一種抗豬鏈球菌細菌素及其生產方法與專用菌株的製作方法

2023-10-07 21:55:04

專利名稱：：一種抗豬鏈球菌細菌素及其生產方法與專用菌株的製作方法
技術領域：
：本發明提供一株有自主智慧財產權的屎腸球菌，及該屎腸球菌產生的細菌素、細菌素的製備方法與應用，屬於生物
技術領域：
。發明的
背景技術：
：隨著對微生物活性代謝產物研究的進行，乳酸菌及其產生的細菌素成為研究的熱點。某些乳酸菌細菌素能抑制常見的腐敗菌和一些病原菌。細菌素是菌體通過核糖體合成機制產生的一類具有抑菌生物活性的多肽，具有較好的選擇性殺菌效果，對熱、酸等穩定性好，經蛋白酶作用而降解，不會在體內殘留，具有較高的安全性，因而得到了較為廣泛的研究應用。其中，腸球菌是乳酸細菌的一個屬，為動物體內正常定居的微生物，其產生的細菌素在複雜的微生態環境中扮演著非常重要的角色，對許多種屬的微生物表現出強烈的抑菌活性，不同的腸球菌素抑菌譜各不相同。在腸球菌素的研究中，有關屎腸菌素的報導最多。防治動物疾病是屎腸球菌及其產生細菌素的重要應用方向。至今為止，純化為均一物質並被深入研究的屎腸球菌素有enterocinA,P,B,L50A,L50B,I,Q，M,從不同生境篩選的屎腸球菌及其產生的細菌素目前主要用來防治動物的大腸桿菌、沙門氏菌等的感染。應用方法為屎腸球菌作為益生菌製劑添加入飼料中，通過促進其生長的低聚糖等來使其定植於腸道中，發揮其抗菌效果，以預防感染；屎腸球菌產生的細菌素純品稀釋到一定濃度後，以生理鹽水或滅菌注射用水稀釋，肌肉注射，連用34d來治療豬的各種細菌性感染疾病。豬鏈球菌病為一種常見的豬病，在我國其病原菌主要以馬鏈球菌獸疫亞種為主。該病在豬群中以呼吸道為主要傳播途徑，且可以通過傷口、消化道等途徑傳播，發病率和死亡率均較高。目前,全群預防在臨床上常用弱毒疫苗免疫和飼餵抗生素兩種方法。由於致病性豬鏈球菌的血清型較多，故免疫預防常常不能起到很好的效果；抗生素雖能夠在一定程度上控制該病的流行，但容易引起豬胃腸道菌群失調，造成耐藥菌增多及肉製品藥物殘留等問題，因此，用可以強烈抑制病原菌的細菌素來代替傳統治療方法成為促進養豬業健康發展的必然選擇。本發明所解決的問題本發明的目的是針對我國目前沒有可以安全有效防治豬鏈球菌病方法，豬鏈球菌病頻頻發生，為養豬業帶來了巨大的經濟損失的現實，提供一株有自主智慧財產權的屎腸球菌，及該菌所產細菌素的製備方法及應用。該細菌素對酸、熱穩定，可以強烈抑制豬鏈球菌病的主要病原菌-馬鏈球菌獸疫亞種，易被胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K降解，提取方法簡單易行，應用效果良好，為預防和治療豬鏈球菌病提供了新的途徑。
發明內容本發明篩選出一株產細菌素屎腸球菌LPL420P06，已於2009年1月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC2856，所產細菌素具有抑制馬鏈球菌獸疫亞種(該菌是我國養豬業流行的豬鏈球菌病的主要病原菌)的活性。本發明屎腸球菌LPL420P06的特徵是在MRS液體培養基中多呈對排列，細胞卵圓形，菌體大小為0.62.0jmix0.62.5nm,不生芽孢，革蘭氏陽性，兼性厭氧。在MRS固體培養基上呈現微小圓形，白色突起、較厚、邊緣圓整的菌落。可發酵糖類產酸。其接觸酶陰性，不運動，在10'C、45'C，6.5%NaCl，pH值9.6均能生長，V-P反應、精氨酸雙水解酶和馬尿酸水解為陽性，具有LancefieldD群抗原，不能耐受0.04%亞碲酸鹽。本發明還提供了抗豬鏈球菌細菌素產生菌的篩選方法及該菌產細菌素培養方法。本發明之產抗豬鏈球菌細菌素菌株的定向篩選方法，從健康長白、大白未斷奶仔豬的糞便中隨機取樣，將所得單菌落點種於含馬鏈球菌獸疫亞種(引起豬鏈球菌病的主要病原菌)的固體平板上進行初篩，37°C培養24h觀察周圍有抑菌圈的菌落即懷疑為細菌素產生菌。將初篩得到的菌株進行培養，得到發酵上清液，排除幹擾因素(有機酸如乳酸、過氧化氫及菌體細胞等)的幹擾後仍有抑菌活性，而經蛋白酶的處理後無抑菌活性上清液對應的菌株為產細菌素菌株。本發明之產細菌素屎腸球菌菌株產生細菌素的培養基為糖蜜3-5%、豆粉34%、酵母膏1.5-2%、麩皮浸出液10-15%、吐溫0.1%、磷酸氫二鉀0.2%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸銨0.2%、硫酸鎂0.058%、硫酸錳0.025%,pH值6.5-7.0，培養條件為30-35'C下培養14h-16h後添加等量酵母膏與麩皮浸出液，繼續培養8h-10h。本發明還包括細菌素的製備方法，採用pH值依賴的吸附解吸法進行提取，吸附pH值為4.0-7.0(最佳為6.0),解吸pH值為1.5-2.5(最佳為2.5)，陽離子交換樹脂層析後冷凍乾燥得到純品。本發明還提供了該細菌素的理化特性、抑菌譜及在防治豬鏈球菌病方面的應用。本發明的優點本發明篩選出的屎腸球菌LPM20P06可以產生屎腸球菌細菌素，該細菌素可以強烈抑制引起豬鏈球菌病的馬鏈球菌獸疫亞種，從而使其具有很好的使用價值。屎腸球菌LPL420P06可以在較廉價的培養基中產生活力較強的細菌素，生產方法較為簡單易行，成本較低，對豬鏈球菌病的預防與治療效果明顯。屎腸球菌LPL420P06產生的細菌素具有較穩定的理化特性，抑菌譜較廣，可以用於微生態製劑的開發。圖1為在不同pH值下細菌素對產生菌和指示菌的吸附率指示圖。圖2為細菌素在pH5.5條件下的陽離子樹脂層析洗脫曲線圖。圖3為細菌素對溫度的穩定性圖。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不僅限於本發明。實施實例1菌種的篩選鑑定從健康未斷奶仔豬的糞便中分離出108株產生較大溶鈣圈的可疑乳酸菌，經點種法初篩後，發現來自於長白仔豬的菌株LPL420P05，LPL420P06,LPL420P09,LPL420P027,LPL420P029,LPL420P033,LPL420P054和來自於大白仔豬的LPL420P11,LPL420P117，LPL420P126的發酵上清液對豬鏈球菌有不同程度的抑制作用。將10株菌離心上清液用lMNaOH中和有機酸，加入過氧化氫酶，使其濃度為lmg/mL，37'C水浴lh,經細菌濾器過濾除去菌體細胞，硫酸銨沉澱、透析處理後，僅菌株LPL420P06的代謝產物有較好的抑制豬鏈球菌活性。向菌株LPL420P06透析液中加入蛋白酶K(20U/mL),37'C作用lh後發現抑菌活性消火。用」倍稀釋法測定其不同處理後的抑菌效價值，結果見表1表1不同處理對抑菌活性的影響不同處理抑菌圈直徑效價值(AU/mL)1〔中和前)18.12mm1602(中和後)18.26mm1603(去除菌體細胞)18.18mm1604(60%硫銨沉澱)22.84mm12805(透析袋處理後)24》0mm12806(凍幹處理後)23.20mm12806(PBS緩衝液)007(飽和硫銨溶液)008(蛋白酶K處理)00我們選擇對豬鏈球菌抑菌效果最好的菌株LPL420P06培養鑑定，其特徵為在液體培養基中呈對排列，細胞卵圓形，菌體大小為0.62.0nmx0.62.5nm,不生芽孢，革蘭氏陽性，兼性厭氧。在MRS固體培養基上呈現微小圓形，白色突起、較厚、邊緣圓整的菌落。用菌株LPL420P06發酵上清液做紙層析試驗，與標準乳酸的Rf值對照基本一致，說明菌株LPL420P06發酵產物中有機酸含有乳酸，該菌屬於乳酸細菌。菌株LPL420P06的生理生化試驗表明，其接觸酶陰性，不運動，在10'C、45'C，6.5%NaCl，pH值9.6均能生長，V-P反應、精氨酸雙水解酶和馬尿酸水解為陽性，具有LancefieldD群抗原，不能耐受0.04%亞碲酸鹽，結合糖醇發酵試驗結果(見表2),參照伯傑氏鑑定細菌學手冊(第八版)，初步確定該菌株屬於屎腸球菌。進一步經16SrRNA序列鑑定知，菌株LPL420P06為屎腸球菌。表2菌株LPL420P06生理生化特徵試驗測試項目結果測試項目結果接觸酶-纖維二糖+運動性-半乳糖+45'C生長+乳糖-l(TC生長+麥牙糖+厭氧生長+澱粉-6.5%NaCl+核糖pH值9.6水楊苷V-P反應+海藻糖精氨酸雙水解酶+甘露醇+馬尿酸鹽松三糖LancefieldD群抗原+蜜二糖+0.04%亞碲酸鹽-D-棉籽糖+苦杏仁苷+山梨醇L-阿拉伯糖+D-木糖葡糖酸鹽-蔗糖實施實例2屎腸球菌所產細菌素的培養基及培養條件確定基礎培養基(MRS培養基)葡萄糖2%、蛋白腖1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、乙酸鈉0.5%、擰檬酸銨0.2%、硫酸鎂0.058%、硫酸錳0.025%、吐溫訓.1%，pH6,5。不同培養溫度細菌素產生的影響分別在30'C、35°C、37°C、42'C三個溫度下，以基礎培養基培養24h，將發酵上淸液做抑菌實驗，比較溫度對細菌素產生的影響。接種於MRS培養基在不同培養溫度下培養時細胞的生長及細菌素產生情況見表3:在不同溫度下培養時，生長與細菌素產生都有很大不同，在30-35'C培養時，細菌素活性較好。表3培養溫度對細菌素產生的影響tableseeoriginaldocumentpage6最終pH值4.14±0.00264.02±0.00383.96±0.00193.99±0.0053效價AU/ml138.00±1.1514126.00±1.228980.00±1.538598.00±0.5622培養pH值對細菌素產生的影響pH值5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的培養條件下培養至穩定期(24h)，接種於不同pH值的MRS培養基在3(TC下培養時細胞的生長及細菌素產生情況見表4，培養pH值對細菌素的產生有明顯的影響，在pH6.0-7.0時細菌素產量較高。表4培養pH對細菌素產生的影響tableseeoriginaldocumentpage7碳源不同添加量對細菌素產量的影響糖蜜為3%、4%、5%的添加量，代替MRS中的葡萄糖成分，在以上實驗確定的最佳培養條件(即30'C、初始pH6.5)下培養24h，結果見表5,可知添加3%-4。/。的糖蜜，可得到較大產量的細菌素。_表5碳源對細菌素產量的影響_碳源_活菌數(lg)_ODeop最終pH值效價AU/ml3%8.59±0.53601.92±0.00604.16±0.0025131.00±1.56304%8.17±0.84100.95±0細65.00±0.0053120.00±0.45005%9.17±0.48602.12±0.00183.82±0.007280.00±0.4920不同氮源不同添加量對細菌素產量的影響氮源分別添加不同量的豆粉、酵母膏、麩皮浸出液代替MRS培養基中的氮源成分進行單因素試驗，表6氮源對細菌素產量的影響tableseeoriginaldocumentpage7補料添加時間對細菌素產量的影響在培養的不同時間添加的酵母膏lj麩皮浸山液作為補料，得劃的結果見表7，可知在14h-16h後添加補料，繼續培養8h-10h，可得到較大產量的細菌素。表7補料添加時間對細菌素產量的影響tableseeoriginaldocumentpage8因此，該菌株作為細菌素產生菌，考慮到其大量應用，可採用如下改良MRS培養基，其成分為糖蜜3-4%，豆粉3-4%，酵母膏1.5-2%,麩皮浸出液10-15%,吐溫0.1%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸銨0.2%,硫酸鎂0.058%,硫酸錳0.025%，pH值6.5-7.0，培養條件為30-35'C卜培養14h-16h後添加等量的酵母膏和麩皮浸出液，繼續培養8h-10h,以延長菌體的對數生長期，可得到細齒素的最火產ii。實施實例3屎腸球菌所產細菌素的提取最佳的吸附解吸pH值的確定(1)離心收集細胞-包括產生菌和指示菌，用滅菌的PBS(5mMpH6.0)衝洗幾次並重懸於l.OMNaCl中用5%的磷酸調pH2.0,在4°C混勻lh，離心收集並重懸於20倍初始體積的無菌水中，以確保細胞表面己沒有吸附的細菌素。(2)確定pH對細菌素吸附的影響(包括產生菌和指示菌)，O.lmL細胞(產生菌或指示菌)，O.lmL—定效價的細菌素加入1.8mL的PBS用磷酸或氫氧化納調pH在1.5-14.0之間，混合物於3(TC緩慢震蕩30min，離心檢測上清液中的效價。對照1:用O.lmL的水代替O.lmL的細菌素；對照2:用O.lmL的水代替加入的細胞；細菌素的吸附率=100%*(上沾液中的效價-對照l)/對照2。(3)從吸附了細菌素的產生菌表面提純細菌素，準備一定量的培養液，7(TC，25min滅酶後調至最適吸附pH,4°C磁力攪拌2h，然後細胞用相同pH值的PBS洗淨，重懸於一定體積的0.1M的NaCL中，用5%的磷酸調pH至2.5，4'C磁力攪拌至解吸充分，得到如圖1的結果。利用該細菌素可以吸附於產生菌細胞的特點，通過調節pH值實現了高效的純化。將該菌以1°/。(V/V)的接種量(約107CFU/mL)接種，培養溫度為3(TC，轉速100rpm，發酵過程中控制pH值為6.5，發酵過程中補料，24h後結束髮酵。結束髮酵後調溫度至70'C,25min滅酶。冷卻至室溫後將發酵液調至最適吸附pH6.0，100rpm恆速攪拌2h,離心收集細胞，用與吸附pH值相同的磷酸緩衝液洗細胞1-2次，重懸T200mL的NaCI(O.lmol/L)溶液中,調至最佳解吸pH值2.5,4。C磁力攪拌12h以上，8000rpm,離心15min,上清液即為粗提物。將得到的粗品用pH值5.5，0.02M醋酸緩衝液溶解至終濃度為lmg/mL,取樣品l.OmL上樣,進行陽離子交換層析(採用陽離子樹脂填料SPSepharoseFastFlow25mL)，待樣品全部進入柱中後，接入平衡緩衝液進行洗脫，同時開始收集流出液。調整洗脫流速約為l.OmL/min,每3min收集一管，洗脫過程中同時檢測蛋白質濃度即紫外吸收值A280。待雜蛋白峰洗脫結束後，以0.5MNaCI的pH值5.5，0.02M醋酸緩衝液洗脫目的蛋白。檢測洗脫液的紫外吸收值，得到如圖l洗脫曲線，洗脫出的第一個峰(即34-38管)經檢測有較好的抑菌活性，收集活性峰透析24h後凍T為細菌素純品。實施實例4屎腸球菌所產細菌素的應用特性細菌素對熱的穩定性將細菌素在60-10(TC下分別水浴中處理15min禾U30min,12rC處理15min,所得結果如圖2所示，細菌素在60-卯'C下分別處理15min和30min，其殘留效價經統計分析沒有顯著性差異(p>0.05);當處理溫度達到IOO'C時，細菌素可保持約50%的活性；在121'C，15min處理後，其活性明顯下降，但仍可以保持部分活性。試驗結果表明，該細菌素具有很好的熱穩定性，在巴氏殺菌(65-80'C15min)的條件下基本不會失活，因此具有很好的應用前景。細菌素對蛋白酶的敏感性細菌素對蛋白酶的敏感性試驗結果如下表8所示，此糞腸球菌細菌素可以被胰蛋白酶、蚩白酶K、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶完全失活，胃蛋白酶部分失活、溶菌酶不能使細菌素失活。說明該細菌素是一種蛋白類物質，且由於可被蛋白酶降解而不會在體內殘留，因此具有較高的安全性。表8細菌素對蛋白酶的敏感性蛋白酶最適pH範圍殘留的抑菌活性(mm)是否失活胃蛋白酶(pepsin)1.5-20十蛋白酶K(proteinaseK)5陽90+胰蛋白酶(trypsin)7.8-8.70+木瓜蛋白酶(papain)3-90+溶菌酶(lysozyme)6-715.24±0.18-中性蛋白酶(nutralproteinase)5.5-7.50+CK15.68±0.20-注+表示有抑菌活性；一表示沒有抑菌活性。細菌素對表面活性劑的穩定性對在飼料生產加工過程中，常會用到一些乳化劑如，吐溫20、司本80等，因此有必要研究它們對細菌素活性的影響。結果(見表9)表明，四種表面活性劑對細齒素的活性影響較小，而SDS使得細菌素的活性有增強，有可能是細菌素這種聚合體在SDS的作用下其空間結構發生變化，更容易與敏感細胞接觸，導致其殺菌能力增強。表9細菌素對表面活性劑的穩定性9代號處理效價AU/ml表面活性劑影響0CK658/1SDS783+2吐溫20621-3吐溫80669-4司本80651一注+表示有抑菌活性；_表示沒有抑菌活性*細菌素的抑菌譜屎腸球菌LPL420P06菌株所產細菌素的抑菌譜測定結果見表10:表10菌株LPL420P06所產細菌素的抑菌譜指示菌來源培養基細菌素粗提液(mm)金黃色葡萄球菌(""iSffl//^/0c0ccm5.CGMCCTSB27.68±0.121,128)金黃色葡萄球菌(&flewMl.89)實驗室收藏TSB19.7±0.18金黃色葡萄球菌ACTT653S)ATCCTSB17.04土0.23金黃色葡萄球菌(S."ew"李)實驗室收藏TSB0金黃色葡萄球菌"，aerett26112)CGMCCTSB0金黃色葡萄球菌flew"GJ。實驗室收藏TSB0大腸桿菌K12(￡jc/^n'c/^co//K12)微生物與生物技術國家重點實驗室贈LB20.02±0.19大腸桿菌(￡.co/!'K88C83901血清型中國獸藥監察所LBOS:K87(B)，K88ab)22.78±0,35大腸桿菌(￡.co//K99C835290141:K99)中國獸藥監察所TSB大腸桿菌(￡.co/z'ATCC80739)ATCCLB23'42±0.21大腸桿菌(￡.co/H.90)實驗室收藏TSYEB13'42±0.16單增李斯特氏菌(Zi加Wamo/u)0^o併"e20.80±0.3754002)NICPBPTSB單增李斯特氏菌(L/nowootogewes(l/2a))實驗室收藏TSYEB20.38±0.22伊氏李斯特氏菌(丄.iV朋ov"LIV-l)實驗室收藏TSYEB25.22±0.08伊氏李斯特氏菌(丄./v朋ov&'LIV-2)實驗室收藏TSYEB19.28±0.31斯氏李斯特氏菌(Z.5"/z'ge/7'LS、)實驗室收藏TSYEB15.72±0,20單增李斯特氏菌(丄./wo/ioo^og朋"(4b))實驗室收藏TSYEB15,84±0,33枯草芽孢桿菌(5.幼&'7&)實驗室收藏LB15.94土0.36蠟樣芽孢桿菌(及cermw)實驗室收藏LB16.20t0.22藤黃微球菌(Mcwco"i/5/"Zeu5)實驗室收藏TSB18.98±0.16凝結芽孢桿菌(醜oa'〃iucoflgwZfl"siffl附附er)實驗室收藏TSYEB19.22±0,14假單胞菌(/^etw/o卿"as)實驗室收藏TSYEB25.48士0.06丁酸梭菌(C/o加Ww/Ti6mWw附)實驗室收藏TSYEB25.78±0.14馬鏈球菌獸疫亞種(^ft/"印/ococaw25.20±0.23中國獸藥監察所THB19.88±0.162型豬鏈球菌(S^ococcws幼&serotype2，基礎獸醫學國家重點SS2)四川分離株ZY05719實驗室贈TOB1632±0.182型豬鏈球菌(Sfe/^ococcwsserotype2,基礎獸醫學國家重點SS2)江蘇株HA9801實驗室贈THB18.25±0.06熱殺索絲(5raC"A/"ix//^/7W05//l。加)實驗室收藏TSB21.60±0.17沙門氏菌(Sfl/mo恥"GC500)cvccLB21.70±0.26白色念珠菌(JWo"!7^a仿icv7")實驗室收藏TSYEB16.52±0.15抑菌譜的研究結果表明，該細菌素抑菌譜很廣，不僅對受試的豬鏈球菌、熱殺索絲菌、李斯特氏菌、部分金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌有明顯的抑齒作用，同時對大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌表現出抑制作用，而且對酵母菌-白色念珠菌也顯示出一定的抑制作用。該細菌素對豬鏈球菌的抑制效果，顯示出了該細菌素具有開發新型獸藥製劑的潛在應用價值。而對其他病原菌的抑制作用提升了其作為微生態製劑應用的潛力。實施實例5細菌素在防治豬鏈球菌病方面的應用菌液的製備:無菌條件下採用加入2X的小牛血清的THB液體培養基進行增菌培養，37'C,180rpm,24h,檢測細菌濃度，並稀釋到所需要的濃度。THB培養基含量(g/L):酵母浸出物3,胰蛋白腖20，牛肉膏5,葡萄糖2,氯化鈉2,碳酸鈉2.5,磷酸氫二鈉0.4.用鹽酸調pH至7.5-7.8，115'C滅菌20min,溫度降至70-80'C加入2X的小牛血清。細菌素菌素的準備將粗提後的細菌素用10mmol/LpH值7.0的憐酸緩衝液稀釋至效價為20AU/ml:用無菌生理鹽水稀釋細菌素純品至效價為2560AU/mL，按0.05mL/kg的量進行肌肉注射。實驗動物一個月健康斷奶長白系仔豬，每隻體重為15kg左右，實驗前用拭子採集鼻腔、扁桃體樣本檢測鏈球菌為陰性，觀察10d後用於試驗。動物分組與接種20頭仔豬隨機分為5組，每組4頭，第一組為空白組，耳靜脈注射lmL生理鹽水，單獨飼養；第二組為感染組，取馬鏈球菌獸疫亞種的液體培養物(l-2)xlScfu/mL經耳靜脈注射豬，1mL/頭；第三組為易感組，將該組豬與感染組豬相鄰飼養，其間只隔柵欄，用細菌素粗品進行預防消毒，間隔ld對豬進行全身噴霧消毒一次，噴霧量以達到豬體潮溼為準，每次飼餵前，將飼槽等進食用貝.在細菌素稀釋液中浸泡lh;第四組為易感組，將該組豬與感染組豬相鄰飼養，其間只隔柵欄，常規消毒；第五組為治療組，注射馬鏈球菌獸疫亞種同第2組，接種ld後肌肉注射細菌素純品0.75mL，每大一次，連W—周。動物的臨床表現(連續觀測20d):第一組未發病，無肉眼可見症狀。第二組4隻實驗豬12h後體溫均有所升高，仔豬食量略有減少，精神不振，ld後體溫升高，有2頭出現後腿紅腫；2d後體溫明顯升高，仔豬出現四肢疼痛紅腫，不敢受力，呈坐立姿勢；3、4d精神不佳，食慾銳減，四肢紅腫，不願站立喜臥，其中有2頭出現祌經症狀，呼吸急促、伸腿、抽動呈划水狀，另有2頭豬尿道口積尿；5d後2頭出現神經症狀的豬死亡，7d後，其餘兩隻豬死亡。第三組未發病，無肉眼可見症狀。第四組在5d吋，有一隻豬體溫有升高，在一周後恢復正常。第五組4隻實驗豬12h後體溫均有所升高，仔豬食tt略有減少，精神不振，ld後體溫升高，有2頭出現後腿紅腫；2d後體溫明顯升高，仔豬出現四肢疼痛紅腫，食慾不佳，精神不振；3、4d精神不佳，體溫略有下降，四肢繼續紅腫，呈坐立姿勢。5d後2頭症狀有所減緩，開始少量進食。7d後，病豬體溫正常，紅腫略有減輕。15d後恢復正常。從上述試驗結果我們可以看出，用該細菌素對豬體及進食用具消毒能夠對豬鏈球菌病起到較好的預防作用，該細菌素純品肌肉注射可以有效治療由馬鏈球菌獸疫亞種引起的豬鏈球菌病。1權利要求1.一株產細菌素屎腸球菌菌株，其特徵是該屎腸球菌Enterococcusfaecium，保藏名稱為屎腸球菌LPL420P06，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2009年1月8日，保藏號為CGMCC2856。2.根據權利要求1所述的一種屎腸球菌菌株所產細菌素的生產方法，其特徵是步驟l，準備改良MRS培養基，30-35'C下培養14-16h後添加等量酵母膏與麩皮浸出液，繼續培養8-10h;步驟2，細菌素的提取，採用pH值依賴的吸附解吸法進行提取，吸附pH值為4.0~7.0，解吸pH值為1.5-2.5，得到細菌素粗品，陽離子交換樹脂層析後冷凍乾燥得到細菌素純品。3.根據權利2所述pH值依賴的吸附解吸法,其特徵在於最佳的吸附pH值為6.0，最佳的解吸pH值為2.5。4.根據權利要求2所述細菌素的生產方法，其特徵在於所述的改良MRS培養基成分為糖蜜34%，豆粉34%，酵母膏1.5-2%,麩皮浸出液10-15%,吐溫0.1%,磷酸氫二鉀0.2%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸銨0.2%、硫酸鎂0.058%、硫酸錳0.025%，pH值6.5-7.0。5.根椐權利要求3的所述提取方法得到的細菌素，其特徵為對溫度、酸鹼耐受性好，對蛋白酶敏感，抑菌譜廣，尤其用於抑制引起我國養豬業流行的豬鏈球菌病的主要病原菌-馬鏈球菌獸疫亞種。6.根據權利要求2或3或4或5所述屎腸球菌細菌素，其特徵在於用於豬鏈球菌病的預防與治療。全文摘要本發明涉及一種能產生抗豬鏈球菌細菌素的微生物，經鑑定為屎腸球菌LPL420P06，保藏編號為CGMCC2856。本發明還公開了屎腸球菌LPL420P06所產細菌素的生產方法。本發明還公開了屎腸球菌LPL420P06所產細菌素的特性及應用方法。屎腸球菌LPL420P06可以在較廉價的培養基中產生活力較強的細菌素，生產方法較為簡單易行，成本較低，該細菌素可以強烈抑制引起豬鏈球菌病的馬鏈球菌獸疫亞種，對豬鏈球菌病的預防與治療效果明顯。文檔編號C12N1/20GK101492650SQ20091007635公開日2009年7月29日申請日期2009年1月14日優先權日2009年1月14日發明者劉國榮,張金蘭,李平蘭,梁志宏,暢曉淵,程萬鵬申請人:中國農業大學