聚合物鍵接的喜樹鹼衍生物的製作方法

2023-10-07 21:20:04 2

專利名稱：聚合物鍵接的喜樹鹼衍生物的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有抗癌活性的水溶性聚合物鍵接的喜樹鹼和聚合物鍵接的喜樹鹼衍生物，製備它們的方法及含有它們的藥物組合物。
喜樹鹼是一種從喜樹的葉和樹皮分離出來的生物鹼；喜樹鹼的其它類似物也是已知的並能通過從喜樹鹼進行半合成或通過總體合成來製備參見J.Amer.Chem.Soc.94(10)，3631(1972)；J.Chem.Soc.D(7)，404(1970)；US—A—4,981,969(1991年1月1日)；US—A—5,049,668(1991年9月17日)。
喜樹鹼具有由稠環體系組成的五環結構，稠環形成喹啉環(環A和B)，吡咯烷環(環C)，吡啶酮環(環D)和α—羥基—δ—內酯部分(環E)。喜樹鹼和幾種其A環被取代的衍生物都對各種固體癌(細胞)譜系，包括耐臨床上可使用的化學治療劑的細胞譜系，表現出抗癌活性[參見J.Clin.Phamacol.30，770(1990)；Cancer Chemoth-er.Pharmacol.28，192(1991)]。
喜樹鹼，以及其絕大多數衍生物，由於醌氮原子的弱鹼性，幾乎不溶於適合腸胃外施藥的賦形劑。為了溶解喜樹鹼，曾推出幾種水溶性前藥(Prodrug)，如20—O—磷酸酯或20—O—醯氨基衍生物，它們能被無機酸質子化，從而具有水溶解性參見US—A—4,943,579(1990年7月24日)。在施用這些藥物時，會伴隨而來一些毒副作用，包括血液和胃腸毒副作用。已經作了許多嘗試，通過改善其結構來改進喜樹鹼的治療指數。
本發明提供水溶性的及在體內具有抗癌活性和低毒性的喜樹鹼的聚合共軛體。更具體地說，本發明提供了聚合共軛體，它在這裡表示為A並主要由以下單元組成(i)60～99摩爾％的由以下通式1表示的N—(2—羥基丙基)甲基丙烯醯胺單元 (ii)1～40摩爾％的由以下通式2表示的20—O—(N—甲基丙烯醯甘氨醯—氨基醯基)喜樹鹼單元 其中[A]是具有由至少三個原子隔開的各端氨基和羰基的間隔基，O—CPT表示喜樹鹼殘基，喜樹鹼的C—20基團連接到司隔基[A]的端羰基；和(iii)0～10摩爾％的由以下通式3表示的N—甲基丙烯醯甘氨酸或N—(2—羥基丙基)甲基丙烯醯甘氨醯胺單元 其中Z表示羥基或結構式為—NH—CH2—CH(OH)—CH3的殘基。
本發明還提供了製備如上定義的聚合共軛體的方法，該方法包括讓通式7的20—O—醯氨基喜樹鹼衍生物H[A]-O-CPT7其中[A]和O—CPT如上所定義，與主要由以下單元組成的聚合物進行反應(i)60～99摩爾％的由通式1表示的N—(2—羥丙基)甲基丙烯醯胺單元 和
(iv)40～1摩爾％的由通式4表示的N—甲基丙烯醯甘氨酸單元 其中R2是(a)活性酯殘基或(b)羥基；及選擇性地用1—氨基—2—丙醇置換剩餘活性酯基。
該聚合共軛體A含有比例達60摩爾％或更高的，例如至少80摩爾％或至少85摩爾％的，由通式1表示的N—(2—羥丙基)甲基丙烯醯胺單元。這些單元可以以91—98摩爾％的量存在。該共軛體還可含有1～40摩爾％的由通式2表示的20—O—(N—甲基丙烯醯甘氨醯—氨基醯基)喜樹鹼單元，例如1～20％摩爾％的此類單元。該共軛體可含有1～8摩爾％的，例如2～6摩爾％的這些單元。
間隔基[A]可以是3～12，例如6～9個原子長。一般地，該基團易發生細胞內水解。優選其耐細胞內水解。該間隔基可以是多肽間隔基，例如1～4或2～4個胺基酸殘基那樣長。該間隔基可以是二肽、三肽或四肽。
優選的間隔基[A]是選自Ala-Gly，Phe-Gly，Phe-Phe，Leu-Gly，Val-Ala，Phe-Ala，Leu-Phe，Leu-Ala，Phe-Leu-Gly，Phe-Phe-Leu，Leu-Leu-Gly，Phe-Tyr-Ala，Phe-Gly-Phe，Phe-Phe-Gly和Phe-Leu-Gly-Phe。此外，間隔基[A]是結構式為HN—Y—CO—的基團，其中Y是C3—C6直鏈或支鏈烷基，如—(CH2)n—，這裡n是3，4，5或6。
此外，間隔基[A]是結構式為Ala-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Phe-NH-Y-CO-，Leu-Gly-NH-Y-CO-，Val-Ala-NH-Y-CO-，Phe-Ala-NH-Y-CO-，Leu-Phe-NH-Y-CO-，Leu-Ala-NH-Y-CO-，Phe-Leu-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Phe-Leu-NH-Y-CO-，Leu-Leu-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Tyr-Ala-NH-Y-CO，Phe-Gly-Phe-NH-Y-CO-，Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO-或Phe-Leu-Gly-Phe-NH-Y-CO-的基團，其中Y具有與以上同樣的定義。
喜樹鹼殘基由O—CPT表示。該喜樹鹼可以是喜樹鹼本身或其類似物如A—環類似物。這種A—環類似物因而是在A—環上被取代的喜樹鹼。該喜樹鹼可以是天然S形式或R形式，或者是R和S形式的混合物(外消旋混合物)。適宜的喜樹鹼殘基O—CPT由通式5表示 其中R1表示，例如氫、羥基、硝基或氨基或者連接到A環上兩相鄰碳原子上的亞甲二氧基。優選R1表示氫，9—，10—，11—或12—羥基，9—或10—硝基，9或10氨基或10，11—亞甲二氧基。更優選的是通式6的喜樹鹼殘基 其中R1是如上所定義。
優選地，通式2單元以1—10摩爾％，如0.5—5摩爾％的量存在。同時還優選地，喜樹鹼含量佔聚合共軛體體的1—10％(W/W)，更優選4—8％(W/W)。
本發明還提供如上所定義的通式7的20—O—醯氨基—喜樹鹼衍生物。本發明進一步提供了製備通式7的20—O—醯氨基—喜樹鹼衍生物的方法，該方法包括在活化劑如4—二甲氨基吡啶存在下，讓喜樹鹼與通式8的N—保護了的氨基醯基衍生物進行縮合R3-[A]-P 8其中[A]如上所定義，以及R3表示氨基保護基，如t—boc，CBZ，FMOC，三苯甲矽烷基、二苯亞甲基或三苯甲基，和P是活化酯殘基，如對—硝基苯氧基，五氟苯氧基或N—羥基琥珀醯亞胺基，製得由通式9表示的N—保護了的—20—O—(醯氨基)化合物R3-[A]-[O-CFT]其中R3，[A]和[O—CPT]是如上定義；和從所得化合物脫去N—保護基通式8的化合物的製備是採用了文獻中已知的標準合成工藝步驟。合適的通式8的N—保護了的—氨基醯基衍生物包括N—三苯甲基—L—苯基丙醯胺基—L—亮氨醯甘氨酸(對硝基苯)酯(8a)或N—三苯甲基—甘氨醯—L—亮氨醯—甘氨酸(對硝基苯)酯(8b)，或6—N—三苯甲基—己酸(對硝基苯)酯(8c)。一些通式8的衍生物及它們的製備方法還在我們等待審查的國際專利申請PCT/EP94/01100中有敘述。
因此，比方說，在活化劑如4—二甲氨基吡啶的存在下，喜樹鹼能夠在無水溶劑如無水二甲基甲醯胺或二甲亞碸中與摩爾過量的，例如接近5倍摩爾過量或更多的，尤其2摩爾當量的通式5的N—保護了的—氨基醯基衍生物進行反應。以這種方式，該保護了的胺基酸被連接在喜樹鹼分子的C—20位上。該反應一般可進行8—24小時。該反應一般在15—40℃的溫度下進行。應該注意，在此類反應條件下，9—氨基喜樹鹼因9—氨基的弱鹼性而能夠部位專一地在C—20—羥基位發生反應。
氨基保護基R3可由適當的解保護劑來脫除，得到通式7的20—O—醯氨基—喜樹鹼衍生物。因而，解保護可由中等強度的酸來實現，如用乙酸處理，或者由還原來實現。從而可使用氫解方法。
通式7的20—O—醯氨基—喜樹鹼衍生物與主要由60—99摩爾％通式1的N—(2—羥丙基)—甲基丙烯醯胺單元和40—1摩爾％通式4的N—甲基丙烯醯胺單元所組成的聚合物的縮合，以及隨後可以進行的剩餘活性酯基的置換，都是在能夠保留喜樹鹼和間隔基[A]之間的鍵合性質及保留共軛體的性質的條件下進行的。
按照在Makromol.Chem.178，2159(1977)中所描述的那樣，主要由60—99摩爾％通式1的N(2—羥丙基)—甲基丙烯醯胺單元和40—1摩爾％通式4的N—甲基丙烯醯甘氨酸單元組成的聚合物是通過N—(2—羥丙基)甲基丙烯醯胺與N—甲基丙烯醯甘氨酸或N—甲基丙烯醯甘氨酸活性酯衍生物進行共聚而製備的。R2可以表示苯氧基，它能夠在苯環上被一個或多個吸電子基團取代。適宜的吸電子基團的例子包括硝基和滷素。R2優選是離去基團 其中L是吸電子基團，例如—NO2或滷素如氟或氯，和m是1—5之間的整數，一般為1—3，優選為1或2。R2優選是對硝基苯氧基或2，4—二氯苯氧基。
優選地，在其中R2表示(a)活性酯殘基的聚合物和通式7的化合物之間發生的製備本發明聚合物共軛體的反應是在無水極性有機溶劑如二甲基甲醯胺或二甲亞碸中進行的。該反應一般進行8—24小時。該反應一般在15—30℃的溫度下，優選在室溫下進行15小時；然後，剩餘活性酯的氨解可以在室溫下在1—氨基—2—丙醇存在下進行0.5—1小時。該共軛體可適當地用丙酮沉澱，溶於乙醇中，然後用丙酮沉澱。
在另一個方法中，為了製備本發明的聚合物共軛體，在其中R2表示羥基(b)的聚合物和通式7的化合物之間發生的反應是在縮合劑2—乙氧基—1—乙氧基羰基—1，2—二氫喹啉存在下在無水極性溶劑如二甲基甲醯胺或二甲亞碸中進行的。該反應一般進行8至24小時。該反應一般在15—30℃的溫度下，優選在室溫下反應15小時；然後，共軛體用丙酮沉澱，溶於乙醇中，接著用丙酮沉澱。
例如，其中R2表示活性酯殘基(a)的、在無水二甲亞碸中以15％(重量/體積)的濃度提供的聚合物是在室溫下用3％(W/V)的通式7的20—O—氨基醯基喜樹鹼衍生物處理15小時。然後，加入0.1％(W/V)的1—氨基—2—丙醇，該反應混合物在室溫下保持1小時。該共軛體可用丙酮沉澱，然後以10％(W/V)的濃度用絕對乙醇溶解，接著再次用丙酮沉澱，得到根據本發明的中性喜樹鹼共軛體。
在另一個實施例中，其中R2表示羥基(b)的、在無水二甲亞碸中以15％(重量/體積)的濃度提供的聚合物是在室溫下在1.3％(W/V)的2—乙氧基—1—乙氧基羰基1，2—二氫喹啉存在下用3％(W/V)的通式7的20—O—氨基醯基喜樹鹼衍生物處理15小時。然後，加入丙酮引起沉澱，以10％(W/V)的濃度用絕對乙醇溶解沉澱物，接著再次加入丙酮引起沉澱，得到根據本發明的聚合共軛體。
在本發明的聚合共軛體中活性藥物如喜樹鹼或其A—環類似物的含量是通過HPLC或吸收光譜分析法測定的。
在本發明中描述的喜樹鹼及其A—環類似物的聚合物共軛體具有改進的水溶性和較低的毒性。該共軛體表現出良好的水溶性、生物相容性並通過酶催裂解將喜樹鹼釋放在血漿中或在內化後進入細胞中。
生物活性N—(2—羥基丙基)甲基丙烯醯胺，20—O—[N—甲基丙烯醯甘氨醯—L—苯基丙醯胺基—L—亮氨醯甘氨醯]喜樹鹼和N—(2—羥丙基)甲基丙烯醯基甘氨醯胺(A2)的共聚物對移植有HT29/ColonCarcinoma(表1)的裸(nude)鼠和對有早期和後期M5076鼠網狀細胞內瘤(表2和表3)的鼠進行試驗，與游離的喜樹鹼(CPT)相比較。
當與喜樹鹼對比時，對於聚合物鍵接的喜樹鹼衍生物A2來說，在所有的實驗中都觀察到了很高的活性。值得注意的是，在對HT29/Colon Carcinoma的實驗中發現治癒的鼠。
用同樣的治療程序測試A2和CPT的抗癌活性。
應該注意，聚合物鍵接的喜樹鹼A2被發現高度溶於水並能溶於鹽水及可以靜脈(iv)注射，而CPT溶於水和吐溫80(Tween 80，聚環氧乙烷山梨糖醇單月桂酸酯)的混合物中。
藥物製劑和施用化合物A2在使用前溶於蒸餾水中，其濃度在370nm(EL％57.18)處用分光光度分析法檢測。喜樹鹼(CPT)溶於有10％吐溫的滅菌水中。
以體重的10ml/kg的容積進行靜脈(iv)注射治療，對比鼠用滅菌水進行治療。
瘤使用15—20mg瘤漿將HT29 Colon Carcinoma皮下(S.C.)移植在athymic Swiss/nu/mice體內。
M5076鼠網狀細胞肉瘤由一連串i、m、(肌內)通道保藏並被皮下移植(5×105細胞/鼠)在可相容的C57B1/6鼠體內)。
所有的動物來自Charles River Calco，Como，Italy。
普通鼠10隻一組，無胸腺鼠8隻一組普通鼠重量為20—22g，並保持在標準實驗室條件下。
該鼠群被定期試驗一組病原體(包括鼠肝炎，Sendai Virus和Myco Plasma Pulmonis)的抗體的消失。
抗癌活性和毒性的評價由長規測量鑑測瘤的生長並根據Geran等(參見Cancer Chem.Rep.，Part3，3(2)ed.3，PP1—103，1972)估計瘤重量。抗癌活性使用下式表達為瘤生長的抑制百分數(％T/l) 使用下式計算存活時間(T/C％)的中等增長 治癒的鼠是在實驗結束時沒有瘤的鼠。
以體重的減少和全部屍體剖檢為基礎，主要根據脾臟和肝的大小的減少來評價毒性。
表1.化合物A2與喜樹鹼(CPT)對HT29/Colon Carcinoma的抗癌活性的比較
(1)表示為CPT當量。
(2)毒死鼠的數目/鼠的總數(3)瘤移植90天後無瘤的鼠。
表2.化合物A2與喜樹鹼(CPT)對早期M5076鼠網狀細胞肉瘤的抗癌活性的比較
(1)表示為CPT當量。
(2)毒死鼠的數目/鼠的總數
(3)在最後治療後的一星期時間估計瘤抑制率％。
表3.化合物A2與喜樹鹼(CPT)對後期M5076鼠網狀細胞肉瘤的抗癌活性的比較。在第16、20、24、28、31、35天的治療程序iv(靜脈注射)
(1)表示為CPT當量。
(2)毒死鼠的數目/鼠的總數(3)在第34天評估瘤抑制率％。
毒性N—(2—羥丙基)甲基丙烯醯胺，20—O—[N—甲基丙烯醯基甘氨醯—L—苯基丙醯胺基—L—亮氨醯甘氨醯]喜樹鹼和N—(2—羥丙基)甲基丙烯醯甘氨醯胺(A2)的共聚物的毒性是以健康C57B1/F鼠進行評價的，與喜樹鹼比較靜脈注射治療。
C57 B1/F鼠的LD10(1)和LD50(2)值如下
(1)LD10誘發10％的死鼠的劑量。
(2)LD50誘發50％的死鼠的劑量。
聚合物鍵接的喜樹鹼衍生物A2的低毒性使得能施用較大劑量的產物並能達到與喜樹鹼相當的或更好的效果。
該聚合物鍵接的喜樹鹼具有抗癌活性。它們抑制topo isomeraseI。它們尤其用於治療白血病及結腸癌和直腸癌。
因此，人或動物可由這樣一種方法進行治療包括向他(它)們施用治療有效量的本發明的聚合共軛體。從而可以改善病人或患病動物的狀況。
所使用的劑量範圍將取決於施藥途徑和取決於患者的年齡、重量和狀況。該聚合物共軛體一般通過腸胃外途徑施藥，例如肌內注射、靜脈注射或通過快速濃注施藥。適宜的劑量範圍是每m2體表面積1—1000mg喜樹鹼當量，例如10—50mg/m2。
該聚合共軛體可與藥理上可接受的載體或稀釋劑一起配成藥物組合物。該聚合共軛體一般經配製後用於腸胃外施藥，例如溶於水或生理鹽水中用於注射。
下面實施例是為了說明本發明，而不是限制定。在本說明書的上下文中，胺基酸殘基都是以根據Eur.J.Biochem，138，9—37，1984的三字母編碼表示的。
以如下方式測試聚合共軛體在鼠或人的血漿中的穩定性向1ml鼠或人的血漿中，加入不同濃度的本發明聚合共軛體，然後在適當的時間(24，48，72，96小時)收集100μl樣品並在—70C下貯藏直到進一步處理為止。
每一樣品通過加入100μl的0.25M磷酸，500μlCH3CN和700μl乙酸乙酯及在4℃下劇烈振蕩20分鐘來進行萃取。然後，樣品以15000×g離心旋轉10分鐘，分離出上層清液。向殘餘物中加入300μlCH3CN和500μl乙酸乙酯，以15000×g離心旋轉10分鐘。分離出上層清液。合併有機相，使用高真空離心進行蒸發。通過加入500μlMeOH/水(70/30，體積比)(PH為2)回收樣品，並注射入HPLC裝置(高效液體色譜)中測定藥的總百分含量。
HPLC體系柱μBondapak C10(Waters)3.9×300mm流速1.5ml/mmin檢測器Spectrophotometer Fluorescence 650—40(Perkin Elmer)；發射434nm(窄縫5)；激發370nm(窄縫5注射10μl流動相51.5％MeOH，47.5％水，1％磷酸實施例16—N—三苯甲基—己酸對硝基苯酯(8C)(C6H5)3C-NH(CH2)5CO-OC6H4pNO28C6—氨基己酸(6.5g，50mmol)懸浮在乾燥氯仿(75ml)和乾燥乙腈(acetonitrile)(15ml)的混合物中，添加氯化三甲基矽(6.3ml，50mmol)並在劇烈攪拌下回流2小時。然後，冷卻該混合物，按順序添加三乙胺(13.7ml，100mmol).和己溶於乾燥氯仿(100ml)的三苯甲基氯(14g，50mmol)。該混合物在室溫下放置過夜，然後加入甲醇(10ml)，反應混合物在減壓下濃縮。殘餘物用5％冷檸檬酸水溶液(200ml)溶解，用乙酸乙酯(200ml)萃取。分離出有機相，用冷的1N氫氧化鈉水溶液(200ml)萃取。分離出有機相，用冰冷卻，用乙酸調PH至5，然後用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。在減壓下除去有機溶劑，在從乙酸乙酯中結晶出來後，得到6—N—三苯甲基—己酸(16g)。這一物質溶於無水四氫呋喃(150ml)和在攪拌下在0℃用對硝基苯酚(5.6g，400mmol)和二環己基碳二亞胺(8.4g，40mmol)處理1小時，然後在8℃下放置過夜。然後，過濾該反應混合物，在0℃下冷凍2小時，再一次過濾。最後，在減壓下除去有機溶劑，殘餘物用乙醚結晶，得到標題化合物8C(16.4g)。在Kieselgel(白色硅藻土載體)板F245(Merck)上做TLC，洗脫體系乙醚/正己烷(1∶1，按體積)Rf＝0.6；FD-MSm/z[M＋H]＋495 H1NMR(90MHz，CDCl3)δ1.1-1.9(m，6H)；2-2.5(m，4H)；5.7-5.9(m，2H，NH，-COOH)；7.2-7.7(m，15H)。
實施例220—O(6—氨基己醯)喜樹鹼(7C) 將喜樹鹼(6a，R1＝H，0.7g，2mmol)溶於乾燥二甲亞碸(100ml)，添加按照在實施例1中所敘述的那樣製備的6—N—三苯甲基—己酸對硝基苯酯(8C，2g，4mmol)，及4—二甲氨基吡啶(0.24g，2mmol)。反應混合物在室溫下保持48小時，然後用氯仿稀釋(400ml)，用水(3×100ml)洗滌。分離出有機相，經無水硫酸鈉乾燥，在減壓下濃縮至較小的體積。該粗物質在矽酸柱上進行快速色譜分離，用氯仿洗脫，得到20—O—(6—N—三苯甲基—己醯)喜樹鹼(0.6g)。在Kieselgel板F245(Merck)上做TLC，洗脫體系氯仿/甲醇(95∶5，按體積)Rf＝0.4。該N—保護了的衍生物在室溫下用95％的三氟乙酸(10ml)處理50分鐘。在減壓下除酸之後，用乙醚收集標題化合物7C。收率0.4g。在Kieselgel板F245(Merck)上做TLC，洗脫體系二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(80∶20∶7∶3)Rf＝0.6。FD—MSm/Z[M＋H]＋462實施例3
20—O—(L—苯基丙醯胺基—L—亮氨醯—甘氨醯)喜樹鹼(7b) 按照前面在UK申請號9309663.4中敘述的那樣所製備的N—三苯甲基—L—苯基丙醯胺基L—亮氨醯甘氨酸對硝基苯酯(8a，1.4g，2mmol)，喜樹鹼(6a，R1＝H，0.35g，1mmol)和4—二甲氨基吡啶(0.12g，1mmol)用乾燥二甲亞碸(50ml)溶解，在室溫下攪拌20小時。然後，反應混合物用氯仿(400ml)稀釋並用水(3×100ml)洗滌。分離出有機相，經無水硫酸鈉乾燥，然後在減壓下濃縮至較小的體積。該粗物質在矽酸柱上進行快速色譜分離，用氯仿/甲醇(99.5/0.5，按體積)的混合物洗脫。合併含有標題化合物的N—保護了的衍生物的級分，濃縮至乾燥，用75％乙酸水溶液(30ml)溶解，然後在室溫下保持1小時。反應混合物用固體碳酸氫鈉調至PH7，然後用氯仿(400ml)萃取。在除去有機溶劑之後，標題化合物7b從乙醚中結晶出來。收率0.16g。在Kieselge(板F245(Merck)上做TLC，洗脫體系氯仿/甲醇(9∶1，按體積)Rf＝0.35。FD-MSm/z[M＋H]+6671H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.81(d，J＝6.5Hz，3H，δ-Leu)；0.82(d，J＝6.6Hz，3H，δ′-Leu)；0.98(t，J＝7.6Hz，3H，CH3-CH2)；1.25(m，1H，β-Leu)；1.39(m，1H，-Leu)；1.56(m，1H，β′-Leu)；1.98(dd，J＝6.4Hz，J＝13.5Hz，1H，β-Phe)；2.1-2.4(m，2H，CH2CH3)；2.48(d，J＝7.0Hz，1H，NH-Phe)；2.77(dd，J＝4.7Hz，J＝13.5Hz，1H，β′-Phe)；3.41(m，1H，α-Phe)；4.0-4.3(m，3H，α-Gly＋α′-Gly＋α-Leu)；5.20-5.27(two-d，J＝19.9Hz，2H，5-CH2)；5.41-5.68(two-d，J＝17.3Hz，2H，17-CH2)；6.35(t，J＝5.3Hz，1H，NH-Gly)；6.76(d，J＝7.6Hz，1H，NH-Leu)；6.8-7.3(m，21H，4×(C6H5)＋14-H)。
實施例49—氨基—20—O—(L—苯基丙醯胺基—L—亮氨醯—甘氨醯)喜樹鹼(7C) 按照在實施例3中所敘述的那樣，N—三苯甲基—L—苯基丙醯胺基—L—亮氨醯甘氨酸對硝基苯酯(8a，1.14g，2mmol)，9—氨基—喜樹鹼(6b，R1＝NH2，0.363g，1mmol)，4—二甲氨基吡啶(0.12g，1mmol)在室溫下在乾燥二甲亞碸(20ml)中進行反應，得到標題化合物7C(0.31g)。在Kieselgel板F245(Merck)上做TLC，洗脫體系氯仿/甲醇(9∶1，按體積)Rf＝0.2；FD-MSm/z[M＋H]+682；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.82(d，J＝6.5Hz，6H，δ-Leu＋δ′-Leu)；1.00(t，J＝7.6Hz，3H，CH2CH3)；1.25(m，1H，β-Leu)；1.41(m，1H，-Leu)；1.59(m，1H，β′-Leu)；1.99(dd，J＝6.2Hz，J＝13.5Hz，1H，β-Phe)；2.1-2.4(m，2H，CH2CH3)；2.47(d，J＝6.5Hz，1H，NH-Phe)；2.79(dd，J＝4.7Hz，J＝13.5Hz，1H，β′-Phe)；3.4 3(m，1H，α-Phe)；4.0-4.3(m，5H，9-NH2＋α-Leu＋α-Gly＋α′-Gly)；5.04-5.15(two-d，J＝19.9Hz，2H，CH2)；5.39-5.66(two-d，J＝17.0Hz，2H，17-CH2)；6.44(t，J＝5.3Hz，1H，NH-Gly)；6.81(d，J＝7.6Hz，1H，NH-Leu)；6.85(m，3H，10-H+ -)；7.0-7.4(m，19H，3x(C6H5) +14-H)；7.51(m，1H，11-H)。
實施例5N—(2—羥丙基)甲基丙烯醯胺，20—O—[N—甲基丙烯醯甘氨醯—(6—氨基己醯)]喜樹鹼和N—(2—羥丙基)甲基丙烯醯甘氨醯胺的共聚物(A1X＝96，Y＝3，Z＝1) 按照在Makromol.Chem.，178，2159(1977)中描述的那樣所製備的含有2.7×103當量對硝基苯酯的N—(2—羥丙基)甲基丙烯醯胺和N—甲基丙烯醯甘氨酸對硝基苯酯的共聚物(0.15g)，與按照在實施例2中描述的那樣所製備的20—O—(6—氨基己醯)喜樹鹼(7C，18mg)在室溫下在乾燥二甲亞碸(1ml)中反應18小時，然後，在室溫下與1—氨基—2—丙醇(2μl)反應1小時。然後，用丙酮(70ml)處理反應混合物。收集沉澱，用無水乙醇(5ml)再次溶解，然後用丙酮(50ml)再次沉澱，得到含有5％(W/W)喜樹鹼的標題共軛體A1(0.14g)。在經過血漿培育120、時後，共軛體A1釋放出10％喜樹鹼。
實施例6N—(2—羥基丙基)甲基丙烯醯胺，20—O—[N—甲基丙烯醯甘氨醯—L—苯基丙醯胺基—L—亮氨醯甘氨醯]喜樹鹼和N—(2—羥基丙基)甲基丙烯醯甘氨醯胺的共聚物(A2X＝96，Y＝2.2，Z＝1.8) N—(2—羥基丙基)甲基丙烯醯胺和N—甲基丙烯醯甘氨酸對硝基苯酯的共聚物(0.15g，含有2.7×103當量的對硝基苯酯)和按照在實施例3中描述的那樣所製備的20—O—(甘氨醯—L—亮氨醯—L—苯基丙醯胺基)喜樹鹼(7b，20mg)在乾燥二甲亞碸(1ml)中進行反應，然後與1—氨基—2—丙醇進行反應(都按照在實施例6中描述的那樣)，得到含4.8％W/W喜樹鹼的標題共軛體A2(0.14g)。在經過血漿培育60小時之後，共軛體A2釋放100％的喜樹鹼。
實施例7N—(2—羥基丙基)甲基丙烯醯胺，9—氨基—20—O—[N—甲基丙烯醯甘氨醯—L—苯基丙醯胺基—L—亮氨醯甘氨醯]喜樹鹼和N—(2—羥基丙基)甲基丙烯醯甘氨醯胺的共聚物(A3X＝96，Y＝3，Z＝1)
按照在實施例5中所描述的那樣，通過讓N—(2—羥基丙基)甲基丙烯醯胺和N—甲基丙烯醯甘氨酸對硝基苯酯的共聚物(0.15g，含有2.7×10-3當量的對硝基苯酯)和按照在實施例4中描述的那樣所製備的9—氨基—20—O—(甘氨醯—L—亮氨醯—L—苯基丙醯胺基)喜樹鹼(7C，20mg)在乾燥二甲亞碸(1ml)中進行反應，然後與1—氨基—2—丙醇進行反應而製備出標題共軛體。收率0.14g，含有6.3％W/W9—氨基—喜樹鹼。在經過血漿培育50小時之後，共軛體A3釋放出100％的喜樹鹼。
權利要求
1.一種聚合共軛體，它主要由以下單元組成(i)60—99摩爾％由通式1表示的N—(2—羥基丙基)甲基丙烯醯胺單元 (ii)1—40摩爾％由通式2表示的20—O—(N—甲基丙烯醯甘氨醯—氨基醯基)喜樹鹼單元 其中[A]是具有由至少三個原子隔開的各端氨基和羰基的間隔基，O—CPT表示喜樹鹼殘基，喜樹鹼的C—20羥基連接到間隔基[A]的端羰基；和(iii)0—10％摩爾％由通或3表示的N—甲基丙烯醯甘氨酸或N—(2—羥基—丙基)甲基丙烯醯甘氨醯胺單元 其中Z表示羥基或結構式為—NH—CH2—CH(OH)—CH3的殘基。
2.根據權利要求1的共軛體，其中間隔基[A]選自Ala-Gly，Phe-Gly，Phe-Phe，Leu-Gly，Val-Ala，Phe-Ala，Leu-Phe，Leu-Ala，Phe-Leu-Gly，Phe-Phe-Leu，Leu-Leu-Gly，Phe-Tyr-Ala，Phe-Gly-Phe，Phe-Phe-Gly和Phe-Leu-Gly-Phe。
3.根據權利要求1的共軛體，其中司隔基[A]是結構式為—NH—Y—CO的基團，這裡Y是C3—C6直鏈或支鏈烷基；或結構式為 Ala-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Phe-NH-Y-CO-，Leu-Gly-NH-Y-CO-，Val-Ala-NH-Y-CO-，Phe-Ala-NH-Y-CO-，Leu-Phe-NH-Y-CO-，Leu-Ala-NH-Y-CO-，Phe-Leu-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Phe-Leu-NH-Y-CO-，Leu-Leu-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Tyr-Ala-NH-Y-CO，Phe-Gly-Phe-NH-Y-CO-，Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO-，或Phe-Leu-Gly-Phe-NH-Y-CO-的基團，這裡Y具有與以上同樣的意義。
4.根據前面權利要求中任一項的共軛體，其中O—CPT表示通式6的喜樹鹼殘基 這裡R1表示氫、羥基、硝基或氨基或者連接到A環上兩相鄰碳原子上的亞甲二氧基。
5.根據前面權利要求中任一項的共軛體，其中存在1—10摩爾％的該通式2單元。
6.根據前面權利要求中任一項的共軛體，其中喜樹鹼的含量是1—10％(W/W)。
7.一種製備按照權利要求1所定義的聚合共軛體的方法，該方法包括讓通式7的20—O—醯氨基—喜樹鹼衍生物H[A]—O—CPT 7其中[A]和O—CPT與權利要求1中所定義的相同，與主要由以下單元組成的聚合物進行反應(i)60—99摩爾％由通式1表示的N—(2—羥基丙基)甲基丙烯醯胺單元 和(iv)40—1摩爾％由通式4表示的N—甲基丙烯醯甘氨酸單元 其中R2是(a)活性酯殘基或(b)羥基；以及可以用1—氨基—2—丙醇置換剩餘活性酯基。
8.按照權利要求7定義的通式7的20—O—醯氨基—喜樹鹼衍生物。
9.一種製備按照權利要求7中所定義的通式7的20—O—醯氨基—喜樹鹼衍生物的方法，該方法包括讓喜樹鹼與通式8的N—保護了的一氨醯基衍生物R3—[A]—P 8其中[A]是具有與權利要求1中相同的定義，R3表示氨基保護基和P是活性酯殘基，在活化劑存在下縮合，得到由通式9表示的N—保護了的—20—O—(醯氨基)化合物R3—[A]—[O—CPT] 9其中R3和[A]具有與以上相同的定義，O—CPT具有與權利要求1中相同的定義；以及從所得化合物中脫除N—保護基。
10.藥物組合物，它包括藥理上可接受的稀釋劑或載體及作為活性成分的、按照在權利要求1—6中任一項要求的聚合共軛體。
全文摘要
一種聚合共軛體，它主要由以下單元組成(i)60-99摩爾％由通式1表示的N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺，(ii)1-40摩爾％由通式2表示的20-O-(N-甲基丙烯醯甘氨醯-氨醯)喜樹鹼單元，其中[A]是具有由至少三個原子隔開的各端氨基和羰基的間隔基，O-CPT表示喜樹鹼殘基，喜樹鹼的C-20羥基連接到間隔基[A]的端羰基；和(iii)0-10％摩爾％由通或3表示的N-甲基丙烯醯甘氨酸或N-(2-羥基-丙基)甲基丙烯醯甘氨醯胺單元，其中Z表示羥基或通式為-NH-CH
文檔編號C08F220/36GK1115564SQ94190775
公開日1996年1月24日 申請日期1994年9月21日 優先權日1993年10月8日
發明者F·安格魯希, A·蘇拉託 申請人:藥製品公司