青光眼的診斷和治療藥物的製作方法

2023-10-11 19:13:24

專利名稱：青光眼的診斷和治療藥物的製作方法
技術領域：
本發明提供了診斷和治療青光眼的方法和組合物。2. 背景技術 音光眼青光眼是一組眼病，其特徵在於^L神經變性。它是導致世界範圍內 失明的首要原因。發生青光眼的一個主要危險因素是家族史。業已闡釋 了幾種不同的青光眼遺傳方式。原發性先天性青光眼或嬰兒青光眼是一種遺傳性疾病，其特徵在於 眼內房水回流系統發育異常，導致眼內壓增高，glove或角膜增大(即眼 積水)，視神經損傷，最終導致視覺損害。原發性開角型青光眼(POAG)是一種常見疾病，其特徵在於視神經 萎縮，導致視野缺損，最終失明。根據發病年齡和臨床表現的不同，POAG 又主要被分為兩組。青年發病的POAG通常在較大兒童或青年期發病， 進展迅速，病情嚴重，伴隨較高的眼內壓。該型POAG對醫學治療反應 較差，通常需要進行眼科手術治療。成年或晚髮型POAG是青光眼中最 常見的類型。其症狀較青年發病的POAG為輕，發展也更加緩慢，發病 年齡不定，通常在40歲以後。該型POAG的眼內壓輕度或中度升高，對 於常規監測的醫學治療反應滿意。不幸的是，由於該病的進展比較緩慢而 且沒有痛感，因此通常都是在視神經已經發生不可逆性損傷後才^支發現。兩種類型的POAG通常都與眼內壓升高有關，而眼內壓升高是由於 房水通過小梁網回流時受到抑制導致的。POAG中人小梁網(HTM)的 病理生理學特徵在於細胞外基質組分增加，而小梁網細胞數量減少。因 此，有可能是由於HTM細胞在結構、功能或數量上的缺陷影響了 POAG
的發病機理。POAG的病理生理學還涉及人鞏膜篩板(HLC)細胞，業 已顯示該細胞擁有的蛋白表達模式與HTM類似(Steely et al. (2000) Exp. Eye Res 70: 17-30) 因此，POAG的常見起因可能在於對神經視網膜損 傷最具作用的兩種組織。因此，為了 了解POAG的分子發病機理並制定 獨特治療方式，確定並了解HTM和HLC的分子控制機制至關重要。業已顯示，培養的HTM細胞表達多種生長因子受體mRNA,而且， 業已顯示，這些表達的受體具有功能，因為應用外源性生長因子可以引 起生理反應(Wordinger et al. (1998) Invest Ophthalmol Vis Sci 39: 1575-89)。在體內，這些受體可能通過房水中存在的生長因子(aquecrine/旁 分泌)或小梁網細胞本身合成或局部釋放的生長因子(自分泌)來激活。 實際上，業已顯示，多種TGF-b同工型可以顯著抑制EGF刺激的小梁網 細胞增殖，而FGF-1, TGF-a， EGF, IL-la， IL-lb， HGF， TNF-a, PDGF-AA和 IGF-1可以顯著刺激細胞外酸化(ibid)。通過高親和力受體作用的特定 生長因子可能涉及HTM正常微環境的維持，也可能涉及POAG的發病 機理.對分子病理學的一種深入探討源於這樣的觀察結果，即可以在人和結構(Wilson etal. (1993) Current Eye Res 12: 783-93).這些細胞骨架:支 變包括肌動蛋白微絲重組形成交聯的肌動蛋白網絡(CLANs)，而這種 結構改變可能是導致眼內高壓的最終生理學改變(Clark etal, (1993) J Glaucoma4: 183-88) 4實際上，降壓類固醇四氬可的松業已顯示可以降 低由糖皮質激素誘導的眼內高壓的眼內壓(IOP)，而且還可以抑制這些 糖皮質激素介導的HTM細胞骨架方面的改變(Clark et al. (19%) Inv Ophthal & Vis Sci 37: 805-813 ) 美國專利5,925,748， 5,916,778和5,885,776披露了與GLC1A基因突 變相關的青光眼診斷方法，以及鑑定青光眼治療的實驗方法，所迷青光 眼治療方法調節GLC1A基因編碼的MYOC蛋白活性. 'W似信號通路Wnt基因家族編碼在分化和發育過程中起關鍵作用的分泌型配體蛋 白。該家族包括至少15種脊推動物和無脊推動物基因，包括果蠅體節極 性基因W"g/ew以及一種脊推動物同系物/fl￡egra^/， Wnt的名字就是從 上述兩種基因衍生的。Wnt蛋白似乎可以使很多發育和平衡過程變得容
易。例如，脊推動物『"f/似乎在體節誘導肌節和建立中腦邊界的過程中表現積極(見McMahon and Bradley (1990) Cell 62: 1073; Ku and Melton(1993) Development 119: 1161; Stem et al. (1995) Development 121: 367S)。在脊推動物原腸胚形成過程中，『"f3a,『W5fl和『"f56在原條 中的表達是獨立而又有所重疊的。在原條區域，Wnt3a是唯一一種能夠 產生背部(體節)中胚層的Wnt蛋白，而『w"a無效等位基因的純合小 鼠沒有形成前肢的尾部體節。在脊推動物肢體建立極性方面，『"f基因 也非常重要，正如業已顯示的非脊推動物同系物w力g/ew,在昆蟲肢體發 育過程中可以建立極性。在兩種情況下，還與刺蝟蛋白(Hedgehog)家族成員有相互作用.Wnt信號通路包括多種涉及Wnt/無翅蛋白信號傳導的蛋白質，並與刺蝟蛋白發育通路緊密相聯。在果蠅中的無翅-刺謂蛋白(wingless-hedgehog) 通路中，分泌型無翅蛋白通過巻曲蛋白受體與鄰近細胞結合， 介導細胞間的相互作用。然後巻曲蛋白受體激活Dishelveled蛋白，阻斷 Zeste-white-3激酶對Armadillo蛋白(一種P-連環蛋白)的抑制作用。活 化的Armadillo蛋白可以與高遷移率組(HMG)蛋白LEF/TCF (淋巴增 強因子/T細胞因子)作用，促進細胞核表達刺蝟蛋冷f7iW基因。刺鄰蛋 白是一種分泌型蛋白質，可以通過另一個受體一一Patched蛋白與鄰近 Wnt/無翅蛋白活化細胞的細胞結合.刺稍蛋白與Patched受體的結合，激 活細胞核表達無翅蛋白，然後該蛋白分泌，進一步加強與鄰近刺蝟蛋白 分泌細胞的相互信號作用.因此，Wnt/無翅蛋白-刺稩蛋白相互信號系統 在脊推動物和非脊推動物發育過程中，使兩種鄰近細胞的分化決定更加 容易。這導致了分化界線的穗定，其中一邊組織分泌刺稩蛋白，而另一 邊組織則產生無翅蛋白。實際上，細胞表面通過影響一個細胞與另一個 細胞以及細胞外基質的差異粘附，在發育和平衡過程中起到至關重要的 作用。而且， 一旦細胞差異粘附發生，Wnt/無翅蛋白-刺蝟蛋白的過程作 用就會使鄰近細胞層之間的後續信號更加容易。這種Wnt/無翅蛋白分界對於果蠅體節和附器的產生以及哺乳動物腦 和肢體的細分非常重要(Ingham (1994) Curr Biol 4:1; Niswander et al.(1994) Nature 371: 609; Wilder and Pernmon (1995) Development 121: 477)。在非洲爪塘(Xenopus)中，眼原基和耳泡的原腸胚形成後，巻 曲蛋白-2受體(xfz2)高度表達，在雞中，Wnt基因家族中的一個特別
成員『"f"，業已顯示在晶狀體和睫狀邊緣的色素和非色素層增殖上皮中表達(Jasonietal. (1999)DevDyn215:215)。相互作用的Wnt/無翅蛋 白-刺蝟蛋白通路在正常分化的體節組織的維持方面具有作用。例如，在 人類中，體節組織p"/cAW基因的散發失能突變可以導致人類腫瘤中最常 見類型的基底細胞癌.而且，/7加c/ W基因的可遺傳突變還可導致基底細 胞痣症候群，該症候群是一種常染色體顯性遺傳病，特徵在於發育異常， 包括肋骨和顱面部改變以及惡性腫瘤(Hahnetal. (1996) Cell 85: 841; Johnson et al. (1996) Science 272: 1668)。最近，業已顯示，與哺乳動物Wnt受體巻曲蛋白同源的被稱為分泌 型或可溶性巻曲蛋白相關蛋白5(SFRP5)的蛋白質優先由脊推動物視網 膜色素上皮細胞(RPE)表達(Changet al. (1999)Hum Mol Genet 8: 575 )。 而且，另一種SFRP， SFRP2業已顯示，由內核層細胞特異性表達.結果 是視網膜的感光細胞暴露於兩種相反梯度的SFRP分子下.由於巻曲蛋 白相關蛋白不含跨膜區，它們被認為是一種分泌型、可溶性受體，通過 正常七次跨膜巻曲蛋白受體與Wnt信號系統發生作用。實際上，在血管 內皮細胞和多種上皮細胞中高度表達的一種sFRP—一FrzA可以與Wnt-l 蛋白特異性結合，從而通過巻曲蛋白受體阻斷Wnt-l信號(Dennisetal. (1999) J Cell Sci 112:3815)。3.發明內容一方面，本發明提供了確定某個研究對象是否傾向於發生青光眼的 新方法和試劑盒。在一個實施方案中，所述方法基於測定下述物質的相 對水平或活性，所述物質包括巻曲蛋白相關蛋白(FRP)、無翅蛋白(Wnt) 信號通路組分、Wnt信號激活基因或Wnt信號激活基因的基因產物.在 優選實施方案中，應用源於研究對象的小梁網細胞進行實驗。該方法包 括在適宜細胞中測定基因損傷的存在或缺如，所述基因損傷的特徵在於 具有至少下迷特徵之一(i)編碼巻曲蛋白相關蛋白(FRP-1)的基因、 Wnt信號組分或由Wnt信號激活表達的基因發生突變；(ii)FRP、 Wnt信 號組分或由Wnt信號激活表達的基因錯誤表達；(iii)FRP、 Wnt信號組分 或由Wnt信號激活表達的基因的調節啟動子存在錯誤或突變，所述錯誤 或突變導致異常表達。在特別優選實施方案中，診斷方法包括確定至少下述一種現象的存 在(a)野生型FRP、 Wnt信號組分或由Wnt信號激活表達的基因中存
在一個或多個核苷酸的缺失；(b)野生型FRP、 Wnt信號組分或由Wnt 信號激活表達的基因中存在一個或多個核苷酸的添加；(c)野生型FRP、 Wnt信號組分或由Wnt信號激活表達的基因中存在一個或多個核苷酸的 取代；(d)野生型FRP、 Wnt信號組分或由Wnt信號激活表達的基因中 存在染色體整體重排；(e)FRP、 Wnt信號組分或由Wnt信號激活表達的 基因的轉錄信使RNA (mRNA)水平發生變化；(f)FRP、 Wnt信號組分 或由Wnt信號激活表達的基因的轉錄mRNA中存在非野生型剪接模式； (g)FRP、 Wnt信號蛋白或由Wnt信號激活表達的基因的水平或活性異 常。例如，可以通過下述方法檢測基因損傷(i)提供含寡核苷酸的探針 和引物，所述寡核苷酸可以與以下核酸的正義或反義序列雜交，所述核 酸為FRP、 Wnt信號組分或由Wnt信號激活表達的基因(野生型或突變 型)，或其片段，或者與FRP、 Wnt信號組分或由Wnt倌號激活表達的 基因的天然相關5'或3'側翼序列；(ii)將探針或引物與含有源於研究對 象生物學樣本的適宜核酸混合；以及(iii)通過探針或引物與核酸雜交， 測定基因損傷的存在或缺如.在一個優選實施方案中，診斷方法和/或試 劑盒應用一套引物擴增(如通過PCR或LCR)可能包括突變的FRP、 Wnt信號組分或由Wnt信號激活表達的基因的至少一個區域，然後分析 擴增產物與正常野生型編碼序列之間存在的不同突變或基因表達水平. 在另一個優選實施方案中，診斷方法和/或試刑盒應用探針，在適宜嚴格 的條件下，測定其與生物學樣本中互補核酸序列的雜交能力，其中，含 有野生型FRP、 Wnt信號組分或由Wnt信號激活表達的基因的探針沒有 與樣本核酸進行雜交的能力，提示在樣本核酸中存在突變；或者含有突 變型FRP、 Wnt信號組分或由Wnt信號激活表達的基因的探針具有與樣 本核酸進行雜交的能力，提示在樣本核酸中存在突變。在另一個優逸實 施方案中，可以應用多種方法，包括免疫探測和生化實驗，測定FRP、 Wnt信號組分或由Wnt信號激活表達的基因編碼的蛋白質的水平或活 性。應用本文描述的實驗方法和試劑盒獲得的信息(單獨或結合其他與 青光眼發生相關的基因缺陷信息或環境因素)在確定一個無症狀個體是 否已經或者容易發生青光眼時非常重要。此外，這些信息還提供了更加 個性化的預防或治療該病的方法。
另 一方面，本發明還提供了為青光眼防治確定治療方法的體外或體 內試驗篩查測試化合物。在一個特殊優選實施方案中，該治療方法促進Wnt信號。在一個實施方案中，該方法是一個結合試驗，主要包括以下 步驟(a)形成反應混合物，包括(i) FRP或Wnt信號多肽，(ii) FRP或 Wnt信號多肽的結合配體，以及(iii)測試化合物；以及(b)測定FRP或 Wnt信號多肽與結合蛋白的相互作用。在有化合物存在的情況下，FRP 或Wnt信號多肽與結合蛋白的相關作用存在具有統計學意義的改變(增 強或抑制)，提示為Wnt信號的潛在激動劑(擬態劑或增強劑)或拮抗 劑(抑制劑)。反應混合物可以是無細胞蛋白製劑如重建蛋白混合物或 細胞裂解物、培養的細胞系統、或者含有表達結合配體的異種核酸的重 組細胞。另 一個示例實施方案提供了 一種篩檢測試化合物的試驗方法，可以 用來鑑定能夠促進或增強Wnt信號和/或基因表達的試劑，所述基因由小 梁網細胞的Wnt信號調節。在一個實施方案中，篩檢試驗方法包括將轉 染了報告基因的細胞與測試化合物混合，然後測定報告基因的表達水 平，其中，所述報告基因與啟動子操作相連，並由高遷移率組(HMG) 蛋白調節(如淋巴增強因子/T細胞因子)。報告基因可以編碼，例如產 生可檢測信號的基因產物，所述可檢測信號如顏色、螢光、發光、細胞 活性、減少細胞對營養物質的需求、細胞生長和耐藥。例如，報告基因 編碼的基因產物可以選自氯黴素乙醯轉移酶，螢光素酶，p半乳糖苷酶和 石成性;舞酸酶。另一方面，本發明描述了治療青光眼的方法，包括將適宜的細胞(如 小梁網細胞)與有效劑量的化合物混合，所述化合物可以促進小梁網基 因的表達，所述基因涉及Wnt信號，或由Wnt信號調節。優選化合物是 小分子的核酸(包括反義或三體分子以及核酶)，蛋白，肽或擬肽。特 別優選的化合物是巻曲蛋白相關蛋白(FRP)拮抗劑。特別優選的拮抗劑 是抑制或降低細胞內FRP表達水平的反義、核酶或三體分子。其他優選 FRP拮抗劑是抗體，它可以減少或抑制FRP與Wnt的結合。力口清晰。3.附圖簡述

圖1圖示了 Wnt信號傳導通路。圖l(a)顯示了基於FRP與Wnt的結
合導致的基因表達抑制。圖l(b)顯示了 Wnt刺激基因表達。Wnt與巻曲 蛋白(Fz)的結合可以激活disheveled蛋白(Dsh),該蛋白反過來防止 糖原合酶激酶3 (GSK3)與蛋白激酶C (APC)的結合，導致(3-連環蛋 白的積聚，而P-連環蛋白的積聚反過來可以使與轉錄因子、T細胞因子 (TCF)的相互作用變得更加容易，促進基因表達。4.發明詳述4丄趙總的來說，本發明基於以下發現，即巻曲蛋白相關蛋白-1 (FRP-1 ) 在青光眼患者的小梁網(TM)中上調。儘管不希望受到限制，但據認為， Wnt信號通路如圖l(b)所示在TM中發揮作用，調節小梁網細胞重要的 功能，而FRP-1可以如圖l(a)所示拮抗正常的Wnt信號，因此千擾TM細胞功能。4.2.定義為方便起見，下面給出了本說明書、實施例和後附權利要求中採用 的某些術語和短語的含義。本文所用術語"異常，，是指基因產物水平或生物活性的改變，這種 改變只存在於青光眼組織或細胞中，但不存在於非青光眼組織或細胞 中。例如，異常高水平的巻曲蛋白相關蛋白基因產物與青光眼患者青光 眼性小梁網細胞的相關性高於與正常患者非青光眼性小梁網細胞的相關 性。而且，Wnt通路組分生物活性的異常低下與正常患者小梁網細胞相 關。如用於多肽如FRP的活性的術語"異常活性"是指與野生型或天然 多肽活性不同的活性，或者與健康個體中多肽活性不同的活性。多肽活 性的異常可以是因為它較天然對應物活性更強。此外，活性異常還可以 因為它較天然對應物活性更弱，或其活性與天然對應物活性無關。活性 異常還可以是活性的改變。例如， 一種異常肽可以與不同的靶肽發生相 互作用。具有異常FRP活性的細胞可以是因為編碼FRP的基因過量表達 或表達不足。本文所用術語"激動劑"是指這樣一種製劑，它可以直接或間接增 強、補充或加強Wnt啟動的基因表達，或者由Wnt調控基因編碼的蛋白
的活性或水平，或者Wnt信號通路中的基因或蛋白。術語"等位基因"，在本文還可與"等位基因變異體"互換使用， 是指一個基因或其部分的另一種形式。等位基因佔據同源染色體的相同 位點或位置。當一個個體攜帶某基因的兩個完全相同的等位基因時，該 個體被稱為該基因或等位基因的純合子。當一個個體攜帶某基因的兩個 不同等位基因時，該個體被稱為該基因的雜合子。特定基因的等位基因 間的差異可以是一個核苷酸或幾個核苷酸，還可以包括核苷酸的取代、 缺失和插入。某基因的等位基因還可以是含有突變的基因形式。本文所用術語"拮抗劑"是指這樣一種製劑，它可以直接或間接防 止、最小化或抑制Wnt啟動的基因表達，或者由Wnt調控基因編碼的蛋 白的活性或水平，或者Wnt信號通路中的基因或蛋白。本文所用術語"結合配體"是指一種能與特定基因產物通過非共價 力相互作用的物質組合物.例如，巻曲蛋白相關蛋白基因產物的"結合 配體"包括能與巻曲蛋白相關蛋白基因mRNAs如FRP-l反義多核苷酸發 生相互作用的物質組合物，以及能與巻曲蛋白相關蛋白多肽如Wnt多肽 發生相互作用的組合物。本文所用術語"多肽的生物活性片段"是指一個全長多肽的片段， 其中該片段可以特異性模擬或拮抗相對應的全長野生型多肽的活性."細胞"、"宿主細胞"或"重組宿主細胞"是可以在本文中交互 使用的術語.應該理解，這些術語不僅指特定的個體細胞，而且指這樣 一種細胞的後代或潛在後代。因為在傳代過程中，由於突變或環境影響 會發生某些修飾，使後代細胞實際上可能與親本細胞不完全相同，但這 些細胞仍屬於本文所用術語範疇."嵌合多肽"或"融合多肽"是編碼例如一種個體FRP多肽的第一 種胺基酸序列與定義一個功能區(如多肽部分)的第二種胺基酸序列的 融合，所迷功能區與FRP多肽的任意一個功能區都不同或基本不同源。 一種嵌合多肽可能存在一種異源功能區，該功能區可能存在於也表達第 一種多肽的生物體內(雖然屬於不同的多肽)，也可能是不同種類的生 物體表達的"種間""基因間"等融合多肽結構。總的說來，融合多肽 可以用通式X-FRP-Y來表示，其中FRP代表FRP衍生多肽的一部分，X和Y可以獨立缺如或代表在生物體內與FRP序列不相關的胺基酸序列， 包括天然發生的突變。"導入複合體"應該代表一種靶向工具(如可以導致與一種基因、 蛋白、多肽或肽以高親和力與靶細胞表面結合，和/或被靶細胞的細胞或胞核增強攝取的分子)。靶向工具的示例包括固醇(如膽固醇)，月旨 質(如陽離子脂質，病毒體或脂質體)，病毒(如腺病毒，腺相關病毒 和逆轉錄病毒)或靶細胞特異性結合刑(如被靶細胞特異性受體識別的 配體)。優選的複合體在體內非常穩定，防止在靶細胞內化作用前，發 生顯著的解構.但是，在適宜的條件下，該複合體可以在細胞內裂解， 使基因、蛋白、多肽或肽以功能活性的形式釋放。眾所周知，基因可以以單拷貝或多拷貝的形式存在於個體基因組 內。這些基因副本可以完全相同，也可以存在某些修飾，包括核苷酸取 代、添加、倒位或缺失，但這些基因副本仍編碼幾乎具有相同活性的多 肽。因此，術語"編碼FRP多肽的DNA序列"是指某個個體中一個或 多個基因。而且，核苷酸序列可以在不同生物個體間存在某些差異，這 些存在差異的核苷酸序列被稱為等位基因。這些等位基因差異可能或不 會導致編碼多肽的胺基酸序列差異，但編碼的多肽仍具有相同的生物活 性."巻曲蛋白相關蛋白(FRP)"可以是與巻曲蛋白細胞外配體結合功 能區相似的分泌型蛋白家族中的任意一員。FRP也指分泌型或可溶性巻 曲蛋白相關蛋白(sFRP)，因為它們不含跨膜功能區，因此似乎可以作 為Wnt蛋白的主要陰性受'體發揮作用。有很多不同的脊推動物基因編碼 FRP，這些基因包括人分泌型巻曲蛋白相關蛋白編碼基因/^z-/ (GenBank存取號AF056087);人分泌型巻曲蛋白相關蛋白編碼基因 S^7 R5 (GenBank存取號AFl 17758);人Frz-S基因(GenBank存取號 U24163);以及非洲爪簷^V^4基因(GenBank存取號AF049908)。本文所用術語"青光眼"是指一組眼病，其特徵在於視神經變性和 視野缺損，其原因通常是由於房水回流通道受阻導致的眼內壓升高(慢 性或開角型青光眼)，或由於虹膜與晶狀體之間的壓力導致的(急性或 閉角型青光眼)。"同源"或"相同"或"相似"是指在兩種肽或兩種核酸分子之間 序列的相似性.同源性可以通過比較每一序列同一位置得到確定，為了 比較的目的，可以進行序列比對。當對比序列的某一位置被相同的鹼基 或胺基酸佔椐時，那麼這些分子在該位置相同。核酸序列間同源或相似
或相同的程度可以通過核酸序列中相同或匹配核苷酸位置的數量函數來 計算。胺基酸序列間的相同程度可以通過胺基酸序列中相同胺基酸的數 量函數來計算。胺基酸序列間的同源或相似程度可以通過胺基酸序列中 胺基酸即結構相關胺基酸的位置的數量函數來計算。兩個核酸或多肽序 列中的同源百分比可以應用本領域眾所周知的幾種數學運算方法之一進行確定(如通過BLAST序列同源軟體，該軟體可以在下迷網址獲得 http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)'"不相關"或"不同源"序列與 本發明一種FRP序列的相同程度低於40% ,儘管優選相同程度低於25%。本文所用術語"相互作用"包括在分子間可以檢測到的相互作用， 如可以應用例如酵母雙雜交試驗來檢測。術語相互作用還包括分予間的 "結合"相互作用。相互作用可以，例如是天然存在的蛋白-蛋白或蛋白 -核酸或核酸-核酸.本文所用術語"分離的"如果指核酸，如DNA或RNA，是指分別 從其他DNA或RNA中分離的分子，以天然來源的大分子形式存在。例 如，編碼一個FRP多肽的分離核酸優選包括不超過10千鹼基(kb)的基 因組DNAFRP天然緊鄰側翼核酸序列，更優選這種天然側翼序列不超過 5kb，最優選這種天然側翼序列不超過1.5kb。本文所用術語分離的還指 基本不舍細胞物質、病毒物質的核酸或肽，或在通過重組DNA技術製備 時基本不含培養基、以及在化學合成時基本不含化學前體或其他化學物 質的核酸或肽.而且，"分離的核酸"還意味著包括非天然核酸片段以 及在自然狀況下不存在的核酸片#殳。本文所用術語"分離的"還指從其 他細胞蛋白中分離的多肽，並意味著包括純化重組多肽。本文所用術語"調製，，是指上調(即激活或刺激(如通過激動作用 或加強作用))和下調(即抑制或壓制(如通過拮抗作用，減弱作用或 抑制作用)).術語"突變基因"是指一個基因的等位基因形式，該突變基因可以變.如果一個個體必須是該突變的純合子才能發生表型改變，那麼該突變被稱為隱性.如果單拷貝的突變基因就足以使個體發生表型改變，那麼該突變被稱為顯性.如果攜帶單拷貝突變基因的個體表型位於(該基 因)純合子和雜合子之間，那麼該突變被稱為共顯性.
本發明的"非人動物"包括哺乳動物，如嚙齒類動物、非人靈長類 動物、羊、狗、牛、雞、兩棲類動物、爬行動物、兔等。優選的非人動 物選自嚙齒類家族，包括大鼠和小鼠，最優選小鼠，儘管在理解和確定 可以影響例如胚胎發生和組織形成的製劑時，轉基因兩棲類動物如非洲 爪蟾屬成員以及轉基因雞也可以作為很重要的研究工具。本文所用術語 "嵌合動物"是指體內存在重組基因表達的動物，或者重組基因在動物 的某些細胞但非全部細胞表達的動物.術語"組織特異性嵌合動物，，提 示，重組基因之一在某些組織而非其他組織中存在和/或表達或受到幹 擾.本文所用術語"核酸"是指多核苷酸，如脫氧核糖核酸(DNA)， 以及在適宜情況下的核糖核酸(RNA),應該理解，作為等價物，術語 還包括從核苷酸類似物中製備的RNA或DNA類似物，並如下迷實施方 案所用，單鏈(正義或反義)和雙鏈多核苷酸。術語"與序列x^^布的核苷酸序列互補的核苷酸序列"是指序列x 的核酸鏈的互補鏈核苷酸序列.本文所用術語"互補鏈"可以與術語"互 補"互換使用。核酸互補鏈可以是編碼鏈的互補鏈，也可以是非編碼鏈 的互補鏈。當所指為雙鏈核酸時，序列x的核酸的互補鏈是指具有序列x 核酸序列鏈的互補鏈，或者具有序列x互補鏈的核苷酸序列的任意括 酸.當所指具有序列x核苷酸序列的核酸是單鏈時，該核酸的互補鏈是 具有與序列x核苷酸序列互補序列的核酸，核苷酸序列及其互補序列總 是以5，到3，的順序給出.術語"多態性"是指一個基因或其部分(如等位基因變異體)有超 過一種的形式共同存在. 一個基因的某部分，存在至少兩種不同的形式， 即兩種不同的核苷酸序列，就被稱為"基因的多態區"。多態區可以是 一個核苷酸，該核普酸在不同的等位基因中表現不同.多肽區的長度也 可以是幾個核苷酸."多態性基因"是指具有至少一個多態區的基因。 本文所用術語"啟動子"是指一個DNA序列，可以調節與啟動子操 作性連接的所選DNA序列的表達，從而影響細胞中所選DNA序列的表 達.該術語包括"組織特異性"啟動子，即只在特定細胞中(如特定組 織的細胞)影響所選DNA序列表達的啟動子.該術語還包括所謂的"瀉 露型"啟動子，該啟動子不僅調節所選DNA主要在一種組織中的表達，
而且可以導致該DNA也在其他組織表達。該術語還包括非組織特異性啟 動子和構建表達啟動子、誘導啟動子(即表達水平可以控制)。在本文中，當指含胺基酸的基因產物時，"蛋白"、"多肽"和"肽" 是可以互換使用的.術語"重組蛋白"是指本發明應用重組DNA技術製備的多肽，通常 情況下，編碼FRP多肽的DNA被插入到適宜的表達栽體中，然後再應 用該載體轉化宿主細胞，產生異源蛋白。而且，在用於重組FRP基因時， 短語"衍生於"是指包括在"重組蛋白，，含義之內，那些蛋白具有天然 FRP多肽的胺基酸序列，或者與通過突變產生的多肽相似的胺基酸序列，所述突變包括天然形式多肽的取代或缺失(包括截短).本文所用術語"小分子"是指一種組合物，其分子量小於大約5kD, 優選小於大約4kD。小分子可以是核酸，肽，多肽，擬肽，碳水化合物， 脂質或其他有機(含碳)或無機分子.很多製藥公司都擁有廣泛的化學 和/或生物學混合物文庫，通常是真菌、細菌或藻類提取物，可以應用本 發明任意一種試驗方法進行篩選，鑑定可以調製FRP或wm信號生物活 性的化合物.本文所用術語"特異性雜交"或"特異性檢測"是指本發明核酸分 子與脊推動物優選FRP基因的至少大約6， 12, 20， 30， 50， 100， 150, 200， 300， 350， 400或425個連續核普酸雜交的能力。在本說明書中所用的遺傳學術語"轉錄調控序列"是指DNA序列， 如起始倌號、增強子和啟動子，可以誘導或調控與其操作性連接的蛋白 編碼序列的轉錄.本文所用術語"轉染"是指如通過表達栽體，通過核酸介導的基因 轉移將核酸導入受體細胞.本文所用術語"轉化"是指一個過程，在該 過程中> 細胞的基因型由於細胞攝取外源性DNA或RNA而發生改變， 並且，例如，轉化細胞表達重組形式的FRP多肽，或者，在反義表達轉 移基因的情況下，天然形式的FRP多肽的表達受到破壞。本文所用術語"轉基因，，是指業已導入到細胞中的核酸序列(編碼， 如FRP多肽之一，或反義轉錄物).轉基因可以與其導入的轉基因動物 或細胞部分或完全異源，即不同，或者與其導入的轉基因動物或細碼的 內源性基因同源，但是該基因應該被設計成插入或被插入到動物基因組 中，插入方式應該可以改變其插入細胞的基因組(如，它可以在某位點
插入，使之與天然基因不同，或者它的插入可以導致基因敲除)。轉基 因還可以游離基因的形式存在於細胞中。轉基因還可以包括一個或多個 轉錄調控細胞和其他核酸，如內含子，它們對於所選核酸的最優化表達 可能是必需的."轉基因動物，，是指任何動物，優選非人哺乳動物、鳥類或兩棲類 動物，在這些動物中，動物的一個或多個細胞含有通過人為千預導入的 異源核酸，如通過本領域眾所周知的轉基因技術。將核酸導入細胞，通 過周密的基因操作直接或間接導入前體細胞，如通過微注射或注射重組病毒。術語基因操作不包括經典雜交，或體外受精，而是主要指重組DNA 分子的導入。該分子可以整合到染色體中，也可以是染色體外的可複製 DNA。本丈所用術語"治療，，意欲包括病況或疾病的至少一個症狀的治癒 或改善.術語"栽體"是指能夠將與之連接的另一核酸進行轉移的核酸分子。 優選栽體的一種類型是游離基因，即能夠在染色體外進行複製的核酸.酸:能夠指導與它們操作';連接的基因表達的栽體在本文被稱為"表達栽體"。總的說來，在重組DNA技術中應用的表達栽體的常用形式是"質 粒"，所述質粒通常指環狀雙鏈DNA環，以栽體的形式不會與染色體結 合。在本說明書中，"質粒"和"栽體"可以交互使用，因為質粒是最 常用的栽體形式，但是，本發明意欲包括其他形式的表達載體，這些載 體可以發揮同等功效，並在本領域眾所周知.術語"野生型等位基因"是指一個基因的等位基因，當該基因以雙 拷貝形式存在於個體時，導致野生型表型. 一個特定基因可以有幾種不 同的野生型等位基因，因為基因中某些核苷酸的改變不會影響一個個體 的表型，所述個體攜帶兩個拷貝的核苷酸發生變化的基因。"Wnt信號通路組分"是指涉及Wnt信號通路的蛋白或蛋白編碼基 因。這些蛋白的示例包括Wnt，巻曲蛋白(Fz) ， disheveled (Dsh)， 糖原合酶激酶3 (GSK3)，蛋白激酶C (APC) , (3-連環蛋白以及高遷 移率組(HMG)蛋白(如LEF/TCF (淋巴增強因子/T細胞因子))。-"Wnt蛋白"是指由一大組哺乳動物基因包括Wnt3a,Wnt5a,Wnt5b編碼的蛋白。5.3.音光眼的預後和診斷基於本文公開的發現，即某些青光眼患者FRP水平升高，可以發展 出多種音光眼診斷方法。某些診斷方法可以檢測核酸序列中存在的突 變，這些突變可以導致不恰當的高水平FRP。這些診斷方法可以基於已 知的人FRP cDNA核酸序列或編碼的胺基酸序列進行開發，所述核酸序 列如圖1所示，所迷胺基酸序列如圖2所示。其他診斷方法可以基於人 FRP的基因組序列或調控FRP表達的基因序列進行開發。另外一些診斷 方法可以基於在mRNA水平的FRP基因表達水平的變化進行開發.含有 人FRP基因組序列的質粒可以從NIH-MGC-95文庫中獲得，其克隆編號 為NM-003012。其他診斷方法還可檢測Wnt信號蛋白或編碼Wnt信號蛋白的基因的 活性和水平。例如，診斷方法可以這樣開發，即檢測不適宜的低水平Wnt 信號活性，包括例如，導致Wnt信號組分功能發生異常的突變，所述 Wnt信號組分包括巻曲蛋白(Fz) ， disheveled (Dsh)，糖原合酶激 酶3 (GSK3)，蛋白激酶C (APC) , P-連環蛋白，高遷移率組(HMG) 蛋白(如LEF/TCF(淋巴增強因子/T細胞因子))以及刺蝟蛋白(Hh). 此外，還可應用基於非核酸的技術，檢測任何Wnt信號蛋白量或特異性 活性的改變.目前可以應用多種方法檢測基因和基因產物的異常水平或活性。例 如，有很多方法可以用來檢測人多態性位點的特異性等位基因。檢測特 異性多態性等位基因的優選方法部分有賴於該多態性的分子特徵。例 如，多態性位點的多種等位基因形式可能只是DNA中單個鹼基對的差 異.這些單核苷酸多態性(或SNPs)是遺傳變異的主要貢獻者，包括所 有已知多態性的大約80%,它們在人類基因組中的密度預計平均為 1/1000鹼基對，SNPs是最常見的二等位基因一一僅以兩種不同的形式存 在(儘管在理論上可能在一個SNP中存在高達4種不同的形式，對應於 DNA中存在的4種不同的核苷酸鹼基).但是，SNPs是比其他多態性 更穩定的突變，使它們適於在標記物和未知變異體間存在連鎖不平衡時 進行相關研究，所迷未知變異體可以用來繪製致病突變圖謙。此外，由 於典型的SNPs僅有兩個等位基因，可以應用簡單的增/減試驗方法 (plus/minus assay)而不是長度測定法進行基因型分析，使它們更容易 進行自動分析。
有多種方法可以用來檢測個體中存在的特定單核苷酸多態性。該領域的進步業已提供了準確、簡便而且便宜的大規模SNP基因型分析技 術。最近，例如，業已披露了幾種新技術，包括動態等位基因特異性雜 交(DASH),微板試驗診斷凝膠電泳(MADGE),焦磷酸的螢光檢測， 寡核苷酸特異性結合，TaqMan系統以及多種DNA "晶片"技術，如 AffymetrixSNP晶片。這些方法需要擴增耙基因區，典型的通過PCR進 行擴增.其他新開發的方法基於通過侵入性裂解產生小信號分子，然後 進行質譜分析或固定掛鎖探針和滾環擴增，可能會逐漸消除對PCR的需法.應該理解，本發明的方法包括所有這些可用方法。業已發展出幾種方法，使單核苷酸多態性的分析變得容易。在一個 實施方案中，可以應用專門的耐核酸外切酶的核苷酸檢測單鹼基多態 性，所迷耐核酸外切酶的核普酸如Mundy， C.R.(美國專利號4,656,127) 所披露。根據該方法，將與緊鄰多態性位點3，端的等位基因序列互補的引物與源於特定動物或人的靶分子進行雜交。如果靶分子上的多態性位 點含有與耐特定核酸外切酶的核苷酸衍生物互補的核苷酸，那麼該衍生物就會整合到雜交引物的末端。這種整合使引物也耐核酸外切酶，並因 此可以進行檢測.因為樣本中耐外切酶的衍生物特點已知，因此發現引 物變得耐核酸外切酶就提示，靶分子多態性位點中存在的核苦酸與反應 中應用的核苷酸衍生物互補。該方法的優點在於它不需要測定大量無關 序列數據。在本發明另一個實施方案中，應用基於解決方案的方法來檢測多態 性位點核苷酸的特點。Cohen， D, et al (法國專利2,650,840; PCT申請號 WO91/02087),如Mundy在美國專利號4,656,127中披露的方法，應用 的引物與緊鄰多態性位點3'端的等位基因序列互補。該方法應用標記的 二脫氧核苷酸衍生物測定該位點的核苷酸特點，如果該二脫氣核苷酸衍 生物與多態性位點的核苷酸互補，它就會整合到引物末端.Goelet, P. etal. (PCT申請號92/15712)描述了另一種被稱為Genetic Bit Analysis或GBAtm的方法。Goelet， P. et al.的方法應用標記終止子和引 物的混合物，所迷引物與多態性位點的3，端序列互補.因此，可以通過 預測靶分子多態性位點中存在的核苷酸測定整合的標記終止子，所述核 苷酸與標記終止子互補。與Cohen etal(法國專利2,650,840; PCT申請號
WO91/02087)所迷方法不同，Goelet,P. etal.的方法優選異相試驗，在試 驗中，引物或靶分子被固定在固相基質上。最近，業已描迷了幾種在DNA中檢測多態性位點的引物指導性核苷 酸整合法(Komher， J.S. et al., Nucl. Acids, Res. 17: 7779-7784 (1989); Sokolov. B.P., Nucl. Acids. Res. 18: 3671 (1990); Syvanen， A.-C.， et al.， Genomics 8: 684-692 (19卯)；Kuppuswamy， M.N, et al,， Proc. Natl. Acad Sci. (U.S.A.) 88: 1143-1147 (1991); Prezant, T.R. etal.， Hum. Mutat. 1: 159-164 (1992); Ugozzoli， L. et al.， GATA 9: 107-112 (1992); Nyren, P. et al.， Anal. Biochem. 208:171-175 (1993))。這些方法與GBAtm不同的地方在 於，它們全都有賴於標記脫氧核苷酸整合到多態性位點鹼基存在差異的 部位.在這種形式下，因為信號的強弱與整合脫氧核苷酸的數量成正比， 因此，發生於相同核苷酸runs的多態性導致的信號與run長度成正比 (Syvanen， A. -C.， et al., Amer. J, Hum. Genet. 52: 46-59 (1993)),對於導致蛋白翻譯永久性終止的突變，蛋白截短試驗(PTT)提供 了 一種有效的診斷方法(Roest, et al.， (1993) Hum. Mol. Genet. 2: 1719-21; van der Luijt, et al.， (1994) Genomics 20: 1~4).對於PTT,首先從可用組 織中分離RNA，然後進行逆轉錄，並通過PCR擴增感興趣片段.然後將 逆轉錄PCR的產物作為模板，進行巢式PCR擴增，所用引物含有RNA 多聚酶啟動子和啟動真核細胞翻譯的序列.感興趣區域擴增後，整合到 引物中的獨特功能區可以進行隨後的體外轉錄和PCR產物翻譯。翻譯產 物進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳，出現截短的肽信號提示存 在導致蛋白永久性終止的突變，在該技術的改良方案中，當感興趣靶區 域源於羊一外顯子時，可以應用DNA (而非RNA)作為PCR模板。可以應用任何類型的細胞或組織獲得核酸樣本，用於本文描迷的診 斷方法.在一個優選實施方案中，DNA樣本可以獲取自體液，例如應用 已知技術(如靜脈穿刺抽血)獲取自血液，或唾液.此外，核酸試驗還 可在乾燥樣本(如毛髮或皮膚)中進行.診斷方法還可以直接在組織切片(固定和/或冰凍)上原位進行，所 迷組織切片源於活檢或切除術獲得的患者組織，這樣就不需要進行核酸 純化了。在這些原位方法中，核酸製劑可以用作探針和/或引物(見例如， Nuovo, G.J.， 1992， PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY)。
除了這些主要集中於一種核酸序列檢測的方法外，在這些檢測方案中還可評價某些特徵。例如，可以應用差異顯示方法、Northern分析和/ 或RT-PCR產生指紋特徵.一種優選檢測方法是等位基因特異性雜交法，所用探針與Wnt信號 組分的至少一個等位基因區域重疊，並在突變或多態性區域周圍存在大 約5， 10， 20， 25或30個核苷酸，所述Wnt信號組分可以提示青光眼. 在本發明一個優選實施方案中，將幾種能夠與涉及青光眼的等位基因變 異體特異性雜交的探針粘附於固相支持物上，如"晶片"(能夠支持高 達大約250,000個寡核苷酸)。可以通過多種方法使寡核苷酸與固體支持 物結合，包括平版印刷術.應用含有寡核苷酸的這些晶片進行突變檢測 分析的方法，又被稱為"DNA探針檢測"，如CronineUl. (1996)Human Mutation 7: 244所述。在一個實施方案中，晶片含有一個基因至少一個多 態性區城的所有等位基因變異體。然後將固相支持物與測試核酸混合， 檢測與特異性探針的雜交.因此，在一個簡單的雜交試驗中，可以鑑定 一個或多個基因的很多等位基因變異體的身份.這些技術在分析前還包括核酸擴增步驟.擴增技術對於本領域技術 人員來說眾所周知，包括但不限於克隆，多聚酶鏈反應(PCR)，特異 性等位基因多聚酶鏈反應(ASA)，連接酶鏈反應(LCR),巢式多聚 酶鏈反應，自主序列複製系統(Guatelli， J.C. et al., 19卯，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878)，轉錄擴增系統(Kwoh， D.Y. et al.， 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177),以及Q-J3複製酶(Lizardi， P.M etal., 1988, Bio/Technology 6: 1197)。擴增產物可以多種方式進行試驗分析，包括大小分析，大小分析後 的限制性酶切分析，在反應產物中探測特異性標記寡核苷酸引物，等位 基因特異性寡核苷酸(ASO)雜交，等位基因特異性5，外切酶檢測，測 序，雜交等。基於PCR的檢測方法包括同時多重擴增多種標記物.例如，本領域 眾所周知，可以選擇PCR引物產生PCR產物，這些產物在大小上互不重 疊，可以同時進行分析，此外，還可以應用不同標記的引物擴增不同的 標記物，使每一種產物可以區別檢測.當然，基於雜交的檢測方法使樣 本中的多種PCR產物可以進行區別檢測，其他技術也是本領域已知的， 允許對多種標記物進行多重分析。
在一個僅為舉例說明的實施方案中，方法包括以下步驟(i)從患者 中收集細胞樣本，(U)從樣本細胞中分離核酸(例如基因組，mRNA或兩 者的混合物)，(iii)將核酸樣本與一種或多種引物混合，在能夠發生雜交 和等位基因擴增的條件下，所迷引物能與提示青光眼的Wnt信號組分的 至少一個等位基因的5'和3，雜交，以及(iv)檢測擴增產物。這些檢測方案 對於分子數量非常低的核酸分子的檢測尤為重要。在研究試驗的優選實施方案中，通過限制性酶切圖語的變化可以鑑 定提示音光眼的Wnt信號組分的異常水平或活性。例如，分離、擴增(任 選)樣本和對照DNA，然後應用一種或多種限制性內切酶消化，通過凝 膠電泳測定片段長度。在另一個實施方案中，可以應用本領域已知的多種測序反應直接進 行等位基因測序。測序反應示例包括那些基於由Maxim and Gilbert ((1977) Proc. Natl Acad Sci USA 74:560)或Sanger ( Sanger et al. (1977) Proc. Natl Acad Sci USA 74:5化3 )開發的技術。還應該考慮，在進行研究 試驗時(見，例如Biotechniques (1995) 19: 448),可以應用多種自動測 序方法，包括質鐠測序(見例如PCT公開內容WO94/16101;Coheneta1. (1996) Adv Chromatogr 36: 127-162; and Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol38: 147-159).很明顯，本領域技術人員應該知曉，在某些實 施方案中，測序反應只需檢測一個、兩個或三個核酸鹼基的發生。例如， 可以進行A-Track等，例如在只檢測一個核酸時.在另一個實施方案中，可以應用裂解製劑保護劑(如核酶，羥胺或 四氣化鋨聯合哌咬)來檢測RNA/RNA或RNA/DNA或DNA/DNA雜合 雙鏈中的錯配鹼基(Myers, etal, (1985) Science 230: 1242)。通常說來， "錯配裂解，，領域的技術始於雜合雙鏈的提供，所述雜合雙鏈由含有野 生型等位基因和樣本的雜交(標記)RNA或DNA形成。然後應用能夠 裂解雙體分子中單鏈區域的製劑處理該雙鏈雙體分子，在對照和樣本鏈 之間由於鹼基錯配會有這樣的單鏈區域存在.例如，RNA/DNA雜交分子 可以應用RNase來處理，而DNA/DNA雜交分子則可應用SI核酶處理， 消化錯配區域，在其他實施方案中，DNA/DNA或RNA/DNA雙體分子可 以應用羥胺或四氧化鋨聯合哌啶來處理，消化錯配區域.消化錯配區域後，在變性聚丙烯醯胺凝膠上通過分子大小分離消化獲得的物質，確定 突變位點.見，例如Cotton etal (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85: 4397;
and Saleeba et al (1992) Methods Enzymol. 217: 286-295。在一個優選實施 方案中，對照DNA或RNA經標記，便於檢測，在另一個實施方案中，應用能夠在雙鏈DNA中識別錯配鹼基的一種 或多種蛋白(即所謂的"DNA錯配修復"酶)用於錯配裂解反應。例如， 大腸桿菌的mutY酶可以裂解G/A錯配中的A,而源於Hela細胞的胸苷 DNA糖基化酶可以裂解G/T錯配中的T ( Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662).根據一個示例實施方案， 一種適宜探針可以與源於測 試細胞的cDNA或其他DNA雜交。然後應用DNA錯配修復酶處理該雙 體分子，應用電泳等策略檢測如果可能有的裂解產物。見，例如美國專 利號5,459,039。在另一個實施方案中，可以應用電泳遷移率的變化鑑定可以提示青 光眼的Wnt信號組分的異常水平或活性。例如，可以應用單鏈構象多態 性(SSCP)在突變和野生型核酸之間檢測電泳遷移率的差異(Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86: 2766，還見Cotton (1993) Mut汰t Res 285: 125-144;肌d Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9: 73-79)。樣本和 對照位點等位基因的單鏈DNA片段變性再復性。單鏈核酸的二級結構會 根據序列而有所變化，導致的電泳遷移率的改變可以檢測甚至單個鹼基 的變化。DNA片段可以標記，也可以應用標記探針進行檢測.方法的敏 感性可以通過應用RNA (而非DNA)得到加強，在RNA中，二級結構 對序列變化更敏感。在一個優選實施方案中，研究方法根據電泳遷移率 的變化，應用雜合雙體分析來分離雙鏈雜合雙體分子(Keenetal. (1991) Trends Genet 7:5 ),在另一個實施方案中，應用變性梯度凝膠電泳法(DGGE)在含有梯 度變性聚丙烯醯胺凝膠上檢測等位基因的遷移(Myers et al. (1985) Nature 313:495)。當應用DGGE作為分析方法時，DNA應經修飾，以確保它 沒有完全變性，例如通過PCR添加一個大約40 bp的高熔富GC的GC髮夾。在另一個實施方案中，在變性製劑梯度中應用溫度梯度，鑑定對 照和樣本DNA的遷移率差異(Rosenbaum and Reissner (198" Biophys Ch柳265: 12753 )。檢測等位基因的其他示例技術包括但不限於選擇性寡核苷酸桌交， 選擇性擴增或選擇性引物延伸。例如，製備寡核苷酸引物，該引物中含 有的已知突變或核苷酸變異(如等位基因變異體)被置於引物中夾，然
後在只允許完全匹配雜交發生的條件下將引物與靶DN A進行雜交(S aiki et al, (1986) Nature 324: 163; Saiki et al (1989) Pro. Natl Acad. Sci USA 86: 6230)。這些等位基因特異性寡核苷酸雜交技術可以在下迷情況下用來 檢測一個突變或多態性區域，所迷情況包括當寡核苷酸附著於雜交膜並 與標記耙DNA進行雜交時，寡核苷酸與經PCR擴増的靶DNA或很多不 同突變或多態性區域進行雜交.此外，有賴於選擇性PCR擴增的等位基因特異性擴增技術可以與本發明聯合使用.作為特異性擴增引物的寡核苷酸可以在分子的中心部分 或引物的3'端盡頭攜帶感興趣突變或多態性區域(這樣擴增就有賴於區 別雜交)(Gibbsetal (1989)Nucleic Acids Res. 17:2437-2448)，在適宜 的條件下，可以防止錯配的發生，或者降低多聚酶延伸反應(Prossner (1993)Tibtech 11: 238) 此外，還需要在突變區域引入新的限制性酶切 位點，建立基於裂解的檢測方法(Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1)。可以預見，在某些實施方案中，可以應用T叫連接酶進行擴增 (Barany(1991)Proc.Nat1. Acad. SciUSA88: 189)'在這些情況下，連 接只在下述條件下發生，即5，序列的3，端完全匹配，這樣在特定位點檢 測已知突變是否存在就可以通過檢測擴增的存在或缺如來進行。在另一個實施方案中，等位基因變異體的鑑定通過應用寡核苷酸連 接試驗(OLA)來進行，如下述文獻所述，如美國專利號4,998,617，以 及Landegren， U. et al. ( 1988) Science 241: 1077-1080。在OLA方法中， 應用兩個設計能夠與靶單鏈鄰接序列雜交的寡核苷酸.其中一個寡核苷 酸與分隔標記連接，如，生物素化分隔標記，另一個進行可檢測標記. 如果在靶分子中存在完全互補序列，寡核苷酸將會雜交，這樣他們的末 端臨近並形成連接底物.連接允許應用親和素或其他生物素配體使標記 的寡核苷酸恢復。Nickerson， D.A. et al.描述了 一種結合PCR和OLA的核 酸檢測試驗方法(Nickerson, D.A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923-27)。在該方法中，應用PCR獲得扭DNA的指數級擴增，然 後應用OLA檢測擴增產物。業已開發出幾種基於這種OLA的技術，可以用來檢測提示青光眼的 Wnt信號組分的異常水平或活性。例如，美國專利號5,593,826披露亇一 種OLA方法，應用具有3，氨基的寡核苷酸和5，磷酸化寡核苷酸形成一個 含有氨基磷酸酯連接的結合物。在Tobe et al( (1996) Nucleic Acids Res 24:3728)描迷的另一種OLA變異方法中，OLA與PCR的結合可以在單一 微升孔中測定兩種等位基因類型。通過將每種等位基因特異性引物標記 一個獨特的半抗原，即地高辛和螢光素，然後應用半抗原特異性抗體檢 測每個OLA反應，所述抗體應用不同的報導酶、鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶標記。該系統可以通過產生兩種不同顏色，以高產量形式檢測兩 種等位基因。本發明的另一個實施方案針對可以檢測青光眼易感性的試劑盒。該 試劑盒含有一種或多種寡核苷酸，包括能夠與至少一個Wnt信號組分的 5'和3'雜交的5'和3，寡核苷酸。為了便於隨後的分析，產生的PCR產物 應該大小適宜，PCR擴增寡核苷酸應該能夠與25-2500個分離鹼基對雜 交，優逸大約100-500個分離鹼基。為了用於試劑盒，寡核苷酸可以是多種天然和/或合成組合物的任意 一種，如合成寡核苷酸，限制性片段，cDNA,合成肽核酸(PNAs)等， 試驗試刑盒還可應用標記寡核苷酸，使試驗中的鑑別工作變得更加容 易.可以採用的標記示例包括放射性標記，酶，螢光化合物，鏈黴親和 素，親和素，生物素，磁性等分，金屬結合等分，抗原或抗體等分等。試刑盒還可以任選包括DNA取樣方法.DNA取樣方法在本領域技 術人員中眾所周知，包括但不限於底物，如濾紙等；DNA純化試刑如 NucleonTM試刑盒，裂解緩沖液，蛋白酶溶液等；PCR試刑如10x反應緩衝液，熱穩定多聚酶，dNTPs等；以及等位基因檢測方法如限制性酶， 等位基因特異性寡核苷酸，來自乾燥血液用於巢式PCR的變性寡核苷酸引物.5.4. I脅治M輛驗她本發明還提供了答定青光眼治療藥物的篩檢方法。青光眼的治療藥 物可以是任何類型的化合物，包括蛋白、肽、擬肽、小分子和核酸。核 酸可以是，例如基因、反義核酸、核酶或三體分子.本發明的音光眼治 療藥物可以是Wnt信號組分活性的激動劑，或者是FRP或Wnt信號拮抗 活性的拮抗劑.優選的激動劑包括Wnt信號組分或者表達由Wnt信號調 控的基因和蛋白。本發明還提供了鑑定青光眼治療藥物的篩檢方法，所述治療藥物能 夠與FRP蛋白結合，進而幹擾其對Wnt信號的阻斷，或者治療藥物能夠 與Wnt信號組分結合，進而激動Wnt信號組分的活性。
根據化合物類型和所需化合物活性，可以應用多種試驗方法鑑定本 發明化合物。下面披露的是可以用來鑑定青光眼治療藥物的至少一些方法。根據基於小梁網基因活性的Wnt信號，本領域技術人員可以設計其 他鑑定青光眼治療藥物的試驗方法。 5.4.1.無細胞試驗方法可以應用無細胞試驗方法鑑定能夠與FRP， Wnt信號組分或其配體 發生相互作用的化合物，這樣的化合物能夠，例如修飾FRP， Wnt信號 組分或其配體的結構，進而影響其活性。無細胞試驗方法還可用來鑑定 能夠調節FRP或Wnt信號組分與結合配體相互作用的化合物。在一個優 選實施方案中，鑑定這些化合物的無細胞試驗方法主要包括反應混合 物，該反應混合物在有或沒有結合配體存在的情況下，含有FRP或Wnt 信號組分以及測試化合物或測試化合物庫。測試化合物可以是，例如結 合配體衍生物，如生物滅活把肽，或小分子.因此，本發明的一個示例篩檢試驗方法包括以下步驟，將FRP、 Wnt 信號組分或其功能片段、或者結合配體與測試化合物或測試化合物庫混 和，然後檢測複合物的形成.為了便於檢測，可以將分子用一種特異性 標記物進行標記，將測試化合物或測試化合物庫用另 一種不同的標記物 進行標記，測試化合物與FRP、 Wnt信號組分或其功能片段、或其結合 配體的相互作用可以在孵育步驟和清洗步驟後，通過測定兩種標記的水 平進行檢測。在清洗步驟後，存在兩種標記提示有相互作用。分子間相互作用還可應用實時BIA (生物分子相互作用分析， Pharmacia Biosensor AB)進行鑑定，該方法檢測表面胞質團共振(SPR), 這是一種光學現象.檢測有賴於大分子在生物特異性界面上質量濃度的 變化，不需要對反應物進行標記。在一個實施方案中，測試化合物庫可 以固定在傳感器表面上，例如，形成一個流動細胞墻。然後，含有FRP、 Wnt信號組分、其功能片段、或其結合配體的溶液持續流過傳感器表面. 在信號記錄儀上顯示的共振角變化就會提示相互作用的發生，該技術在 例如Pharmacia編寫的BIAtechnology用戶手冊中有進一步詳細闡述。本發明的另一個示例篩檢試驗方法包括以下步驟(a)形成反應混合 物，包括(i)FRP或Wnt信號多肽，(ii)其結合配體，以及(iii)測試化合 物；以及(b)測定FRP或Wnt信號多肽與結合蛋白的相互作用。如本文 所迷，FRP或Wnt信號組分與結合配體可以重組製備，從來源中純化， 如血漿，或者化學合成。在有測試化合物存在的情況下，相對於沒有測試化合物存在的情況，FRP或Wnt信號組分與結合蛋白的相關作用存在 具有統計學意義的改變(增強或抑制)，提示該測試化合物為FRP或這種試驗方法的化合物可以同時混和.此外，FRP或Wnt信號組分可以 首先與測試化合物混和一段適宜時間，然後將結合配體加入反應混合 物。化合物的效果可以通過產生的劑量反應曲線來評價，該劑量反應曲 線數據通過應用不同濃度的測試化合物獲得。而且，還應進行對照試驗， 提供用於對比的基線值.在對照試驗中，將分離或純化的FRP或Wnt信 號組分加入含有FRP結合配體或Wnt信號組分結合配體的組合物中，然 後在沒有測試化合物的條件下，定量檢測複合物的形成.可以通過多種技術檢測FRP蛋白與FRP結合配體的複合物形成，復 合物形成的調製可以應用，例如可檢測標記蛋白，如放射標記、螢光標 記或酶標記的FRP、 Wnt信號組分或結合配體，通過免疫試驗或者色語法進行定量檢測，典型地，需要固定FRP、 Wnt信號組分或其結合配體，這樣可以使 複合物與一種或兩種未結合蛋白的分離變得更加容易，還可使試驗可以 自動進行，FRP或Wnt信號組分與結合配體的結合可以在任何適宜裝栽 反應試刑的容器中進行.示例包括微量滴定板，試管和微量離心管。在 一個實施方案中，提供的融合蛋白增加了一個功能區，使蛋白可以結合 到基質上.例如，谷光甘肽-S-轉移酶融合蛋白可以吸附到谷光甘肽 sepharose珠(Sigma Chemical, St. Louis, MO)或谷光甘肽衍生性微量滴 定板上，然後再與結合配體例如35S標記的結合配體，以及測試化合物 結合，並在能夠形成複合物的條件下醉育混合物，例如，在生理狀態的 鹽和pH的條件下，儘管可能需要稍微更嚴格一些的條件。孵育後，清洗 珠子，去除任何未結合標記，基質固定，直接進行放射標記的測定(如 將珠子置於閃爍劑中)，或者在隨後將複合物分離後，在上清中測定放 射標記。此外，從基質中分離複合物，SDS-PAGE分離，然後應用標準 電泳技術如下述實施例所述，從凝膠中定量珠子部分存在的FRP或Wnt 信號組分或結合配體的水平.其他將蛋白質固定於基質上的技術也可用於本研究試驗方法，例 如，可以利用生物素與鏈黴親和素的結合，固定FRP， Wnt信號組分或 其同類結合配體，例如，可以應用本領域眾所周知的技術(如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals,Rockford，IL),從生物素-NHS (N-羥基-琥珀 醯亞胺)中製備生物素化的FRP或Wnt信號組分，然後將之固定於鏈黴 親和素包被的96孔板中(Pierce Chemical)。此外，能與FRP或Wnt 信號組分起反應的抗體也可加入平板孔中，通過抗體結合可以將FRP或 Wnt信號組分固定於孔中。如上所述> 在有FRP或Wnt信號組分存在的 平板中孵育FRP或Wnt信號組分、結合蛋白和測試化合物製劑，定量孔 中形成的複合物的量。除了上述檢測GST-固定複合物的方法外，檢測這 些複合物的示例方法還包括免疫檢測複合物法和酶聯試驗，前者應用能 與FRP或Wnt信號組分結合配體起反應的抗體，或者能與FRP或Wnt 信號組分蛋白起反應而且能與結合配體竟爭的抗體；後者有賴於檢測與 結合配體相關的酶活性，可以是內在活性，也可以是外在活性。在後述 情況下，酶可以與結合配體化學結合，也可以與其以融合蛋白的形式出 現.為了舉例說明，結合配體可以與辣根過氣化物酶化學交聯，也可以 與其基因融合，複合物中多肽的量可以應用酶的發色底物，如3,3'-二氨 基聯苯胺四鹽酸鹽或4-chloro-l-napthol來評價。同樣，可以提供含有多 肽和谷光甘肽-S-轉移酶的融合蛋白，然後應用l-氯-2，4-二硝基苯檢測 GST活性來定量形成的複合物。對於有賴於免疫檢測法的複合物中一種蛋白的定量過程，可以應用 抗該蛋白的抗體。此外，複合物中待檢測的蛋白質還可能以融合蛋白的 形式成為"抗原決定簇標記"，所述融合蛋白除了 FRP或Wnt信號組分 序列外，還包括第二種多肽，其抗體可以容易地獲得(例如通過商業途 徑).例如，應用針對GST等分的抗體，上述GST融合蛋白就可以用來 定量結合.其他有用的抗原決定銕標記包括myc抗原決定簇(如見Ellison etal, (1991) J Biol Chem 266: 21150-21157)，以及pFLAG系統 (International Biotechnologies, Inc.)或pEZZ蛋白A系統(Pharmacia, NJ)，所述myc該抗原決定簇包括源於c-myc的IO個殘基的序列。無細胞試驗方法還可用來鑑定能夠與FRP或Wnt信號組分發生相互 作用以及能夠調製其活性的化合物，因此，在一個實施方案中，將FRP 或Wnt信號組分與測試化合物混和，然後監測FRP或Wnt信號組分的催化活性，在一個實施方案中，根據本領域已知方法，檢測FRP或Wnt信 號組分與靶肽結合的能力.
5.4.2.基千細胞的試瞼方法除了如上所述的無細胞試驗方法，本發明提供的FRP蛋白還使基於 細胞的試驗方法的產生變得容易，如鑑定小分子激動刑或拮抗劑。在一 個實施方案中，將細胞膜外表面表達FRP蛋白的細胞與測試化合物單獨 孵育，或者與測試化合物以及已知能夠與FRP發生相互作用的分子共同 釁育，然後應用例如微生理儀檢測FRP與測試化合物之間的相互作用 (McConnelletal. (1992) Science 257: 1906) 。 FRP與測試化合物之間的 相互作用可以通過微生理儀檢測培養基中酸度的變化來進行。在優選實 施方案中，本發明基於細胞的試驗方法應用的人類細胞源於正常或青光 眼患者的眼組織小梁網。人類小梁網細胞的培養增殖允許在可重複實驗條件下進行該類獨特 細胞的結構和功能特性研究。人類小梁網細胞可以從小梁網組織粉碎的 外植體中有效生長，而且培養細胞可以在體外通過多種途徑維持未培養 小梁網細胞獨特的超微結構特徵.小梁網細胞擁有廣泛的生化和結構特 徵，這些特徵對於維持房水回流通路非常重要。這些特徵包括小梁網細 胞生長成為內皮細胞單層，細胞表面呈非血栓性，產生血漿酶原激活因 子，活躍的吞噬作用，以及合成粘多糖、膠原、纖連蛋白和其他結締組 織元素的能力.透明質酸酶和其他溶酶體酶的存在強調，人小梁網細胞 能夠代謝透明質酸和其他細胞外物質。體外小梁網細胞損傷的潛在機制 可以通過下述手段進行檢驗，包括評價例如通路延長、過氧化物暴露和 細胞形態雷射處理的影響.基於小梁網細胞或其他類型細胞的試驗方法還可用來鑑定化合物， 這些化合物可以調製FRP基因的表達，調製FRPmRNA的翻譯，或者調 制FRPmRNA或蛋白的穩定性，因此，在一個實施方案中，能夠產生FRP 的細胞，如小梁網細胞與測試化合物共同孵育，檢測細胞培養基中產生 的FRP的量，並與沒有與測試化合物共同孵育的小梁網細胞產生的量進 行比較。化合物對FRP的特異性可以通過多種對照分析進行確證，如檢 測一種或多種對照基因的表達。測試化合物包括小分子，蛋白和核酸。特別是，該方法可以用來測 定FRP反義分子或核酶的功效，在另一個實施方案中，應用與FRP基因啟動子至少一個部位操作性 連接的報導基因，通過轉染實驗，測試化合物對FRP基因轉錄的作用。
基因的啟動子區域可以應用本領域已知方法從例如基因組文庫中分離。報導基因可以是編碼易於定量的蛋白質的任何基因，如螢光素酶或CAT 基因，這些基因本領域眾所周知.在一個優選實施方案中，報導基因是能夠被Wnt信號轉錄激活的天 然或合成基因.例如，在Wnt誘導下，鋸齒蛋白(engrailed)基因被激 活。而且，鋸齒蛋白表達的增加導致刺蝟蛋白基因的誘導轉錄，使刺蝟 蛋白基因在Wnt的作用下也被激活。最後，能夠由核LEF (tcf)/p-連環 蛋白激活的合成報導基因也可以成為衡量Wnt誘導的敏感報導基因.如本文所述，本發明還涉及通過上述篩檢試驗鑑定的新製劑及其治 療應用。5.5.治疔疾病的方法"青光眼治療藥物"可以是拮抗劑，也可以是激動劑，可以是上述 任何適宜製劑，包括應用本文提供的藥物篩檢方法鑑定的分離的多肽， 基因治療構建物，反義分子，擬肽，小分子，非核酸，非肽或製劑。本發明提供了預防或治療某個體的方法，所述個體業已罹患或可能 罹患與FRP或Wnt通路組分表達或活性異常相關的疾病，如青光眼。5*5丄預防方法一方面，本發明提供了一種在個體中預防疾病或病況的方法，該方 法包括給該個體應用 一種能夠調製FRP或Wnt通路組分表達或至少 一個 FRP或Wnt通路組分活性的製劑，所述疾病或病況與異常的FRP或Wnt 通路組分表達或活性相關。具有罹患該疾病風險的個體可以通過如本文 所述的診斷或預後方法進行鑑定。預防製劑可以在出現FRP或Wnt通路 組分異常的表現症狀特徵之前應用，這樣，疾病或病況就得到預防，或 者其進展得到延緩.根據異常FRP或Wnt通路組分的類型，例如，可以 應用FRP或Wnt通路組分激動劑或FRP或Wnt通路組分拮抗劑製劑來 預防性處理個體。預防方法與本發明的治療方法類似，將在下面的部分 給予進一步闡述。S.5.2.治疔方法通常說來，本發明提供了一種治療疾病或病況的方法，該方法包括 給個體應用有效劑量的能夠調製FRP或Wnt通路組分活性的化合物，所 迷疾病或病況由異常的FRP或Wnt通路組分活性所致。能夠用來減梧涉 及FRP或Wnt通路組分活性異常的疾病症狀的方法包括，'例如如上所迷
的反義，核酶，和三螺旋分子或小的有機物。適宜化合物的示例包括拮 抗劑，激動劑或本文詳述物質的同系物。5.5.3.有效劑量可以在細胞培養或實驗動物中應用標準藥理學方法檢測這些化合物 的毒性和療效，如測定LDso (使群體中50%死亡的劑量)和ED5C)(在 50%群體中治療有效的劑量)。毒性作用和治療效果的劑量比率是治療 指數，可以表示為LD5o/ED5。優選治療指數大的化合物。儘管可以應用 有毒副作用的化合物，但在設計給藥系統時應該注意，將這些化合物定 嚮導入到受累組織部位，使其對未受累細胞的潛在危害最小化，進而減 少副作用。劑量範圍.這些化合物的刑量優選位於這樣的循環濃度範圍內，所述循 環濃度包括的濃度x，其EDso的毒性作用很小或沒有毒性.劑量可以在 該範圍內根據所用劑型和給藥方式而有所變化。對於本發明方法中應用 的任何化合物，開始時其治療有效劑量都可以從細胞培養試驗中估計，在動物模型中可以制定一個劑量，使循環血漿濃度範圍包括IC5t)，包括在細胞培養試驗中測定的濃度x的IC50 (即測試化合物的濃度可以使症狀得到一半抑制).這些信息可以用來更精確地確定人類應用劑量。例 如可以應用高效液相層析測定血漿水平。5*5.4.在臨床試驗中監浙FRP/Wnt治疔銪物的效臬根椐FRP或Wnt通路組分或疾病遺傳學特徵，確定預期可以顯示最 好臨床效果的人群的能力使下迷方面成為可能1)對已經上市但市場反 應不好的藥物進行重新定位；2)援救備選藥物，其臨床開發由於安全性 或療效的限制而不能繼續，這種限制是部分患者特異性的；以及3)加速 備選藥物的開發過程，並使備選藥物開發的成本降低，藥物標記更加理 想(例如，應用FRP或Wnt通路組分作為標記，可以用來使有效劑量最 優化)。治療FRP或Wnt通路組分的個體，應用通過檢測FRP或Wnt通路 組分特徵對治療進行監測，所述特徵如FRP或Wnt通路組分蛋白水平或 活性，FRP或Wnt通路組分mRNA水平，和/或FRP或Wnt通路組分基 因轉錄水平。這些檢測指標可以提示治療是否有效，或者是否應該對治 療進行調製或優化。因此，可以應用FRP或Wnt通路組分作為臨床試驗 期間藥物療效的標記.在一個優選實施方案中，本發明提供了一種監測某製劑(如激動劑， 拮抗劑，擬肽，蛋白，肽，核酸，小分子或其他應用本文所迷篩檢方法鑑定的備選藥物)治療受試者有效性的方法，該方法包括以下步驟(i) 在應用製劑前，獲得受試者治療前樣本；(ii)檢測治療前樣本中FRP或 Wnt通路組分蛋由、mRNA或基因組DNA的表達水平；(iii)獲得一個或 多個受試者治療後樣本；(iv)檢測治療後樣本FRP或Wnt通路組分蛋白、 mRNA或基因組DNA的表達或活性水平；(v)將治療前樣本FRP或Wnt 通路組分蛋白、mRNA或基因組DNA的表達或活性水平與治療後一個或 多個樣本的FRP或Wnt通路組分蛋白、mRNA或基因組DNA的表達或 活性水平進^f亍比較；以及(vi)根據結果修正受試者製劑的應用。例如，如 果需要將FRP或Wnt通路組分的表達或活性提高到高於檢測水平，可以 增量使用制刑，即增加製劑的效果。此外，如果需要將FRP或Wnt通路 組分的表達或活性降低到低於檢測水平，可以減量使用製劑，即降低制 刑的效果.還可以在應用FRP或Wnt通路組分治療藥物前後獲取受試者細胞， 檢測FRP或Wnt通路組分之外的其他基因的表達水平，確認FRP或Wnt 通路組分治療藥物不會產生有害的基因表達的增加或降低。可以應用， 例如轉錄profiling來達成這一點，因此，可以應用體內暴露於FRP或 Wnt通路組分治療藥物的細胞mRNA以及未暴露於FRP或Wnt通路組分 治療藥物的細胞mRNA進行逆轉錄，然後與含有多種基因DNA的晶片 進行雜交，進而比較經過或未經FRP或Wnt通路組分治療藥物處理的細 胞的基因表達。如果，例如，FRP或Wnt通路組分治療藥物使個體的原 癌基因表達開放，那麼這種特定FRP或Wnt通路組分治療藥物可能是不受歡迎的，5.5 5.配方和應用根據本發明所用的藥物組合物可以應用一種或多種生理可接受栽體 或賦形劑以傳統方式製備.因此，化合物及其生理可接受鹽類、溶劑可 以製備成用於，例如注射、吸入或吹入(通過口腔或鼻腔)或局部外用、 口服、口腔、非腸道或直腸的製劑。對於這樣的治療，本發明化合物可以製備成多種給藥方式，包括系 統給藥，外用或局部給藥。所用技術和制刑通常可以參考Remmington，s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co. Eastern, PA。 注射通常不是 系統給藥的優選方式，而口服刑型則是。本發明的局部眼用組合物可以 與一種或多種藥用賦形劑配伍，如緩沖劑，防腐劑(包括防腐佐劑)， 張力調節劑，表面活性刑，助溶劑，穩定刑，舒適感增強劑，緩和劑， pH調節劑和潤滑劑。眼部外用組合物的pH通常製備成4.5-8，滲透壓為 26-320 mOSm/kg。對於系統給藥，優選注射，包括肌內注射，靜脈內注 射，腹腔注射和皮下注射.對於注射製劑，本發明化合物可以製成溶液 形式，優選溶於生理可兼容緩衝液，如Hank's液或Ringer's液，此外， 化合物還可製備成固體形式，在用前溶解或再懸，還包括凍幹形式。對於口服給藥，藥物組合物可以採用例如通過傳統方式與藥用賦形 劑製備的片劑或膠嚢的形式，所迷藥用賦形劑如結合劑(如pregelatinised 玉米澱粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)，填充劑(如乳糖， 微晶纖維素或礴酸氫鈣)，潤滑劑(如硬脂酸鎂，雲母或矽土)，分散 劑(如馬鈴薯澱粉或澱粉輕乙酸鈉)，或溼潤劑(如硫酸月桂酸鈉)。 片劑可以應用本領域眾所周知的方法進行包衣.口服液體製劑可以採用 例如溶液、糖漿或懸液的形式，或者也可以以幹品形式呈現，然後在使 用前用水或其他適宜栽體進行溝兌.這些液體製劑可以通過傳統方法與 藥物添加刑共同製備，所述藥用添加劑如懸浮劑(如山梨醇糖漿，纖維 素衍生物或氫化可食用脂肪)，乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯樹膠)，非 水性栽體(如，ationdoil，油脂，酒精或分餾植物油)，以及防腐劑(如 甲基或丙基-p-羥安息香酸或山梨酸)。製劑還可以包括適宜的緩沖鹽， 調味劑，色素和增甜劑。口服製劑還可以通過適宜製備，控制活性化合物的釋放。對於口腔 用藥，組合物可以採用以傳統方式製備的片劑或錠劑的形式。對於吸入 給藥，本發明應用的化合物可以應用適宜的推進劑通過加壓裝置或噴霧 器以氣霧劑的形式方便地給藥，所迷推進劑如二氯二氣甲烷，三氯氣甲 烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他適宜氣體。在加壓氣霧劑的情況下， 劑量單位可以通過提供閥門來確定，這樣可以給予一定數量的藥物，例 如用於吸入器或吹入器的白明膠膠嚢和cartridge,可以製備成含有化合 物和適宜粉基的粉劑混合物，所迷粉基如乳糖或澱粉。化合物還可以製備用於通過注射的非腸道給藥，如彈丸注射或連續y 輸注。注射制刑可以以單位劑量的形式存在，如在安瓿中或在多劑量容
器中，並添加防腐刑。組合物可以採用如下形式，如懸液，溶液或溶於 油性或水性栽體的乳劑，並可含有如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑的制 劑。此外，活性成分還可以是粉劑，在使用前用適宜的栽體進行溝兌， 如無病原體消毒水。化合物還可製備成直腸用組合物，如栓劑或保留灌腸劑，如含有傳 統栓劑基質，如可可油或其他甘油酯。除了前述製劑，化合物還可製備成長效製劑。這些長效製劑可以局 部應用，通過植入(如皮下或肌內)或肌內注射.因此，例如，化合物 可以與適宜的多聚物或疏水物質(如在適宜的油類中的乳劑)或離子交換樹脂一起製備，或者製備成sparingly可溶性衍生物，如sparingly可溶 性鹽，其他適宜的給藥系統包括微球系統，該系統可以在一段較長的時 間內，將藥物無損性局部導入。該技術應用的微球為前毛細血管大小， 可以通過冠脈導管注射到任何所需部分，如心臟或其他器官，而不導致 炎症或缺血，應用的治療藥物可以從這些微球中緩慢釋放，並通過周圍 的組織細胞(如上皮細胞)攝取。系統給藥還可以通過經黏膜或經皮途徑進行。對亍經黏膜或經皮給 藥，製劑中可以應用能夠滲透屏障的適宜滲透刑。這些滲透劑在本領域 通常已知，包括，例如經黏膜給藥的膽鹽和梭鏈孢酸衍生物，此外，還 可應用去汙劑使滲透變得更加容易.經黏膜給藥可以通過鼻腔噴霧或應 用栓刑，對於外用給藥，本發明的寡聚體可以製備成本領域通常已知的 藥骨、油骨、凝膠或霜劑.還可以局部應用洗液治療損傷或炎症，加速 癒合。在臨床工作中，可以通過本領域熟悉的多種方法，將治療性FRP或 Wnt通路組分基因的基因導入系統引入患者中.例如，基因導入系統的 藥用制刑可以通過眼內注射或系統給藥如靜脈注射引入，蛋白質在靶細 胞中的特異性轉導可以主要通過基因導入栽體的特異性轉染實現，細胞 型或組織型表達是由於轉錄調控序列控制報導基因的表達，或者兩者結 合。在另一個實施方案中，重組基因的起始導入限制更多，需要定位導 入到動物體內。例如，基因導入栽體可以通過導管(見美國專利 5,328,470)或定位注射(如Chen etal. (1994) PNAS 91:3054-3057)的方 式導入。FRP或Wnt通路組分基因可以以基因治療構建物的形式通過例 如Devetal. (1994) Cancer Treat Rev 20: 105-115所述的電擊轉化技術或 transcleral iontophoresis技術導入。基因治療構建物的藥物製劑或本發明化合物可以主要包括適宜稀釋 的基因導入系統，或者包括緩釋基質，該基質中埋入基因導入栽體或化 合物。此外，當完整的基因導入系統可以從重組細胞中完全製備時，如 逆轉錄病毒栽體，藥物制刑可以包括一種或多種製備該基因導入系統的 細胞。如果需要，組合物還可以包裝或dispenser裝置的形式存在，包裝或 裝置中可以包括含有活性成分的一個或多個刑型單位。例如，包裝可以 含有金屬或塑料襯託，如真空成形泡殼包裝。包裝或dispenser裝置中還 可以包括使用說明書。5.6.試劑盒本發明還提供了用於診斷或預後方法或者用於治療疾病或病況的試 劑盒，所述疾病或病況與異常的FRP或Wnt通路組分蛋白相關.本發明 還提供了確定給某受試者應用哪種FRP或Wnt通路組分治療藥物的試刑 盒。本發明包括的試劑盒可以檢測生物樣本中FRP或Wnt通路組分 mRNA或蛋白的存在，還可以檢測FRP或Wnt通路組分中存在的突變， 或者鑑定FRP或Wnt通路組分中的多態性區域。例如，試劑盒可以包括 能夠檢測生物樣本中FRP或Wnt通路組分蛋白或mRNA的標記化合物或 製劑；檢測樣本中FRP或Wnt通路組分量的工具；以及將樣本中FRP或 Wnt通路組分的量與標準進行比較的工具.化合物或製劑可以包裝在適 宜的容器中。試劑盒還可包括應用試刑盒檢測FRP或Wnt通路組分 mRNA或蛋白的使用說明書，在一個實施方案中，試刑盒包括含有有效劑量FRP或Wnt通路組分 拮抗劑治療藥物的藥物組合物和治療或預防髙血壓的使用說明書。在另 一個實施方案中，試劑盒包括含有有效劑量FRP或Wnt通路組分拮抗刑 治療藥物的藥物組合物和治療眼病如青光眼的使用說明書.通常說來， 試劑盒包括含有有效刑量FRP或Wnt通路組分激動刑或拮抗劑治療藥物 的藥物組合物和作為青光眼治療藥物的使用說明書.例如，試刑盒可以 包括含有有效劑量FRP或Wnt通路組分激動刑治療藥物的藥物組合物和 用作止痛刑的使用說明書。還有其他試劑盒可以用來確定一個個體是否已經發病或傾向於發r病，所迷疾病與異常的FRP或Wnt通路組分活性相關.這樣的試劑盒可 以包括，例如一種或多種核酸探針，所迷探針可以與FRP或Wnt通路組 分基因或其等位基因變異體或其變異形式的至少一個部分進行特異性雜 交.5,7. FRP成Wnt通路晝白和核酸的其他應用本發明FRP或Wnt通路組分核酸還可用於以下試驗。在一個實施方 案中，具有序列1或其部分的人類FRP或Wnt通路組分核酸或者能夠與 之雜交的核酸，可以用來確定FRP或Wnt通路組分基因的染色體位置。 將FRP或Wnt通路組分基因的染色體位置與業已顯示與某特定疾病或病 況相關的染色體區域位置進行比較，例如通過連鎖分析(物理位置臨近 基因的共同遺傳)，可以提示FRP或Wnt通路組分可能具有一定作用的 疾病或病況。業已與特定疾病連鎖的染色體區域列表可以在，例如 McKusick， Mendelian Inheritance in Man (可以通過約翰霍普金斯大學 Welch醫學圖書館在線獲得)和http:〃ww3,ncbi.nih,gov/Omim (Online Mendelian Inheritance in Man)中獲得.而且，FRP或Wnt通路組分基因還 可作為染色體標記物用於基因連鎖研究，所迷研究涉及的基因不是FRP 或Wnt通路組分。基因的染色體定位可以通過本領域眾所周知的幾種方法進行。例 如，應用Southern印跡雜交或雜交體細胞PCR繪圖技術可以確定某特定 基因位於哪條染色體或染色體片段上。可以將一個基因定位於染色體或染色體區域的其他繪圖策略包括原位雜交，標記流式分類染色體預篩 檢，以及通過與染色體特異性cDNA文庫構建物雜交進行預選。而且，核酸與中期染色體螢光原位雜交(FISH)，是一種將核酸準 確定位到染色體上的一步式方法，所述核酸如FRP或Wnt通路組分核 酸。該技術應用的核酸可以短至500或600鹼基；但是，大於2000 bp 的克隆與特異性染色體位置結合的可能性更高，所迷特異性染色體位置 具有簡單檢測所需要的足夠的信號強度.這些技術在如Verma et aL， Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)中有述.應用這些技術， 一個基因可以定位於含有大約50-500個基因的染色體區域.如果顯示，FRP或Wnt通路組分基因位於的染色體區域與某種特異 性疾病共分離，即相關，那麼就需要測定受累個體與未受累個體間cDNA 或基因組序列的差異。在突變存在於一些或所有受累個體而非正常個
體，提示突變可能是疾病的致病原因。5.8*貧物基因組學單獨運用導致個體FRP或Wnt通路組分基因或蛋白缺陷或缺乏的特 定改變的知識(FRP或Wnt通路組分基因的遺傳特徵)，或者結合導致 該疾病的其他遺傳學缺陷信息，可以針對個體的基因特徵，為其定製特 定疾病的治療方法，這就是"藥物基因組學"的目標。例如，攜帶FRP 或Wnt通路組分基因某特異性等位基因的個體，可能出現也可能不出現 某種特定疾病的症狀，或者有發生某種特定疾病症狀的傾向。而且，如 果這些個體是有症狀的，他們對某種藥物的治療也可能有反應，也可能 沒有反應，但也可能對另一種藥物的治療有反應，所迷藥物如特異性FRP 或Wnt通路組分治療藥物。因此，從一個群體中產生FRP或Wnt通路組 分的遺傳特徵(FRP或Wnt通路組分的群體遺傳特徵)(如與發生某種 疾病相關的FRP或Wnt通路組分基因改變分類)，所迷群體具有某疾病 或病況的症狀，所迷疾病或病況由FRP或Wnt通路組分基因和/或蛋白的 缺陷和/或缺乏所致，並將某個體的FRP或Wnt通路組分基因特徵與群體 基因特徵相比較，使我們可以篩選或設計預期對某特定患者或患者群(即 具有相同遺傳改變的患者)安全有效的藥物。例如> FRP或Wnt通路組分的群體遣傳特徵可以通過在罹患某一疾 病的群體中測定FRP或Wnt通路組分的遺傳特徵達成，如測定FRP或 Wnt通路組分基因的同一性，所迷疾病由FRP或Wnt通路組分基因的缺 陷或缺乏所致.任選地，FRP或Wnt通路組分群體遺傳特徵還可以包括 該群體對FRP或Wnt通路組分治療藥物反應的相關信息，該信息可以通 過應用多種方法獲得，包括，監測l)FRP或Wnt通路組分相關疾病相 關症狀的嚴重性，2) FRP或Wnt通路組分基因的表達水平，3)FRP或 Wnt通路組分的mRNA水平，和/或4 )FRP或Wnt通路組分的蛋白水平. 以及(iii討艮據FRP或Wnt通路組分基因中存在的特定基因改變，或者FRP 或Wnt通路組分基因，將群體分開或分類。FRP或Wnt通路組分的群體 遺傳特徵還可以任選提示，某些特定改變的患者可能對某種特定治療方 法有反應或沒有反應。根據個體FRP或Wnt通路組分逸傳特徵，應用這 種信息或群體特徵應該可以預言哪個個體將對特定藥物治療有反應。在一個優選實施方案中，FRP或Wnt通路組分遺傳特徵是轉錄或表 達水平特徵，以及步驟(i)包括單獨確定FRP或Wnt通路組分蛋白的表
達水平，或者聯合確定已知對該疾病有關的其他基因的表達水平。FRP 或Wnt通路組分遺傳特徵可以在很多患者的疾病不同階段給予檢測，還可以應用轉基因動物進行藥物基因組學研究。例如，如本文所述， 可以製備轉基因小鼠，該小鼠含有FRP或Wnt通路組分基因的特定等位 基因變異體。這些小鼠可以通過下述方法創建，例如通過應用人FRP或 Wnt通路組分基因等位基因取代小鼠的野生型FRP或Wnt通路組分基 因。然後測定這些小鼠對FRP或Wnt通路組分治療藥物的反應情況.5.9.本發明還提供了轉基因動物，這些動物可以用於多種目的，如鑑定 青光眼治療藥物。本發明轉基因動物包括核酸序列中含有突變的非人動 物，所迷核酸序列可以導致不適宜高水平的FRP (如可以調控FRP表達 的轉錄因子的編碼基因發生突變).此外，轉基因動物還可以包括Wnt 信號組分的突變，包括巻曲蛋白(Fz) , Disheveled (Dsh)，糖原合酶 激酶3(GSK3)，蛋白激酶C(APC)， JJ-連環蛋白和高遷移率組(HMG) 蛋白(如LEF/TCF (淋巴增強因子/T細胞因子))。這些動物可以用來， 例如檢測通過幹擾小梁網細胞基因表達對表型的影響，所述基因的表達 受Wnt倌號調控。轉基因動物還可以是含有轉基因的動物，所述轉基因如報導基因， 受FRP啟動子或其片段的控制.這些動物對於，例如鑑定調製FRP產生的藥物非常有用，例如，這些藥物可以調製FRP的基因表達。例如，可 以根據本領域已知方法，應用FRP cDNA片段篩檢基因組文庫，分離FRP 基因啟動子，並對其進行特徵鑑定，在本發明範疇內的其他非人動物還包括(這樣的動物)，(該動物 中)編碼Wnt信號組分的內源性基因的表達發生突變或被"敲除，，。這 些動物可以用來檢測某一Wnt信號組分的缺失是否可以導致某一特定表 型。獲得轉基因和基因敲除非人動物的方法在本領域眾所周知，並將在 這裡給予探討。在一個優選實施方案中，本發明提供了用於開展青光眼診斷和治療 的轉基因非人動物.例如，在某些優選實施方案中，本發明轉基因動物 包括異源FRP表達基因，該基因導致眼部組織中FRP基因表達水平增 加.在優選實施方案中，眼部組織是小梁網，FRP過度表達細胞是小梁 網細胞。在其他更優選實施方案中，小梁網細胞FRP表達水平增加的轉
基因非人動物至少具有一個青光眼特徵性症狀，如眼內壓(IOP)增高。在某些優選實施方案中，本發明轉基因動物提供了體內篩檢青光眼治療化合物和開展青光眼診斷的試驗系統。5.9丄基子動物的系統本發明的另一方面涉及轉基因動物，該轉基因動物包括含有本發明 轉基因的(該動物)細胞，優選(雖然任選)在動物的一個或多個細胞 中表達外源性FRP蛋白。FRP轉基因可以編碼野生型蛋白，也可以編碼 其同系物，包括激動劑和拮抗刑，以及反義構建物.在優選實施方案中， 可以應用，例如能夠控制所需表達模式的cis-作用序列，將轉基因的表達 限制於某些特定類型的細胞、組織或發育階段，在本發明中，這種嵌合 表達的FRP蛋白對於多種形式的連鎖分析都很重要，而且提供了另外一 種方法，評價例如FRP表達缺乏的效果，在其他部分正常的胚胎中，FRP 表達缺乏可能會完全改變組織某一部分的發育情況。為了達到這一目 的，可以應用組織特異性調控序列和條件調控序列控制轉基因以某一特 定空間模式表達。而且，表達的暫時模式可以通過，例如條件重組系統 或原核轉錄調控序列達到，是本領城技術人員眾所周知的.例如，現在已有能夠使重組酶得到調控 表達的基因系統，所述重組酶可以催化把序列的基因重組.本文所用短 語"靶序列"是指能夠通過重組酶基因重組的核苷酸序列.把序列的側 翼序列是重組酶的識別序列，在表達重組酶活性的細胞中通常是切除的 或者是反轉的.可以設計重組酶催化的重組亊件，這樣靶序列的重組可 以導致FRP蛋白之一的表達激活或抑制，例如，可以設計將能夠幹擾重 組FRP基因表達的一個把序列切除，如編碼拮抗同系物或反義轉錄物的 序列，這樣可以激活該基因的表達。這種千擾蛋白表達的過程可以由多 種機制產生，如將FRP基因從啟動子元件或內部終止子中空間分離。而 且，轉基因還可以這樣製備，其中基因的編碼序列由重組酶識別序列側 翼包繞，並在起始時以相對於啟動子元件3，到5，的方向轉化細胞。在這 種情況下，靶序列的反轉使研究基因進行了重新定向，即通過將編碼序 列的5，端以相對於啟動子元件的方向定位，這樣啟動子可以驅動轉錄的 激活。本發明所有轉基因動物都在它們的多種細胞中包括一個本發明轉基
因，該轉基因可以通過調控細胞功能、細胞生長、死亡和/或分化改變"宿 主細胞"的表型。因為應用本文描述的一個或多個轉基因構建物可以產 生本發明轉基因生物體，所以將給出通過參考外源性遺傳物質製備轉基 因生物體的一般性論迷，為了應用下迷方法和材料將特異性轉基因序列 整合到生物體中，本領域技術人員可以對該一般性論述進行調整。在一個示例實施方案中，可以應用噬菌體P1的we/Zo;c屍重組酶系統 (Lakso et al. (1992) PNAS 89: 6232-6236; Orban et al. (1992) PNAS 89: 6861-6貼5)或者釀酒酵母的FLP重組酶系統(O，Gorman et al. (1991) Science 251: 1351-1355; PCT公開WO 92/15694 )產生體內位點特異性基 因重組系統。Cre重組酶可以催化位於/ojc屍序列之間的幹預靶序列的位 點特異性重組./o;c屍序列是34個鹼基對的核苷酸重複序列，可以與Cre 重組酶結合，而且是Cre重組酶介導的基因重組的必需序列。在Cre重 組酶存在的情況下，/ojc屍序列的方向性決定了幹預靶序列是切除的還是 反轉的(Abremski et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1509-1514 );當/ojc屍 序列序列是順行重複序列時，催化靶序列的切除，當/o;c屍序列是反轉重 復序列是，催化把序列的倒位.因此，靶序列的基因重組有賴於Cre重組酶的表達.重組酶的表達 可以通過啟動子元件進行調控，所迷啟動子元件也受調控，如通過外部 添加製劑，啟動子元件可以是組織特異性的，發育階段特異性的，可誘 導的或可抑制的。這種調控可以使靶序列的基因重組只發生在啟動子元 件介導的重組酶表達的細胞中。因此，重組FRP蛋白的表達激活可以通 過控制重組酶表達得到調控。應用cre//o;f重組酶系統調控重組FRP蛋白的表達需要構建一個轉 基因動物，該動物包括編碼Cre重組酶和研究蛋白的轉基因。通過構建 "雙"轉基因動物可以得到含有Cre重組酶和重組FRP基因的動物.得到這種動物的一種方便方法是將兩種轉基因動物雜交，這兩種轉基因動 物中，每一種都含有一個轉基因，如FRP基因和重組酶基罔，開始構建轉基因動物獲得的一個優勢源於這樣的可能性，即研究蛋 白的表達對於轉基因動物可能有害，所述研究蛋白可以是激動刑，也可 以是拮抗刑，所述轉基因動物含有重組酶介導的可表達形式的FRP蛋 白。在這種情況下，可以繁殖並維持研究轉基因在所有組織中都保持靜 默狀態的初始群。該初始群中的個體可以與表達重組酶的動物進行雜 交，所迷重組酶在動物的例如一個或多個組織和/或以所需時間模式表達。因此，創建一個初始群，例如，初始群中FRP拮抗轉基因是靜默的， 可以進行該初始群後代的研究，在這些後代中，特定組織或特定發育階 段的FRP介導的誘導發生障礙，導致，例如致死性表型的出現。相似的條件轉基因還可應用原核啟動子序列進行提供，為了使FRP 轉基因的表達更加容易，該原核啟動子序列需要與原核蛋白同時表達。 示例的啟動子和相應的轉激活原核蛋白可以參考美國專利號4,833,080。而且，條件轉基因的表達還可以通過類似基因治療的方法進行誘 導，其中，編碼轉激活蛋白，如重組酶或原核蛋白的基因被導入到組織 中，並以，例如細胞類型特異性的方式表達。通過該方法，FRP轉基因 可以一直保持靜默狀態到成年，除非由轉激活子誘導"打開"。在一個示例實施方案中，本發明"轉基因非人動物"可以通過將轉 基因導入非人動物生殖細胞系來製備。可以應用不同發育階段的胚胎靶細胞導入轉基因。根據胚胎靶細胞的發育階段，可以應用不同的方法. *擇用於實踐本發明的任何動物特定細胞系，這些細胞系健康，胚胎生長良好，胚胎生殖核能見度良好，複製適應性良好.此外，單模標本也 是一個顯著因素。例如，在製備轉基因小鼠時，通常應用如C57BL/6的 品種或FVB品系(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)。優選品種為攜 帶H-2b,H-2d或H-2q單模標本的品種，如C57BL/6或DBA/1 。用來實踐 本發明的品系可以是轉基因品系本身，和/或敲除品系(即源於一個或多 個基因部分或完全受到抑制的動物)。在一個實施方案中，轉基因構建物被導入到單細胞階段的胚胎.合 子是最佳的顯微注射靶目標.在小鼠中，雄性生殖核的直徑可以達到大 約20微米，這樣可以進行再生性注射DNA溶液1-2pl。應用合子作為 基因轉移的靶目標的一個主要優勢在於，在絕大多數情況下，注射的DNA 可以在第一次分裂前整合到宿主基因中(Brinster et al. (1985) PNAS 82: 4438-4442)。結果是，轉基因動物的所有細胞都攜帶整合的轉基因.這 通常在轉基因有效傳播到初始群後代方面也有所反映，因為50%的生殖 細胞將含有轉基因。正常情況下，在適宜的培養基中孵育受精胚，直至出現生殖核。如 下所述，大約在這個時候，將含有轉基因的核香酸序列導入雌性或雄性 生殖核中。在一些品種如小鼠中，優選雄性生殖核.最優選的是，在雄
性合子被卵子核或合子的雌性生殖核處理之前，將外源性遺傳物質添加到雄性合子的DNA互補鏈中。據信卵子核或雌性生殖核可以釋放能夠影 響雄性DNA互補鏈的分子，可能是通過將雄性DNA的精蛋白置換為組 蛋白，從而使雌性和雄性DNA互補鏈能夠更加容易地結合，形成二倍體 合子.因此，優選在雄性DNA互補鏈受到雌性生殖核影響之前，將外源性 遺傳物質添加到雄性DNA互補鏈或其他任何DNA互補鏈中.例如，外 源性遺傳物質可以在雄性生殖核剛剛形成後，就添加到早期雄性生殖核 中，這個時候，雄性和雌性生殖核相互分離，兩個生殖核都緊鄰細胞膜. 此外，還可在精子經誘導進行decondensation後，將外源性遺傳物質添 加到精子核中。然後將含有外源性遺傳物質的精子添加到卵子中，或者 將decondensed精子添加到卵子中，然後立即添加轉基因構建物。可以應用本領域已知的任意方法將轉基因核苷酸序列導入到胚胎 中，例如，顯微注射，電擊轉化或微脂粒感染技術.轉基因核苷酸序列 導入胚胎後，可以在體外孵育胚胎，孵育時間不限，也可以將胚胎直接 再植入代理宿主，或者在體外孵育一段時間後，再植入宿主.體外孵育 至成熟也屬於本發明範疇. 一種常見方法是在體外孵育胚胎大約1-7天 後，將它們再植入代理宿主，具體孵育時間要根據種系來確定。為本發明起見，合子實際上是二倍體細胞的形成，該細胞能夠發育 成為一個完整的生物體。通常，合子包括一個含有核的卵，核可以是天 然形成的，也可以是人工形成的，所述卵是通過兩個來自接合體的單倍 體核融合形成的。因此，結合體核必須是天然兼容的核，即這個核可以 導致健康合子的形成，合子能夠進行分化，並發育成為具有功能的生物 體，通常，優選整倍體合子.如果荻得了整倍體合子，那麼染色體數量 的變化相對於接合體來源生物體的整倍體數量就不應該超過1。除了相似的生物學考慮外，物理學特徵也控制著外源性遺傳物質的 量(如體積)，所述外源性遺傳物質可以添加到合子核中，或者添加到 構成合子核一部分的遣傳物質中。如果沒有去除遺傳物質，那麼外源性 遺傳物質可以添加的量就會受到在不破壞物理特性的情況下的吸收量的 限制。通常，插入的外源性遣傳物質的體積不超過大約IO皮升.一添加的 物理學效應必需不能破壞合子的存活能力。DNA序列數量和變異的生物 學限制根據特定合子和外源性遺傳物質的功能而有所差異，這對於本領
域技術人員來說是顯而易見的，因為產生合子的遺傳物質，包括外源性 遺傳物質，必須在生物學上能夠啟動並維持合子的分化和發育，使之成 為一個具有功能的生物體。添加到合子中的轉基因構建物的拷貝數量有賴於添加的外源性遺傳 物質的總量，而且該拷貝數量將是能夠使基因轉化發生的數量。理論上 只需要一個拷貝，但是通常情況下，需要應用多拷貝，例如，為了保證一個拷貝具有功能，需要應用1，000-2，000拷貝的轉基因構建物。對於本 發明，為了增強外源性DNA序列的表型表達，使每個插入的外源性DNA序列有超過一個的功能拷貝通常是具有優勢的。可以應用任何能夠將外源性遣傳物質添加到核遺傳物質中的技術，只要這種技術不破壞細胞、核膜或其他現存的細胞結構或基因結構。優 選通過顯微注射技術將外源性遺傳物質插入到核遣傳物質中。顯微注射 的細胞和細胞結構已知，並在本領域得到應用.應用標準方法可以完成再植。通常情況下，代理宿主是麻醉的，胚 胎一皮植入到輸卯管中.植入特定宿主的胚胎數量;f艮據品種的不同而有差 異，但通常與該品種自然生產的後代數量相匹配。可以應用任何適宜方法篩檢代理宿主轉基因後代轉基因的存在和/ 或表達情況.篩檢通常可以通過PCR， Southern印跡或Northern印跡分析 完成，分析中應用與轉基因至少一個部分互補的探針。可以採用Western 印跡分析作為篩檢轉基因產物存在的替代或其他方法，分析應用抗轉基 因編碼蛋白的抗體.典型地，從尾部組織中製備DNA，然後應用Southern 印跡或PCR法分析轉基因，此外，儘管任何組織或細胞類型都可用於該 分析，但可以應用據信表達轉基因水平最高的組織或細胞進行轉基因存 在和表達的測試，所迷測試可以應用Southern分析或PCR法。評價轉基因存在的其他替代方法包括但不限於適宜的生物化學方 法，如酶和/或免疫學方法，特定標記物或酶活性的組織學染色，流式細 胞儀分析等。血液分析還可用來檢測血液中轉基因產物的存在，並評價 轉基因對多種類型血細胞和其他血液組分水平的影響。可以通過將轉基因動物與適宜的配體進行交配獲得轉基因動物後 代，也可以通過將轉基因動物的卵子和/或精子體外受精獲得轉基臥動物 後代，在與配體進行交配的時候，該配體可以是也可以不是轉基因動物 和/或基因敲除動物；當該配體是轉基因動物時，它可以包括同一或不同
的轉基因，也可以同時包括同一和不同的轉基因。此外，配體可以是親 本系。當採用體外受精時，受精胚胎可以植入到代理宿主體內，也可以 體外孵育，或者在體外孵育後植入代理宿主體內。無論應用哪一種方法， 都應該應用上述方法或其他適宜方法評價後代轉基因的存在情況。根據本發明製備的轉基因動物包括外源性遺傳物質。如上所述，在某些實施方案中，外源性遺傳物質是導致FRP蛋白(激活劑或拮抗劑) 產生的DNA序列，反義轉錄產物或FRP突變體。而且，在這些實施方 案中，該序列還與轉錄調控元件相連接，如啟動子，該啟動子優選能夠 使轉基因產物在某一特定類型的細胞中得到表達.還可應用逆轉錄病毒感染將轉基因導入到非人動物中。發育的非人 胚胎可以體外培養到胚泡期。在此期間，分裂球可以作為逆轉錄病毒感 染的靶細胞(Jaenich,R. (1976) PNAS 73: 1260-1264),分裂球的有效感 染可以通過酶處理去除透明帶獲得(Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986)).所用導入轉基因的典型病毒栽體系統是攜帶轉基因的複製缺陷 型逆轉錄病毒(Jahner et al. (1985) PNAS 82: 6927-6931; Van der Putten et al. (1985)PNAS 82: 6148-6152) 可以通過在單層產病毒細胞上培養分 裂球獲得有效而容易的轉染(Van der Putten et al., supra; Stewart et al. (1987) EMBO J. 6:383-388)。此外，還在更晚一些的階段進行感染。可 以將病毒或產病毒細胞注射到分裂腔內(Jahner etal. (l卯2)Nature298: 623-628)。絕大多數初始群將成為轉基因嵌合體，因為整合只發生在一 部分細胞中，形成轉基因非人動物.而且，初始群還可以含有在基因組 不同位點上插入的多種逆轉錄病毒轉基因，在後代中通常會分離。此外， 還可以通過逆轉錄病毒宮內感染妊娠中期胚胎，將轉基因導入到生殖細 胞系(Jahner et al. (1982) , supra)。轉基因導入的第三類把細胞是胚胎千細胞(ES) 。 ES細胞可以從體 外培養的植入前胚胎中獲得，並與胚胎融合(Evanseta1.(1981)Nature 292: 154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309: 255-258; Gossler et al. (1986) PNAS 83: 9065-9069; and Robertson et al. (1986) Nature 322: 445-448)。 可以通過DNA轉染或逆轉錄病毒介導的轉導有效地將轉基因導入JES細 胞.然後，可以將這些轉化的ES細胞與來自非人動物的胚泡結合。這樣， ES細胞可以定殖在胚胎中，形成能夠產生嵌合動物的生殖細胞系。綜述
見Jaenisch， R. (1988) Science 240: 1468-1474。在一個實施方案中，應用基因打靶技術將變化引入培養的胚胎幹細 胞中，所述基因打靶技術是一種應用同源重組修飾動物基因組的方法。 通過靶定ES細胞內感興趣FRP基因，這些變化可以導入動物的生殖細 胞系，產生嵌合體，基因打靶過程可以通過將DNA靶構建物引入組織培 養細胞完成，所迷DNA靶構建物包括與靶FRP位點同源的片段，還包 括對FRP基因組序列進行修飾的所需序列(如插入，缺失，點突變) 然後篩檢準確打靶的處理細胞，鑑定並分離那些業已適當打靶的細胞，胚胎幹細胞基因打靶技術實際上是本發明考慮的一種方案，是通過 應用打靶轉基因構建物破壞FRP基因功能的 一種方法，所迷打靶轉基因 構建物被設計成能夠與 一個或多個FRP基因組序列進行同源重組。可以 安排打靶構建物，在與FRP基因某一元件重組的基礎上，將陽性篩選標 記物插入(或置換)基因的編碼序列，插入的序列不僅幹擾破壞了 FRP 基因的功能，而且提供了一種陽性篩選性狀。FRP的示例打靶構建物將 在下面給予更加詳細的描述.通常，用來產生基因敲除動物的胚胎幹細胞(ES細胞)與產生的基 因敲除動物是同一種系。因此，例如，小鼠胚胎千細胞通常被用來產生 基因敲除小鼠。可以應用技術人員眾所周知的方法產生並維持胚胎幹細胞，如 Doetschman et al. (1985) J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27-45所迷的方 法。可以應用任何ES細胞系，但是典型情況下，選擇的細胞系應該具有 這樣的能力，細胞可以整合進入發育胚胎中，並成為生殖細胞系的一部 分，進而產生敲除構建物的傳動生殖細胞系。因此，任何據信具有這種 能力的ES細胞系都適用於本發明。 一種用來產生ES細胞的典型小鼠品 系是129J。另 一種ES細胞系是鼠細胞系D3 (American Type Culture Collection,分類號CKL 1934).另一種優選ES細胞系是WW6細胞系 (Ioffeetal. (1995)PNAS 92: 7357-7361 )。可以應用技術人員眾所周知 的方法培養細胞，準備敲除構建物的插入，所述方法如Robertson in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E， J. Robertson, ed. IRL Press, Washington, D,C. [1987]; Bradley et al. (1986) Current Topics in Devel. Biol. 20: 357-371; and Hogan et al. (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY [1986])所披露.可以應用多種本領域眾所周知的方法，將敲除構建物插入到ES細胞 中，這些方法包括，例如電擊轉化，顯微注射以及磷酸釣處理。插入的 優選方法是電擊轉化。每個準備插入到細胞中的敲除構建物必須首先是線形的。因此，如 果敲除構建物業已插入到栽體中(下述)，可以應用適宜的限制性內切 酶消化DNA來獲得線性化，選擇的限制性內切酶應該只在栽體序列內進 行酶切，而不在敲除構建物序列內進行酶切。對於插入，根據所選插入方法，在適宜條件下將敲除構建物添加到 ES細胞中，所迷適宜條件技術人員已知。當導入ES細胞的構建物超過 一個時，可以將這些敲除構建物同時導入，也可以每次導入一個。如果ES細胞將進行電擊轉化，應用點擊轉化儀將ES細胞和敲除構 建物DAN暴露於電脈衝，並按照生產廠商的使用說明進行.典型地，電 擊轉化後，在適宜的畔育條件下^f吏ES細胞恢復.然後篩檢細胞，檢視敲除構建物的存在情況。可以應用多種方法進行篩檢。例如，當標記基因是抗生素耐藥基因 時，可以在致死濃度抗生素存在的情況下培養ES細胞。推測那些能夠存 活的ES細胞可能整合了敲除構建物。如果標記基因不是抗生素耐藥基 因，可以應用Southern印跡法，用設計的只能夠與標記序列雜交的DNA 序列作為探針，分析ES細胞基因組DNA。此外，還可應用PCR法。最 後，如果標記基因是編碼酶的基因，所迷酶活性可以檢測(如b-半乳糖 苷酶)，可以在適宜條件下將酶作用底物添加到細胞中，然後分析酶活 性，本領域技術人員可能對其他有用的標記物非常熟悉，並熟知在給定 細胞中檢測這些標記物存在的方法.所有這些標記物都在本發明教義的 考慮範疇之內，敲除構建物可能整合到ES細胞基因組的多個位點，由於隨機插入亊 件的發生，敲除構建物可能在每個ES細胞基因組中整合的位點有所不 同.插入的所需位置位於將被敲除DNA序列的互補位點，如FRP編碼 序列，轉錄調控序列等.典型地，實際上只有少於大約1-5%攝取了敲 除構建物的ES細胞在所需位點整合了敲除構建物.為了鑑定那些適當整 合了敲除構建物的ES細胞，應用標準方法從ES細胞中提取總DNA.'然 後，應用設計的探針對DNA進行Southern印跡分析，所迷探針能夠以特
定形式與應用特定限制性酶消化的基因組DNA雜交.此外，或者另外， 還可以應用探針通過PCR擴增基因組DNA,所述探針經特意設計，可以 擴增特定大小和序列的DNA片段(即，只有在適宜位置舍有敲除構建物 的那些細胞才會產生適宜大小的DNA片段)《 鑑定了在適宜位置含有敲除構建物的適宜細胞後，就可以將細胞插 入到胚胎中了。插入可以通過技術人員熟知的多種方式進行，但是，優 選的方法是顯微注射。對於顯微注射，在微量加樣槍中收集大約10-30 個細胞，然後注射到胚胎中，所述胚胎處於適宜的發育階段，允許含有 敲除構建物的異體ES細胞整合到發育胚胎中。例如，如下述實施例所 述，轉化的ES細胞可以被顯微注射到胚球中。用於插入ES細胞的胚胎適宜發育階段非常依賴動物品種，但是對於 小鼠來說，該階段大約為3.5天，胚胎是通過灌注雌性妊娠動物子宮獲得 的.進4亍該過程的適宜方法是技術人員已知的，如Bradley et al. (supra) 所披露.儘管任何適宜發育階段的胚胎都適用，優選雄性胚胎.在小鼠中， 優選的胚胎還具有編碼毛皮顏色的基因，所述基因編碼的毛皮顏色與ES 細胞基因編碼的毛皮顏色不同.按照這種方式，可以通過尋找嵌合毛皮 顏色(提示ES細胞整合進入發育胚胎)容易地篩查出敲除構建物的存 在.因此，例如，如果ES細胞系攜帶的基因編碼白色皮毛，選擇的胚胎 攜帶的基因就應該編碼黑色或棕色皮毛.ES細胞導入胚胎後，可以將胚胎植入假孕撫育母體子宮進行孕育. 儘管可以應用任何雌性動物作為撫育母體，典型的撫育母體應按照下述 條件進行選擇，即具有繁殖和生殖的良好能力，具有照顧下一代的能力。 這些撫育母體可以通過與進行了輸精管切除術的同種雄性動物交配來制 備。假孕撫育母體的階段對於成功植入是至關重要的，該時間是品種依 賴性的。對於小鼠，該階段大約為假孕2-3天。在採用了皮毛顏色篩選策略的情況下(如上所述，並見下述實施 例)，可以首先通過嵌合皮毛顏色篩檢撫育母體生養的後代。此外，或 者作為替代，還可應用如上所述的Southern印跡和/或PCR方法，篩檢後 代尾部組織DNA中敲除構建物的存在。為了產生純合的敲除動物，可以 將顯示嵌合性狀的後代進行彼此雜交，前提是這些動物據信在其生殖細 胞中攜帶敲除構建物.通過Southern印跡分析同等數量的基因組DNA來
鑑定純合子，所迷基因組DNA來自該雜交產生的小鼠，以及已知是雜合 於的小鼠和野生型小鼠。還有其他方法可以用來鑑定和闡明敲除後代的特徵。例如，可以應 用Northern印跡來分析mRNA中敲除基因、標i己基因或者兩種基因的編 碼轉錄產物的存在或缺如。此外，可以應用Western印跡來評價後代中 多種組織敲除的FRP基因的表達水平，可以應用針對特定FRP蛋白的抗 體或者針對標記基因產物的抗體進行Western印跡分析，前提是該基因 得到表達。最後，可以應用適宜的抗體對後代的多種細胞進行原位分析 (如固定細胞，應用抗體標記)和/或FACS分析(螢光激活細胞分類)， 尋找敲除構建物基因產物的存在或缺如。其他製備敲除或破壞轉基因動物的方法也眾所周知。見，例如 Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)。還可通過，例如同源重組插入把序列， 產生重組酶依賴性敲除，這樣可以通過重組酶序列控制FRP基因的組織 特異性和/或時間調控性失活(下述).可以通過多種方式，製備含有一個以上敲除構建物和/或一個以上轉 基因表達構建物的動物。製備的優選方式是產生一系列哺乳動物，每種 含有一個所需轉基因表型.這些動物通過一系列雜交、回交和篩選進行 繁殖，最終產生含有所有所需敲除構建物和/或表達構建物的單一動物， 其中，動物除了存在敲除構建物和/或轉基因外，是野生型的同源林(異 常一致)。本發明還以下迷實施例的形式進行闡釋，但這些實施例不應被視為 以任何形式對本發明的限制.所有引用參考文獻內容(包括本申請全部 引用的參考文獻，授權的專利，公開的專利申請以及共同未決的專利申 請)在此引入，作為參考4除非有特別指示，本發明的實踐方法均採用 傳統細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、 重組DNA以及免疫學技術，這些技術屬於本領域常規技術。這些技術在 文獻中有全面介紹。見，例如Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed.， ed. by S咖brook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M丄Gait ed.， 1984); Mullis et al.美國專利號 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R丄Freshney, Alan R. Liss， Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);論著，Methods In Enzymobgy (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al, eds.)， Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.， Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M Weir and C.C. Blackwell， eds.， 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)。6丄塞曲相關蛋白1 (FRP-1)與音光眼的關係材料與方法通過RNA差異顯示鑑定的泉曲相關蛋白cDNA序列AACAGCCI vjCCTCTCCCCCCOCACTTTTTACATATATTTO iTTC八TTTCTGCAOAT(3GAA AO TTOACATGGGTGGGGTOTCCCCATCCAOCOAOAOAOTTTCAAAAOCAAAACATCTCTGCAGTTmc CCAAOTACCCTOAOATACTTCCCAAAOCCCTTATGnTAATCAOCOATOTATATAAOCCAOTTCACT TAOACAACTTTACCCTTCTTOTCCAATOTACAOOAAOTAOTTCT(序列3)6.2.重組FRP成Wnt通路基因在COS細胞中的炎達本實施例描述了一種在哺乳動物表達系統中產生全長人類FRP或 Wnt通路組分基因的方法.可以通過下述方法，構建含有編碼全長人類FRP或Wnt通路組分蛋 白或者可溶性FRP或Wnt通路組分蛋白的核酸表達構建物。應用基於序 列1公開的序列信息的PCR引物，通過逆轉錄(RT-PCR) mRNA獲得 上述編碼全長人類FRP或Wnt通路組分蛋白或者可溶性FRP或Wnt通 路組分蛋白的核酸，所述mRNA提取自表達FRP或Wnt通路組分的人細 胞，如人小梁網細胞.PCR引物還可以含有適宜的限制性酶切位點，用於引入表達質粒.然後將擴增的核酸插入到真核表達質粒如 pcDNAI/Amp (InVitrogen)中，所迷質粒含有1) SV40複製起點；2)
氨千青黴素耐藥基因；3)大腸桿菌複製起點；4)CMV啟動子以及隨後 的多接頭區域，SV40內含子和聚腺苷酸位點。然後將編碼全長人類FRP 或Wnt通路組分以及在其3，端框架融合的HA或myc標籤的DNA片段 克隆到多接頭區域.如前所述(I. Wiison， H. Niman， R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell 37， 767) ， HA標籤對應 於衍生於流感病毒血凝素蛋白的抗原決定簇。HA標籤與FRP或Wnt通 路組分的融合使應用能夠識別HA抗原決定簇的抗體來檢測重組蛋白更 加容易。為了表達重組FRP或Wnt通路組分，可以通過DEAE-DEXTRAN法 應用表達栽體轉染COS細胞(J. Sambrook， E, Fritsch， T. Maniatis， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)).應用抗HA抗體，可以通過放射標記和免疫沉澱法(E. Harlow， D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1988))檢測FRP或Wnt通路組分-HA蛋白的表達。為了檢測，轉染細 胞在轉染兩天後應用"S半胱氨酸標記。然後收穫細胞或者培養基(如， 對於可溶性FRP或Wnt通路組分)，使FRP或Wnt通路組分蛋白與HA 特異性單克隆抗體進行免疫沉澱反應。或者，也可以通過Western印跡 分析檢測重組蛋白的表達.為了確定全長FRP或Wnt通路組分是膜蛋 白，還是分泌型蛋白，可以應用去汙劑(RIPA緩沖液(150mMNaCl， 1% NP-40, 0.1% SDS， 1°/。 NP-40, 0.5% DOC， 50 mM Tris, pH 7.5 ))裂解轉染 了編碼全長FRP或Wnt通路組分蛋白栽體的細胞。(Wilson, I. et al. Id. 37: 767(1984))。然後在SDS-PAGE凝膠上分析沉澱蛋白.因此，細胞中存 在FRP或Wnt通路組分可以提示全長FRP或Wnt通路組分是膜結合的， 而在上清中存在FRP或Wnt通路組分則提示蛋白還以可溶性形式存在， 這種可溶性蛋白可能以分泌型蛋白的形式產生，或者通過滲漏的形式從 細胞中釋放出來。等價方隸本領域技術人員應該理解，或者能夠確認，應用常規試驗就可以產生很多本文描述的本發明特定實施方案的等價方案.這些等價方案也包 括在下迷權利要求範圍內.
序列表<110〉阿爾康公司青光眼的診斷和治療 ALA-003.25 PCT/USO1/06100 2001-02-26 60/186,073 2000-02-29<160〉 3 Patentln Ver. 2.1 1 4469 DNA <213〉人 1cctgcagcct ccggagtcag tgccgcgcgc ccgccgcccc gcgccttcct gctcgccgca 60 cctccgggag ccggggcgca cccagcccgc agcgccgcct ccccgcccgc gccgcctccg 120 accgcaggcc gagggccgcc actggccggg gggaccgggc agcagcttgc ggccgcggag 180 ccgggcaacg ctggggactg cgccttttgt ccccggaggt ccctggaagt ttgcggcagg 240 acgcgcgcgg ggaggcggcg gaggca.gccc cgacgtcgcg gagaacaggg cgcagagccg 300 gcatgggcat cgggcgcagc gaggggggcc gccgcggggc cctgggcgtg ctgctggcgc 360 tgggcgcggc gcttctggcc gtgggctcgg ccagcgagta cgactacgtg agcttccagt 420 cggacatcgg cccgtaccag agcgggcgct tctacaccaa gccacctcag tgcgtggaca 480 tccccgcgga cctgcggctg tgccacaacg tgggctacaa gaagatggtg ctgcccaacc 540 tgctggagca cgagaccatg gcggaggtga agcagcaggc cagcagctgg gtgcccctgc 600 tcaacaagaa ctgccacgcc gggaccc鄉tcttcctctg ctcgctcttc gcgcccgtct 660 gcctggaccg gcccatctac ccgtgtcgct ggctctgcga ggccgtgcgc gactcgtgcg 720 agccggtcat gcagttcttc ggcttctact ggcccgagat gcttaagtgt gacaagttcc 780 cggaggggga cgtctgcatc gccatgacgc cgcccaatgc caccgaagcc tccaagcccc 840 aaggcac犯c ggtgtgtcct ccctgtgaca acgagttgaa atctg嗎gcc atcattgaac 900 atctctgtgc cagcgagttt gcactgagga tgaaaataaa agaagtgaaa aaagaaaatg 960 gcgacaagaa gattgtcccc aagaagaaga agcccctgaa gttggggccc atcaagaaga 1020 aggacctgaa gaagcttgtg ctgtacctga agaatggggc tgactgtccc tgccaccagc 1080 tggacaacct cagccaccac ttcctcatca tgggccgcaa ggtgaagagc cagtacttgc 1140 tgacggccat ccaca喊gg gacaag咖a acaaggagtt caa咖cttc atgaagaaaa 1200formula see original document page 53tatttttaaa atatcctgtg taacacttgg ctcttggtac ctgtgggtta gcatcaagtt 3960 ctccccaggg tagaattcaa tcagagctcc agtttgcatt tggatgtgta aattacagta 4020 atcccatttc ccaaacctaa aatctgtttt tctcatcaga ctctgagtaa ctggttgctg 4080 tgtcataact tcatagatgc aggaggctca ggtgatctgt ttgaggagag caccctaggc 4140 agcctgcagg gaataacata ctggccgttc tgacctgttg ccagcagata cacaggacat 4200 ggatgaaatt cccgtttcct ctagtttctt cctgtagtac tcctctttta gatcctaagt 4260 ctcttacaaa agctttgaat actgtgaaaa tgttttacat tccatttcat ttgtgttgtt 4320 tttttaactg cattttacca gatgttttga tgttatcgct tatgttaata gtaattcccg 4380 tacgtgttca ttttattttc atgctttttc agccatgtat caatattcac ttgactaaaa 4440 tcactcaatt aatcaatgaa aaaaaaaaa 44692 313 PRT 人 2Met Gly He Gly Arg Ser Glu Gly Gly Arg Arg Gly Ala Leu Gly Val 15 10 15Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Val Gly Ser Ala Ser Glu 20 25 30Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gin Ser Asp He Gly Pro Tyr Gin Ser Gly 35 40 45Arg Phe Tyr Thr Lys Pro Pro Gin Cys Val Asp lie Pro Ala Asp Leu 50 55 60Arg Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80Leu Glu His Glu Thr Met Ala Glu Val Lys Gin Gin Ala Ser Ser Trp85 90 95Val Pro Leu Leu Asn Lys Asn Cys His Ala Gly Thr Gin Val Phe Leu 100 105 110Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro lie Tyr Pro Cys 115 ^120 125Arg Trp Leu Cys Glu Ala Val Arg Asp Ser Cys Glu Pro Val Met Gin 130 135 140 Phe Phe Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp Lys Phe Pro145 150 155 160Glu Gly Asp Val Cys He Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala Thr Glu Ala165 170 175Ser Lys Pro Gin Gly Thr Thr Val Cys Pro Pro Cys Asp Asn Glu Leu 180 185 190Lys Ser Glu Ala lie lie Glu His Leu Cys Ala Ser Glu Phe Ala Leu 195 200 205Arg Met Lys He Lys Glu Val Lys Lys Glu Asn Gly Asp Lys Lys lie 210 215 220Val Pro Lys Lys Lys Lys Pro Leu Lys Leu Gly Pro He Lys Lys Lys225 230 235 240Asp Leu Lys Lys Leu Val Leu Tyr Leu Lys Asn Gly Ala Asp Cys Pro245 250 255Cys His Gin Leu Asp Asn Leu Ser His His Phe Leu lie Met Gly Arg 260 265 270Lys Val Lys Ser Gin Tyr Leu Leu Thr Ala He His Lys Trp Asp Lys 275 280 285Lys Asn Lys Glu Phe Lys Asn Phe Met Lys Lys Met Lys Asn His Glu 290 295 300Cys Pro Thr Phe Gin Ser Val Phe Lys 305 310
權利要求
1.診斷青光眼的方法，包括檢測患者樣本中Wnt通路組分或捲曲相關蛋白基因產物的異常水平或生物活性。
2. 權利要求l的方法，其中患者樣本包括小梁網細胞組織細胞或患 者淚液。
3. 權利要求l的方法，其中巻曲相關蛋白基因產物的異常高水平可 以診斷青光眼狀態。
4. 權利要求3的方法，其中巻曲相關蛋白基因產物是FRP-1核酸或 FRP-1多肽。
5. 權利要求1的方法，其中Wnt通路組分選自Wnt基因，巻曲蛋白 基因，糖原合酶激酶基因，蛋白激酶C基因，(3-連環蛋白基因，TCF基 因，TCF調控基因以及刺蝟蛋白基因。
6. 權利要求1的方法，其中Wnt通路組分生物活性是(3-連環蛋白的 生物活性。
7. 權利要求6的方法，其中通過測定磷酸化(3-連環蛋白的水平來檢測 (3-連環蛋白的生物活性。
8. 權利要求6的方法，其中磷酸化!3-連環蛋白的異常高水平可以診斷青光眼狀態。
9. 權利要求l的方法，其中Wnt通路組分生物活性是激酶。
10. 權利要求8的方法，其中激酶是糖原合酶激酶-3或蛋白激酶C。
11. 權利要求10的方法，其中糖原合酶激酶-3活性或蛋白激酶C活 性水平的異常可以診斷青光眼狀態。
12. 診斷青光眼的方法，包括從患者樣本中檢測至少一種人Wnt通 路組分編碼基因或巻曲相關蛋白編碼基因的多態性等位基因。
13. 權利要求12的方法，其中患者樣本是血樣或頰部刮片樣本。
14. 權利要求12的方法，其中人多態性等位基因是FRP-1基因。
15. 權利要求14的方法，其中人多態性等位基因是FRP-1基因啟動子。
16. 權利要求15的方法，其中FRP-1基因啟動子多態性等位基因與 FRP-1基因產物表達增加有關。
17. 鑑定抗青光眼化合物的方法，包括將表達Wnt通路組分或巻曲相關蛋白基因產物的細胞與測試化合物混合；並檢測在測試化合物存在的情況下，所述Wnt通路組分或所述巻曲相 關蛋白基因產物的水平或生物活性；其中，在測試化合物存在的情況下，Wnt通路組分或巻曲相關蛋白 基因產物水平或生物活性相對於沒有測試化合物存在下的Wnt通路組分 或巻曲相關蛋白基因產物水平或生物活性的升高或降低，就能鑑定所述 測試化合物是一種抗青光眼化合物。
18. 權利要求17的方法，其中，在測試化合物存在的情況下，檢測 到的巻曲相關蛋白基因產物水平或生物活性相對於沒有測試化合物存在 下檢測到的水平或生物活性降低，就能鑑定所述測試化合物是一種抗青 光眼化合物。
19. 權利要求18的方法，其中巻曲相關蛋白基因是FRP-1。
20. 權利要求17的方法，其中，在測試化合物存在的情況下，檢測 到的Wnt通路組分水平或生物活性相對於沒有測試化合物存在下的檢測 到的水平或生物活性升高，就能鑑定所述測試化合物是一種抗青光眼化 合物。
21. 權利要求20的方法，其中Wnt通路組分選自Wnt基因產物， 巻曲蛋白基因產物，糖原合酶激酶基因產物，蛋白激酶C基因產物，|3-連環蛋白基因產物，TCF基因產物，TCF調控基因產物，以及刺蝟蛋白 基因產物。
22. 權利要求20的方法，其中Wnt通路組分生物活性是P-連環蛋白 的生物活性。
23. 權利要求22的方法，其中通過測定磷酸化P-連環蛋白的水平來 檢測(3-連環蛋白的生物活性。
24. 權利要求23的方法，其中在測試化合物存在的情況下，磷酸化 p-連環蛋白的水平相對於沒有測試化合物存在下的磷酸化(3-連環蛋白的 水平降低，就能鑑定所述測試化合物是一種抗青光眼化合物。
25. 權利要求17的方法，其中Wnt通路組分生物活性是激酶活性。
26. 權利要求25的方法，其中激酶活性是糖原合酶激酶-3的活性， 並且，在測試化合物存在的情況下，激酶活性水平相對於沒有測試化合 物存在下的激酶水平發生變化，就能筌定所述測試化合物是一種抗青光 眼4匕合物。
27. 權利要求25的方法，其中激酶活性是蛋白激酶C的活性，並且， 在測試化合物存在的情況下，激酶活性水平相對於沒有測試化合物存在 下的激酶水平發生變化，就能鑑定所述測試化合物是一種抗青光眼化合 物。
28. 鑑定抗青光眼化合物的方法，包括 將細胞樣本與測試化合物混合；並 測定Wnt響應基因的水平或生物活性；其中，在測試化合物存在的情況下，Wnt響應基因的水平相對於沒 有測試化合物存在下的Wnt響應基因的水平或生物活性增加，就能鑑定 所述測試化合物是一種抗青光眼化合物。
29. 權利要求28的方法，其中Wnt響應基因選自刺蝟蛋白基因， 鋸齒蛋白基因，Lef/tcf調控基因，合成報導基因。
30. 治療人類青光眼的方法，包括給該個體應用治療有效劑量的化 合物，所述化合物能夠調節Wnt通路組分或巻曲相關蛋白基因產物的水 平或生物活性。
31. 權利要求24的方法，其中所述化合物選自蛋白，肽，擬肽， 小分子或核酸。
32. 權利要求31的方法，其中所述核酸選自基因，反義，核酶和 三體核酸。
33. 權利要求31的方法，其中所述核酸是巻曲相關蛋白基因核酸。
34. 權利要求30的方法，其中所述化合物是巻曲相關蛋白基因產物 的拮抗劑。
35. 權利要求34的方法，其中所述化合物是基因治療藥物。
36. 權利要求34的方法，其中所述化合物是蛋白治療藥物。
37. 權利要求30的方法，其中所述化合物是能夠增加Wnt通路組分 基因水平或生物活性的製劑。
38. 權利要求30的方法，其中所述化合物含有突變巻曲相關蛋白基 因或基因產物的拮抗劑。
39. 權利要求38的方法，其中所述化合物是反義，核酶或三螺旋分子。
40. 權利要求38的方法，其中所述化合物是小分子，肽或擬肽。
41. 權利要求38的方法，其中所述化合物是抗體。
42. 篩檢巻曲相關蛋白激動劑或拮抗劑的方法，包括以下步驟a) 令巻曲相關蛋白多肽或其生物活性片段在一定條件下與巻曲相 關蛋白結合配體以及測試化合物結合，在所述條件下，對於測試化合物， 巻曲相關蛋白與巻曲相關蛋白結合配體能夠發生相互作用；並且b) 檢測在測試化合物存在的情況下，巻曲相關蛋白/巻曲相關蛋白結 合配體複合物的形成程度，其中，在測試化合物存在的情況下，相對於 沒有測試化合物存在的情況下，複合物形成的量增加，提示測試化合物 是巻曲相關蛋白激動劑，而在測試化合物存在的情況下，相對於沒有測 試化合物存在的情況下，複合物形成的量減少，提示測試化合物是巻曲 相關蛋白拮抗劑。
43.權利要求42的方法，該方法還可包括從測試化合物中製備藥物 組合物的步驟。
全文摘要
本發明提供了診斷青光眼的方法，包括檢測患者樣本中Wnt通路組分或捲曲相關蛋白基因產物的異常水平或生物活性。本發明還涉及鑑定抗青光眼化合物的方法以及篩檢捲曲相關蛋白激動劑或拮抗劑的方法。
文檔編號A61K39/395GK101117644SQ20061009448
公開日2008年2月6日 申請日期2001年2月26日 優先權日2000年2月29日
發明者A·F·克拉克, E·M·斯通, J·芬格爾特, L·麥克納特, W-H·王 申請人:阿爾康公司;衣阿華大學研究基金會