一種依諾肝素鈉的生產方法
2023-10-23 09:29:02 1
一種依諾肝素鈉的生產方法
【專利摘要】本發明公開了一種依諾肝素鈉的生產方法，所述方法首先將肝素鈉酶解後，進行HPLC分析，採用峰面積歸一化法計算各個峰的含量，根據肝素鈉酶解後的二糖和四糖的標準圖譜，確定待測肝素鈉酶解後二糖和四糖的種類，並與標準圖譜的二糖和四糖的含量進行比較，選擇符合標準要求的肝素鈉原料進行依諾肝素鈉的生產。本發明簡單有效，不僅能夠保證產品的安全性有效性，而且從源頭控制依諾肝素鈉的質量，能夠避免肝素鈉原料藥的浪費，大大節約了成本，提高了生產效率。
【專利說明】一種依諾肝素鈉的生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，具體地說是一種依諾肝素鈉的生產方法。
【背景技術】
[0002] 肝素是由L-艾杜糖醛酸（或葡糖醛酸）和N-乙醯葡糖胺（或D-葡糖胺）形成 的二糖單元重複構成的高度硫酸化的線性多糖，具有抗凝血作用，被廣泛用於治療靜脈血 栓和預防凝血。低分子肝素是未分級肝素中具有較低分子量的組份或片段，是新一代肝素 類抗血栓藥物。肝素經過酶或化學的方式部分降解就可以獲得低分子肝素。低分子肝素類 產品因分子量較小，不易被第IV因子中和，抗凝效果和纖溶作用得以增強，而抗血小板、影 響血小板功能、影響血液凝固性、誘發出血的作用大為減弱，加之生物利用度高達98%，量 效關係明確，抗凝效果易於預測，血漿半衰期較普通肝素長2?3倍，同時具有快速和持續 的抗血栓形成作用，改善血流動力學，因而國內市場以那曲肝素鈣、依諾肝素鈉為代表的低 分子肝素類產品已逐步取代普通肝素產品。依諾肝素鈉是由法國安萬特公司研製開發的一 種目前銷售量最大的新型抗凝藥物。
[0003] 由於低分子肝素鈉結構的多樣性，因此低分子肝素鈉的結構確定非常重要。FDA要 求從結構上證明仿製藥物與原產家藥物具有生物一致性。因此，低分子肝素精細結構的分 析方法很快成為學術界和製藥界關注的焦點。
[0004] 依諾肝素鈉需要嚴格控制完全降解後的依諾肝素鈉產生的二糖及四糖的含量， 以及依諾肝素鈉獨有的1，6-脫氫環結構的含量，以保證產品的有效性和安全性。專利 CN102792158B提供了一種用於定量分析的依諾肝素鈉特徵性寡糖結構的毛細管電泳方法。 專利CN102323355B提供了一種酶解-HPLC法檢測依諾肝素的方法。這兩種方法都是依諾 肝素鈉的結構分析方法，是對成品的質量控制，無法從源頭對依諾肝素鈉的質量進行控制。
[0005] 肝素原料藥可直接被用於製成標準肝素製劑，或進一步加工製成低分子肝素原料 藥，再製成低分子肝素製劑。肝素鈉是從新鮮的健康的生豬的小腸黏膜中提取製成的，由於 原料的差異性，導致所製得的肝素鈉結構的差異性。同樣地，由於不同批次肝素鈉結構差 異，使得加工得到的達肝素鈉批次間也存在差異。在達肝素鈉的生產中，存在因肝素鈉的結 構不適合，致使該批達肝素鈉產品的結構不符合標準的情況，不僅浪費時間、人力和物力， 而且不利於生產和經濟。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的就是針對上述現有技術的不足，提供一種依諾肝素鈉的生產方法， 本法包括對原料的篩選，本發明簡單有效，不僅能夠保證產品的安全性有效性，而且能夠避 免肝素鈉原料的浪費，提高了生產效率。
[0007] 本發明的目的可以通過以下措施達到：
[0008] -種依諾肝素鈉的生產方法，其包括如下步驟：
[0009] 1)肝素鈉酶解：將肝素鈉原料配製成水溶液，向其加入含有肝素酶I、肝素酶II 和肝素酶III的混合肝素酶溶液，進行酶解64?72小時，製成肝素鈉酶解溶液；其中混合肝 素酶溶液中各肝素酶的含量比為肝素酶I :肝素酶II :肝素酶111= 1:0. 6:0. 2;
[0010] 2)分離分析：將所述肝素鈉酶解溶液注入HPLC中進行檢測，記錄色譜圖，根據肝 素鈉的二糖和四糖的保留時間，確定待測肝素鈉中的二糖和四糖的種類，並計算待測肝素 鈉酶解後10個二糖和2個四糖的含量；其中檢測條件為：色譜柱為季銨型強陰離子交換色 譜柱，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為220?240nm，使用流動相A和流動相B梯度洗脫， 所述流動相A為磷酸二氫鈉溶液，所述流動相B為磷酸二氫鈉和高氯酸鈉的混合溶液；
[0011] 3)原料藥篩選：選取酶解後二糖和四糖的含量符合下述要求的待測肝素鈉作 為依諾肝素鈉原料；其中二糖和四糖色譜峰的峰面積分別在1. 8%?3.7 %、< 1.0%、 1. 8%?3. 6%、2· 3%?4. 4%、1· 1%?2. 1%、彡 3. 9%、8· 4%?11. 9%、4· 0%?8. 8%、 1. 1%?2. 0%、彡 1. 0%、52· 4%?66. 9%、1· 6%?3. 4%範圍內；
[0012] 4)生產依諾肝素鈉：以步驟3)中選取的肝素鈉為原料，經過季銨鹽化、酯化和氧 化反應，得到依諾肝素鈉。
[0013] 在步驟1)中，酶解溫度優選為25°C ;混合肝素酶溶液中肝素酶I的含量為 1. 0/3IU/mL，肝素酶II的含量為0. 6/3IU/mL，肝素酶III的含量為0. 2/3IU/mL。
[0014] 在步驟2)中，流動相的配製優選為：流動相為流動相A和流動相B，所述流動相A 為0. 20?0. 30g/L的磷酸二氫鈉溶液，所述流動相B為0. 20?0. 30g/L的磷酸二氫鈉和 120?140g/L的高氯酸鈉的混合溶液。在HPLC檢測過程中，進樣量為5?20 μ L，流速為 0· 2 ?1. 2mL/min，柱溫為 50 ?55°C。
[0015] 在步驟2)中，儀器條件：所用儀器為高效液相色譜儀（HPLC)，色譜柱季銨型強 陰離子交換色譜柱，所用檢測器為紫外檢測器，檢測波長為220?240nm，進樣量為5? 20 μ L，流速為0. 2?1. 2mL/min，柱溫為50?55°C，使用流動相A和流動相B梯度洗脫的 過程優選見表1。
[0016] 表 1
[0017]
【權利要求】
1. 一種依諾肝素鈉的生產方法，其特徵在於其包括如下步驟： 1) 肝素鈉酶解：將肝素鈉原料配製成水溶液，向其加入含有肝素酶I、肝素酶II和肝 素酶III的混合肝素酶溶液，進行酶解64?72小時，製成肝素鈉酶解溶液；其中混合肝素酶 溶液中各肝素酶的含量比為肝素酶I :肝素酶II :肝素酶111= 1:0. 6:0. 2; 2) 分離分析：將所述肝素鈉酶解溶液注入HPLC中進行檢測，記錄色譜圖，根據肝素鈉 的二糖和四糖的保留時間，確定待測肝素鈉中的二糖和四糖的種類，並計算待測肝素鈉酶 解後10個二糖和2個四糖的含量；其中檢測條件為：色譜柱為季銨型強陰離子交換色譜 柱，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為220?240nm，使用流動相A和流動相B梯度洗脫，所 述流動相A為磷酸二氫鈉溶液，所述流動相B為磷酸二氫鈉和高氯酸鈉的混合溶液； 3) 原料藥篩選：選取酶解後二糖和四糖的含量符合下述要求的待測肝素鈉作為依諾 肝素鈉原料；其中二糖和四糖色譜峰的峰面積分別在1.8%?3.7%、< 1.0%、1. 8%? 3. 6%、2· 3%?4. 4%、1· 1%?2. 1%、彡 3. 9%、8· 4%?11. 9%、4· 0%?8. 8%、1· 1%? 2.0%、彡 1·0%、52·4%?66·9%、1·6%?3.4%範圍內； 4) 生產依諾肝素鈉：以步驟3)中選取的肝素鈉為原料，經過季銨鹽化、酯化和氧化反 應，得到依諾肝素鈉。
2. 根據權利要求1所述的依諾肝素鈉的生產方法，其特徵在於在步驟1)中，酶解溫度 為25°C ;混合肝素酶溶液中肝素酶I的含量為1.0/3IU/mL，肝素酶II的含量為0.6/3IU/ mL，肝素酶III的含量為0. 2/3IU/mL。
3. 根據權利要求1所述的依諾肝素鈉的生產方法，其特徵在於在步驟2)中，所述流動 相A為0. 20?0. 30g/L的磷酸二氫鈉溶液，所述流動相B為0. 20?0. 30g/L的磷酸二氫 鈉和120?140g/L的高氯酸鈉的混合溶液。
4. 根據權利要求1所述的依諾肝素鈉的生產方法，其特徵在於在步驟2)中，在HPLC檢 測過程中，進樣量為5?20 μ L，流速為0. 2?1. 2mL/min，柱溫為50?55°C。
5. 根據權利要求1所述的依諾肝素鈉的生產方法，其特徵在於在步驟2)中，10個二糖 分別為Λ IVA、A IVSgal、A IVS、A ΙΙΑ、Λ ΙΙΙΑ、Λ IISgal、A IIS、A IIIS、A IA和Λ IS， 2 個四糖分別為Λ ΠΑ-IVSglu 和Λ IIA-IISglu。
6. 根據權利要求1或5所述的依諾肝素鈉的生產方法，其特徵在於在步驟3)中，選取 的依諾肝素鈉原料酶解後二糖和四糖的含量要求為：
其中"P"表示此峰必須存在。
7. 根據權利要求1所述的依諾肝素鈉的生產方法，其特徵在於在步驟2)中，使用流動 相Λ和流動相β進行梯度洗脫的過程為:_
8. 根據權利要求1所述的依諾肝素鈉的生產方法，其特徵在於在步驟4)中，稱取篩 選出的肝素鈉原料，加水溶解製成8%?15%的肝素鈉溶液，20?30°C下緩緩加入卞索 氯銨溶液，充分混勻，離心分離得到季銨鹽肝素，重複進行洗滌和離心操作後乾燥，向季銨 鹽肝素中加入二氯甲烷後攪拌溶解加入氯化苄，保持溶液溫度29?31°C進行酯化反應 得到酯化液，對酯化液用無水乙酸鈉的甲醇液沉澱，再用水和氯化鈉溶液並用甲醇沉澱 後，得到酯化肝素；取酯化肝素用純化水溶解後加入氫氧化鈉溶液反應，再用酸調節溶液 PH值至7. 0-7. 5用用甲醇沉澱，將沉澱物加入純化水溶解溶液後加入過氧化氫，在PH值 10. 5-11. 0、溫度25-30°C下進行氧化反應，反應後調節溶液PH6. 1?6. 3,再用濾膜過濾並 用乙醇沉澱，將沉澱物脫水乾燥得到依諾肝素鈉。
9. 根據權利要求8所述的依諾肝素鈉的生產方法，其特徵在於在步驟4)中，卞索氯銨 固體的加入量是肝素鈉重量的1?5倍，優選為2?3倍，更優選為2. 5倍，卞索氯銨溶液的 質量含量為5?15%，所述的季銨鹽肝素的乾燥溫度為47?53°C，乾燥時間為60?70h， 所述的無水乙酸鈉的甲醇液的加入量為二氯甲烷與氯化苄總體積的1. 2倍；季銨鹽肝素與 二氯甲烷的重量體積比為1 :3.5 (g/ml)，季銨鹽肝素與氯化苄的重量體積比為1 :1 (g/ml)， 酯化反應時間為24?26h ;酯化肝素與氫氧化鈉溶液反應時,酯化肝素與氫氧化鈉的質量 比為10 :1。
【文檔編號】C08B37/10GK104193849SQ201410398891
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月13日 優先權日:2014年8月13日
【發明者】唐詠群, 黃錫偉, 段豔冰 申請人:南京健友生化製藥股份有限公司