一種聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法及其產品的製作方法
2023-10-07 21:36:39 1
一種聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法及其產品的製作方法
【專利摘要】本發明提出了一種聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法，通過採用獨特的工藝條件，無需進行突變等處理，來達到單修飾的效果，工藝簡單，成本低，且得到的聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子活性損失小，純度高等，本發明還涉及由該方法製得的產品。
【專利說明】一種聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法 及其產品
【技術領域】
[0001] 本發明涉及蛋白質的聚乙二醇修飾領域，特別是指一種聚乙二醇單修飾的人粒細 胞集落刺激因子的製備方法，本發明還涉及由該方法製得的聚乙二醇修飾的人粒細胞集落 刺激因子。
【背景技術】
[0002] 粒細胞集落刺激因子（G-CSF)是刺激骨髓細胞集落形成的集落刺激因子之一，能 夠特異性的刺激和調節粒細胞系統的增殖、分化、存活和活化，主要用於各種原因引起的 中性粒細胞減少症，天然人粒細胞集落刺激因子（hG-CSF)含有174個胺基酸，分子量約為 19KDa，其中含有5個半胱氨酸（Cys)，Cys36與Cys42, Cys74與Cys64之間形成兩對二硫 鍵，Cysl7為不配對半胱氨酸，而重組表達的人粒細胞集落刺激因子由於增加了一個起始密 碼子，因此為175個胺基酸，相應的，未配對的半胱氨酸成為Cysl8。由於G-CSF在代謝過程 中易由腎小球濾過，在通過腎小管時又被其中的蛋白酶部分降解並從尿中排出，臨床表現 為半衰期短，易被酶水解和腎臟清除，因此，臨床應用時需要對患者進行多次注射以維持一 定的療效，這樣會給患者帶來很大的不便於痛苦，而且重複注射也會引起一些不良反應。
[0003] 蛋白質或者多肽的聚乙二醇（PEG)修飾即PEG化，是將活化的PEG通過化學方法 以共價鍵偶聯到蛋白質或多肽分子上，自1977年Davis首次採用PEG修飾BSA (牛血清白 蛋白）以來，PEG修飾技術迅速發展，並廣泛應用於多種蛋白質和多肽的化學修飾。PEG修 飾能賦予蛋白質和多肽多種優良性能，具體表現為循環半衰期延長、免疫原性降低或消失、 毒副作用減少以及物理、化學、生物穩定性增強等，在很大程度上擴寬了蛋白質和多肽的應 用範圍，其機理可能為：蛋白質PEG修飾後，相對分子質量（Mr )增大，當修飾後的蛋白質Mr 達到或超出腎小球濾過閥值時，蛋白質隨血液循環進入腎臟後就可以逃避腎小球的濾過 作用；由於PEG的屏蔽效應，使得修飾後的蛋白質或多肽不易受到各種蛋白酶的攻擊，降解 速率明顯降低，穩定性提高；PEG在溶液中呈無規則捲曲，作為一種屏障，能掩蓋蛋白質表 面的抗原決定簇，使蛋白質不能與各種細胞表面受體結合，不被機體的免疫系統識別，降低 了蛋白質的免疫原性；PEG與蛋白質偶聯後能將其優良的理化性質賦予蛋白質，如能改善 蛋白質的生物分布和溶解性能。
[0004] 但是傳統的PEG修飾多為隨機修飾，存在修飾劑呈現多種聚合度、選擇性不夠高、 修飾後蛋白質分子Mr分布寬、活性降低、穩定性有時不夠理想等問題，對於hG-CSF的修飾， 不同的PEG修飾劑能夠與hG-CSF上N-端的氨基、賴氨酸上的氨基，半胱氨酸上的巰基進 行反應，因此得到的為多種修飾產物的混合物，且每種產物的產量多少、活性高低均不同， 這對於應用帶來很多不便，因此，我們需要對傳統的修飾進行處理，已達到定點單修飾的效 果，傳統的定點單修飾的方法主要從三個方面入手：蛋白質方面，如蛋白質的定點突變、蛋 白質可逆性位點定向保護、非天然胺基酸的引入等；PEG的活化形式，如修飾氨基的PEG-醛 和修飾巰基的PEG-乙烯基碸等；反應條件的控制，如PH值、金屬離子或酶的催化等。發明 專利（專利申請號為00130974. 9)公開了 N-端化學修飾的蛋白質組合物及方法，所採用的 PEG-醛定點修飾蛋白質N端，但得到的產物仍然含多修飾產物的混合物。中國發明專利(專 利申請號為200810062516. 3)公開了一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突 變體的製備方法，所採用的就是將重組人粒細胞集落刺激因子的第18位半胱氨酸突變為 絲氨酸，從而將突變後的重組人粒細胞集落刺激因子突變體與帶有氨基反應基團的PEG反 應，再分離純化，得到聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子突變體，由於此方法需要 對蛋白質進行突變，而突變之後對蛋白質的影響未知，所以，採用這種方法，一方面操作復 雜，另一方面，容易對蛋白質的性質、活性等產生影響，因此，適用範圍有限。
【發明內容】
[0005] 本發明的一個目的是提供一種具有高生物活性的聚乙二醇單修飾的人粒細胞集 落刺激因子。
[0006] 本發明的另一個目的是提供一種製備高生物活性的聚乙二醇單修飾的人粒細胞 集落刺激因子的方法。
[0007] 本發明的另一個目的是提供一種聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的純 化方法。
[0008] 本發明的技術方案是這樣實現的：
[0009] -種聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法，包括以下步驟：
[0010] ①在hG-CSF溶液中加入0· 5-10m〇l/L的變性劑，在變性劑的存在下，hG-CSF中的 巰基便暴露出來，易於與所述特異性巰基修飾劑發生反應；
[0011] ②加入特異性巰基修飾劑，所述特異性巰基修飾劑為PEG-馬來醯亞胺、 PEG-鄰-吡啶-二硫醚、PEG-乙烯基碸和PEG-碘乙醯胺中的一種，用量為hG-CSF摩爾量 的1-50倍，所述特異性巰基修飾劑能夠特異的同hG-CSF種未配對的Cys上的巰基進行結 合；
[0012] ③在無氧條件下，25-40°C反應1-24小時後，去除所述變性劑，從而使hG-CSF復 性；
[0013] ④將步驟③中的反應物上樣，經離子交換層析及凝膠過濾層析得到單修飾的 PEG-hG-CSF 純品。
[0014] 優選的：
[0015] 步驟①中，在hG-CSF中加入濃度為4mol/L的鹽酸胍或者尿素作為變性劑；
[0016] 步驟②中，加入hG-CSF摩爾量10倍的PEG-鄰-吡啶-二硫醚作為所述特異性巰 基修飾劑；
[0017] 步驟③中，為在無氧條件下，室溫反應4小時後，通過超濾將反應液置換至 10-100mmol/L、PH4. 0-5. 0 的醋酸緩衝液中；
[0018] 步驟④中，將步驟③中的反應物上樣，經10-100mmol/L、pH4. 0-5. 0的醋酸緩衝 液平衡過的陽離子交換柱，上樣後，用0-100%的含lmol/L氯化鈉、濃度為10-100mm〇l/L、 PH4. 0-5. 0的醋酸緩衝液線性洗脫，收集主峰為PEG-hG-CSF，經過凝膠過濾柱柱脫鹽，並更 換緩衝液為l〇-l〇〇mM醋酸緩衝液PH4. 0-5. 0,即得到單修飾PEG-hG-CSF。
[0019] 根據上述方法製得的一種聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子，由人粒細胞 集落刺激因子Cysl7上的巰基結合聚乙二醇構成。
[0020] 優選的，所述特異性巰基修飾劑為PEG-馬來醯亞胺、PEG-鄰-吡啶-二硫醚、 PEG-乙烯基碸和PEG-碘乙醯胺中的任一種。
[0021] 優選的，所述特異性巰基修飾劑的Mr為lKDa至60KDa，性狀為直鏈狀或分支狀。
[0022] 更優選的，所述特異性巰基修飾劑是Mr為lOKDa的PEG-鄰-吡啶-二硫醚。
[0023] 對於重組的人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF)，由於其於天然人粒細胞集落刺激 因子（hG-CSF)的區別僅在於多了一個自由胺基酸，未配對的半胱氨酸由第17位排到第18 位，因此，其也可以採用本發明提供的方法進行同hG-CSF的操作，並得到相應的單修飾的 PEG-rhG-CSF (聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子)，即由重組人粒細胞集落刺 激因子Cysl8上的巰基結合聚乙二醇構成。
[0024] 本發明的有益效果為：本發明通過採用所述特異性巰基修飾劑以及特殊的反 應條件控制、反應步驟設定等，得到的所述聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子 (PEG-hG-CSF)，具有活性高，操作簡單，成本低的特點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可 以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0026] 圖1為採用本發明提供的方法製備的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激 因子的電泳圖譜，其中，數字1表示蛋白maker，2為市售藥品，3為採用本發明方法製得的單 修飾PEG-rhG-CSF，4為反應液；
[0027] 圖2為本發明實施例中，根據單修飾PEG-rhG-CSF活性測定實驗的方法測製得修 飾PEG-rhG-CSF的曲線圖；
[0028] 圖3為本發明實施例中，採用單修飾PEG-rhG-CSF活性測定實驗的方法測未進行 休書的rhG-CSF的曲線圖。
【具體實施方式】
[0029] 下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於 本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬於本發明保護的範圍。
[0030] 根據本發明提供的方法，我們進行下述操作：
[0031] ①在rhG-CSF中加入濃度為4mol/L的鹽酸胍作為變性劑，本實施例中，該rhG-CSF 由我公司自行純化，在變性劑的存在下，rhG-CSF的巰基便暴露出來，易於與所述特異性巰 基修飾劑發生反應；
[0032] ②加入hG-CSF摩爾量10倍的PEG-鄰-吡啶-二硫醚作為所述特異性巰基修飾 劑；
[0033] ③在無氧條件下，本實施中，採用的是氮氣條件下，室溫反應4小時後，通過超濾 將反應液置換至10mm〇l/L、PH4. 0的醋酸緩衝液中，使hG-CSF復性；
[0034] ④將步驟③中的反應物上樣，經10mmol/L、pH4. 0的醋酸緩衝液平衡過的陽 離子交換柱，陽離子交換柱的種類很多，如MacroCap SP，SP Sepharose Fast Flow, SP Sepharose High Performance等陽離子交換介質，本實施例中，我們採用的是SP Sepharose High Performance，上樣後，用 100% 含 lmol/L 氣化納、濃度為 10mmol/L、PH4. 0 的醋酸緩衝液線性洗脫，收集主峰為PEG-rhG-CSF，經過凝膠過濾柱脫鹽，凝膠過濾柱有多 種，包括Sephadex G10、G15、G25等，本實施例中，採用的是Sephadex G25柱，並更換緩衝液 為10mM醋酸緩衝液pH4. 0,得到單修飾PEG-rhG-CSF。
[0035] 我們對得到的單修飾的PEG-rhG-CSF進行活性測定實驗，如下：
[0036] 1、實驗目的：測定採用本發明得到的單修飾PEG-rhG-CSF的活性；
[0037] 2、實驗材料準備：
[0038] 2. 1RPMI1640 培養液：每 1L 添加 2. 2g 碳酸氫鈉、5. 9g HEPES，4°C保存。
[0039] 2. 2基礎培養液：RPMI1640培養液+15%馬血清（v/v) +0. 03%穀氨醯胺+0. 011%丙 酮酸鈉+ l〇〇U/ml雙抗(青、鏈黴素)，4°C保存。
[0040] 2. 3完全培養液：基礎培養液+ PEG-rhG-CSF至終濃度20ng(3000IU/ml)。4°C保 存。
[0041] 2. 4測活培養液：RPMI1640培養液+7. 5%馬血清（v/v) +0. 03%穀氨醯胺+0. 011% 丙酮酸鈉+ l〇〇U/ml雙抗(青、鏈黴素)，4°C保存。
[0042] 2· 5MTT :用 PBS(0. 01mol/L ρΗ7· 2)配成 5mg/ml。
[0043] 2. 6裂解液：含1%濃鹽酸，10%Triton X-100的異丙醇溶液，室溫避光保存。
[0044] 2. 7PEG-rhG-CSF生物學活性國家標準品：使用rhG-CSF，購於中國生物製品檢定 所。
[0045] 2. 8NFS-60細胞培養物：應為偏酸性、略微混濁液體，上次傳代後48?60小時用 於PEG-rhG-CSF活性測定。
[0046] 3、實驗步驟
[0047] 以下3. 1?3. 7項各步驟應於無菌條件下進行。
[0048] 3. 1準備：將實驗所用溶液預溫至37°C。
[0049] 3. 2製備細胞懸液：取足量NFS-60細胞培養物，離心收集NFS-60細胞，用 RPMI 1640培養液洗滌3次，然後重懸於測活培養液配成1. 0X 105?2. 0X 105個細胞/ml 的細胞懸液，每孔50 μ 1細胞懸液接種96孔培養板中，置37°C備用。
[0050] 3. 3標準品溶液：取標準品或企業生物學活性標準品，用測活培養液稀釋至 500IU/ml 左右。
[0051] 3. 4樣品溶液：將待檢樣品按標不量溶解後，用測活培養液稀釋成500IU/ml左右。
[0052] 3. 5在96孔細胞培養板中，每孔加入100 μ 1測活培養液，每孔加入50 μ 1標準品 溶液或樣品溶液，然後以3倍稀釋度做梯度稀釋，標準品和待檢樣品同做7?8個稀釋度， 取50ul加入96孔細胞板中，每個梯度做2?3個復孔，同時做空白對照。37°C，5%C02培養 40?48小時。
[0053] 3. 6加入MTT溶液並培養：每孔加入20μ 1MTT溶液，37°C，5%C02培養4?5小時。
[0054] 3. 7加入裂解液並測定結果：每孔加入200 μ 1裂解液，混勻後在酶標儀上比色，測 定波長570nm，參比波長630nm，記錄測定結果。
[0055] 3. 8稀釋倍數為橫坐標，A570/630值為縱坐標，做四參數回歸方程曲線圖。
[0056] 4.結果計算：
[0057]
【權利要求】
1. 一種聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法，其特徵在於，包括以下 步驟： ① 在hG-CSF溶液中加入0· 5-10mol/L的變性劑； ② 加入特異性巰基修飾劑，用量為hG-CSF摩爾量的1-50倍； ③ 在無氧條件下，25-40°C反應1-24小時後，去除所述變性劑； ④ 將步驟③中的反應物上樣，經離子交換層析得到單修飾的PEG-hG-CSF純品。
2. 如權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法，其特徵 在於：步驟①中，在hG-CSF中加入濃度為4mol/L的鹽酸胍或尿素作為變性劑。
3. 如權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法，其特 徵在於：步驟②中，所述特異性巰基修飾劑為PEG-馬來醯亞胺、PEG-鄰-吡啶-二硫醚、 PEG-乙烯基碸和PEG-碘乙醯胺中的任一種。
4. 如權利要求3所述的聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法，其特徵 在於：步驟②中，所述特異性巰基修飾劑的Mr為lKDa至60KDa，性狀為直鏈狀或分支狀。
5. 如權利要求4所述的聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法，其特徵 在於：步驟②中，所述特異性巰基修飾劑是Mr為lOKDaPEG-鄰-吡啶-二硫醚，加入量為 hG-CSF摩爾量10倍。
6. 如權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法，其特徵 在於：步驟③中，為在無氧條件下，室溫反應4小時後，通過超濾或凝膠過濾層析將反應液 置換至10-100mm〇l/L、PH4. 0-5. 0的醋酸緩衝液中。
7. 如權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子的製備方法，其特 徵在於：步驟④中，將步驟③中的反應物上樣，經l〇-l〇〇mmol/L、pH4. 0-5. 0的醋酸緩衝 液平衡過的陽離子交換柱，上樣後，用0-100%含lmol/L氯化鈉、濃度為10-100mm〇l/L、 PH4. 0-5. 0的醋酸緩衝液線性洗脫，收集主峰為PEG-hG-CSF，經過凝膠過濾柱脫鹽，並更換 緩衝液為l〇-l〇〇mM醋酸緩衝液PH4. 0-5. 0,即得到單修飾PEG-hG-CSF。
8. -種聚乙二醇單修飾的人粒細胞集落刺激因子，由人粒細胞集落刺激因子Cysl7上 的巰基結合聚乙二醇構成，其特徵在於：採用如權利要求1所述的方法製得。
【文檔編號】C07K14/53GK104109199SQ201310130804
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年4月16日 優先權日:2013年4月16日
【發明者】王軍, 張靜, 張楠, 慕彩梅 申請人:深圳新鵬生物工程有限公司