一種新型胞外多糖及其生產菌株和製備方法

2023-10-26 15:50:37

一種新型胞外多糖及其生產菌株和製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種新型胞外多糖及其生產菌株和製備方法，屬於微生物【技術領域】。該新型胞外多糖為酸性多糖，其在水相中以納米粒子形態存在，而在二甲基亞碸中溶解完全；在pH3-11範圍內結構穩定，鹼處理後在中和過程中形成凝膠。可發酵生產該胞外多糖的菌株為肺炎克雷伯氏菌（ Kleibsiellapneumoniae ）PHRC1.001，保藏編號為CCTCC NO：M2014427。以此菌為出發菌株，以碳水化合物為主要碳源，以硝酸鹽為主要氮源，進行發酵可生產該新型胞外多糖。本發明獲得的新型胞外多糖產品是一種很有市場潛力的親水膠體添加劑，可應用於絮凝、水泥、陶瓷、食品添加劑等領域中，也可製備金屬納米粒子。CCTCC NO：M 201442720140918
【專利說明】一種新型胞外多糖及其生產菌株和製備方法
[0001]

【技術領域】
[0002] 本發明涉及微生物【技術領域】，尤其涉及一種新型胞外多糖及其生產菌株和製備方 法。

【背景技術】
[0003] 自黃原膠第一次實現工業化生產並實現巨大商業成功後，微生物多糖的開發引起 了科學界和工業界的濃厚興趣，紛紛投入人力、物力和財力開展新的具有特殊性能的微生 物多糖研究。
[0004] 微生物多糖包括胞內多糖、胞壁多糖和胞外多糖。微生物胞外多糖 (Exopolysaccharide)是指許多微生物在不同外部條件下的生長活動中分泌到細胞壁外的 多糖或多糖混合物。一方面，胞外多糖容易與菌體分離，可以通過深層發酵來實現工業化生 產。與動植物多糖相比，微生物多糖的生產受氣候、地理環境、自然災害等因素的影響較小， 生產周期短，產量及質量穩定，且微生物多糖安全無毒。另一方面，微生物多糖具有獨特的 理化性質，可作為乳化劑、潤滑劑、膠凝劑、成膜劑、懸浮劑、增稠劑和穩定劑廣泛應用於化 工、農業、石油、製藥和食品等多個領域。
[0005] 到目前為止，已研究成熟並投入生產的微生物多糖主要有黃原膠（Xanthan gum)、 威蘭膠(Welan gum)、結冷膠（GelIan gum)、小核菌葡聚糖（ScIeeroglucan)、短梗黴多糖 (Pullulan)、熱凝多糖（Curdlan)等。世界上微生物多糖的產量和年增長量都在大幅度上 漲，一些新型多糖的年增長量也達到了 30%以上，據估計，全世界微生物多糖的年工業產值 可達幾百億美元。但是國內微生物多糖的研究和生產創新性研究有待提高，國內首次發現 的有工業化潛力的新型微生物多糖不多，且相關的專利報導也很少，所以值得大力開展新 型微生物多糖的研究。
[0006] 克雷伯氏菌OWei/wie/a 是一種能夠產胞外多糖的微生物，國內外 克雷伯氏菌多糖相關的專利很少，而在非專利性的一些文章中，一些研究者報導了克雷伯 氏菌多糖可應用於免疫活性調節、吸附重金屬離子、絮凝等；但文獻報導中，克雷伯氏菌多 糖單位產量低（<15g/L)，碳源轉化率低，很難實現大規模工業生產，且沒有特殊的流變學特 性，在應用上有一定的局限性。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的在於：提供一種新型胞外多糖，該多糖具有良好的酸鹼穩定性和特 殊的鹼處理凝膠特性；提供能夠發酵生產該新型胞外多糖的微生物菌株，以及使用該菌株 製備新型胞外多糖的方法。
[0008] 本發明的目的通過下述技術方案實現： 一株生產新型胞外多糖的菌株，從湖北省武漢紡織大學汙水處理廠的活性汙泥中篩 選得到，該菌株於2014年9月18日保藏於中國典型培養物保藏中心（中國，武漢)，其分類 命名為肺炎克雷伯氏菌OVeiZwieBa /we應PHRC1. 001，保藏編號為CCTCC NO :M 2014427。
[0009] -種新型胞外多糖，由上述菌株肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001發酵生產得到。經化 學組分分析和理化性質研究表明，該胞外多糖是一種酸性多糖，在水相中以納米粒子形態 存在，而在二甲基亞碸中溶解完全，在pH 3-11範圍內結構穩定，鹼處理後的胞外多糖在中 和過程中形成凝膠。
[0010] 一種使用肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001製備新型胞外多糖的方法，包括如下步驟： (1) 種子培養 種子液體培養基：葡萄糖10-30g/L，氯化鉀5-20g/L，蛋白腖5-10g/L，pH 7. 0 ; 將肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001菌種接種於種子液體培養基中，在30-35°C、振蕩速度為 150-300rpm的條件下培養10-24h來獲得種子培養液； (2) 發酵培養 發酵培養基：蔗糖10_50g/L，硝酸鉀l-10g/L，磷酸二氫鈉 l-10g/L，七水合硫酸鎂 l-10g/L，氯化鈣 0· 5-2g/L，pH 7. 0 ; 種子培養液以2. 5-10%的接種量接種於發酵培養基中，在25-30°C、振蕩速度為 200-500rpm、空氣流量為5-30mV(L · h)的條件下，發酵48-96h生產胞外多糖。
[0011] 所述的製備新型胞外多糖的方法還包括如下處理步驟：將發酵液先於80-KKTC 水浴滅活菌體，再經離心除去菌體；發酵上清液中加入2-5倍體積的乙醇，靜置12-24h，使 胞外多糖成纖維狀析出，用300-500目的濾布過濾收集胞外多糖沉澱；將胞外多糖沉澱復 溶於水中，配成0.5-5%的多糖水溶液，以多糖水溶液：Sevag試劑=(2?4):1 (v/v)的比 例加入Sevag試劑(正丁醇：氯仿=1: (3?5) (v/v))沉澱去除蛋白，離心獲得上清液，重 復2-5次；將多糖水溶液(上清液)真空濃縮至濃度10-30%，採用真空乾燥或冷凍乾燥，研磨 製得胞外多糖粉末。所得到的胞外多糖粉末可以再溶於水中通過透析進一步純化。
[0012] 本發明的有益效果：提供了 一種發酵生產新型胞外多糖的菌株 PHRC1. 001，並確定了最優的發酵培養基、發酵條件和發酵後處理製備方法，獲 得了該微生物多糖粉末。該新型胞外多糖在水相中以納米粒子形態存在，而在二甲基亞碸 中溶解完全，同時具有良好的酸鹼穩定性和特殊的鹼處理凝膠特性，是一種很有市場潛力 的親水膠體添加劑，可應用於絮凝、水泥、陶瓷、食品添加劑等領域中，也可用於製備金屬納 米粒子。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1是實施例1所篩選產糖菌株的菌落形態圖。
[0014] 圖2是肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001在顯微鏡下的形態圖。
[0015] 圖3是肺炎克雷伯氏菌PHRCL 001懸液的OD (600nm)與菌體乾重DCW (g/L)之 間關係的標準曲線圖。
[0016] 圖4是肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001在7L發酵罐中發酵過程的各參數曲線。
[0017] 圖5是肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001胞外多糖溶解在不同溶劑中的粒徑分布圖。
[0018] 圖6是肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001胞外多糖水溶液在透射電鏡下的形態。
[0019] 圖7是pH對肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001胞外多糖粘度和結構的影響。
[0020] 圖8是pH為14對肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001胞外多糖形成凝膠的影響。

【具體實施方式】
[0021] 以下實施例用於進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制，在不 背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換均屬於本 發明的範圍。
[0022] 實施例1胞外多糖產生菌的篩選及鑑定 (1)樣品採集和預處理 從湖北省武漢紡織大學汙水處理廠的活性汙泥中取樣。將收集的樣品放入冰袋旁冷 藏，保持在較低溫度的環境下帶回實驗室並儘快進行處理。取固液混合樣品IOg放入裝有 150mL、0. 9%無菌生理鹽水的250mL錐形瓶中，振蕩均勻後備用。
[0023] (2)產糖菌株的初步分離 使用0. 9%無菌生理鹽水以體積計按照KT1-KT8的梯度對上述預處理樣品進行連續稀 釋，在每個稀釋度取〇. ImL稀釋樣品，分別塗布平板，在30°C條件下恆溫培養36-72h，用無 菌接種環挑取較大且粘稠的單菌落，菌落形態如圖1所示，粘稠的菌株周圍被一圈粘性多 糖包圍著。然後在相應的平板上劃線分離，得到純的單菌落，共分離出40株菌。純化的菌 株保藏在斜面培養基上，冰箱4°C保存。
[0024] (3)產糖菌株的二次分離 將40株菌通過如下方法進行發酵生產胞外多糖： 1)種子培養 種子液體培養基：葡萄糖15g/L，氯化鉀5g/L，蛋白腖7g/L，pH 7. 0,自來水配製； 將斜面保藏的菌種接種於種子液體培養基中，在30°C、振蕩速度為220rpm的條件下培 養12h來獲得種子培養液。
[0025] 2)發酵培養 發酵培養基：蔗糖40g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氫鉀2. 6g/L，七水合硫酸鎂2g/L，氯化鈣 0. 5g/L，pH 7. 0,自來水配製； 種子培養液以2. 5%的接種量接種於發酵培養基中，在30°C、振蕩速度為220rpm、空氣 流量為60mV(L · h)的條件下，發酵72h生產胞外多糖。
[0026] 測定發酵液的粘度和胞外多糖粗產量，最終獲得一株菌粗多糖的產量和發酵液表 觀粘度都相對較高，結合菌落的粘度，選取這株菌，命名為PHRC1. 001。
[0027] 其中，測定發酵液表觀粘度的方法為：在25°C時，採用椎板轉子（C60/l°，Til， gap 0.052mm)，在穩態剪切模式下，剪切速率為0.01-500 1/s時，用Haake Rheostress 6000旋轉流變儀測定發酵液的表觀粘度。
[0028] 測定胞外多糖粗產量的方法為：取20mL發酵液先於SO-KKTC水浴滅活菌體，經 lOOOOr/min離心20min除去菌體；發酵上清液中加入2-5倍體積的乙醇，靜置12-24h，使胞 外多糖成纖維狀析出，用300-500目的濾布過濾收集胞外多糖沉澱；將多糖沉澱放於真空 乾燥箱中35_45°C真空乾燥3_4h，稱得的總質量數值減去濾布質量後的數值與發酵液體積 的比值即為胞外多糖粗產量，單位為g/L。
[0029] 將篩選的菌株PHRC1. 001進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌株的形態，如圖2所 示，此株菌為革蘭氏陰性菌，呈短杆狀。
[0030] (4)篩選菌株的鑑定 將菌株PHRC1. 001送生工生物工程(上海）股份有限公司進行16S rDNA分子生物學鑑 定。將該株細菌測序結果在GenBank資料庫中進行Blast,根據16S rDNA的序列分析比對， 將篩選菌株鑑定為肺炎克雷伯氏菌該菌株已於2014年9月18 日保藏於中國典型培養物保藏中心（中國，武漢)，其保藏編號為CCTCC NO :M 2014427。
[0031] 實施例2蔗糖濃度對肺炎克雷伯氏菌PHRC1. 001產胞外多糖的影響 將蔗糖作為碳源，按照酵母膏3g/L，磷酸二氫鉀2. 6g/L，七水合硫酸鎂2g/L，氯化鈣 0.5g/L，pH 7.0,配製成不同蔗糖濃度的發酵培養基，按實施例1中所述的方法進行發酵培 養，結果發現在蔗糖濃度較低時，菌體主要進行自身的生長，代謝產糖活動比較緩慢，隨著 蔗糖濃度的增大，菌體量和產糖量都在增加，但在40g/L時達到最大，而隨著蔗糖濃度的繼 續增大，就會抑制菌體的生長和糖的積累，故確定蔗糖濃度為40g/L。蔗糖濃度對發酵產胞 外多糖的影響如表1所示。
[0032] 表1 鹿糖濃度對

【權利要求】
1. 一株生產胞外多糖的菌株，其特徵在於：分類命名為肺炎克雷伯氏菌 應o/?iae)PHRCl. 001，保藏編號為 CCTCC NO :M 2014427。
2. 使用權利要求1所述的菌株製備新型胞外多糖的方法，其特徵在於包括如下步驟： (1) 種子培養 將權利要求1所述的菌株菌種接種於種子液體培養基中，在30-35°C、振蕩速度為 150-300rpm的條件下培養10-24h來獲得種子培養液；所述的種子液體培養基為：葡萄糖 10-30g/L，氯化鉀 5-20g/L，蛋白腖 5-10g/L，pH 7. 0 ; (2) 發酵培養 種子培養液以2. 5-10%的接種量接種於發酵培養基中，在25-30°C、振蕩速度為 200-500rpm、空氣流量為30-60mV(L ? h)的條件下，發酵48-96h生產胞外多糖；所述的發 酵培養基為：蔗糖10_50g/L，硝酸鉀l-10g/L，磷酸二氫鈉l-10g/L，七水合硫酸鎂l-10g/L， 氯化鈣 0. 5-2g/L，pH 7. 0。
3. 根據權利要求2所述的製備新型胞外多糖的方法，其特徵在於：步驟（2)中所述的 發酵培養基為：蔗糖40g/L，硝酸鉀2g/L，磷酸二氫鈉3. 5g/L，七水合硫酸鎂7g/L，氯化鈣 0? 8g/L, pH 7. 0。
4. 根據權利要求2所述的製備新型胞外多糖的方法，其特徵在於還包括如下處理步 驟：將發酵液先於80-100°C水浴滅活菌體，再經離心除去菌體；發酵上清液中加入2-5倍體 積的乙醇，靜置12-24h，使胞外多糖成纖維狀析出，用300-500目的濾布過濾收集胞外多糖 沉澱；將胞外多糖沉澱復溶於水中，配成〇. 5-5%的多糖水溶液，以多糖水溶液：Sevag試劑 =(2?4) :1的比例加入Sevag試劑沉澱去除蛋白，離心獲得上清液，重複2-5次；將多糖 水溶液真空濃縮至濃度10-30%，真空乾燥或冷凍乾燥，研磨製得胞外多糖粉末。
5. 根據權利要求4所述的製備新型胞外多糖的方法，其特徵在於：將胞外多糖粉末再 溶於水中通過透析純化。
6. -種新型胞外多糖，其特徵在於：通過權利要求2-5任一項所述的方法製備得到。
7. 根據權利要求6所述的新型胞外多糖，其特徵在於：所述的新型胞外多糖為酸性多 糖。
8. 根據權利要求6所述的新型胞外多糖，其特徵在於：所述的新型胞外多糖在水相中 以納米粒子形態存在，在二甲基亞碸中溶解完全。
9. 根據權利要求6所述的新型胞外多糖，其特徵在於：所述的新型胞外多糖在pH 3-11 範圍內結構穩定。
10. 根據權利要求6所述的新型胞外多糖，其特徵在於：所述的新型胞外多糖鹼處理後 在中和過程中形成凝膠。
【文檔編號】C12N1/20GK104403981SQ201410786092
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月18日 優先權日:2014年12月18日
【發明者】方亞鵬, 崔娜娜, 趙萌 申請人:湖北工業大學