利用飛秒雷射使微生物失活的系統和方法

2023-10-23 11:45:57 4

專利名稱：利用飛秒雷射使微生物失活的系統和方法
利用飛秒雷射使微生物失活的系統和方法關於聯邦政府資助研究的聲明作為通過國家科學基金會給予的基金號DMR-0305147和由美國國防部保健科學 軍醫大學三軍放射生物學研究所給予的基金號RAB2CF的條款所提供的，美國政府擁有對 本發明的已付費的許可，並擁有在受限情況下要求專利所有人在合理的條件下許可他人的 權利。相關申請的交叉參考本申請要求於2007年6月1日遞交的序列號60/932，668，發明名稱為「利用可見 飛秒雷射來減少微生物活性的系統和方法」的美國臨時專利申請的優先權，其全部內容在 此引入作為參考。
背景技術：
本發明涉及使微生物失活或降低微生物活性的領域，具體而言，涉及使用產生可 見或近紅外飛秒雷射的衝擊受激拉曼散射以引起這種失活或減少。用於使病毒失活或改變病毒和其它微生物活性的現有方法並不完全有效，且又會 引起抗性和臨床副作用問題。微生物可經歷遺傳基因突變，導致它們變得對抗生素、抗菌 劑、抗病毒藥物、清潔產品、人類免疫系統、紫外線(UV)處理、照射和其它意在使它們失活 的藥劑有抗性。此外，目前使用的抗微生物劑的副作用也限制了它們在臨床環境中的應用。避免抗性問題的一種方法是微波/超聲吸收。該技術旨在將微生物內的振動模式 激發到如此高的振幅，以致於引起它們的失活/解體。由於微生物的突變對其結構蛋白、脂 類和碳水化合物包括衣殼、外殼蛋白、細胞壁、細胞膜和膜結合蛋白的振動頻率沒有影響， 因此微生物無法通過突變來避開破壞。從而，該方法避免了微生物抗性株的產生或進化，並 能有效地用於使野生型和突變的微生物失活。對於通過微波/超聲吸收激發而言，主要障礙在於水也會吸收這些通常為 30GHz-300GHz的振動頻率(參見以下參考文獻1和2)。由於在活性微生物存在的地方通 常也存在水，因此大量的會誘發微生物振動能量的微波/超聲激發能量都被水所替代吸收 了。因而這樣的方法對於大多數應用並不可行。因此需要用於誘導微生物內振動的更有效 的方法來完全實現這一目的。先前用雷射來減少微生物活性的方法使用了破壞微生物的蛋白質結構的UV激 光。其它方法涉及使用不同波長的雷射。然而，除了殺死微生物以外，這些技術需要大量的 動力，並且破壞期望的物質例如人細胞、血小板和蛋白。為了減少發明詳述內容的複雜性和長度，同時為了在某些技術領域完整地建立現 有技術水平，申請人在此明確地引入所有下列材料作為參考，所述材料確定於如下每個編 號段落。1. Ford LH，球形病毒顆粒振動頻率的評估，Phys. Rev. E67， 051924-1-051924-3(2003) ·2. Tsen KT, Dykeman EC, Sankey OF, Lin N-T, Tsen S-ff D, KiangJG 通過拉曼光
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發明內容
本發明以最小化副作用並且不受響應於選擇壓力的抗性發展的影響的方式，尤其 提供了一種使微生物失活或減少微生物活性的裝置和方法。「使微生物失活或減少微生物 活性」指「抑制/減少微生物的生長、生存、功能和/或傳染性」。本發明的一個目的是操作、控制和使微生物失活。本發明的一個目的是在水存在下激發微生物中的振動態。本發明的一個目的是使用在IR和可見光譜區的低能電磁波激發微生物的振動 態。本發明的一個目的是使用衝擊受激拉曼散射(ISRS)對微生物功能性必需的結構 上產生大振幅的振動模式。本發明的一個目的是通過ISRS在對於微生物功能性必需的結構上將相干聲拉曼 激活振動模式激發到一種狀態，該狀態導致微生物活性的選擇性減少，包括通過受迫機械 聲振動的失活。本發明的一個目的是使病毒和/或細菌失活，使得病毒和/或細菌的組成部分以 可用於接種的方式被改變或解體。本發明的一個目的是選擇性使微生物失活而不影響真核細胞。本發明的一個目的是使血液中血源性病原體失活同時不傷害關鍵的血細胞和血 液組分。以上的和其它的目的可使用包括能在具有相應於對水基本上透過的電磁頻譜區 的波長的波寬上產生飛秒輻射脈衝的雷射器的設備來實現。該設備還使用了諧波發生器例 如非線性BBO晶體，其產生散射效應，接著通過激發微生物的振動態來照射微生物。該設備 還可以具有聚焦透鏡例如顯微鏡物鏡。雷射器可以是一個鈦藍寶石雷射器。目標微生物包 括病毒和細菌以及原生動物。以上的和其它的目的可使用這樣的方法來達到，包括用對水基本上透過的電磁頻譜區內的飛秒脈衝輻射激發微生物的振動態，轉而在微生物內產生機械聲激發。當光束聚 焦於微生物上時，機械聲激發隨後導致微生物活性減少。可通過機械聲激發將微生物的活 性減少到這樣一種程度以致於該微生物失活。在此所示的本發明的方面和應用在下面的附圖和發明詳述部分進行描述。對於適 用領域技術人員而言，除非特別說明，說明書和權利要求書中的用詞和短語的含義都具有 普通的、通常的和習慣的含義。本發明人完全明白如果需要的話他們可以是其自己的詞典 編纂者。作為其自己的詞典編纂者，本發明人明確地選擇僅使用說明書和權利要求書中的 術語的普通的和通常的含義，除非他們另外清楚地陳述，以及進一步特別地闡明該術語的 「特別」定義並解釋其如何不同於普通的和通常的含義。如果缺少這種旨在應用「特別」定 義的清楚陳述，則將這些術語的簡單的、普通的和通常的含義應用於說明書和權利要求書 的解釋就是本發明人的意圖和需要。本發明人也知曉英文語法的標準規則。因此，如果名詞、術語或短語意在以某種方 式進行進一步表徵、指定或限定，則根據英文語法的標準規則，這樣的名詞、術語或短語將 明確地包括附加的形容詞、描述性術語或其它修飾詞。如果不使用這樣的形容詞、描述性術 語或修飾詞，則如上所述對於適用領域技術人員而言，意在對這樣的名詞、術語或短語給出 它們普通的、和通常的英文含義。此外，本發明人完全通曉35 U. S. C. § 112，· | 6的專門條款的標準和應用。因此， 在發明詳述或


或權利要求書中的詞語「功能」、「手段」或「步驟」的使用並不意在以 某種方式指示援引35 U. S. C. § 112，· I |6的專門條款來定義本發明的意願。相反地，如果 尋求援引35 U. S. C. § 112，· I 6的條款來定義本發明，則權利要求書將特別地且明確地陳 述確切的短語"...的手段」或"...的步驟」，也將陳述詞語「功能」(即，將陳述「執行[插 入功能]功能的手段」)，而不在這樣的短語中陳述任何結構、材料或動作來支持該功能。因 此，即使當權利要求書陳述「用於執行...功能的手段」或「用於執行...功能的步驟」，如 果該權利要求同時陳述任何結構、材料或動作來支持該手段或步驟，或者支持執行所陳述 的功能，則這就是本發明人不援引35 U. S. C. §112，· |6的條款的清楚意圖。此外，即使 35 U. S. C. § 112，· I 6的條款被援引來定義所要求保護的發明，本發明也不受限於僅在優 選的實施方案中所描述的特殊結構、材料或動作，而是除此之外，還包括如本發明替代實施 方案或形式中所描述的執行所請求保護功能的任何和所有結構、材料或動作，或用於執行 所請求保護功能的公知存在的或隨後開發的等價的結構、材料或動作。

當考慮與下列說明性附圖結合時，可從所涉及的發明詳述中導出本發明的更完整 的理解。在這些附圖中，所有附圖的相同的附圖標記表示相同的元件或動作。圖1顯示了可用於減少M13噬菌體活性的本發明的一種形式。圖2A顯示了滴定度為1 X IO3Pfu的M13噬菌體不經過雷射照射的噬菌斑形成分 析結果。圖2B顯示了滴定度為IX IO3Pfu的M13噬菌體經過雷射照射的噬菌斑形成分析結果。圖3A顯示了滴定度為5X IO2Pfu的M13噬菌體不經過雷射照射的噬菌斑形成分
圖3B顯示了滴定度為5 X IO2Pfu的M13噬菌體經過雷射照射的噬菌斑形成分析結果。圖4顯示了滴定度為1 X IO3Pfu的M13噬菌體經過改變的激發雷射功率密度的噬 菌斑形成分析結果。圖5是顯示不同的脈衝寬度使微生物失活結果的表格。附圖中的元件和動作是用簡單形式舉例說明，並不需要根據任何特殊的順序或實 施方案來展現。發明詳述在下面的描述中，為了解釋的目的，列出很多的細節以便提供對本發明各方面的 全面理解。然而，對於相關領域的技術人員而言，應當明白本發明可以不用這些細節來實 施。在其它實例中，更一般性地展示或討論已知的結構和設備以避免使本發明變得模糊不 清。在很多例子裡，操作的描述足以使人們實施本發明的各種形式。應當指出有很多不同 的和可選的配置、設備和技術可以應用於公開的本發明。本發明的全部範圍並不限於以下 所描述的實例內。本發明用對水基本上透過的電磁頻譜區中的超短波、低能脈衝激發微生物的振動 態。一個這樣的區域是可見光譜。衝擊受激拉曼散射(ISRS)可用於在存在於液體溶液的 分子中產生大振幅的振動模式，以及在固態系統中產生點陣振動(參見參考文獻3)。在分子以及固態系統中已經成功地說明了 ISRS(參見參考文獻8-12)。在分子系 統中，由於斯託克斯(Stokes)頻率包含在激發脈衝的譜寬中，因此用單雷射束激發的ISRS 是一種受激的前向散射過程。此外，只要足夠短的雷射脈衝通過拉曼激活固體或分子液體 或氣體，ISRS為一個過程，通過該過程相干點陣或分子振動的激發將會發生。對單光束激 發來說，如果忽略衰減，則由ISRS引起的離開平衡分子間距的位移的振幅(Rtl)可由下式給 出
2 2.R0 = {δα / SR) 0β'ω°τι 'Α I πιω^ηο(ι);其中I是激發雷射的功率密度；α是媒質的極化率；R是離開平衡分子間距的位 移；δ α / δ R與拉曼散射截面成正比；COtl是相干振動激勵的角頻率；τ L是激發雷射的脈 衝寬度的半峰全寬(FWHM) ；m是分子質量；11是折射率；以及c是光速(參見參考文獻3)。基於上述方程式，更大的拉曼截面、更高的雷射功率密度，以及更低的振動頻率， 都會造成更大的激發振動幅度。對於很多具有足夠低的振動頻率和合理的激發功率密度的 拉曼散射截面來說，通過ISRS可以實現在0.01-IA範圍內的振動位移幅度。相對於分子 位移，激發的分子系統的極化率應該大於10_16Cm2。在該範圍內的振動位移幅度可用於在微生物中產生振動。例如，M13噬菌體顯示 與病毒衣殼的軸向扭轉振動相關的低頻(約8. 5cm-1)振動模式(參見參考文獻13和14)。 使用超短脈衝雷射激發，該振動模式的振幅可通過ISRS以相干方式激發，以達到微生物的 活性減少的程度。為了減少活性，必須超過振動模式的振幅閾值。例如，參見圖4，直至超過約50MW/ cm2的激發雷射功率密度後，M13噬菌體的活性才受到影響。此外，即使超過激發雷射功率
9密度的閾值，如果脈衝寬度長於800飛秒，則活性也不受影響。其它微生物在不同於M13噬 菌體的振幅上可具有自己的活性減少，這樣的振幅通過上述方程式估計。在本發明的一種形式中，可見飛秒雷射系統通過ISRS在微生物內將相干聲拉曼 激活振動模式激發至導致其活性選擇性減少的狀態，包括其通過機械聲激發使其失活。現 在參見圖1，雷射器100產生具有給定重複頻率的大約飛秒的脈衝(參見參考文獻4-7)。倍 頻器200用於照射樣品。反射鏡310、320、330和340將光束反射到聚焦透鏡400，該聚焦透 鏡400把光束聚焦到樣品容器500中。在樣品容器505的局部放大圖中，光束聚焦把樣品 容器限定在光束強聚焦的510區域內和光束較不強聚焦的520區域內。可用於本發明的雷射器的一個實例是二極體抽運cw模式鎖定的鈦藍寶石雷射 器。然而，其它飛秒雷射器也可以使用。這樣的飛秒雷射器包括環形雷射器、氬泵浦雙噴 射染料雷射器(argon-pumpeddual-jet dye lasers)或YAG雷射器的二次諧波輸出、超短 脈衝光纖雷射器。其它Ti 藍寶石雷射器包括集束泵浦雷射器(Integrated pumplaser) 例如來自Time-Bandwidth Products的Pallas-LP，腔倒空飛秒Ti 藍寶石雷射系統例如 Tiger-CD可調諧Nd 玻璃雷射器，如來自Time-Bandwidth Products的GLX-200，或被動模 式鎖定薄盤雷射器例如來自Time-Bandwidth Products的Fortis。設定雷射器以產生設定的重複頻率的脈衝連續波。優選地，脈衝為約80飛秒波寬 以及重複頻率為約80MHz，波長為約425nm，以及功率為約40mW。然而，也可使用其它設定。 例如，可使用約1阿秒_約1皮秒的脈衝寬度和約400nm-約900nm的波長。優選地，諧波生成系統可以是BBO非線性晶體，但是用於倍頻近紅外至可見光的 其它非線性晶體也可使用。這些替代的非線性晶體包括LB0、LiNb03、KTP、LiTa03、KNb03、 KDP, CLBO, ΒΙΒ0、CB0、ZGP、AgGaS2、AgGaSe2、CdSe 和 GaAs 非線性晶體。聚焦透鏡可以是具有超長工作距離，優選約2. Ocm的顯微鏡物鏡。然而，也可使用 具有不同工作距離的其它聚焦透鏡。聚焦透鏡可包括複合透鏡或光纖透鏡。可調整本發明以將雷射聚焦在其表面上具有微生物的結構上，以一種特定的方式 破壞該微生物的結構，或減少存在於液體、固體或氣體中的微生物的活性。對於飛秒雷射器類型、其設定和特性的更詳細討論，可參見以下文章，在此引入作 為參考82. Claude Rulliere,Femtosecond Laser Pulses 理論禾口實驗[Principles and Experiments (Advance Texts in Physics)]第 2 版· (2005).83. Jean Claude Diels和Wolfgang Rudolph，超短雷射脈衝現象飛秒時間規模 的基本原理、技術和應用(光學和光電子學系列)，Academic Press (1996).84. Sigrid Avrillier，飛秒雷射在生物學中的應用，Proceedings ofSPIE, Volume 5463(2004).現在參看圖2A和2B，用具有425nm波長和100飛秒脈衝寬度的Inj/脈衝飛秒激 光照射用IX IO3Pfu的M13噬菌體製備的三塊獨立平板。M13噬菌體失活至統計學顯著(注 意圖中y軸在比例上的不同)。現在參見圖3A和3B，用具有425nm波長和100飛秒脈衝寬度的Inj/脈衝飛秒激 光照射用5 X IO2空斑形成單位的M13噬菌體製備的三塊獨立平板。M13噬菌體失活至統計 學顯著(注意圖中y軸在比例上的不同)。
現在參見圖4，M13噬菌體以1. 1 X 103pfu/板的濃度鋪板並經受波長425nm和 IOOfs脈衝寬度的脈衝。使用不同的雷射功率密度。至少對於M13噬菌體，達到至少45MW/ cm2的雷射功率密度的雷射才能有效使噬菌體失活。這些設定對於所有微生物可能是不同 的。現在參看圖5，測定了具有425nm脈衝和64MW/cm2能量的不同脈衝寬度照射對Ml3 噬菌體的影響。注意到除非脈衝長度低於800飛秒，否則不能有效失活。這些設定對於所 有微生物可能是不相同的。根據本發明的具體實施方案，通過使用衝擊受激拉曼散射，本發明可用飛秒雷射 選擇性使病毒失活。M13噬菌體樣品以1. 1 X 107pfu/ml鋪板並經受425nm波長和IOOfs脈 衝寬度的脈衝。使用不同的雷射功率密度。至少對於M13噬菌體，達到至少49MW/cm2的激 光功率密度的雷射才能有效使噬菌體失活。對於非常低功率的可見飛秒雷射，病毒如M13 噬菌體可通過ISRS過程而失活。對於所有微生物這些設定可能是不相同的，然而，應當明 白本發明可通過利用飛秒雷射系統的操作和控制來選擇性使微生物失活，同時使敏感物質 不受傷害。因此，對於不同類型的微生物，可在能選擇性使目標病毒和細菌失活而不在哺乳 動物細胞中引起細胞毒性的功率密度中，利用相應的窗口適當選擇波長和脈衝寬度。對於選擇性使微生物失活的更詳細討論，參見下列文章，在此引入作為參考85. K. T. Tsen等，使用通過衝擊受激拉曼散射的飛秒雷射滅活病毒，Proceedings of SPIE, Volume 6854，68540N(2008).86. K. Τ. Tsen等，用近紅外飛秒選擇性滅活微生物，J. Phys. =Condensed Matter 19,472201(1-7)(2007).87. K. Τ. Tsen等，由通過衝擊受激拉曼散射過程的雷射驅動相干激發滅活病毒， Journal of Biomedical Optics 12，064030 (1-7)(2007).88. K. Τ. Tsen等，用亞皮秒近紅外雷射脈衝選擇性滅活人體免疫缺陷病毒， J.Phys. =Condensed Matter,20,252205(1-4) (2008).可利用本發明的其它實施方案以從微生物中提取核酸。通過激發微生物，本發明 允許在微生物蛋白衣殼上形成穿孔，從而，微生物內的核酸可被釋放並被收集和分析。此外，由于振動幅度隨著雷射功率密度持續變化，本發明的其它實施方案可包括 激發微生物直至微生物達到失活的狀態，但以一種改變或破裂的狀態保持完整。預計這樣 的微生物可用於疫苗的製造。在此陳述實施方案和實例是為了最好地解釋本發明及其實際應用，從而使得本領 域技術人員能實施並使用本發明。然而，本領域技術人員應當認識到前述描述和實例僅用 於說明和示例的目的。所述的描述並不意在窮舉或限制本發明於所公開的確切形式。許多 修改和改變可以從上述的教導中得出而不背離隨後權利要求的精神和範圍。
權利要求
一種減少微生物活性的裝置，該裝置包括雷射器，該雷射器具有被設定產生在對水基本上可透過的電磁頻譜區內的飛秒脈衝的輸出功率；和諧波發生器，該諧波發生器對飛秒脈衝進行操作以產生散射效應，從而通過激發微生物的振動態而照射微生物。
2.根據權利要求1所述的裝置，其中，所述雷射器包括鈦藍寶石雷射器或超短脈衝光 纖雷射器。
3.根據權利要求1所述的裝置，其中，所述飛秒脈衝具有在1納焦/脈衝到1毫焦/脈 衝範圍內的功率。
4.根據權利要求1所述的裝置，其中，所述諧波發生器包括非線性晶體。
5.根據權利要求1所述的裝置，其中，所述諧波發生器包括BBO非線性晶體。
6.根據權利要求1所述的裝置，其中，對水基本上可透過的電磁頻譜區包括紅外區和 可見光區。
7.根據權利要求1所述的裝置，其中，所述微生物包括病毒。
8.根據權利要求1所述的裝置，其中，所述微生物包括細菌。
9.根據權利要求1所述的裝置，該裝置還包括將散射脈衝聚焦於微生物上的聚焦透^Mi ο
10.根據權利要求9所述的裝置，其中，所述聚焦透鏡包括顯微鏡物鏡。
11.一種減少微生物活性的方法，該方法包括用在對水基本上可透過的電磁頻譜區中的波長的飛秒脈衝輻射照射微生物到振動狀 態，從而在微生物內產生減少微生物活性的人工聲激發。
12.根據權利要求11所述的方法，該方法還包括將激發源的光束聚焦於微生物上。
13.根據權利要求11所述的方法，其中，所述微生物被失活。
14.根據權利要求1所述的裝置，其中，所述微生物包括原生動物。
全文摘要
本發明涉及一種使微生物失活或減少微生物活性的方法和應用該方法的裝置。通過用輻射飛秒寬度的脈衝激發微生物的振動狀態減少微生物活性。脈衝的波長處於水基本上透過的電磁頻譜區，例如可見光。脈衝引起微生物的振動，使得其活性減少。雷射器產生這樣的脈衝。然後諧波發生器作用於脈衝以產生用於照射微生物的散射效應。一種這樣的雷射器是鈦藍寶石雷射器。諧波發生器的一個實例是非線性晶體例如BBO晶體。該裝置還可具有聚焦透鏡例如將光束聚焦於微生物上的顯微鏡物鏡。本發明有效地使病毒或細菌失活。本發明可用於從微生物中提取核酸。本發明可用於製造疫苗。本發明使選擇性使目標病毒和細菌失活而不引起哺乳動物細胞內的細胞毒性成為可能。
文檔編號G01N21/76GK101971008SQ200880101152
公開日2011年2月9日 申請日期2008年6月2日 優先權日2007年6月1日
發明者鄭功榮 申請人:紹偉·D.·鄭;朱麗安·G.·江;鄭功榮