皂角刺總黃酮在製備預防和治療腫瘤藥物方面的應用的製作方法

2023-10-28 22:33:52 1

專利名稱：皂角刺總黃酮在製備預防和治療腫瘤藥物方面的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於皂角刺總黃酮應用技術領域，具體涉及皂角刺總黃酮作為細胞連接通訊增強劑，在製備預防和治療腫瘤藥物方面的應用，尤其是在腫瘤預防、腫瘤化療增效、組織增生方面的應用，如預防化學致癌、提高腫瘤化療指數、逆轉腫瘤化療耐藥、阻止乳腺增生和前列腺增生等。
背景技術：
細胞通訊通過細胞間連接，在細胞多種生理方面起重要作用，如調解細胞生長和分化、維持組織穩態和胚胎發育等，是細胞間通道的集合器，負責實體組織中鄰近細胞間的離子和小分子直接交換，其功能紊亂與多種疾病如組織增生、腫瘤形成等直接相關。細胞間通訊依靠間隙連接蛋白形成的蛋白通道維持，其中已知的重要間隙連接蛋白是間隙連接蛋白43(ConneXin 43)，在多種過度增殖的增生組織及腫瘤組織中表達減少。因此，升高間隙 連接蛋白43可以恢復細胞間連接通訊的正常化，對組織穩態失常化疾病有潛在的預防和治療作用。調節組織穩態、維持陰陽平衡是中藥治療疾病的主要特色。皂角刺，又稱天丁、皂針等，為豆科植物阜莢(Gleditsiasinensis Lain)的乾燥棘刺,主要產於江蘇、湖北，以及四川和貴州等地，有破血散結、消腫止痛、祛風止癢、通經活絡之功。皂角刺在中醫臨床中應用歷史悠久，《本草綱目》記載其「消腫脫毒，妒乳，風癘惡瘡，排膿，殺蟲」。現代醫學證實，皂角刺辛散性強，善通經活血，藥力能直達病所，是一味具有溫通消結功能的良藥。皂角刺總黃酮是一類主含黃酮類化合物的皂角刺精提物。本申請首次發現皂角刺總黃酮是一個細胞連接通訊增強劑，有很好的預防和逆轉腫瘤耐藥作用，並能阻止組織增生，進而對其在醫藥中潛在的臨床應用進行了深入的研究。

發明內容
本發明目的在於提供皂角刺總黃酮作為細胞連接通訊增強劑，在製備預防和治療腫瘤藥物方面的應用。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案
皂角刺總黃酮作為細胞連接通訊增強劑，在製備預防和治療腫瘤藥物方面的應用。進一步的，皂角刺總黃酮在製備抗癌藥物方面的應用，尤其是在製備抗皮膚癌、肺癌、乳腺癌及治療乳腺增生或前列腺增生藥物方面的應用。皂角刺總黃酮作為細胞連接通訊增強劑，可用於預防化學致癌、提高腫瘤化療指數、逆轉腫瘤化療耐藥、阻止乳腺增生和前列腺增生等組織穩態失常化疾病。其動物有效劑量範圍為口服50-5000mg/kg體重/日、注射20-2000mg / kg體重/日，優選劑量為口服IOO-IOOOmg /kg體重/日、注射50-500mg /kg體重/日。推算的人用有效劑量範圍為口服O. 4-40g /日、注射O. 16-16g /日，優選劑量為口服O. 8-8g/日、注射0.4_4g/日。所述皂角刺總黃酮可按照本領域常規技術進行提取即可。如，在本發明中，皂角刺總黃酮可按下述方法獲取將洗淨、烘乾、粉碎過的皂角刺經石油醚脫脂後，用體積濃度60 — 80%的乙醇水溶液按液料比20 — 30 I於80±5°C提取2次，每次2h，過濾，合併提取液並濃縮至每ml相當於O. Ig原藥材，分別經95%乙醇(指體積濃度，下同)、80%乙醇各醇沉I次，過濾，濾液再經大孔吸附樹脂吸附、70%乙醇洗脫，洗脫液真空乾燥後即得。以蘆丁為標準經分光光度測定總黃酮含量>90%。本發明經試驗發現皂角刺總黃酮作為細胞連接通訊增強劑，可用於預防化學致癌、提高腫瘤化療指數、逆轉腫瘤化療耐藥、阻止乳腺增生和前列腺增生等組織穩態失常化疾病。皂角刺總黃酮對二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮膚癌及烏拉坦引起的小鼠肺癌均有顯著降低發病率作用(見圖I、圖2);對阿黴素、環磷腺癌、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤均有增效作用(見圖3、圖4);可以逆轉阿黴素耐藥小鼠乳腺癌4T1及阿黴素耐藥小鼠肺癌lewis對阿黴素的治療抵抗作用(見圖5、圖6、圖7)。皂角刺總黃酮對小鼠乳腺增生和前列腺增生均有抑制作用(見圖8、圖9);能升高誘癌組織、腫瘤組織和增生組織間隙連接蛋白43(見圖10、圖11),增加阿黴素耐藥小鼠肺癌lewis和正常小鼠肺癌lewis細胞間通訊(見圖12)。 綜合上述試驗結果，本發明內容可概括以下幾個方面①皂角刺總黃酮對誘癌組織、腫瘤組織和增生組織間隙連接蛋白43含量有升高作用，增強腫瘤細胞間通訊，是一個細胞連接通訊增強劑。②皂角刺總黃酮對二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮膚癌及烏拉坦引起的小鼠肺癌均有抑制作用，可以預防化學致癌。③皂角刺總黃酮對阿黴素、環磷腺癌、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤均有增效作用，可以提高腫瘤化療指數。④皂角刺總黃酮可以逆轉阿黴素耐藥小鼠乳腺癌4T1及阿黴素耐藥小鼠肺癌lewis對阿黴素的治療抵抗作用，可以逆轉腫瘤化療耐藥。⑤皂角刺總黃酮對小鼠乳腺增生和前列腺增生均有抑制作用，可以阻止組織增生。


圖I代表皂角刺總黃酮對二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮膚癌及烏拉坦引起的小鼠肺癌發病率的影響；
圖2代表皂角刺總黃酮對二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮膚腫瘤數及烏拉坦引起的小鼠肺腫瘤結節數的影響(n=20);注與模型組比較1ZXO. 05，2/X0. 01 ；
圖3代表皂角刺總黃酮對阿黴素、環磷腺癌、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤生長的影響(n=10);注與模型組比較2ZXO-Ol ；
圖4代表皂角刺總黃酮對阿黴素、環磷腺癌、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤大小及肺轉移的影響(n=10);注與模型組比較2/X0. 01 ；
圖5代表皂角刺總黃酮對阿黴素耐藥小鼠lewis肺癌皮下腫瘤生長的影響(n=10)；注與模型組比較2ZXO. 01 ；
圖6代表皂角刺總黃酮對阿黴素耐藥小鼠4T1乳腺癌原位腫瘤生長的影響(n=10)；注與模型組比較2ZXO. 01 ；
圖7代表皂角刺總黃酮對阿黴素耐藥小鼠lewis肺癌皮下腫瘤及阿黴素耐藥小鼠4T1乳腺癌原位腫瘤大小和肺轉移的影響(n=10);注與模型組比較2/X0. 01 ；
圖8代表皂角刺總黃酮對小鼠乳腺增生的影響(n=10);注與模型組比較1ZXO. 05，2ZXO. 01 ；
圖9代表皂角刺總黃酮對小鼠前列腺增生的影響(n=10);注與模型組比較1ZXO. 05，2ZXO. 01 ；
圖10代表皂角刺總黃酮對誘癌組織及增生組織間隙連接蛋白43的影響(n=3);注 與模型組比較2ZXO. 01 ；
圖11代表皂角刺總黃酮對腫瘤組織間隙連接蛋白43的影響(n=3);注與模型組比較2ZXO. 01 ；
圖12代表皂角刺總黃酮對阿黴素耐藥小鼠肺癌lewis和正常小鼠肺癌lewis細胞間通訊的影響(n=10);注與空白對照組比較2P〈0. 01。
具體實施例方式本發明對皂角刺總黃酮作為一個細胞連接通訊增強劑及其在醫藥中的應用進行了試驗，皂角刺總黃酮口服、注射均有效，下面各試驗以皂角刺總黃酮口服為例。試驗中用到的皂角刺總黃酮按下述方法獲取將洗淨、烘乾、粉碎過的皂角刺經石油醚脫脂後，用體積濃度70%的乙醇水溶液按液料比25 I於80°C提取2次，每次2h，過濾，合併提取液並濃縮至每ml相當於O. Ig原藥材，分別經95%乙醇(添加量以乙醇濃度佔溶液體積總量的70%為宜)、80%乙醇(添加量以乙醇濃度佔溶液體積總量的50%為宜)各醇沉I次，過濾，濾液再經大孔吸附樹脂吸附、70%乙醇洗脫，洗脫液真空乾燥即得後黃色的粉狀固體皂角刺總黃酮。以蘆丁為標準經分光光度測定總黃酮含量>90%。實驗I.皂角刺總黃酮對二甲基苯蒽/巴豆油引起小鼠皮膚癌的影響
實驗方法將100隻昆明小鼠適應性餵養I周后隨機分為5組，每組20隻，雌雄各半，分別為正常對照組，模型組，皂角刺總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組(50mg/kg體重/日、100mg/kg體重/日、200mg/kg體重/日)。正常組和模型組飲正常水和食正常飼料，皂角刺總黃酮各劑量組按每隻小鼠日食量將皂角刺總黃酮按所需劑量濃度摻入飼料中餵飼小鼠，從實驗分組後開始到處死小鼠全程餵飼。除正常對照小鼠外，將其他實驗組小鼠用理髮電推除去背部毛髮，於實驗第I天背部脫毛區塗二甲基苯蒽丙酮液200 μ I (150 μ g)，每周I次，共4次；第22天起在相同部位塗O. 25%巴豆油丙酮液200 μ 1，每周2次，連續20周。第40周計數各組出現皮膚腫瘤的小鼠數和每隻小鼠皮膚出現的腫瘤數。頸椎脫白法處死全部小鼠，切取誘癌部位凍存於_80°C用於致癌組織間隙連接蛋白43檢測。結果模型組20隻小鼠全部發生皮膚癌，平均每鼠皮膚出現腫瘤的數目為4. 5個；皂角刺總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組20隻小鼠發生皮膚癌的小鼠分別為15隻、11隻、8隻(見圖1)，平均每鼠皮膚出現腫瘤的數目分別為3. I個、2. 5個、I. 6個(見圖2)。 實驗2 :皂角刺總黃酮對烏拉坦引起小鼠肺癌的影響
實驗方法將100隻昆明小鼠適應性餵養I周后隨機分為5組，每組20隻，雌雄各半，分別為正常對照組，模型組，皂角刺總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組(50mg/kg體重/日、100mg/kg體重/日、200mg/kg體重/日)。正常組和模型組飲正常水和食正常飼料，皂角刺總黃酮各劑量組按每隻小鼠日食量將皂角刺總黃酮按所需劑量濃度摻入飼料中餵飼小鼠，從實驗分組後開始到處死小鼠全程餵飼。除正常對照小鼠外，其他實驗組小鼠於實驗第I天腹腔注射烏拉坦1000mg/kg，每周I次,共5次。第30周頸椎脫臼法處死全部小鼠，計數各組出現肺腫瘤的小鼠數和每隻小鼠肺表面出現的腫瘤結節數，並取小鼠肺臟凍存於_80°C用於致癌組織間隙連接蛋白43檢測。結果模型組20隻小鼠全部發生肺癌，平均每鼠肺表面出現的腫瘤結節數為13. I個；過山蕨黃酮低劑量、中劑量、高劑量組20隻小鼠發生肺癌的小鼠分別為17隻、14隻、10隻(見圖I)，平均每鼠肺表面出現的腫瘤結節數分別為8. 5個、4. 8個、2. 2個(見圖2)。實驗3 :皂角刺總黃酮對阿黴素、環磷醯胺、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤生長的影響
實驗方法取生長良好的lewis肺癌傳代實體瘤，用生理鹽水製備瘤細胞懸液，調細胞數I X IO6個細胞/ml，按O. 2 ml/只接種於80隻雌性C57BL /6小鼠右前肢腋部皮下。將腫瘤接種小鼠隨機分為8組，每組10隻，分別為模型組，皂角刺總黃酮組(100mg/kg體重/日)，阿黴素組(5mg/kg體重/日)、環磷醯胺組(10mg/kg體重/日)、氟尿嘧啶組 (15mg/kg體重/日)、皂角刺總黃酮+阿黴素組、皂角刺總黃酮+環磷醯胺組、皂角刺總黃酮+氟尿嘧啶組。腫瘤接種後次日，模型組和正常組灌胃生理鹽水10ml/kg，皂角刺總黃酮組灌胃相應劑量的皂角刺總黃酮水溶液，環磷醯胺組和氟尿嘧啶組腹腔注射相應劑量的藥物，每日I次，連續3周；阿黴素組尾靜脈注射相應劑量的藥物，每周I次，共3次；兩種藥物聯用組按2種藥物單獨使用時的劑量和方式聯合治療。腫瘤長出後每周用遊標卡尺測量腫瘤直徑2次，腫瘤大小按下面公式計算腫瘤體積(mm3)=腫瘤長度X腫瘤寬度X腫瘤寬度/ 2。腫瘤接種後22日頸椎脫白法處死全部小鼠，剝離接種部位腫瘤，稱重，取部分瘤組織凍存於_80°C用於瘤組織間隙連接蛋白43檢測檢測。另剝離小鼠肺臟，檢測出現肺腫瘤的小鼠數和每隻小鼠肺表面出現的腫瘤結節數，評價皂角刺總黃酮對阿黴素、環磷醯胺、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤生長的影響。結果模型組小鼠皮下腫瘤生長較快，並全部出現肺轉移。與模型組比較，阿黴素、環磷醯胺和氟尿嘧啶組小鼠皮下腫瘤生長雖均明顯減緩，但腫瘤肺轉移並無減輕。皂角刺總黃酮對小鼠皮下腫瘤生長抑制作用雖比阿黴素、環磷醯胺和啶氟尿嘧啶弱，但可同時可阻止腫瘤肺轉移。皂角刺總黃酮與阿黴素、環磷醯胺和氟尿嘧聯合後對小鼠皮下腫瘤生長抑制作用明顯增強，且能顯著降低肺轉移(見圖3，圖4)。實驗4 :皂角刺總黃酮對阿黴素耐藥小鼠肺癌lewis皮下腫瘤及阿黴素耐藥小鼠4T1乳腺癌阿黴素治療抵抗的影響
實驗方法體外阿黴素濃度遞增法建立阿黴素耐藥小鼠乳腺癌4T1及阿黴素耐藥小鼠肺癌lewis細胞。取對數生長期阿黴素耐藥lewis肺癌細胞，用生理鹽水調細胞數5X IO5個/ ml，以O. 2ml/只接種於40隻雌性C57BL/6小鼠右前肢腋部皮下；或對數生長期阿黴素耐藥4T1乳腺癌細胞，用生理鹽水調細胞數3X IO5個/ml，以O. Im I/只接種於40隻雌性BALB/c小鼠右側第2乳頭脂肪墊下。將腫瘤接種小鼠隨機分為4組，每組10隻，分別為模型組，皂角刺總黃酮組(100mg/kg體重/日)，阿黴素組(5mg/kg體重/日)，皂角刺總黃酮+阿黴素組。腫瘤接種後次日，模型組和正常組灌胃生理鹽水10ml/kg，皂角刺總黃酮組灌胃相應劑量的皂角刺總黃酮水溶液，每日I次，連續3周；阿黴素組尾靜脈注射相應劑量的藥物，每周I次，共3次；兩種藥物聯用組按2種藥物單獨使用時的劑量和方式聯合治療。腫瘤長出後每周用遊標卡尺測量腫瘤直徑2次，腫瘤大小按下面公式計算腫瘤體積(mm3)=腫瘤長度X腫瘤寬度X腫瘤寬度/ 2。腫瘤接種後22日頸椎脫白法處死全部小鼠，剝離接種部位腫瘤，稱重，取部分瘤組織凍存於-80°C用於瘤組織間隙連接蛋白43檢測檢測。另剝離小鼠肺臟，檢測出現肺腫瘤的小鼠數和每隻小鼠肺表面出現的腫瘤結節數，評價皂角刺總黃酮對阿黴素耐藥小鼠肺癌lewis皮下腫瘤及阿黴素耐藥小鼠4T1乳腺癌阿黴素治療抵抗的影響。結果模型組阿黴素耐藥小鼠肺癌lewis皮下腫瘤及阿黴素耐藥小鼠4T1乳腺癌生長較快，並全部出現肺轉移。與模型組比較，阿黴素組小鼠腫瘤生長抑制僅為越20%，顯示對阿黴素治療抵抗，並且腫瘤肺轉移無減輕。皂角刺總黃酮對阿黴素耐藥小鼠腫瘤有抑制作用，同時可阻止腫瘤肺轉移。皂角刺總黃酮與阿黴素聯合後對小鼠耐藥腫瘤阿黴素治療抵抗有逆轉作用，且能顯著降低肺轉移(見圖5、圖6和圖7)。實驗5 :皂角刺總黃酮對小鼠乳腺增生的影響
實驗方法將50隻昆明雌性小鼠適應性餵養I周后隨機分為5組，每組10隻，分別為正常對照組，模型組，皂角刺總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組(50mg/kg體重/日、100mg/kg 體重/日、200mg/kg體重/日)。除正常對照組外，其餘各組小鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇
O.5mg/kg, I次/2d，共注射15次。從實驗第I天開始，正常組和模型組飲正常水和食正常飼料，皂角刺總黃酮各劑量組按每隻小鼠日食量將皂角刺總黃酮按所需劑量濃度摻入飼料中餵飼小鼠，從實驗分組後開始到處死小鼠全程餵飼。造模結束後第5周頸椎脫臼法處死全部小鼠，取右側第2乳腺用10%甲醛液固定作病理組織切片，HE染色，通過光鏡視野下觀察乳腺腺泡數、乳腺小葉數、乳腺腺泡腔直徑、乳腺胞漿面積、每小葉平均腺泡數及導管的平均直徑，以乳腺增生病變記分標準對各組小鼠進行計分。另取部分乳腺組織凍存於_80°C用於增生組織間隙連接蛋白43檢測。(O分)腺小葉散在分布，每個小葉腺泡數< 5，腺泡腔不擴張，導管壁較薄，上皮層數約為2-5層；
(I分)乳腺小葉無明顯增生，個別腺泡和導管輕度增生，無擴張；
(2分)乳腺小葉增生、體積變大，腺泡數量增多；部分腺泡和導管處於明顯擴張狀態；(3分)乳腺腺小葉明顯增生，部分腺泡和導管處於極度擴張狀態，腺上皮細胞呈扁平狀，腺泡內及導管內有大量的分泌物。結果正常對照組小鼠無I例乳腺增生症狀(O分)，與正常對照組比較，模型組的小葉數、腺胞數、腺泡腔直徑、導管平均直徑、胞漿面積均明顯增加，全部小鼠出現乳腺增生(平均2.4分)。乳腺增生小鼠經皂角刺總黃酮治療後，乳腺增生各項指標有不同程度降低，50mg/kg體重/日組增生分值大都在1-2分(僅有I例增生3分，平均I. 5分)；IOOmg/kg體重/日組增生分值大都在1-2分(無I例增生3分，平均I. O分)；200mg/kg體重/日組增生分值大都在I分(僅有I例增生2分，平均O. 6分)(見圖8)。實驗6 :皂角刺總黃酮對小鼠前列腺增生的影響
實驗方法將50隻昆明雄性小鼠適應性餵養I周后隨機分為5組，每組10隻，分別為正常對照組，模型組，皂角刺總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組(50mg/kg體重/日、100mg/kg體重/日、200mg/kg體重/日)。除正常對照組外其餘各組小鼠皮下注射用橄欖油溶解的丙酸睪丸酮5mg/kg，連續3周，正常對照組注射橄欖油溶液，每日造模30min後灌胃給藥。從實驗第I天開始，正常組和模型組灌胃生理鹽水10ml/kg，皂角刺總黃酮各劑量組按所需劑量濃度灌胃皂角刺總黃酮水溶液，每天I次，連續3周。末次造模後小鼠禁食24h處死，分離背側葉前列腺，剝離乾淨後立即用電子天平稱重，計算前列腺指數。前列腺指數=前列腺溼質量mg/小鼠體重g。取部分前列腺組織用10%甲醛液固定作病理組織切片，HE染色，通過光鏡視野下觀察組織形態，以前列腺增生病變記分標準對各組小鼠進行計分。另取小鼠前列腺凍存於_80°C用於增生組織間隙連接蛋白43檢測。(O分)腺體無增生，間質無纖維增生和炎細胞浸潤；
(I分)腺體稍有增生，間質出現2層纖維增生和少數炎細胞浸潤；
(2分)腺體明顯增生，間質出現3-4層纖維增生和少數炎細胞浸潤；
(3分)腺體顯著增生，間質出現5-7層纖維增生和少數炎細胞浸潤。結果正常對照組小鼠前列腺腺體較少，無I例出現間質纖維增生和炎細胞浸潤(O分)。與正常對照組比較，模型組前列腺腺體顯著增多，全部小鼠增生分值都在2-3分(平均2. 5分)。前列腺增生小鼠經皂角刺總黃酮治療後，前列腺增生指標有不同程度降低，·50mg/kg體重/日組增生分值大都在1-2分(僅有2例增生3分，平均I. 7分);100mg/kg體重/日組增生分值大都在1-2分(僅有I例增生3分，平均I. 4分)；200mg/kg體重/日組增生分值大都在I分(無I例增生3分，平均I. O分)(見圖9)。實驗7 :皂角刺總黃酮對誘癌組織、瘤組織及增生組織間隙連接蛋白43的影響 實驗方法將收集凍存的誘癌組織、瘤組織及增生組織用RIPA強裂解液(50 mMTris -
HCl, pH 7.4，150 mM NaCl, l%TritonX-100, I mM EDTA, 100 mM NaVO3, I mMPMSF, O. 1% SDS, 1%去氧膽酸鈉，另加蛋白酶抑制劑混合物)提取蛋白。上樣50yg蛋白，經10% SDS-PAGE電泳分離後轉移到PVDF膜上(德國)，4°C、5%脫脂奶粉-Tris鹽酸緩衝液(TBS)封閉，將兔抗(鼠)間隙連接蛋白43單克隆抗體(Anti-Cx 43，1:100,北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)或兔抗(鼠)β肌動蛋白單克隆抗體(Anti-β-Actin, 1:100,北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)加入含5%脫脂奶粉的TBS中，室溫下與PVDF膜結合孵育lh，再與辣根過氧化物酶偶聯的鼠抗IgG (1:200) 二抗室溫下在含5%脫脂奶粉的TBS中結合孵育30mins。抗原抗體結合物檢測用化學發光增強底物試劑盒，進行，光帶的相對光密度用間隙連接蛋白43和β肌動蛋白的光密度比值表示。結果誘癌組織及增生組織與其相應的正常組織比較，間隙連接蛋白43的光密度值明顯降低，皂角刺總黃酮治療後誘癌組織及增生組織間隙連接蛋白43的光密度值均有不同程度回升，其中皂角刺總黃酮200mg/kg體重/日組使誘癌組織及增生組織間隙連接蛋白43的光密度值回升到相應的正常組織(見圖10)。阿黴素耐藥的腫瘤及非阿黴素耐藥腫瘤經皂角刺總黃酮治療後瘤組織中間隙連接蛋白43的光密度值比未經皂角刺總黃酮治療的腫瘤組織顯著升高(見圖11)。實驗8 :皂角刺總黃酮對阿黴素耐藥小鼠肺癌lewis和正常小鼠肺癌lewis細胞間通訊的影響
實驗方法體外阿黴素濃度遞增法建立阿黴素耐藥小鼠Lewis肺癌細胞。取對數生長期阿黴素耐藥小鼠Lewis肺癌細胞或正常小鼠Lewis肺癌細胞,按2 X IO5個/ml細胞接種在6孔培養板中，貼壁過夜後加入皂角刺總黃酮和RPMI-1640細胞培養液，使皂角刺總黃酮終濃度分別為1μπιο1/1、3μπιο1/1、10μπιο1/1和20ymol/l,同時設不加皂角刺總黃酮的空白對照組。加藥後置培養箱內培養48h，棄去培養基，用手術刀在板孔底部表面劃痕2條，PBS漂洗3次，將細胞浸入O. 05%的螢光黃染液中，孵育5min，吸淨染液，PBS漂洗3次，螢光倒置顯微鏡下下觀察記錄染料傳遞的層次和範圍。每孔隨機取5處，結果判讀選擇劃痕較平滑處計數帶有螢光的細胞層數，對每處計分，計算每孔平均得分。(O分)螢光只出現在劃痕旁I列細胞中；
(I分)螢光出現在劃痕旁2列細胞中；
(2分)螢光出現在劃痕旁3列細胞中；
(3分)螢光出現在劃痕旁4列細胞中；
(4分)螢光自劃痕兩側傳遞至鄰近的4列細胞或更遠距離。結果螢光黃染料劃痕負載阿黴素耐藥小鼠Lewis肺癌細胞或非阿黴素耐藥小鼠Lewis肺癌細胞5 m in後，空白對照組染料主要出現在劃痕旁I列細胞中(平均O. 3分)，經皂角刺總黃酮作用48 h後，I μ mol/L組螢光染料主要出現在劃痕旁的1-2列細胞內 (平均1.4分)；3 μ mol/L組螢光染料主要出現在劃痕旁的2 - 3列細胞內(平均2. 2分)；
10μ mo I/L組螢光染料主要出現在劃痕以外的3-4列細胞內(平均3. I分)；20 μ mol/L組螢光染料主要出現在劃痕以外的4列細胞或更遠距離(平均3. 8分)(見圖12)。
權利要求
1.皂角刺總黃酮作為細胞連接通訊增強劑，在製備預防和治療腫瘤藥物方面的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，皂角刺總黃酮在製備抗癌藥物方面的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，皂角刺總黃酮在製備抗皮膚癌藥物方面的應用。
4.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，皂角刺總黃酮在製備抗肺癌藥物方面的應用。
5.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，皂角刺總黃酮在製備抗乳腺癌藥物方面的應用。
6.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，皂角刺總黃酮在製備治療乳腺增生或前列腺增生藥物方面的應用。
全文摘要
本發明屬於皂角刺總黃酮應用技術領域，具體涉及皂角刺總黃酮作為細胞連接通訊增強劑，在製備預防和治療腫瘤藥物方面的應用，尤其是在腫瘤預防、腫瘤化療增效、組織增生方面的應用，如預防化學致癌、提高腫瘤化療指數、逆轉腫瘤化療耐藥、阻止乳腺增生和前列腺增生等。
文檔編號A61K36/483GK102940672SQ20121048636
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月26日 優先權日2012年11月26日
發明者杜鋼軍, 楊義明, 盧琳琳, 林海紅, 劉偉傑, 劉迎輝, 王瑩瑩, 李鴻儒, 趙貝, 侯西棟 申請人:河南大學