一種適用於烷基酚類藥物人工抗原的合成方法

2023-10-11 11:53:54

專利名稱：一種適用於烷基酚類藥物人工抗原的合成方法
技術領域：
本發明屬於生物化工技術領域，具體是涉及一種適用於烷基酚類藥物人工抗原的合成方法。
背景技術：
烷基酚類化合物(Alkyl Phenol，APs)，屬於內分泌幹擾物質中重要的一種，具有明顯的環境雌激素效應。該類化合物多為脂溶性有機化合物，化學穩定性較強，一旦攝入就不易降解排出，有生物累積性，危害性較大，即使微量也可對生物產生影響。同時其在環境中分布也十分廣泛，並且含量較低。烷基酚類化合物Ah是重要的精細化工原料，在表面活性劑、潤滑油添加劑、油溶性酚醛樹脂及絕緣材料、紡織印染、造紙助劑、農藥乳化劑、工業用洗滌劑、橡膠塑料的防老抗氧劑、油田及煉油廠化學品等領域具有廣泛用途。APs中最重要的是壬基酚(Nonyl Phenol, NP)和辛基酚(Octyphenol，OP)，二者只在長碳鏈相差一個甲基，它們同屬於聯合國UNEP制訂的持久性有毒化學汙染物。NP和OP等APs內分泌幹擾物主要為烷基酚聚環氧乙烷醚(Alkylphenolethoxylater，ΑΡΕ0)在環境降解過程中的中間產物。一般隨著APEO的排放進入環境，並且在環境中分布比較廣泛。Ah類化合物可以對生物體形成外因性雌性激素作用，其中又以OP為最強，NP次之，而其它Ah類化合物則依照親水端鏈從短到長，作用程度依次削減。Ah類化合物是促乳房癌細胞活性化與增殖現象的環境內分泌幹擾物。同時烷基酚類化合物對細胞的DNA有明顯的損傷作用，並且DNA的損傷程度與化學結構有一定的關係，苯酚環中增加其他基團，可使致突變活性增強，並且隨著苯酚環中氯原子數的增加，致突變活性也增強；隨著苯酚對位碳原子數增多，其致突變活性也增高等。因此，APs類物質也逐步被列入強制性禁用範圍，一些國家紛紛制定法規限制 APs的生產和使用。歐盟第2003/53/EC號指令規定紡織品中NP和NPEO含量均不能高於 O。1%。這些措施成為我國紡織品出口歐盟面臨的又一大技術貿易壁壘，因此對Ah檢測方法的研究提上日程。現今烷基酚主要的分析方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、LC-MS、 LC-MS/MS、GC/MS等。現有的儀器檢測法雖然有靈敏度高、適用範圍廣等優點，但是樣品前處理複雜，所需的儀器昂貴，成本高，檢測時間長，因此有必要研究特異性強，靈敏度高同時價格低廉，能快速簡便的免疫檢測技術。這就需要合成能產生簇特異性抗體的免疫原。目前為止，國內外尚沒有針對烷基酚結構多殘留的免疫檢測方法的報導，為此設計合成了以烷基酚的降解產物壬基酚的類似物NPA為半抗原的用於烷基酚類結構檢測的完全抗原。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中存在的不足，提供一種適用於烷基酚類藥物人工抗原的合成方法，利用該合成方法所製備的產品可用於烷基酚類結構的免疫分析方法研究，為今後的研究提供更好的必需的人工抗原。按照本發明提供的技術方案一種適用於烷基酚類藥物人工抗原的合成方法，其特徵在於以壬基酚類似物為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯，用聚丙烯醯胺凝膠電泳測定偶聯物的偶聯比；具體包括如下步驟(1)人工抗原的合成(a)壬基酚類似物、N-羥基硫代琥珀醯亞胺、碳二亞胺、牛血清白蛋白以摩爾比為 80 120 136 1的比例反應，將壬基酚類似物溶於N，N-二甲基甲醯胺DMF溶液中，然後轉移到棕色小瓶中，加入N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulf-MB)和碳二亞胺(EDC)，室溫反應6h，製得A液；將牛血清白蛋白(BSA)溶解到磷酸鹽(PBQ緩衝液中，製得B液；然後將 A液緩慢滴加到B液中，室溫反應池，離心去掉沉澱，取上清液即得到烷基酚類藥物人工抗原混合液；(b)透析袋前處理取IOcm的透析袋，於沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水衝洗:3min，保存在4°C去離子水中備用；(c)將步驟(1)製得的烷基酚類藥物人工抗原混合液移入透析袋中，每天先用 0. OlM的pH7. 4的磷酸鹽緩衝溶液透析2次，磷酸鹽緩衝溶液每次用量2L，再用去離子水透析2次，去離子水每次用量2L，共透析3天；最後使用凍幹法將透析袋中的液體製成粉末， 得到壬基酚類似物-牛血清白蛋白，即是烷基酚類藥物人工抗原；(2)人工抗原的鑑定採用紫外掃描儀測定得到的壬基酚類似物-牛血清白蛋白的偶聯比，分別在272nm、278nm波長處測吸光值，並計算偶聯比。偶聯比測定是估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率(偶聯比率)的方法，雖然測定方法種類很多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量(或相對含量)的原理建立起來的。分光光度法是利用物質對光的吸收與其濃度呈比例關係的原理分別測定被偶聯的兩種分子濃度。在大分子與小分子偶聯物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，並表現出光譜圖迭加的性質。作為本發明的進一步改進，所述人工抗原的鑑定方法具體如下將偶聯產物壬基酚類似物-牛血清白蛋白用超純水稀釋到150μ g · mL—1，以超純水作空白對照，用紫外掃描儀測稀釋液在272nm、278nm波長處的吸光值，稀釋液在272nm的吸光值為A1，稀釋液在 278nm 的吸光值為 A2，依據公式 r = (A1X ε 腳-A2 X εΒ272)/(Α2Χ Sa272-A1X ε Α278)計算偶聯比；式中ε Α為壬基酚類似物的摩爾吸光係數，ε A272為272nm處的摩爾吸光係數，ε Α278為 278nm處的摩爾吸光係數；ε Β為牛血清白蛋白的摩爾吸光係數，ε Β272為272nm處的摩爾吸光係數，εΒ278 * 278ηπι處的摩爾吸光係數。作為本發明的進一步改進，所述壬基酚類似物是10-苯基癸酸。作為本發明的進一步改進，所述壬基酚類似物通過如下方法製備取摩爾比為 1 1的庚二酸二甲酯和庚二酸，在PH為11的氫氧化鈉鹼性溶液中水解反應12小時得到庚二羧酸酯，然後再加入亞硫醯氯在苯中反應，得到庚二羧酸氯酯；將庚二羧酸氯酯滴入到苯甲醚的二氯乙烷溶液中，在0°c下攪拌反應M小時，用乙醚萃取，然後再用鋅粉和醋酸汞在甲苯中回流反應6小時；旋蒸乾後用乙醇溶解，並加入10%氫氧化鈉溶液回流水解反應6 小時，再旋蒸乾得沉澱；將沉澱用冰醋酸溶解，並加入48%的溴化氫回流反應6小時，再旋蒸乾，並在乙醇中重結晶，得到帶有羧基的壬基酚類似物(NPA)，即10-苯基癸酸。偶聯物蛋白濃度通過以下實驗方法測定配製濃度分別為0，40，60，80，100，120， 160，200 μ g · mL—1的牛血清白蛋白溶液1. 5ml，加入5ml考馬斯亮藍染色液，立即混勻， 30°C下水浴溫熱5分鐘，每個濃度做平行樣。在595nm處測吸光值，繪製牛血清白蛋白濃度與吸光值的關係曲線。將偶聯物溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定偶聯物溶液的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應的蛋白濃度。本實驗計算得偶聯物溶液的蛋白濃度為 6. 6253mg · ml—1。本發明與現有技術相比，優點在於本發明的合成方法能夠成功合成壬基酚類似物的人工抗原，合成步驟簡潔、有效，完全可用於免疫分析當中，為以後人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足國內對其研究的需要。


圖1為NPA、BSA及其偶聯物的紫外紫外掃描圖。圖2為利用間接ELISA方法測得的壬基酚類似物_牛血清白蛋白的標準抑制曲線。
具體實施例方式下面結合具體附圖和實施例對本發明作進一步說明。實施例1壬基酚類似物的製備取IOOmmol的庚二酸二甲酯和IOOmmol的庚二酸，在pH為 11的氫氧化鈉鹼性溶液中水解反應12小時得到庚二羧酸酯，然後再加入足夠量的亞硫醯氯在苯中反應，使庚二羧酸酯全部轉化為庚二羧酸氯酯；將庚二羧酸氯酯滴入到苯甲醚的二氯乙烷溶液中，在o°c下攪拌反應M小時，用乙醚萃取，然後再用鋅粉和醋酸汞在甲苯中回流反應6小時；旋蒸乾後用乙醇溶解，並加入10%氫氧化鈉溶液回流水解反應6小時， 再旋蒸乾得沉澱；將沉澱用冰醋酸溶解，並加入48%的溴化氫回流反應6小時，再旋蒸乾， 並在乙醇中重結晶，得到帶有羧基的壬基酚類似物NPA。上述製得的壬基酚類似物NPA為 10"苯基癸酸，其只比壬基酚NP在其烷基鏈末端多了一個羧基，其它結構部位完全相同，從而保留了苯酚基的抗原決定簇。人工抗原的製備(a)、取 0. 5ml 含有 Umg(0. 04538mmol)的壬基酚 NP 類似物 NPA 的 N，N- 二甲基甲醯胺DMF溶液到棕色小瓶中，加入14. 77mg (0. 06807mmol)的N-羥基硫代琥珀醯亞胺Sulf-NHS和14. 78mg (0. 07715mmol)的碳二亞胺EDC，室溫反應6h，製得A液；將 37. 55mg(0. 56725 μ mol)的牛血清白蛋白BSA溶解到0. OlM的pH為7. 4的磷酸鹽PBS緩衝液中，製得B液；然後將A液緩慢滴加到B液中，室溫反應3h，離心去掉沉澱，取上清液即得到烷基酚類藥物人工抗原混合液；(b)透析袋前處理取IOcm的透析袋，於沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水衝洗:3min，保存在4°C去離子水中備用；(c)將步驟(1)製得的烷基酚類藥物人工抗原混合液移入透析袋中，每天先用 0. OlM的pH7. 4的磷酸鹽緩衝溶液透析2次，磷酸鹽緩衝溶液每次用量2L，再用去離子水透析2次，去離子水每次用量2L，共透析3天；最後使用凍幹法將透析袋中的液體製成粉末， 得到壬基酚類似物-牛血清白蛋白，即是烷基酚類藥物人工抗原；(2)人工抗原的鑑定採用紫外掃描儀測定得到的壬基酚類似物-牛血清白蛋白的偶聯比，分別在272nm、278nm波長處測吸光值，並計算偶聯比。
該鑑定方法具體如下將偶聯產物壬基酚類似物-牛血清白蛋白用超純水稀釋到150μ g · mL—1，以超純水作空白對照，用紫外掃描儀測稀釋液在272nm、278nm波長處的吸光值，稀釋液在272nm的吸光值為A1,稀釋液在278nm的吸光值為A2,依據公式r = (A1X ε腳-A2X εΒ272)/(Α2Χ Ea272-A1X ε Α278)計算偶聯比。式中ε Α為壬基酚類似物的摩爾吸光係數，ε A272為272nm處的摩爾吸光係數，ε Α278為278nm處的摩爾吸光係數，ε A272 = 3622L · moF1, ε = 3006L · πιοΓ1 ； ε B為牛血清白蛋白的摩爾吸光係數，ε B272為272nm 處的摩爾吸光係數，￡擬78為278nm處的摩爾吸光係數，ε B278 = 41059L · πιοΓ1、ε Β272 = 251656L · πιοΓ1。經計算，本實施例中壬基酚類似物-牛血清白蛋白的偶聯比r ^ 17。所述壬基酚類似物的摩爾吸收係數ε Α通過以下實驗方法獲得配製濃度分別為 0,10, 20, 30 μ g. mr1的壬基酚類似物(NPA)超純水溶液，通過紫外掃描可知壬基酚類似物的最大吸收波長為272nm，牛血清白蛋白BSA的最大吸收波長為278nm，分別在272nm、278nm 處測其吸光值，每個濃度做平行樣，摩爾吸光係數計算為ε A=吸光值/摩爾濃度。本實驗計胃得 ε Α272 = 3622L · moF\ ε Α278 = 3006L · mol—1。所述牛血清白蛋白的摩爾吸收係數ε B通過以下實驗方法獲得配製濃度分別為 0,0. 2,0.4,0.6,0.8, l.Omg· mr1的牛血清白蛋白(BSA)超純水溶液，通過紫外掃描可知牛血清白蛋白BSA的最大吸收波長為278nm，分別在278nm、272nm測吸光值，每個濃度做平行樣。本實驗計算得摩爾吸光係數分別為ε Β278 = 41059L · πιοΓ1、ε Β272 = 251656L · moF10蛋白濃度測定具體方法為配製濃度分別為0，40，60，80，100，120，160， 200 yg -πιΓ1的牛血清白蛋白溶液1. 5ml，加入5ml考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30°C下水浴溫熱5分鐘，每個濃度做平行樣。在595nm處測吸光值，繪製牛血清白蛋白濃度與吸光值的關係曲線(如圖1所示)。將抗原溶液液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應的蛋白濃度。本實驗計算得抗原溶液的蛋白濃度為 6. 6253mg · ml—1。利用間接ELISA方法測的壬基酚類似物-牛血清白蛋白的標準抑制曲線，結果如圖2所示。用製得的壬基酚類似物-牛血清白蛋白偶聯物進行免疫學實驗，相關實驗數據如表1。表1 不同兔子抗血清的抗血清效價
權利要求
1.一種適用於烷基酚類藥物人工抗原的合成方法，其特徵在於以壬基酚類似物為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯，用聚丙烯醯胺凝膠電泳測定偶聯物的偶聯比；具體包括如下步驟(1)人工抗原的合成(a)壬基酚類似物、N-羥基硫代琥珀醯亞胺、碳二亞胺、牛血清白蛋白以摩爾比為 80 120 136 1的比例反應，將壬基酚類似物溶於N，N-二甲基甲醯胺DMF溶液中，然後轉移到棕色小瓶中，加入N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulf-MB)和碳二亞胺(EDC)，室溫反應他，製得A液；將牛血清白蛋白(BSA)溶解到磷酸鹽(PBQ緩衝液中，製得B液；然後將 A液緩慢滴加到B液中，室溫反應池，離心去掉沉澱，取上清液即得到烷基酚類藥物人工抗原混合液；(b)透析袋前處理取IOcm的透析袋，於沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水衝洗 3min，保存在4°C去離子水中備用；(c)將步驟(1)製得的烷基酚類藥物人工抗原混合液移入透析袋中，每天先用0.OlM的 PH7. 4的磷酸鹽緩衝溶液透析2次，磷酸鹽緩衝溶液每次用量2L，再用去離子水透析2次， 去離子水每次用量2L，共透析3天；最後使用凍幹法將透析袋中的液體製成粉末，得到壬基酚類似物-牛血清白蛋白，即是烷基酚類藥物人工抗原；(2)人工抗原的鑑定採用紫外掃描儀測定得到的壬基酚類似物-牛血清白蛋白的偶聯比，分別在272nm、278nm波長處測吸光值，並計算偶聯比。
2.如權利要求1所述的適用於烷基酚類藥物人工抗原的合成方法，其特徵在於所述壬基酚類似物是10-苯基癸酸。
3.如權利要求2所述的適用於烷基酚類藥物人工抗原的合成方法，其特徵在於所述壬基酚類似物通過如下方法製備取摩爾比為1 1的庚二酸二甲酯和庚二酸，在PH為11 的氫氧化鈉鹼性溶液中水解反應12小時得到庚二羧酸酯，然後再加入亞硫醯氯在苯中反應，得到庚二羧酸氯酯；將庚二羧酸氯酯滴入到苯甲醚的二氯乙烷溶液中，在0°C下攪拌反應M小時，用乙醚萃取，然後再用鋅粉和醋酸汞在甲苯中回流反應6小時；旋蒸乾後用乙醇溶解，並加入10%氫氧化鈉溶液回流水解反應6小時，再旋蒸乾得沉澱；將沉澱用冰醋酸溶解，並加入48%的溴化氫回流反應6小時，再旋蒸乾，並在乙醇中重結晶，得到帶有羧基的壬基酚類似物(NPA)，即10-苯基癸酸。
4.如權利要求1所述的適用於烷基酚類藥物人工抗原的合成方法，其特徵在於所述人工抗原的鑑定方法具體如下將偶聯產物壬基酚類似物-牛血清白蛋白用超純水稀釋到150μ g · πιΓ1,以超純水作空白對照，用紫外掃描儀測稀釋液在272nm、278nm波長處的吸光值，稀釋液在272nm的吸光值為A1,稀釋液在278nm的吸光值為A2,依據公式r = (A1X ε腳-A2X εΒ272)/(Α2Χ Ea272-A1X ε Α278)計算偶聯比；式中ε Α為壬基酚類似物的摩爾吸光係數，ε A272為272nm處的摩爾吸光係數，ε Α278為278nm處的摩爾吸光係數；ε B為牛血清白蛋白的摩爾吸光係數，εΒ272為272nm處的摩爾吸光係數，ε B瀏為278nm處的摩爾吸光係數。
全文摘要
本發明涉及一種適用於烷基酚類藥物人工抗原的合成方法。按照本發明提供的技術方案其主要以壬基酚類似物為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯，用聚丙烯醯胺凝膠電泳測定偶聯物的偶聯比。本發明的合成方法能夠成功合成壬基酚類似物的人工抗原，合成步驟簡潔、有效，完全可用於免疫分析當中，為以後人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足國內對其研究的需要。
文檔編號C07K14/765GK102321171SQ20111030441
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月11日 優先權日2011年10月11日
發明者匡華, 周亮, 季曉丹, 殷祥剛, 胥傳來, 董激文, 金勉勉 申請人:中華人民共和國無錫出入境檢驗檢疫局