900.830410.750.026016.226255.366254.3530.1360.23612.34 0.00574.626320.396319.3930.2931.121417.580.042322.046342.236341.2230.3461.536626.640.063930.256456.306455.2930.61821.3573 431.55 1.0263424.016498.256497.2430.7181.848725.840.061336.826521.676520.6630.7732.344032.220.076346.766551.226550.2130.8431.520732.410.076530.406614.066613.0630.9911.790721.310.050135.966653.736652.7231.08440.0260 990.54 2.3211806.226696.046695.0331.1835.558089.500.2091112.306718.436717.4231.2363.953570.520.164580.01
6740.826739.8131.2883.080358.810.137062.446763.086762.0731.3392.613947.310.110053.076832.176831.1731.50029.3327 769.05 1.7805598.616852.896851.8831.54812.8114 225.11 0.5200261.856873.746872.7331.5966.7676115.78 0.2670138.536895.966894.9531.6474.0495126.91 0.292083.036968.156967.1431.8132.646248.810.111954.546987.836986.8231.8589.1160179.49 0.4107188.177007.187006.1831.9023.506448.010.109772.487035.747034.7331.9672.817955.450.126558.377054.797053.7832.0112.611869.350.157854.187219.977218.9732.3856.0098205.68 0.4631126.187323.597322.5932.6171.450243.840.098030.687354.387353.3732.6860.841814.960.033417.857426.457425.4432.8470.25308.63 0.01925.397632.917631.9033.30225.1248 922.09 2.0212543.777697.487696.4733.4432.344094.170.205350.977781.997780.9833.6274.0191140.62 0.305287.957839.407838.3933.7522.065082.170.177645.387929.487928.4733.9460.406511.970.02578.998003.128002.1234.1040.617720.190.043213.748070.028069.0134.2470.740121.610.046116.548141.708140.6934.3992.318068.480.145452.098158.618157.60- 34.4351.667529.110.061737.528251.988250.9734.6330.32829.23 0.01957.438294.078293.0634.7211.229237.020.077927.938372.448371.4334.8860.574127.100.056813.128484.998483.9935.1210.37548.50 0.01778.658589.518588.5035.3382.4703105.46 0.218057.398651.758650.7535.4661.859159.080.121743.398713.508712.4935.5935.5491204.46 0.4198130.118756.818755.8035.6821.726552.130.106740.618833.418832.4035.8382.4403133.47 0.272457.738939.058938.0436.05322.2153 1128.34 2.2880529.759019.229018.2136.2162.398492.320.186257.549091.979090.9636.3622.3245113.49 0.228256.079144.699143.6836.4682.3181121.61 0.243756.149309.129308.1236.7963.6153148.49 0.295288.659374.689373.6836.9262.4549109.39 0.216760.499437.969436.9537.0512.7925165.50 0.326769.149516.919515.9037.2071.8864104.50 0.205546.999581.859580.8437.3341.305170.920.139032.679637.199636.1937.4431.011554.070.105625.439724.009722.9937.6120.375416.300.03179.509785.719784.7037.7320.28529.89 0.01927.259939.689938.6838.0290.747135.290.067919.2210063.40 10062.39 38.5674.5744203.31 0.3889118.8110144.76 10143.75 38.4220.569031.570.060114.8710273.13 10272.12 38.6660.763138.760.073420.1510497.57 10496.57 39.0890.278213.210.02477.4710561.30 10560.29 39.2080.408221.740.040611.0210635.46 10634.45 39.3460.593035.520.066116.1010718.48 10717.47 39.5000.904061.400.113924.7110802.36 10801.36 39.6560.859966.950.123623.6610921.46 10920.45 39.8750.437823.170.042612.1611046.41 11045.40 40.1040.13105.23 0.00963.6811147.95 11146.94 40.2890.15177.75 0.01414.2911431.94 1143.093 40.8021.560185.670.154245.1311515.49 11514.48 40.9523.4607316.45 0.5666100.7911667.57 11666.56 41.2235.1984534.22 0.9496153.2911874.61 11873.61 41.5900.899992.250.162626.9912135.29 12134.28 42.0470.347220.900.036510.6412213.21 12212.20 42.1830.192712.500.02175.9412421.55 12420.55 42.5430.417625.400.043813.1112553.09 12552.08 42.7700.392126.020.044612.4412837.97 12836.97 43.2550.705153.270.090422.9213035.41 13034.40 43.5890.225719.660.03317.4613517.28 13516.27 44.3931.7454207.59 0.343660.2013664.19 13663.19 44.6351.0656136.20 0.223937.2413826.26 13825.25 44.9010.933996.110.157233.1114005.24 14004.23 45.1934.3241437.10 0.7106155.8014103.83 14102.82 45.3532.4578213.14 0.345089.3614335.82 14334.81 45.7278.76321030.75 1.6560325.4714534.46 14533.45 46.0452.5813335.53 0.535197.6614717.09 14716.08 46.3350.8605197.18 0.311833.12
15187.2415186.2447.0750.443775.600.117717.8715657.4115656.4047.8030.08978.45 0.01303.7815820.3915819.3848.0530.08659.75 0.01493.7116443.6516442.6448.9970.119011.730.01765.4517066.0817065.0749.9231.3076165.52 0.244464.0517175.0817174.0750.0832.5670301.87 0.4434127.3017296.4817295.4750.2612.7701417.80 0.6109139.2817482.1017481.0950.5321.0341142.54 0.207253.1117766.5417765.5350.9440.6228131.11 0.189433.0817945.0217944.0151.2010.6698282.23 0.402636.3321092.5621091.5555.5430.1325101.64 0.134111.2623718.0523717.0458.9240.088365.370.081213.4125789.6225788.6261.4620.050934.020.040710.8327804.4627803.4563.8352.94971524.96 1.7606669.0328548.7628547.7564.6890.8053668.67 0.7571187.1231256.5731255.5667.7090.026014.770.01616.6132717.1732716.1769.2840.01807.30 0.00784.8134145.2534144.2470.7910.102484.340.087928.8334918.3834917.3771.5930.051138.330.039414.7837428.1637427.1674.1390.039467.810.067712.5539114.9339113.9275.8020.049357.700.056016.8041845.5441844.5478.4210.1089116.05 0.109740.1742589.2642588.2679.1200.090494.910.088333.6944703.9444702.9381.0730.054686.720.078820.9850260.9550259.9485.9960.019429.770.02558.0655322.5255321.5190.2500.1770349.83 0.285979.5265162.7065161.6997.9960.023772.940.055111.6469555.7069554.69101.264 0.020680.680.058410.4682925.1282924.12110.623 0.024673.370.049013.9389416.6589415.64114.894 0.006023.190.01483.4397397.9597396.94119.939 0.006312.810.00793.57110339.51 110338.50 127.698 0.005746.500.02633.26實施例2.文庫與未分級分離的、未稀釋的人混合血漿的孵育[164]為有助於分析複合樣品，本方法可用於減小濃度差異。人血漿是一種最複雜和難以分析的物質蛋白質存在的濃度範圍大於1010(Anderson和Anderson)；減小該範圍將有助於分析痕量蛋白質。在該方法的條件下，與未經處理的起始物質相比，血漿與配體文庫的孵育將增加可檢測的並隨後可分析的蛋白質的數量。
A.樣品製備[165]冷凍的、混合的人貧血小板血漿(PPP)於37℃下解凍，然後經0.8和0.45μm濾器過濾。位於具有EA CA-Ala間隔子的Toyopearl650M氨基樹脂(平均直徑65μm，～2×106珠/ml；Tosoh Biosciences，Montgomeryville，PA)上的，四個重複份的大約1ml六聚體肽配體文庫各自與9ml血漿於室溫下旋轉孵育1小時。樹脂排乾，然後用1ml檸檬酸鹽緩衝液(20mM檸檬酸鹽，140mM NaCl，pH 7.0)洗滌。保留該洗滌溶液，以及上樣血漿和起始流通的樣品。隨後用20個柱體積的檸檬酸鹽洗滌珠文庫。
100μl來自樣品2和4的樹脂與等體積(100μl)的2×LDS緩衝液+DTT(Invitrogen，Carlsbad，CA)在90℃下孵育10分鐘，然後離心。收集並保存上清液以備分析。
200μl來自重複份1-4的樹脂與400μl 6M GuHCl或400μl6M脲以批量形式孵育1小時。樹脂排乾，然後收集流通液以備分析。在G-25柱上將洗脫液中GuHCl和脲的濃度減低至1M脲，步驟如下用200μl 1M脲5分鐘平衡G-25柱兩次，然後2000rpm離心3分鐘。在試管中加入20μl脲和GuHCl樣品，然後在相同的條件下再次離心。收集流通液。
B.LDS-PAGE分析[168]起始PPP、流通液和洗滌液用檸檬酸鹽緩衝液按1∶25稀釋，然後用2×樣品緩衝液按1∶2稀釋。14μl處理的GuHCl和脲上清液在5μl 4×LDS緩衝液+2μl DTT還原劑中於90℃加熱10分鐘。用大約10μl來自樣品2和4的珠上樣兩個孔。在MOPS緩衝液中，23μl的各個保留的樣品在4-12％Bis-Tris凝膠(NuPage，Invitrogen)上於200V進行電泳。凝膠用Simply Blue(Invitrogen)按照廠商說明書進行染色。結果顯示於圖1和圖4中。
經過處理的樣品中存在若干條帶，這些條帶未能見於初始血漿中，而初始血漿中存在的非常明顯的白蛋白條帶(～64kD)基本上被減小了。這些結果表明，所述方法確實減少了蛋白質的濃度範圍，如該方法所檢測到的，因此與初始物質的分析相比，所述方法增加了可檢測和可分析的蛋白質的數量。
實施例3.除去IgG後濃度方差的減小[170]在多種蛋白質組應用中，樣品製備的首要步驟之一是除去白蛋白和IgG，因為這些高豐度蛋白質掩蔽了低豐度品種的檢測。然而除去這些蛋白，也常常除去了與它們相關的痕量品種，而且還會有樣品的損失。在分析前不需要除去IgG的樣品製備方法將會是有益的。本實施例表明，使在完整血漿中不能檢測的蛋白質品種可視化並不需要除去IgG。在除去或未除去IgG的血漿中，比較了在LDS-PAGE中檢測到的蛋白質圖譜。
A.樣品製備[171]冷凍的、混合的人貧血小板血漿(PPP)於37℃下解凍，然後經0.8和0.45μm過濾器過濾。按照如下步驟除去血漿中的IgG在Bio-Rad柱中填充5ml Protein G Sepharose Fast-flow樹脂(Amersham，TS)，以10cm/h流速(通過振動泵控制)加入10ml過濾的PPP，然後收集流通液。
位於具有EA CA-Ala間隔子的Toyopearl 650 M氨基樹脂(平均直徑65μm，～2×106珠/ml；Tosoh Biosciences，Montgomeryville，PA)上的，大約1ml六聚體肽配體文庫與9ml流通液(如上)孵育1小時/室溫/旋轉。用手除去孵育期間形成的凝塊。樹脂排乾，然後用1ml檸檬酸鹽緩衝液(20mM檸檬酸鹽，140mMNaCl，pH 7.0)洗滌，接著用10ml T-檸檬酸鹽(檸檬酸鹽緩衝液+0.05％Tween-20)和10ml檸檬酸鹽緩衝液洗滌。收集流通液和最初1ml的洗滌液以備分析。將樹脂大約分為3等份，每等份200μl。
一個樹脂等份與等體積(200μl)2×LDS緩衝液+DTT(Invitrogen，Carlsbad，CA)於90℃加熱10分鐘，然後離心。收集並保存上清液以備分析。剩餘的樹脂等份與500μl 6M GuHCl或500μl 6M脲以批量形式孵育1小時。樹脂排乾，然後收集流通液已備分析。
洗脫液中的GuHCl和脲濃度從6M減少至1M濃度，而一半的初始體積(2×濃縮的)在G-25柱上通過緩衝液交換。
B.LDS-PAGE分析[175]初始的PPP、除去IgG的PPP、流通液和洗滌液，以及GuHCl和脲上清液的樣品在LDS緩衝液+DTT還原劑中於90℃加熱10分鐘。LDS緩衝液、GuHCl和脲洗脫液的最終稀釋度分別為0.25x、lx和lx。PPP、除去IgG的血漿、流通液和洗滌液被稀釋為50X。ProteinG LDS和Glycine洗脫液與2×LDS緩衝液+DTT孵育。23μl各樣品在4-12％Bis-Tris凝膠上電泳，MOPS緩衝液，200V。根據上述方法先前所製備的血漿樣品(從中除去IgG)同樣進行電泳。隨後通過SilverQuest按照廠商說明書使用Simply Blue對凝膠染色。數據顯示於圖2中。
雖然開始時，流通液和洗滌液樣品的MW 50和25 KDa的蛋白質(減少的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的大小)有明顯的減少，但如凝膠所示，來自包含和不包含IgG的血漿的LDS-PAGE洗脫液中均沒有顯著性差異。由於樣品處理的問題，來自脲和GuHCl樣品的信號是不明顯的。這些數據表明除去IgG的影響不明顯。優選除去和保留IgG可能是為了其它的原因，或許是為了獨立分析；但是，對於通過該方法分析痕量蛋白而言，並不需要除去IgG。
實施例4.人血清中蛋白質濃度範圍的減小[177]前面的實施例已表明所述方法可用於未稀釋和未分級分離的人血漿的用途。在臨床診斷中起始樣品通常是血清，而非血漿。下面的實施例表明使用所述方法製備血清用於分析的可行性。
A.血清製備[178]5個7ml裝有人血的試管在4℃過夜使其凝固成血塊。凝固的血塊在Sorvall離心機RT7中4,000rpm離心5分鐘，收集血清，然後經0.8和0.45μm濾器過濾。
B.樣品製備1.基於TentaGel的文庫孵育[179]將250μl TentaGel文庫[含有Gly間隔子的TentaGel MNH210μm(Rapp Polymer)文庫(Peptides International，Louisville，KY)平均直徑10μm，～5.6×108珠/ml]置於15ml錐形管中與2.25ml(1∶9v/v)血清在室溫(RT)下孵育1小時。4000rpm離心樹脂2分鐘，然後保存上清液以備分析(FT Tenta)。用1.25ml檸檬酸鹽緩衝液搖動洗珠，然後在2ml Eppendorf管中4,000rpm離心2分鐘。保留洗滌液用於分析(W Tenta)。再加入4×1.25ml檸檬酸鹽緩衝液洗珠。將珠分成3等份，每等份大約75μl。
一個樹脂等份與75μl 2×LDS/DTT於90℃孵育10分鐘。離心珠，然後將上清液保存於-20℃。其它等份與200μl 6M脲或6MGuHCl於RT下孵育1.5小時。初始及未結合的血清部分用檸檬酸鹽按1∶25稀釋，然後用2×LDS/DTT按1∶2稀釋。樣品於90℃加熱10分鐘，然後冷凍於-20℃。
2.基於Toyopearl的文庫孵育[181]將大約1ml Toyopearl文庫(平均直徑65μm，～2×106珠/ml；Tosoh Biosciences，Montgomeryville，PA)與9ml血清孵育1小時/RT/旋轉。200μl樹脂在200μl 2×(LDS緩衝液+DTT還原劑)中於90℃加熱10分鐘。收集上清液並保存於-20℃以備分析。200μl樹脂與400μl(v/v)6M脲以批量形式孵育1小時。收集流通液以備分析並保存於室溫下。200μl樹脂與400μl 6M GuHCl以批量形式孵育1小時。收集流通液以備分析並保存於室溫下。初始及未結合的血清部分用檸檬酸鹽按1∶25稀釋，然後用2×LDS/DTT按1∶2稀釋。樣品於90℃加熱10分鐘，然後冷凍於-20℃。200μl血清和200μl各未結合部分交付於Analytical Chemistry分析。
C.LDS-PAGE分新[182]14μl的1M脲和GuHCl樣品用5μl 4×LDS緩衝液和2μl10×DTT於90℃加熱10分鐘。冷凍的LDS樣品於90℃再加熱10分鐘。在4-12％Bis Tris凝膠中每孔上樣各樣品20μ1。凝膠用MOPS電泳緩衝液於200V進行電泳，直至染料前端到達凝膠底部。根據廠商說明書用Simply Blue蛋白質染色劑染色凝膠，然後用H2O脫色。凝膠顯示於圖3中。
用文庫孵育後，血清中可見條帶的數目有實質性增加(泳道2與3和8相比)。條帶的圖譜與使用血漿孵育文庫所得圖譜非常相似(泳道3，圖3與泳道7，圖1相比)。這些結果表明用本發明的方法製備的血清樣品增加了可用LDS-PAGE分析的條帶的數目，而且與初始血清相比，洗脫液中大部分高豐度蛋白質的濃度減小。
雖然為了清楚和理解而通過例舉說明和實施例的方式已經對上述發明作出了某些細節描述，但對於本領域的普通技術人員來說顯而易見的是，在本發明的教導下在不背離所附權利要求的精神和範圍的情況下可對其作出特定的變化和修改。
正如具體地而且獨立地將各個獨立出版物或專利申請引入作為參考一樣，本說明書中所引用的全部出版物和專利申請均被引入此處作為參考。
權利要求
1.一種方法，包括以下步驟(a)提供第一樣品，該樣品中包含多個不同的分析物品種，所述分析物品種以第一濃度範圍存在於所述第一樣品中；(b)將所述第一樣品與包含至少100種不同的結合部分的一定量文庫接觸；(c)以所述不同的結合部分從所述第一樣品中俘獲一定量的不同分析物品種以及除去未結合的分析物品種；和(d)從所述結合部分上分離所俘獲的分析物品種從而產生第二樣品，該樣品中包含多個不同的分析物品種，所述分析物品種以第二濃度範圍存在於所述第二樣品中；其中所述文庫的量經過選擇以便俘獲一定量的不同的分析物品種從而所述第二濃度範圍低於所述第一濃度範圍。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述第一樣品包含至少100、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000種不同的分析物品種。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述文庫包括至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000種不同的結合部分。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述結合部分包括生物有機聚合物。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述結合部分與固體載體或多個固體載體結合。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述文庫是非選擇性文庫。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述不同的結合部分包含在完全或不完全的組合文庫中。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述第二樣品所具有的分析物品種多樣性基本上與所述第一樣品的相同。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述樣品選自羊水、血、腦脊液、關節內液、眼內液、淋巴液、乳液、汗液、唾液精液、精漿、血清、痰液、滑液、淚液、臍帶液、尿液、活檢組織勻漿液、細胞培養液、細胞提取物、細胞勻漿液、條件培養液、發酵液、組織勻漿液及其衍生物。
10.如權利要求1所述的方法，進一步包括檢測所述第二樣品中的分析物品種。
11.如權利要求1所述的方法，其中未結合的分析物的除去包括採用洗滌緩衝液洗滌所述俘獲的分析物。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述分析物選自多肽、核酸、複合糖、複合脂質、合成無機化合物和合成有機化合物。
13.如權利要求1所述的方法，進一步包括基於物理或化學特性分級分離所述第二樣品中的分析物。
14.如權利要求1所述的方法，進一步包括鑑定至少一種所述分離的分析物。
15.如權利要求1所述的方法，進一步包括將生物特異性結合部分與所述第二樣品接觸以及測定所述生物特異性結合部分是否從所述第二樣品中俘獲了分析物品種。
16.如權利要求4所述的方法，其中所述生物有機聚合物選自肽、寡核苷酸和寡糖。
17.如權利要求1所述的方法，其中所述結合部分選自抗體和核酸適體。
18.如權利要求5所述的方法，其中所述固體載體或多個固體載體是珠或顆粒的集合。
19.如權利要求5所述的方法，其中所述固體載體或多個固體載體選自纖維、整體柱、膜和塑料條帶。
20.如權利要求6所述的方法，其中所述非選擇性文庫選自生殖系抗體文庫、重組結合蛋白質的噬菌體展示文庫、染料文庫或非組合性文庫，其中成員的結合特異性為非預先選擇的、組合文庫及其部分。
21.如權利要求7所述的方法，其中所述組合文庫是六肽文庫。
22.如權利要求10所述的方法，其中採用選自比色、光度、磁共振、橢偏光、質譜、電泳、色譜、酶性和序列分析的方法對所述分析物進行檢測。
23.如權利要求13所述的方法，其中分級分離包括採用選自色譜法、電泳、毛細電泳、過濾和沉澱的方法分離所述分析物。
24.如權利要求18所述的方法，其中各個珠或顆粒連結於基本上不同的結合部分。
25.如權利要求18所述的方法，其中多個不同的結合部分連結於相同的珠或顆粒。
26.如權利要求18所述的方法，其中所述珠或顆粒的直徑小於1μm。
27.如權利要求18所述的方法，其中採用選自粉碎、磨碎和聲波破碎的方法將所述珠或顆粒製成磨碎的微粒化珠。
28.如權利要求27所述的方法，其中所述微粒化珠是由天然或合成聚合物形成的聚合物基質。
29.如權利要求27所述的方法，其中所述顆粒與第二固體載體連結從而形成陣列或試紙條。
30.一種用於檢測樣品中多種分析物的試劑盒，包括(i)含有至少100種不同結合部分的文庫的容器；和(ii)使用所述文庫實施權利要求1所述方法的說明書。
31.如權利要求30所述的試劑盒，其中所述結合部分與固體載體或多個固體載體連結。
32.如權利要求30所述的試劑盒，其中所述文庫包括六肽組合文庫或其部分，其中所述六肽與顆粒連結。
33.如權利要求30所述的試劑盒，進一步包括用於以所述結合部分俘獲分析物的結合緩衝液。
34.如權利要求30所述的試劑盒，進一步包括用於從結合部分上洗脫所述俘獲的分析物的洗脫緩衝液。
35.一種包含至少100種不同的結合部分的文庫，其中多種不同的結合部分與相同的固體載體或多個固體載體連結。
36.如權利要求35所述的文庫，其中所述結合部分包括組合六肽文庫或其部分。
37.一種鑑定診斷性生物標記的方法，該方法包括以下步驟(a)提供來自具有第一表型的第一組生物體的第一組生物樣品；(b)提供來自具有第二表型的第二組生物體的第二組生物樣品；(c)對各個所述的生物樣品實施權利要求1所述的方法，由此分別產生第三和第四組生物樣品；(d)在第三和第四組生物樣品的各個樣品中檢測分析物品種；(e)鑑定在第三和第四組生物樣品中存在不同的至少一種分析物品種，由此該至少一種分析物品種為用於區分第一表型和第二表型的生物標記。
38.如權利要求37所述的方法，其中步驟(e)包括鑑定生物標記圖譜以便提供較所述圖譜中任一生物標記單獨所具有的預測力更佳的預測力。
39.一種減小樣品中分析物的相對量的方法，包括以下步驟(a)提供第一樣品，該樣品包含第一的多種不同的分析物，所述分析物具有第一量方差；(b)將所述第一樣品與多種不同的結合部分接觸，各結合部分的存在量均為已確定的；(c)以所述不同的結合部分從第一樣品中俘獲一部分第一的不同的分析物以及除去未俘獲的分析物；和(d)從所述結合部分上分離所述俘獲的分析物從而產生第二樣品，該樣品中包含第二的多種不同的分析物，所述分析物具有第二量方差其中多種不同結合部分的各結合部分的所述已確定的量經過選擇以便俘獲一定量的所述不同的分析物由此所述第二量方差小於第一量方差。
全文摘要
本發明涉及分子生物學、組合化學和生物化學領域。特別地，本發明描述了用於在動力學上降低取自複合混合物的分析物之間方差的方法和試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK1997284SQ200580016558
公開日2007年7月11日 申請日期2005年3月23日 優先權日2004年3月23日
發明者E·博斯徹蒂, D·哈蒙德 申請人:賽弗吉生物系統有限公司, 美國國家紅十字會