Peg修飾的尿酸酶的製作方法

2023-10-07 21:49:04

專利名稱：Peg修飾的尿酸酶的製作方法
發明的領域本發明針對聚乙二醇修飾的尿酸酶和治療特徵為循環尿酸水平增加的不同疾病的方法。
發明的背景尿酸是鳥、爬行動物和靈長類動物包括人中嘌呤代謝的產物。尿酸是鳥嘌呤核苷酸分解代謝中的中間物，而次黃嘌呤是在腺嘌呤核苷酸分解中產生的尿酸是通過黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化在肝臟中產生的。在大部分哺乳動物中，尿酸進一步被酶尿酸氧化酶氧化成尿囊素。尿囊素由於失去其嘧啶環，表現出超過尿酸20倍多的水溶解性。
尿酸氧化酶也稱為尿酸酶，是嘌呤降解途徑的酶。尿酸酶催化尿酸+O2轉變成尿囊素+CO2。
人缺乏尿酸酶且不能生成尿囊素。這是突變的結果，突變在人尿酸酶基因編碼序列中引入提前終止密碼子(Wu等.，J.Mol.Evol.3478-84，1992；Wu等.，ProcNatl Acad Sci USA 91742-6，1994，各自納入本文供參考)。作為此突變的結果，人中的嘌呤分解代謝終止於尿酸生成，尿酸相對不可溶(蒸餾水中的溶解性指數是13.2mg/dl)，使人對稱為高尿酸血症的病理情況敏感。腎處理尿酸是複雜的且需要腎小球過濾、過濾尿酸的再吸收、腎小管分泌和最終的分泌後再吸收。
高尿酸血症定義為在尿酸的血清水平高於8mg/dl時發生。高尿酸血症可導致血清中形成尿酸晶體，尿酸晶體可沉澱在關節、皮膚和腎中。這可導致關節炎症(痛風)、腎衰竭、代謝性酸中毒和高鉀血症。尿酸過度生成可能有多種來源，包括先天性代謝缺陷、自毀容貌綜合症、嘌呤或蛋白質的過度消化和用排尿酸藥物治療(Kelley，W.N.和Wortman，R.L.《風溼病學教科書》(Textbook ofRheumatology)，第5版，1313-1351頁，1997；納入本文供參考)。高尿酸血症也發現於心臟或腎移植並用免疫抑制劑治療的病人。高尿酸血症可導致這些病人失去腎功能且可產生顯著的發病率和死亡率。
高尿酸血症也發現於患惡性疾病的病人中。化學治療和放射治療的癌症病人可誘導稱為腫瘤崩解綜合症的威脅生命的情況(Kalemkerian，G.P.，Darwish，B.，和Varterasian，M.L.Am J.Med.103，363-367，1997；Lorigan，P.C.，Woodings，P.L.，Morgenstern，G.R.，和Scarffe，J.H.Ann Oncol.7，631-636，1996；Hande，K.R.，和Garrow，G.C.Am J.Med.94，133-139，1993)。血液惡性腫瘤如白血病和淋巴瘤，引起大部分腫瘤崩解綜合症。腫瘤崩解綜合症特徵為高尿酸血症、高鉀血症、高磷酸鹽血症和急性腎衰竭的迅速發展。急性腎衰竭是尿酸的腎內沉澱的結果。腫瘤崩解綜合症通常由化療和放射療法引起的細胞死亡觸發，導致胞內物質的釋放。然而，重腫瘤負擔的癌症病人甚至在沒有放射療法或化療時偶爾可表現出高尿酸血症和其它腫瘤崩解綜合症的特徵，這是由於惡性細胞的高轉化率，惡性細胞隨後將釋放的嘌呤分解代謝謝到尿酸中。
防止和治療腫瘤崩解綜合症相關急性腎衰竭的療法是相當大的挑戰，且一些原因目前不令人滿意。治療高尿酸血症的方法包括水合、尿鹼化、滲透性利尿和別嘌呤醇療法。然而，治療高尿酸血症的困難在於可能加重腫瘤崩解綜合症的其它後果例如，增加尿酸溶解度的尿鹼化促進磷酸鈣沉澱。別嘌呤醇(4-羥基嘌呤醇)是黃嘌呤的類似物，長期作為高尿酸血症的標準治療且也用於防止腫瘤崩解綜合症。別嘌呤醇轉化成羥嘌呤醇，結合併抑制黃嘌呤氧化酶，該酶催化次黃嘌呤和黃嘌呤轉化成尿酸。結果，尿酸生成被抑制，黃嘌呤和次黃嘌呤濃度增加。然而，別嘌呤醇不去除已存在和作為晶體腎內沉積的尿酸。結果，通常在初次用別嘌呤醇治療後幾天(有時10-14天)可觀察到血清中尿酸顯著減少。儘管黃嘌呤和次黃嘌呤的溶解度僅稍高於尿酸，嘌呤在別嘌呤醇治療中分解代謝成黃嘌呤、次黃嘌呤和尿酸，而不是大部分分解代謝成尿酸。結果是尿酸的尿濃度減少到其溶解度以下且防止進一步形成尿酸晶體。然而，在嘌呤過度分解代謝中，別嘌呤醇治療可導致次黃嘌呤和黃嘌呤的腎內沉澱，進一步加重急性腎衰竭。此情況在臨床實踐中有充分的文獻記載。此外，別嘌呤醇治療也與顯著毒性相關並可引起死亡。別嘌呤醇可產生嚴重的毒性作用，包括皮膚超敏感性反應、白細胞減少和肝腫大。此藥物也涉及引起腎小管間質性腎炎。此外，別嘌呤醇可引起不利的藥物相互作用，如6-巰基嘌呤和腺嘌呤阿拉伯糖苷、常用於治療淋巴細胞增生性疾病和白血病的藥物所示(Lauter，CB，Bailey，EJ，Lerner，AM.J Infect.Dis 1976；134，75-79)。最後，儘管別嘌呤醇可阻礙尿酸形成，它很少使已存在的尿酸溶解。所有這些不利作用有時使別嘌呤醇對於治療腫瘤病人的急性高尿酸血症無效。因此別嘌呤醇不是治療高尿酸血症的理想藥物。
透析和連續動靜脈血液透析是另外的方法，用於去除高尿酸血症病人中的尿酸。然而，這些治療方法對惡性腫瘤病人有問題，因為血小板減少或抗凝作用需要引起嚴重出血的風險。此外，由於這些治療的侵入性質，在許多情況中由於疾病或所接受的治療而免疫減弱的病人發生致死感染的風險增加。
尿酸酶顯示出有效治療高尿酸血症和腫瘤崩解綜合症(London，M.，和Hudson，P.B.Science，125，937-938，1957；Oberling，F.和Lang，J.M.Nouvelle Presse Med3，2026，1974；Robert，A.，Corberand，J.和Regnier，C.Rev.Med.Toulouse 12，1093-1100，1976；Masera G.，等.，J.Pediatrics 100，152-155，1982；Jankovic，M.，等.，Am.J.Pediatr.Hematol.Oncol.7，202-204，1985；Masera，G.和Jankovic，M.Ann.Oncol.8,407,1996；Jones，D.P.Mahmoud，H.和Chesney，R.W.Pediatr.Nephrol.9，206-212，1995)。用尿酸酶治療將尿酸轉變化高度可溶性尿囊素。此外，如果足夠過濾入尿中，尿酸酶甚至可溶解已經沉澱的尿酸晶體並改善腎功能。
尿酸酶在治療高尿酸血症和腎結石中有一些優勢，包括低尿酸血效果的速度(在少於24h內減少高尿酸血症50％)，且與其它藥物如別嘌呤醇相比更好的保護腎抗結石病。
尿酸酶僅在少數國家可用，目前限制此治療的使用。尿酸酶通過複雜的生產過程從黃麴黴(Aspergillus flavus)中提取，在法國自1975年起且在義大利自1980年代早期尿酸酶以Uricozyme商品名可從Sanofi(Clin-Midy，Paris，France)購得。此藥物在歐洲被廣泛研究並顯示在施用幾分鐘內對迅速降低病人的尿酸水平非常有效(Oberling，F.和Lang，J.M.Nouvelle Presse Med 3，2026，1974；Robert，A.，Corberand，J.和Regneir，C.Rev.Med.Toulouse 12，1093-1100，1976)。此治療經常用於病人以防止腫瘤崩解綜合症。在一個包括超過400個病人的研究中，尿酸酶治療有效去除腫瘤崩解綜合症(Masera，G.和Jankovic，M.Ann.Oncol.8，407，1996)。在美國，Uricozyme被聖裘德兒童醫院和田納面大學的一組研究人員廣泛測試(Pui，C.-H.，等.，Leukemia，11，1813-1816，1997)。這些研究人員在3年中治療了126個兒童，並發現尿酸酶治療在降低血清尿酸水平方面比別嘌呤醇迅速得多且更有效。此外，沒有尿酸酶治療的個體發生腫瘤崩解綜合症或需要透析。
儘管腫瘤學家充分了解尿酸酶的潛在優勢，此治療在腎領域沒有被廣泛認識。在高尿酸血症中更全面應用尿酸酶的一個障礙可能是參與發酵、提取和純化的酶的複雜生產過程，這明顯限制了其商業利用性以及酶活性的標準化。獲得目前用作藥物的尿酸酶是通過培養黃麴黴並經提取從培養液中分離酶，然後進行一些純化步驟。儘管這可能獲得高度純化的尿酸酶，此方法有缺點。黃麴黴由於其生理和遺傳而不易操作(WOLOSHUK等.Applied Environ.Microbiol.，55，86-90，1989)，使獲得能產生足夠量酶的菌株困難。黃麴黴也能產生純化過程中難以去除的黃麴黴毒素。必須檢查純化的尿酸酶以確保它沒有這些毒素。此外，因為麴黴菌(Aspergillus)酶的外源性質，在許多時候由於超敏感性反應的風險治療限於單劑量。
儘管尿酸酶在美國已被測試，由於過敏反應對此外來蛋白質的高發生率，它不是批准的療法。尿酸酶的臨床使用也受其短循環半衰期的限制。(參見Park等.，Anticancer Res.，1373-6(1981)。
對尿酸酶的超敏感性和尿酸酶的短循環半衰期可通過共價附著聚乙二醇(PEG)來克服(Chen，R.H.-L.，等.Biochim.Biophys.Acta 660，293-298，1981；Nishimara，H.，Matsushima，A.和Inada，Y.Enzyme，26，49-53，1981；Savoca，K.V.，Davis，F.F.和Palczuk，N.C.Int.Archs.Allegy Appl.Immun.75，58-67，1984Tsuji，J.-I.，等.Int.J.Immunopharmac.7，725-730，1985)。PEG附著到蛋白質顯示大幅降低外來蛋白質的抗原性。例如，配製有聚乙二醇(PEG)的異源蛋白質以降低抗原性，這通過核准Oncaspar(大腸桿菌天冬醯胺酶)被證明。以前的研究人員將PEG(分子量5000)附著於尿酸酶並成功地治療了少數病人(Davis，S.，Park，Y.K.，Abuchowski，A.和Davis，F.F.Lancet 2，281-283，1981；Chua，C.C.，等.Ann.Intern.Med.109，114-117，1988)。Davis等.(1981)用單劑量PEG-尿酸酶(尿酸酶分離自產朊假絲酵母(？Candida utilis))治療病人(120 IU/m2表面積，靜脈內)。血清尿酸在注射後60分鐘內下降到不能檢測的水平，且保持不能檢測至少32小時。PEG-5,000尿酸酶的血清半衰期是6小時。在其它研究中，天然(不加入聚乙二醇)的尿酸酶的半衰期記錄為小於4小時。在任何病人中沒有檢測到PEG-尿酸酶或天然尿酸酶的沉澱抗體。Davis等注意到PEG-5,000尿酸酶在治療高尿酸血症中提供了優於天然尿酸酶的潛在主要治療。Chua，等(1988)用尿酸酶治療非何杰金淋巴瘤，尿酸酶純化自PEG-5,000修飾的原玻璃蠅節桿菌(Arthrobacter protoformiae)。病人通過在不同的四天肌肉內注射來治療。血清尿酸水平在每次劑量後急劇下降。到給藥後第26天沒有檢測到PEG-5,000尿酸酶或天然尿酸酶的抗體。Chua等推斷PEG-5,000尿酸酶也許有助於治療進行性血液惡性腫瘤中的高尿酸血症。
需要更有效尿酸酶的產生和製劑，可克服在治療上述高尿酸水平病人中與尿酸酶使用相關的缺點。本發明針對這些以及其它重要的目標。
發明的概述本發明針對上面確定的需要，它提供克服迄今為止所用尿酸酶組合物缺點的尿酸酶製劑。
本發明針對聚乙二醇修飾的尿酸酶。在一個較佳實施方案中，尿酸酶用總平均分子量約10,000到約50,000的聚乙二醇修飾，直接或通過生物相容的連接基團。在一個更佳實施方案中，尿酸酶用總平均分子量約10,000到約30,000的聚乙二醇修飾。在一個甚至更佳實施方案中，尿酸酶用總平均分子量約20,000的聚乙二醇修飾。
發明的另一實施方案針對治療尿酸相關疾病的方法，包括高尿酸血症、腫瘤崩解綜合症和腎結石，此方法包括施用治療有效量的化合物，化合物含PEG-修飾的尿酸酶。在一個較佳實施方案中，尿酸酶用總平均分子量約20,000的聚乙二醇修飾。
在一些實施方案中，本發明提供提高尿酸酶的循環半衰期的方法，包括通過連接基團共價結合所述尿酸酶到聚乙二醇來修飾所述尿酸酶，其中聚乙二醇總平均分子量從約10,000到約30,000，其中連接基團選自琥珀醯亞胺基、醯胺基、醯亞胺基、氨基甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物基團、酪氨酸基團、半胱氨酸基團、組氨酸基團和它們的組合。
在一些實施方案中，本發明提供提高尿酸酶的抗尿酸活性的方法，包括通過連接基團共價結合所述尿酸酶到聚乙二醇來修飾所述尿酸酶，其中聚乙二醇總平均分子量從約10,000到約30,000，其中連接基團選自琥珀醯亞胺基、醯胺基、醯亞胺基、氨基甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪氨酸基團、半胱氨酸基團、組氨酸基團和它們的組合。
在一些實施方案中，本發明提供降低病人中尿酸水平的方法，包括施用治療有效量的化合物給所述病人，化合物含經連接基團共價結合到聚乙二醇的尿酸酶，其中聚乙二醇總平均分子量從約10,000到約30,000。在一個較佳實施方案中，尿酸酶用總平均分子量約20,000的聚乙二醇修飾。
在一些實施方案中，本發明提供治療病人中尿酸相關疾病的方法，包括施用治療有效量的化合物給所述病人，化合物含經連接基團共價結合到聚乙二醇的尿酸酶，其中聚乙二醇總平均分子量從約10,000到約30,000。在一個較佳實施方案中，尿酸酶用總平均分子量約20,000的聚乙二醇修飾。
在一些實施方案中，本發明提供的化合物包含的尿酸酶偶聯到聚乙二醇而沒有連接基團，其中聚乙二醇總平均分子量從約10,000到約30,000。在一個較佳實施方案中，尿酸酶用總平均分子量約20,000的聚乙二醇修飾。
本發明的這些和其它方面將在下列發明的詳細描述中闡明。
發明的詳細描述概述尿酸酶可在許多微生物中發現且有助於治療許多人的疾病和紊亂。然而，尿酸酶具有抗原性且迅速從病人的循環中清除。這些問題可通過聚乙二醇(PEG)共價修飾尿酸酶來克服。
本發明的基礎是聚乙二醇修飾的尿酸酶在治療一些類型的疾病和紊亂中提供很好的結果，這些疾病和紊亂與人中尿酸水平增加有關。與天然尿酸酶相比，尿酸酶-PEG保持大部分酶活性、抗原性小很多、循環半衰期大幅延長、治療疾病和紊亂更有效，包括高尿酸血症和腫瘤崩解綜合症。PEG-20,000特別優選，因為它具有優選的酶活性水平、抗原性、循環半衰期、功效和相對容易的生產。
定義在本發明公開中，使用下列縮寫PEG，聚乙二醇；SS，琥珀醯亞胺基琥珀酸酯；SSA，琥珀醯亞胺基琥珀醯胺；SPA，琥珀醯亞胺基丙酸酯；NHS，N-羥基-琥珀醯亞胺。
聚乙二醇共價修飾的尿酸酶(有或沒有連接基團)可在下文中稱為「尿酸酶-PEG」、「尿酸氧化酶-PEG」或「PEG-尿酸酶」。
「聚乙二醇」或「PEG」指環氧乙烷縮聚物和水的混合物，分分或直鏈，由通式H(OCH2CH2)nOH表示，其中n至少為4。「聚乙二醇」或「PEG」與數字後綴結合使用以表示其大約平均分子量。例如，PEG-5,000指總平均分子量約5,000的聚乙二醇；PEG-12,000指總平均分子量約12,000的聚乙二醇；PEG-20,000指總平均分子量約20,000的聚乙二醇。
如本文所用，術語「病人」指動物，優選是哺乳動物，更優選是人。
如本文所用，術語「尿酸相關疾病」指特徵為尿酸水平增加的疾病和紊亂。尿酸相關疾病包括但不限於高尿酸血症、腫瘤崩解綜合症和腎結石。
如本文所用，術語「約」指值的+/-10％。
如本文所用，術語「生物相容」指材料或化合物一般不損害生物功能和不導致任何程度不能接受的毒性，包括變應原狀態和疾病狀態。
「循環半衰期」指時間段從注射修飾的尿酸酶到病人後直至尿酸酶量清除到原始峰值血清水平的一半水平。循環半衰期可在任何相關種類中確定，包括人或小鼠。
如本文所用，術語「共價結合」和「偶聯」可交換使用並指連接尿酸酶和PEG的共價鍵，直接或通過接頭。
尿酸酶在本發明中，尿酸酶基因可從任何來源衍生、克隆或產生，包括例如來自微生物或通過重組生物技術或它們的任何組合。例如，尿酸酶可從微生物中克隆，包括但不限於黃麴黴、產朊假絲酵母和原玻璃蠅節桿菌。在一些實施方案中，本發明所用尿酸酶具有附加序列表中列出的胺基酸序列。
尿酸酶也可從大量其它生物中克隆，包括但不限於鏈黴菌屬和桿菌屬的細菌；真菌酵母屬、裂殖酵母屬、翹孢黴屬、麴黴屬和脈孢菌屬(包括酵母)；果蠅(Drosophila)；哺乳動物，包括豬(Sus scrofu)、松鼠猴(Samiri sciureus)、狒狒(Papio)、獼猴(Macaca mulatta)、植物包括鷹嘴豆(Cicer arietinum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)和豌豆(Pisum sativum)。
聚乙二醇有許多分子量和連接基團不同的可用聚乙二醇。這些PEGs可對蛋白質的抗原性、免疫原性和循環半衰期有不同效果(Zalipsky，S.和Lee，C.《聚乙二醇化學生物技術和生物醫學應用》(Polyethylene Glycol ChemistryBiotechnical andBiomedical Applications)347-370頁，Plenum Press，New York，1992；Monfardini，C.，等.，bioconjugate Chem.6，62-69，1995；Delgado C；Francis GE；Fisher D.「PEG-連接蛋白質的使用和性質」(The uses and properties ofPEG-linked proteins).Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Sys.，9249-304，1992)在本發明的一個實施方案中，聚乙二醇總平均分子量從約10,000到約50,000；更優選從約12,000到約40,000，更優選從約15,000到約30,000；最優選約20,000。一般，分子量30,000或更多的聚乙二醇難以溶解，製成產物的產量大為減少。
聚乙二醇可以是分支或直鏈，優選直鏈。增加聚乙二醇分子量一般趨向降低尿酸酶的免疫原性。有本發明所述分子量的聚乙二醇可結合尿酸酶和任選的生物相容連接基團使用，以治療與尿酸水平提高相關的疾病和紊亂。
加入聚乙二醇(pegylation)尿酸酶可使用本領域已知方法通過生物相容的連接基團共價結合PEG，，例如Park等，Anticancer Res.，1373-376(1981)；Zaplipsky和Lee，《聚乙二醇化學生物技術和生物醫學應用》，J.M.Harris編輯.，Plenum Press，NY，21章(1992)，所揭示的全部納入本文供參考。
用來使PEG共價附著尿酸酶的連接基團可以是任何生物相容的連接基團。如上所討論，「生物相容」表示化合物或基團是非毒性且可在體外或體內使用而不引起損傷、嘔吐、疾病或死亡。PEG可結合連接基團，例如通過醚鍵、酯鍵、硫醇鍵或醯胺鍵。合適的生物相容的連接基團包括例如酯基、醯胺基、醯亞胺基、氨基甲酸酯基、羧基、羥基、碳水化合物、琥珀醯亞胺基(包括例如琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀醯亞胺基丙酸酯(SPA)、琥珀醯亞胺基羧甲基化物(SCM)、琥珀醯亞胺基琥珀醯胺(SSA)或N-羥基-琥珀醯亞胺(NHS)、環氧基、氧羰基咪唑基(包括例如羰基二咪唑基(CDI))、硝基苯基團(包括例如硝基苯碳酸鹽(NPC)或三氯苯碳酸鹽(TPC))、trysylate基、醛基、異氰酸基團、乙烯碸基團、酪氨酸基團、半胱氨酸基團、組氨酸基團或伯胺。生物相容的連接基團優選是酯基和/或琥珀醯亞胺基。更優選的是，連接基團是SS、SPA、SCM、SSA或NHS；SS、SPA或NHS更優選，SS或SPA最優選。
在本發明中，最優選的生物相容連接基團的共同特徵是它們通過馬來醯亞胺基團附著到尿酸酶的伯胺。一旦與尿酸酶偶聯，SS-PEG有鄰近PEG的酯鍵，使此位點對血清酯酶敏感，可從體內的尿酸酶中釋放PEG。SPA-PEG和PEG2-NHS沒有酯鍵，因此它們對血清酯酶不敏感。
在本發明中，具體連接基團似乎不影響PEG-尿酸酶的循環半衰期或其特異的酶活性。然而，如果使用連接基團，使用生物相容的連接基團是重要的。附著蛋白質的PEG可以是單鏈，如SS-PEG、SPA-PEG和SC-PEG，或可使用支鏈PEG，如PEG2-NHS。
另外，尿酸酶可通過氨基、巰基、羥基或羧基直接與PEG偶聯(即沒有連接基團)。在一個較佳實施方案中，PEG偶聯尿酸酶上的賴氨酸殘基。
尿酸酶-PEG
PEG附著尿酸酶使尿酸酶的循環半衰期增加。
尿酸酶上PEG單位的數量似乎與酶的循環半衰期相關，而保持酶活性的量似乎與所用PEG的平均分子量相關。
已知尿酸酶上PEG單位的數量增加使該酶的酶活性降低。同樣已知一些PEG製劑難以生成和產生相對低數量的產物。因此，為獲得有效產物，需要在循環半衰期、抗原性、生成效率和酶活性間達到平衡。
一般，PEG附著尿酸酶的伯胺。如技術人員已知，選擇尿酸酶上聚乙二醇的附著位點由蛋白質活性結構域內各位點的作用決定。PEG可附著尿酸酶的伯胺而沒有顯著損失酶活性。然而如上所討論，保持酶活性的量似乎與所用PEG的平均分子量相關。例如，克隆自產朊假絲酵母的尿酸酶有約32個賴氨酸，可通過此過程加入聚乙二醇。換句話說，32個賴氨酸是尿酸酶可經生物相容的連接基團附著PEG的所有可能位點，連接基團如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS。考慮到本公開對本領域技術人員顯而易見的是，PEG也可附著尿酸酶上的其它位點，或通過連接基團或直接附著一個或更多殘基上的基團。
1到約32個PEG分子可在賴氨酸殘基共價結合尿酸酶。優選的是，尿酸酶用約5到約30個PEG分子修飾，從約10到約25個PEG分子更優選，從約18到約22個PEG分子更優選且約20個PEG分子最優選。換句話說，尿酸酶中約15％到約95％的伯胺基用PEG修飾，尿酸酶中約55％到約70％的伯胺基用PEG修飾更優選且尿酸酶中約60％的伯胺基用PEG修飾最優選。當PEG共價結合尿酸酶的末端時，優選使用僅1個PEG分子。在一個較佳實施方案中，尿酸酶用PEG-20,000修飾。
尿酸酶可在許多不同位點加入聚乙二醇。在一個較佳實施方案中，尿酸酶在除了一個或更多下列各項外的位點加入聚乙二醇(數字指產朊假絲酵母尿酸酶的胺基酸殘基)Lys12、Lys16、Lys28、Lys64、Lys72、Lys117、Lys156、Lys167和Lys262。在一些較佳實施方案中，尿酸酶用約20個PEG-20,000分子加入聚乙二醇。在這樣一個較佳實施方案中，尿酸酶在Lys156不加入聚乙二醇。在另一個較佳實施方案中，尿酸酶在Lys167不加入聚乙二醇。在又一個較佳實施方案中，尿酸酶在Lys12不加入聚乙二醇。在另一個較佳實施方案中，尿酸酶在Lys64不加入聚乙二醇。在另外一個較佳實施方案中，尿酸酶在Lys262不加入聚乙二醇。在另一個較佳實施方案中，尿酸酶在Lys64不加入聚乙二醇。在另外一個較佳實施方案中，尿酸酶在Lys262不加入聚乙二醇。在又一個較佳實施方案中，尿酸酶在Lys117不加入聚乙二醇。在另一個較佳實施方案中，尿酸酶在Lys16不加入聚乙二醇。在另外一個較佳實施方案中，尿酸酶在Lys28不加入聚乙二醇。在又一個較佳實施方案中，尿酸酶在Lys72不加入聚乙二醇。在一個更佳的實施方案中，尿酸酶在Lys156和Lys167不加入聚乙二醇。在一個更佳的實施方案中，尿酸酶在Lys156、Lys167、Lys12、Lys64和Lys262不加入聚乙二醇。在一個甚至更佳的實施方案中，尿酸酶在Lys156、Lys167、Lys12、Lys64、Lys262和Lys117不加入聚乙二醇。在一個最佳的實施方案中，尿酸酶在Lys156、Lys167、Lys12、Lys64、Lys262、Lys117、Lys16、Lys28和Lys72不加入聚乙二醇。
如所討論的，已知酶活性通過酶上PEG單位數量增加而降低。然而，本發明者發現當各自結合相同數量的PEG分子時，結合約20個PEG-20,000分子的尿酸酶的酶活性實際高於尿酸酶-PEG-5,000的酶活性。尿酸酶-PEG-20,000的這種活性增加可使用低於先前可能考慮的劑量治療。較低劑量的尿酸酶-PEG-20,000提供最小化對尿酸酶-PEG免疫應答的優點，包括減少可能的超敏感性問題、最小化過敏反應、減少施用尿酸酶-PEG患者中的皮疹發生。在小鼠研究中，也顯示PEG-20,000比其它PEG製劑更安全，具體是PEG-5,000。
治療方法在一些實施方案中，本發明提供降低病人中尿酸水平的方法，包括施用治療有效量的化合物給所述病人，化合物含經連接基團共價結合聚乙二醇的尿酸酶，其中聚乙二醇總平均分子量從約10,000到約30,000。在一個較佳實施方案中，尿酸酶用總平均分子量約20,000的聚乙二醇修飾。
在一些實施方案中，本發明提供治療病人中尿酸相關疾病的方法，包括施用治療有效量的化合物給所述病人，化合物含經連接基團共價結合聚乙二醇的尿酸酶，其中聚乙二醇總平均分子量從約10,000到約30,000。在一個較佳實施方案中，尿酸酶用總平均分子量約20,000的聚乙二醇修飾。
治療有效量的本發明化合物是有效減少尿酸水平的量。一般，治療以小劑量開始，劑量可小幅增加直到獲得情況下最佳的效果。一般，治療劑量的本發明化合物可從一周兩次約1到約200mg/kg到每兩周一次。例如，劑量可以是一周一次2ml靜脈注射約1mg/kg到每3天一次約20mg/kg。尿酸酶-PEG20,000可每天施用幾次、一天一次、一周一次或每兩周一次。
注射前，PEG-尿酸酶可與磷酸緩衝鹽水溶液或任何其它本領域技術人員已知的合適溶液混合。PEG-尿酸酶製劑可如所需要作為親液體(lyophilate)或液體製劑施用。
本發明方法可包括體外或體內應用。在體外應用的情況中，包括細胞培養應用，本文所述化合物可加入培養的細胞並隨後孵育。本發明的化合物也可用於促進單克隆和/或多克隆抗體生產，使用本領域熟知的抗體生產技術。對本領域技術人員顯而易見的是，單克隆和/或多克隆抗體可然後用於多種診斷應用。
施用本發明化合物的體內方式取決於預期的應用而不同。本領域技術人員意識到可完成本發明PEG-尿酸酶組合物的施用，例如口腔、鼻內、腹膜內、腸胃外、靜脈內、淋巴內、腫瘤內、肌肉內、間質、動脈內、皮下、眼內、滑膜內、經上皮和經皮膚。
實施例發明進一步在以下例子中證明，用於闡明目的，不想限制本發明的範圍。
實施例1分離產朊假絲酵母尿酸酶編碼序列和構建表達質粒基因組DNA從產朊假絲酵母(ATCC 9950)中分離並用作PCR模板以分離尿酸酶基因。產朊假絲酵母在100mL YPD培養基中30℃×250rpm搖床生長。第二天，來自50mL培養物的細胞通過1500xg室溫離心10分鐘來沉澱。沉澱重懸浮於15mL SCED緩衝液，pH7.5(1M山梨醇、10mM檸檬酸鈉，pH7.5、10mM EDTA、10mM DTT)。3mg LyticasTM(Sigma，St.Louis，MO，目錄號L-4025)加入細胞且細胞在37℃培養60分鐘。加入15 mL 1％SDS，緩慢混合併置於冰上5分鐘。加入6mL 5M乙酸鉀，pH8.9並緩慢混合。溶液在4℃以10,000xg離心10分鐘。上清轉移到乾淨的離心管中，加入2體積乙醇並室溫孵育15分鐘。DNA通過在4℃以10,000xg離心20分鐘來沉澱。沉澱重懸浮於10mL TE緩衝液，pH7.4(10mM Tris-HCl，pH7.4、1mM EDTA)。溶液用等體積酚∶氯仿(1∶1v/v)溫和提取，接著用等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)。加入一半體積的7.5M醋酸銨，pH7.5和2體積的乙醇，管置於-70℃ 10分鐘。DNA在4℃以10,000xg離心10分鐘來沉澱。沉澱在空氣中乾燥並重懸浮於含50μg RNA酶A的1mL TE緩衝液，pH7.5中。DNA在室溫孵育1小時，然後用等體積乙醇再沉澱。DNA在4℃以10,000xg離心10分鐘來沉澱。沉澱重懸浮於1mL TE緩衝液，pH7.5。DNA濃度通過測量260nm光密度來確定。
使用PCR從產朊假絲酵母基因組DNA中分離尿酸酶基因。PCR引物具有下列序列正向引物，URIUforSna5』-GTG TAC GTA ATG TCA ACA ACG CTC TCA TCA-3』(SEQ.ID.NO1)
反向引物，URIUrevH5』-AGA AAG CTT TTA CCA CTT GGT CTT CTC CTT A-3』(SEQ.ID.NO2)這些引物位於編碼序列5』-末端的SnaBI位點和3』-末端的HindIII位點用於亞克隆入pQE70(Qiagen，Valencia，CA)以表達。PCR混合物在50μl最終反應體積中含有1X Vent聚合酶緩衝液、2.5mM硫酸鎂、0.2mM各dNTPs、30pmole各引物、1.8μg產朊假絲酵母基因組DNA和2.5U Vent聚合酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)。PCR在98℃進行2分鐘，接著98℃ 30秒進行30個循環，35℃30秒和72℃60秒。然後加入1單位Taq聚合酶(Gibco，Rockville，MD)且反應在72℃孵育7分鐘。20ml的PCR在0.8％瓊脂糖凝膠上展開。PCR產物從凝膠中切除並用Qiagen gel extration試劑盒提取。PCR產物亞克隆入pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)。尿酸酶PCR產物用SnaBI和HindIII從pCR2.1中切除並用瓊脂糖凝膠電泳純化。pQE70用SphI 37℃消化1小時，Klenow片斷室溫處理15分鐘以產生鈍端，然後在80℃孵育15分鐘以使Klenow酶失活。然後處理的質粒用HindIII在37℃消化1小時，在瓊脂糖凝膠上展開並接著從凝膠中純化。然後尿酸酶片斷連接入消化的pQE70中以產生pQE-URIC。大腸桿菌DG101(ATCC 47041)用連接反應轉化且轉化子在氨卡青黴素存在時選擇。篩選轉化子用於尿酸酶生成，這是通過在3mL含氨卡青黴素的LB(100mg/mL)中培養細胞直到OD600達到0.5到0.6。異丙基-b-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)加至1mM的終濃度且培養物另外孵育2小時。細胞提取物然後用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析並檢測凝膠中34,000Da蛋白質的存在。一個發現產生34,000Da蛋白質的轉化子被測試且發現具有尿酸酶活性。pQE-URIC從此轉化子中分離且將賦予四環素抗性的基因插入質粒。為將賦予四環素抗性的基因插入pQE-URIC，pBR322用EcoRI和AvaI消化，然後用Klenow聚合酶和dNTPs處理以在消化的DNA片斷上產生鈍端。pQE-URIC用XbaI消化，然後用Klenow聚合酶和dNTPs處理。來自含四環素抗性基因的pBR322的～1400bp片斷用凝膠純化並連接入pQE-URIC中以產生pPHX12。pPHX12序列(SEQ ID NO3)、pPHX12中發現的尿酸酶編碼序列(SEQ IDNO4)和其翻譯的胺基酸序列(SEQ ID 5)和從pPHX12中發現的編碼序列推出的尿酸酶的胺基酸序列(SEQ ID NO6)列於附加的序列表中，序列表被納入供參考。大腸桿菌DG101用pPHX12轉化以產生大腸桿菌菌株PHX12，PHX12用於產生和純化尿酸酶。
實施例2在大腸桿菌中表達尿酸酶為生產尿酸酶，PHX12在20L發酵液中生長。大腸桿菌未確定成分培養基#1用於PHX12在Bioflo臺式發酵罐(New Brunswick Scientific，Edison，NJ)中生長。大腸桿菌未確定成分培養基#1的成分由基礎培養基、50％甘油、100X鹽溶液、100X氯化鈣溶液和1000X維生素溶液組成。這些成分如下所述製備。
基礎培養基每升培養基酪蛋白胺基酸 30g硫酸銨3g磷酸鉀，二鹼價2.5g溶解於920mL水中並高壓滅菌或通過0.22μm濾器過濾殺菌。
濃縮鹽溶液(100X)硼酸 0.57g硫酸銅(II)五水合物0.39g氯化鐵，100g於40mL水中2.0ml二氯化錳四水合物 4.0g氯化鈉5.0g鉬酸鈉二水合物0.5g硫酸鎂七水合物25.0g硫酸2.87ml硫酸鋅七水合物1.0g溶解於1L H2O中並高壓滅菌或通過0.22μm濾器過濾殺菌。
50％(v/v)甘油混合1000ml甘油和1000ml H2O並高壓滅菌或通過0.22μm濾器過濾殺菌。
維生素溶液(1000X)鹽酸硫胺素0.26g溶解於100mL H2O中並通過0.22μm濾器過濾殺菌。
鈣溶液(100X)氯化鈣二水合物10g溶解於1L H2O中並高壓滅菌或通過0.22μm濾器過濾殺菌。
對於每升大腸桿菌未確定成分培養基#1，下列各項用無菌方法以下列量加入滅菌的基礎培養基60ml甘油溶液10ml濃縮鹽溶液10ml鈣溶液1ml維生素溶液製備PHX12接種物融化保存於-70℃的來自工作細胞庫(Working Cell Bank)的PHX12小瓶，且內含物無菌轉移到500mL帶擋板搖瓶內的250mL大腸桿菌未確定成分培養基#1中，培養基#1含12μg/mL四環素。四環素選擇僅在搖瓶水平維持。接種的帶擋板搖瓶在環境培養箱中37℃ 250rpm培養。搖瓶培養物在無菌轉移到BioFlo IV發酵罐前生長13到16小時，發酵罐含20升滅菌培養基。
細胞培養和收集大腸桿菌未確定成分培養基#1用於PHX12在發酵罐生長。大腸桿菌未確定成分基本培養基製備是通過溶解600g酪蛋白胺基酸、60g硫酸銨和50g磷酸鉀二鹼價於2L毫微純(nanopure)水中。發酵罐充滿18.4L基本培養基，加入50mL消泡劑B到基本培養基，然後用設定於121℃的發酵罐滅菌循環滅菌30分鐘。滅菌後，使培養基冷卻到37℃或以下，200mL 100X氯化鈣溶液、200mL 100X濃縮鹽溶液、20mL 1000X維生素溶液和1200mL 50％甘油無菌加入發酵罐。
發酵罐參數如下攪拌設定為700rpm，溫度設定為37℃，空氣流量設定為20Lpm。然後接種物用於接種發酵罐。培養物在發酵罐中生長到光密度(A600nm)約為8。然後IPTG無菌加入發酵罐至終濃度為1mM。加入IPTG後使發酵連續2小時。接著收集細胞並立即用空心纖維過濾器通過滲濾濃縮到2到3L。細胞通過8,000x g離心10分鐘沉澱且細胞團轉移到塑料貯藏容器並保存於-70℃直到進一步加工。典型的20升發酵液產生0.5到0.6Kg的細胞團。
實施例3純化尿酸酶來自20升發酵液的細胞團重懸浮於0.4L裂解緩衝液(20mM磷酸鈉，pH8.5、1mM EDTA)，使用PolytronTM勻漿器以獲得均勻懸浮液。以＞15,000psi兩次穿過微流化器(microfluidizer)來裂解細胞。然後裂解的細胞懸浮液以13,000xg離心10分鐘。硫酸銨加入上清以達到30％的飽和度。懸浮液室溫攪拌10分鐘，然後13,000xg離心15分鐘。硫酸銨加入上清至64％的飽和度且溶液室溫攪拌10分鐘，接著溶液以13,000xg離心15分鐘。沉澱重懸浮於0.4L滲濾緩衝液(20mM磷酸鈉緩衝液，pH8.5)並用50,000MW截斷的濾器對5體積滲濾緩衝液滲濾。然後滲濾溶液置於Poros HQ50柱，Poros HQ50柱先前用柱緩衝液(20mM磷酸鈉緩衝液，pH8.5)平衡。柱用柱緩衝液洗滌並收集流過物。然後流過物置於用柱緩衝液平衡的BioRad HA柱。HA柱用10體積柱緩衝液洗滌且尿酸酶通過梯度洗脫，從100％柱緩衝液到100％0.5M磷酸鈉，pH8.5。洗脫的尿酸酶再次通過柱緩衝液平衡的Poros HQ柱。收集含尿酸酶的流過部分並保存於4℃。
實施例4純化的尿酸酶的鑑定尿酸酶分析尿酸酶活性使用Sigma(St.Louis，MO)的尿酸診斷試劑盒分析。此酶的比活性是通過用尿酸孵育酶和監控過氧化氫產生確定的。過氧化氫的產生是通過在過氧化物酶存在時與4-氨基安替比林和3，5-二氯-2-羥基苯磺酸鹽反應確定的。醌亞胺染料在520nm最大吸光率形成。產生顏色的強度與形成過氧化氫的量成正比。形成過氧化氫的量是通過與標準比較確定的，標準含已知量的過氧化氫。酶比活性＝分析中nmol產生的過氧化氫/min/mg的蛋白質。酶活性以IU/mL表達。1IU定義為產生1nmol過氧化氫/分鐘的酶的量。
SDS-PAGE尿酸酶的表達水平由SDS-PAGE確定。在IPTG誘導尿酸酶表達前(誘導前樣品)和IPTG加入後2小時(誘導後樣品)取來自20升發酵培養物的樣品(1ml)。這些樣品在微離心機(12,000xg 1分鐘)中快速離心，然後-70℃冷凍。冷凍的細胞沉澱重懸浮於1ml水並用探測超聲波儀超聲處理15秒。所得超聲處理物在10-20％SDS-PAGE凝膠上在還原條件下電泳。凝膠用考馬斯藍染色。
實施例5加入聚乙二醇尿酸酶用PEG-5,000加入聚乙二醇柱緩衝液(20mM磷酸鈉緩衝液，pH8.5)中的純化尿酸酶用甲氧基-SS-聚乙二醇MW 5,000加入聚乙二醇，PEG與尿酸酶比例為30∶1(wt/wt)。PEG 5000加入尿酸酶溶液並室溫攪拌1小時。結合的尿酸酶-PEG 5000通過滲濾濃縮到約1/10體積，然後對10體積製劑緩衝液(20mM磷酸鈉緩衝液，pH6.8、130mM氯化鈉)滲濾。
尿酸酶用PEG-20,000加入聚乙二醇柱緩衝液(20mM磷酸鈉緩衝液，pH8.5)中的純化尿酸酶用甲氧基-SS-聚乙二醇MW 20,000加入聚乙二醇，PEG與尿酸酶比例為30∶1(wt/wt)。PEG-20000加入尿酸酶溶液並室溫攪拌2小時。結合的尿酸酶-PEG 20000通過滲濾濃縮到約1/10體積，然後對10體積製劑緩衝液(20mM磷酸鈉緩衝液，pH6.8、130mM氯化鈉)滲濾。
實施例6加入聚乙二醇的蛋白質的鑑定SDS-PAGE加入聚乙二醇的尿酸酶的純度和加入聚乙二醇的程度由SDS-PAGE檢測。來自加入聚乙二醇反應的樣品在10-20％SDS-PAGE凝膠上在還原條件下電泳。凝膠用考馬斯藍染色。
尿酸酶分析加入聚乙二醇的尿酸酶的酶活性用實施例4中所述尿酸酶分析來確定。酶比活性分析中＝nmol產生的過氧化氫/min/mg的蛋白質。酶活性以IU/mL表達。1IU定義為產生1nmol過氧化氫/分鐘的酶的量。
PEG數量三硝基苯磺酸(TNBS)分析(Habeeb，A.F.S.A.Analyt.Biochem.14，328-336(1966))用於確定聚乙二醇分子的平均數量，聚乙二醇分子共價附著各尿酸酶蛋白質中的伯胺(PEG數量)。TNBS與伯胺基反應且導致顏色變化。加入聚乙二醇的蛋白質與未加入聚乙二醇的蛋白質相比。
各蛋白質樣品在三個不同蛋白質濃度分析。各濃度重複兩次分析。各樣品的蛋白質濃度用毫微純水調節至0.2、0.4和0.8mg/mL並渦動3到5秒。0.25mL的各蛋白質樣品加入10×75mm玻璃管.0.25ml 4％碳酸氫鈉加入各管，接著加入0.25mL0.1％TNBS。管在40℃孵育2小時。然後管從加熱塊中取出且0.25mL 10％十二烷基硫酸鈉(SDS)加入各管，接著加入0.125mL 1N HCl。各反應的吸光率在335nm測量。繪出蛋白質樣品的吸光率並進行線性回歸以確定線的斜率。加入聚乙二醇的伯胺殘基的數量由下列公式確定加入聚乙二醇的伯胺殘基的數量＝1-(加入聚乙二醇的蛋白質的斜率/未加入聚乙二醇的蛋白質的斜率)×蛋白質中伯胺殘基的總數量表1.比較天然尿酸酶和尿酸酶-PEG製劑
比較不同尿酸酶PEG製劑(表1)顯示尿酸酶-PEG-20,000保持高於尿酸酶-PEG-50,000的比活性，儘管相同平均數量的PEG分子附著蛋白質。尿酸酶-PEG-20,000保持75％天然酶的比活性，而尿酸酶-PEG-5,000僅保持56％天然酶活性。這意味著可使用比尿酸酶-PEG 5,000所需更少的尿酸酶-PEG 20,000以產生特定的酶活性。然而，當大於20,000的PEGs共價結合尿酸酶時，相對於PEG-20,000的尿酸酶-PEG的酶活性未能增加。
此外，共價結合尿酸酶的PEG平均分子量也在確定循環半衰期和產量中發揮重要作用。尿酸酶-PEG的產量隨著結合的聚乙二醇平均分子量增加而上升，PEGs平均分子量增加至PEG-20,000。然而，當使用平均分子量超過20,000的PEG時，尿酸酶-PEG的產量顯著降低。例如，當尿酸酶結合PEG-20,000時，相對產量為1.0。當尿酸酶結合PEG-5,000時，相對產量約為0.5。當尿酸酶結合PEG-10,000時，相對產量約為0.66。當尿酸酶結合PEG-40,000時，相對產量下降到約0.1。
實施例9應用於人結合尿酸酶的PEG的循環半衰期比小鼠中相同製劑長5到10倍。這意味著過去人劑量通常為小鼠中所用的1/5到1/10。因此，人中PEG-尿酸酶的循環半衰期循環應比小鼠長。
本文所述各專利、專利應用和出版物全部納入本文供參考。
考慮到前面描述，除了本文所述，發明的不同修飾對於本領域技術人員是顯而易見的。這種修飾也屬於附加的權利要求範圍內。
序列表110菲尼克斯藥物股份有限公司(Phoenix Pharmacologics，Inc.)120PEG修飾的尿酸酶130PHOE-0190(UWWK-0062)150PCT/US02/132651512002-04-26150US 09/921,3801512001-08-021606170PatentIn version 3.2210121130212DNA213人工序列220
223引物4001gtgtacgtaa tgtcaacaac gctctcatca 30210221131212DNA213人工序列220
223引物4002agaaagcttt taccacttgg tcttctcctt a3121032115740
212DNA213人工序列220
223質粒4003ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aagatgtcaa 120caacgctctc atcatccact tacggcaagg acaacgtcaa gttcctcaag gtcaagaagg 180atccgcagaa cccaaagaag caggaggtta tggaggccac cgtcacgtgt ctgcttgaag 240gtgggttcga cacctcctac acggaggctg acaactcgtc catcgtgcca acagacaccg 300tgaagaacac cattctcgtg ttggcaaaga ccacggagat ttggccaatt gagagatttg 360cagccaagct ggctacgcac tttgttgaga agtactcgca cgtctctggt gtctccgtca 420agattgtcca ggacagatgg gtcaagtacg ccgttgatgg caagccacac gaccactctt 480ttatccacga aggtggtgag aagagaatca ctgacctgta ctacaagaga tccggtgatt 540acaagctgtc atctgccatc aaggacttga cggtgctgaa gtccaccggc tcgatgttct 600acggctacaa caagtgtgac ttcaccacct tgcaaccaac cactgacaga atcttgtcca 660ccgacgtcga tgccacctgg gtttgggata acaagaagat tggcactgtc tacgacatcg 720ccaaggctgc agacaagggg atctttgaca acgtttacaa ccaggctaga gagatcacct 780tgaccacctt cgccctggag aactctccat ctgtgcaggc cacgatgttc aacatggcta 840ctcagatctt ggaaaaggca tgctctgtct actcggtttc atacgccttg ccaaacaagc 900actacttcct cattgacttg aaatggaaag gtttggagaa cgacaacgag ttgttctacc 960catctccaca tccaaatggt ttgatcaagt gtactgttgt ccgtaaggag aagaccaagt 1020tgtaaaagct tagcttaatt agctgagctt ggactcctgt tgatagatcc agtaatgacc 1080tcagaactcc atctggattt gttcagaacg ctcggttgcc gccgggcgtt ttttattggt 1140
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221CDS222(1)..(909)4004atg tca aca acg ctc tca tca tcc act tac ggc aag gac aac gtc aag 48Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys1 5 10 15ttc ctc aag gtc aag aag gat ccg cag aac cca aag aag cag gag gtt 96Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val20 25 30atg gag gcc acc gtc acg tgt ctg ctt gaa ggt ggg ttc gac acc tcc 144
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Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr210 215 220acc ttc gcc ctg gag aac tct cca tct gtg cag gcc acg atg ttc aac 720Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn225 230 235 240atg gct act cag atc ttg gaa aag gca tgc tct gtc tac tcg gtt tca 768Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser245 250 255tac gcc ttg cca aac aag cac tac ttc ctc att gac ttg aaa tgg aaa 816Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys260 265 270ggt ttg gag aac gac aac gag ttg ttc tac cca tct cca cat cca aat 864Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn275 280 285ggt ttg atc aag tgt act gtt gtc cgt aag gag aag acc aag ttg taa 912Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu290 295 3002105211303212PRT213產朊假絲酵母(Candida utilis)4005Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys1 5 10 15Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val20 25 30Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser35 40 45Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys50 55 60Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu
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2106211303212PRT213產朊假絲酵母(Candida utilis)4006Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys1 5 10 15Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val20 25 30Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser35 40 45Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys50 55 60Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu65 70 75 80Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His85 90 95Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr100 105 110Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly115 120 125Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys130 135 140Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser145 150 155 160Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr165 170 175Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp180 185 190Asn Lys Lys Ile Gly Thr Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys
195 200 205Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr210 215 220Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn225 230 235 240Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser245 250 255Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys260 265 270Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn275 280 285Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu290 295 300
權利要求
1.一種含經連接基團共價結合聚乙二醇的尿酸酶的化合物，其特徵在於，聚乙二醇總平均分子量從約10,000到約30,000，其中連接基團選自琥珀醯亞胺基、醯胺基、醯亞胺基、氨基甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪氨酸基團、半胱氨酸基團、組氨酸基團和它們的組合。
2.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，所述連接基團是琥珀醯亞胺基。
3.如權利要求2所述的化合物，其特徵在於，所述琥珀醯亞胺基是琥珀醯亞胺基琥珀酸酯、琥珀醯亞胺基丙酸酯、琥珀醯亞胺基羧甲基化物、琥珀醯亞胺基琥珀醯胺、N-羥基-琥珀醯亞胺或它們的組合。
4.如權利要求3所述的化合物，其特徵在於，所述琥珀醯亞胺基是琥珀醯亞胺基琥珀酸酯、琥珀醯亞胺基丙酸酯或它們的組合。
5.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，所述尿酸酶不源於微生物，微生物選自黃麴黴、產朊假絲酵母、原玻璃蠅節桿菌和它們的組合。
6.如權利要求5所述的化合物，其特徵在於，所述微生物是黃麴黴。
7.如權利要求5所述的化合物，其特徵在於，所述微生物是產朊假絲酵母。
8.如權利要求5所述的化合物，其特徵在於，所述微生物是原玻璃蠅節桿菌。
9.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇的平均分子量約為20,000。
10.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約10到約25個聚乙二醇分子。
11.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約18到約22個聚乙二醇分子。
12.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約20個聚乙二醇分子。
13.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇在除了SEQ ID NO6的Lys156外的殘基共價附著尿酸酶。
14.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇在除了SEQ ID NO6的Lys167外的殘基共價附著尿酸酶。
15.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇在除了SEQ ID NO6的Lys12外的殘基共價附著尿酸酶。
16.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇在除了SEQ ID NO6的Lys64外的殘基共價附著尿酸酶。
17.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇在除了SEQ ID NO6的Lys262外的殘基共價附著尿酸酶。
18.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇在除了SEQ ID NO6的Lys117外的殘基共價附著尿酸酶。
19.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇在除了SEQID NO6的Lys16、Lys28和Lys72外的殘基共價附著尿酸酶。
20.如權利要求1所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇在除了SEQ ID NO6的Lys12、Lys16、Lys28、Lys64、Lys72、Lys117、Lys156、Lys167和Lys262外的殘基共價附著尿酸酶。
21.如權利要求1或13-20中任一項所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇在一個或更多賴氨酸殘基共價附著尿酸酶。
22.一種提高尿酸酶的循環半衰期的方法，包括經連接基團共價結合所述尿酸酶到聚乙二醇來修飾所述尿酸酶，其特徵在於，聚乙二醇的總平均分子量從約10,000到約30,000，其中連接基團選自琥珀醯亞胺基、醯胺基、二醯亞胺基、氨基甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪氨酸基團、半胱氨酸基團、組氨酸基團和它們的組合。
23.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，聚乙二醇的平均分子量約為20,000。
24.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約10到約25個聚乙二醇分子。
25.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約18到約22個聚乙二醇分子。
26.一種提高尿酸酶的抗尿酸活性的方法，包括經連接基團共價結合所述尿酸酶到聚乙二醇來修飾所述尿酸酶，其特徵在於，聚乙二醇的總平均分子量從約10,000到約30,000，其中連接基團選自琥珀醯亞胺基、醯胺基、醯亞胺基、氨基甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪氨酸基團、半胱氨酸基團、組氨酸基團和它們的組合。
27.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，聚乙二醇的均分子量約為20,000。
28.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約10到約25個聚乙二醇分子。
29.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約18到約22個聚乙二醇分子。
30.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約20個聚乙二醇分子。
31.一種降低病人中尿酸水平的方法，其特徵在於，所述方法包括施用治療有效量的權利要求1所述化合物給所述病人。
32.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，所述病人患有低尿酸血症。
33.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，聚乙二醇的平均分子量約為20,000。
34.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，所述連接基團是琥珀醯亞胺基。
35.如權利要求32所述的方法，其特徵在於，所述琥珀醯亞胺基團是琥珀醯亞胺基琥珀酸酯、琥珀醯亞胺基丙酸酯、琥珀醯亞胺基羧甲基化物、琥珀醯亞胺基琥珀醯胺、N-羥基-琥珀醯亞胺或它們的組合。
36.一種治療病人中尿酸相關疾病的方法，其特徵在於，所述方法包括施用治療有效量的權利要求1所述化合物給所述病人。
37.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，聚乙二醇的平均分子量約為20,000。
38.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，聚乙二醇在除了SEQ ID NO6的Lys12、Lys16、Lys28、Lys64、Lys72、Lys117、Lys156、Lys167和Lys262外的殘基共價附著尿酸酶。
39.一種含偶聯聚乙二醇的尿酸酶的化合物，其特徵在於，聚乙二醇的總平均分子量從約10,000到約30,000。
40.如權利要求39所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇的平均分子量約為20,000。
41.如權利要求39所述的化合物，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約10到約25個聚乙二醇分子。
42.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約18到約22個聚乙二醇分子。
43.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約20個聚乙二醇分子。
44.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，聚乙二醇在除了SEQ ID NO6的Lys12、Lys16、Lys28、Lys64、Lys72、Lys117、Lys156、Lys167和Lys262外的殘基偶聯尿酸酶。
45.一種提高尿酸酶的抗尿酸活性的方法，包括通過共價結合所述尿酸酶到聚乙二醇來修飾所述尿酸酶，其特徵在於，聚乙二醇的總平均分子量從約10,000到約30,000。
46.如權利要求45所述的方法，其特徵在於，所述尿酸酶共價結合約20個聚乙二醇分子。
47.如權利要求45所述的化合物，其特徵在於，聚乙二醇的平均分子量約為20,000。
全文摘要
本發明針對聚乙二醇修飾的尿酸酶和治療特徵為循環尿酸水平增加的不同疾病的方法，包括但不限於高尿酸血症和腫瘤崩解綜合症。
文檔編號C12N9/06GK1561390SQ02819387
公開日2005年1月5日 申請日期2002年4月26日 優先權日2001年8月2日
發明者C·M·恩索, M·A·克拉克, F·W·霍爾茨伯格 申請人:菲尼克斯藥物股份有限公司