色譜純化方法和設備的製作方法

2023-09-22 10:29:45

色譜純化方法和設備的製作方法
【專利摘要】本發明涉及適合於僅需三根分離柱的連續色譜過程的方法和設備。該過程為包含兩個色譜步驟的兩步程序。第一色譜步驟(捕獲)在兩根分離柱上交替和循序進行，第二色譜步驟(精純)在第三根柱上同樣循序進行。
【專利說明】色譜純化方法和設備
[0001] 本發明涉及適用於僅需要三根分離柱的連續色譜過程的方法和設備。該過程是一種包含兩個色譜步驟的兩步程序。第一色譜步驟(捕獲)在優選的兩根分離柱上交替且循序地進行，第二色譜步驟(精純，polishing)也循序地在第三根分離柱上進行。
_2] 發明背景
蛋白質的大規模且經濟性的純化逐漸成為生物技術和製藥工業中的重要問題。一般地，採用設計以產生目標蛋白的哺乳動物或菌細胞株，通過插入含有用於該蛋白的基因的重組質粒進行細胞培養來產生蛋白質。由於所用的細胞係為生物體，所以它們必須供給複合的生長培養基，包含糖、胺基酸和生長因子，通常從動物血清製品中提供。從供給細胞的化合物混合物中和從細胞本身的副產物中，將所需的蛋白質分離至足以用作人類治療劑的純度是一種巨大的挑戰。
[0003]從細胞碎片中進行蛋白純化的程序首先取決於蛋白質表達的位置。某些蛋白質被引起從細胞中直接分泌至周圍生長培養基中；其它的則是在細胞內製造。對於後者的蛋白質，純化過程的第一步包含細胞的裂解，其可以通過多種方法進行，包括機械剪切、滲壓震擾或酶處理。此類裂解將細胞的全部內含物釋放到勻漿中，並且另外會產生由於其體積小而難以除去的亞細胞碎片。這些碎片通常通過離心或過濾除去。對於在蛋白質生產運行過程中由於細胞的自然死亡以及細胞內宿主細胞蛋白質的釋放而直接分泌的蛋白質，同樣的問題會出現，儘管規模較小。
[0004]因此，目前所使用的典型的純化過程包括以下步驟:
-進行細胞溶解以回收細胞內蛋白質，或在分泌性蛋白質的情況下從培養基回收蛋白
質，
-使用例如差速離心或過濾除去細胞碎片，以得到含有目標蛋白質的澄清樣品，
-在多步驟過程中利用多種色譜介質，將目標蛋白質與樣品中的其它蛋白質和各種其它雜質分尚。
[0005]色譜技術一般基於蛋白質的電荷、疏水程度或大小進行蛋白質混合物的分離。數種不同的色譜樹脂可用於各自這些技術，使得將所屬純化方案精準地適用於所涉及的特定蛋白。這些分離方法各自的實質就是使得蛋白質順著長的柱以不同的速率移動，實現隨著蛋白質沿著柱進一步移動而增加的物理分離，或者選擇性吸附於分離介質，然後被不同的溶劑進行差別性洗脫。在某些情況下，當雜質特異性吸附於柱上而目標蛋白質沒有被吸附時，可將所需蛋白質從雜質中分離出來，即目標蛋白質存在於「流通(flow-through) 」中。
[0006]因可交換的反離子命名的離子交換色譜法是一種適用於純化可離子化分子的程序。分離離子化的分子，是基於它們的帶電荷基團與連接於固相載體基質上的帶有相反電荷的分子的非特異性靜電作用，從而遲滯那些與固相更強烈相互作用的離子化分子。各類型離子化分子的淨電荷和其對基質的親和力根據帶電荷基團的數量、各基團的電荷以及競爭與帶電荷固相基質的相互作用的分子的性質而變化。這些差異引起經離子交換色譜的各種分子類型的拆分。在使用離子交換色譜法的典型蛋白質純化中，源於宿主細胞的許多蛋白質的混合物(如在哺乳動物細胞培養中)，被應用於離子交換柱。未結合分子被衝掉後，可調整條件，如以梯級或梯度模式改變pH、反離子濃度等，以從固相中釋放非特異性保留或延遲的離子化的目標蛋白質，並將其與具有不同電荷特徵的蛋白質分離。陰離子交換色譜法涉及在pH和特定分離過程的條件下，陰離子目標分子與負性反離子對連接於固相基質的帶正電荷分子的相互作用的競爭。與之相反，陽離子交換色譜涉及在pH和特定分離過程的條件下，陽離子目標分子與正性反離子對連接在固相基質上的帶負電荷分子的競爭。混合模式的離子交換色譜法涉及在相同步驟中陽離子和陰離子交換色譜介質的組合的使用。特別是，「混合模式」是指一種固相載體基質，其共價性連接有陽離子交換和/或陰離子交換與疏水作用基團的混合物。
[0007]親和色譜法，其利用待純化蛋白質與固定化捕獲劑之間特定的結構依賴性(即空間互補性)相互作用，是一種對某些蛋白質(如抗體)的標準純化選項。蛋白質A，例如是包含Fe區域的蛋白質(如抗體)的親和色譜法的有用的吸附劑。蛋白質A是一種源自金黃色葡萄球菌的41kD細胞壁蛋白質，其以高親和力(對人IgG約10_8M)與抗體的Fe區域結合。雖然用途普遍，但親和色譜法成本高，特別是在必須用來純化治療性蛋白質的工業規模上。
[0008]又一色譜法是羥磷灰石色譜法或疏水作用色譜法(HIC)。
[0009]因此，典型的純化過程包括差速離心和過濾步驟以及至少3種色譜分離技術，如親和色譜法(AC)、凝膠滲透色譜法(GPC)、離子交換色譜法(IEC)、疏水作用色譜法(HIC)、反相色譜法(RPC)和正相色譜法(NPC)。通常各指定的技術需要不同的操作條件(緩衝劑、pH、電導率)，這導致在色譜分離實施之前進行樣品製備。通過在一個純化隊列中直接組合各種色譜模式以消除純化步驟之間的樣品摺疊(folding)/製備步驟，可能獲得一種更有效和更經濟的純化過程。
[0010]簡單的間歇式色譜技術在工業應用中得到廣泛接受，然而由於處理時間長和運營成本高(如溶劑量大、樹脂和硬體昂貴)，這種技術非常昂貴。這種技術還對運行條件(如產品滴度、停留時間和進料速度(從80%動態結合容量值開始的產品損耗))敏感。
[0011]某些替代的半連續技術也已開發，意味著它們連接2或3個不同的色譜模式，但不容許其一具有連續進料。
[0012]WO 2011/037522公開一種包含至少兩個分離單元的分離系統，這些單元出口對入口連接。所有柱直列式連接。
[0013]W02011/017514公開一個親和色譜法步驟和兩個離子交換色譜法步驟的組合,但不需要儲存罐或更換緩衝劑的步驟。
[0014]但目前對更有效和更經濟的解決方案仍存在需求。
[0015]發明簡沭
令人驚奇地，我們發現一種系統，其不僅能夠連接分離單元(柱)，還能連續進樣。這通過提供至少兩個捕獲柱實現。
[0016]因此，本發明涉及一種設備，其包含
-兩個分離單元Al和A2以及分離單元B，分離單元Al和A2兩者具有相同的色譜基質，分離單元B具有不同於分離單元Al和A2的色譜基質的色譜基質，所有的分離單元都具有流體入口和流體出口，由此，至少在分離單元Al的流體出口與分離單元B的流體入口之間有流體連接和在分離單元A2的流體出口與分離單元B的流體入口之間有流體連接(在圖2、3和4中的連接線C-P)，
-在分離柱Al和A2與分離單元B之間的流體連接中的至少一個閥，其允許在分離柱Al的流體出口與分離柱B的流體入口之間的流體連通以及分離柱A2的流體出口與分離柱B的流體入口之間的流體連通之間切換，
-至少兩個緩衝劑儲液器和至少兩個泵，由此，緩衝劑儲液器至少與分離單元Al和A2的入口流體連接，而泵用於將液體從儲液器傳輸到分離單元，
-包含樣品溶液(樣品進料)的儲液器，其與分離單元Al和A2的入口流體連接。
[0017]在一實施方案中，分離單元Al和A2具有親和色譜、陽離子交換、陰離子交換色譜基質或混合模式陽離子交換色譜基質。
[0018]在另一實施方案中，分離單元B具有陽離子交換、混合模式陰離子交換或陰離子交換色譜基質。
[0019]在另一實施方案中，分離單元B具有基質的混合物，其包括陽離子交換和陰離子交換色譜基質，或者陽離子和混合模式陰離子交換基質，或者混合模式陽離子交換基質和陰離子交換基質。
[0020]在一優選的實施方案中，分離單元Al和A2具有親和色譜基質，而分離單元B具有陽離子交換色譜基質。
[0021]在另一優選的實施方案中，分離單元Al和A2具有親和色譜基質，而分離單元B具有陰離子交換或混合模式陰離子交換色譜基質。
[0022]在另一實施方案中，分離單元Al和A2具有親和色譜基質，而分離單元B具有陰離子交換和陽離子交換色譜基質的混合物。
[0023]在另一實施方案中，分離單元Al和A2具有親和色譜基質，而分離單元B具有陰離子交換和混合模式陽離子交換色譜基質的混合物、或者陽離子交換和混合模式陰離子交換色譜基質的混合物、或者混合模式陽離子交換和混合模式陰離子交換色譜基質的混合物。
[0024]在另一優選的實施方案中，分離單元Al和A2具有陽離子交換或混合模式陽離子交換色譜基質，而分離單元B具有陰離子交換或混合模式陰離子交換色譜基質。
[0025]在另一實施方案中，分離單元Al和A2具有陰離子交換或混合模式陰離子交換色譜基質，而分離單元B具有陽離子交換或混合模式陽離子交換色譜基質。
[0026]在另一優選的實施方案中，兩個分離單元Al和A2在分離單元出口處都具有至少一個流體選擇閥，由此，分離單元Al和A2的出口處流體選擇閥的至少一個通道與分離單元B的入口連接(通過連接線)，使得能夠控制(開始和停止)分離單元Al與分離單元B之間和分離單元A2與分離單元B之間的流體連通。
[0027]在另一優選的實施方案中，分離單元B在分離單元出口處具有流體選擇閥。
[0028]在另一優選的實施方案中，分離單元Al和A2兩者在分離單元入口處具有至少一個流體選擇閥。
[0029]在一優選的實施方案中，該設備還包含在分離單元Al的流體出口與分離單元A2的流體入口之間的連接線，和在分離單元A2的流體出口與分離單元Al的流體入口之間的連接線(圖2、3和4中的連接線F-F)，由此使得分離單元Al的出口與分離單元A2的入口之間能流體連通，以及分離單元A2的出口與分離單元Al的入口之間能流體連通。在一非常優選的實施方案中，至少一個閥位於分離單元Al的出口和分離單元A2的入口之間的連接線中，且至少一個閥位於分離單元A2的出口和分離單元Al的入口之間的連接線中。一般地，所述閥位於接近於分離單元Al和A2的出口和/或接近於分離單元Al和A2的入口處。
[0030]在另一優選的實施方案中，該設備包含在分離單元Al的流體出口和分離單元A2的流體入口之間的兩條連接線，和在分離單元A2的流體出口和分離單元Al的流體入口之間的兩條連接線(圖4中的連接線F-F和W-F)，由此使得分離單元Al的出口和分離單元A2的入口之間能流體連通，以及分離單元A2的出口和分離單元Al的入口之間能流體連通。在一非常優選的實施方案中，閥位於接近於分離單元Al和A2的入口和出口處，並且連接線從這些閥出發。
[0031]在另一優選的實施方案中，至少兩個緩衝劑儲液器與分離單元Al和A2的入口流體連接。一或多個閥和/或附加的流體入口可能位於緩衝劑儲液器與分離單元Al和A2的入口之間的連接線中。
[0032]在另一優選的實施方案中，所述設備還包含在分離單元A2和Al的流體入口之前的一或多個附加的流體入口，優選在分離單元A2的流體出口和分離單元Al的流體入口之間的連接線之前，以及分離單元Al的流體出口和分離單元A2的流體入口之間的連接線之
N /.刖。
[0033]在另一優選的實施方案中，所述設備包含在柱B的流體入口之前的附加的流體入口，其意味著優選的是至一或多個儲液器的連接線位於在柱Al和A2的出口與柱B的入口之間的連接線中的柱B的流體入口之前。
[0034]在另一優選的實施方案中，該設備包含具有病毒滅活緩衝劑的附加的儲液器，其至少與三個分離單元中一個的入口流體連接。
[0035]本發明還涉及一種從樣品中的一或多種雜質純化靶分子的連續方法，該方法包括以下步驟:
-交替將樣品裝載於分離單元Al和A2上，使得當樣品裝載於其中樣品處於能使靶分子與分離單元Al結合的第一 pH和電導率的分離單元Al上時，分離單元A2至少部分與分離單元B流體連通，使得裝載於分離單元A2上的靶分子被洗脫至分離單元B上，且分離單元A2再平衡，並且當樣品裝載於其中樣品處於能使靶分子與分離單元A2結合的第一pH和電導率的分離單元A2上時，分離單元Al至少部分與分離單元B流體連通，使得靶分子被洗脫至分離單元B上，且分離單元Al再平衡，
-從分離單元B的流體出口中回收所述靶分子。
[0036]在一優選的實施方案中，所述靶分子是抗體。
[0037]在一優選的實施方案中，樣品被交替地連續裝載於分離單元Al或分離單元A2上。
[0038]在另一實施方案中，分離單元Al和A2以結合和洗脫模式運行，而分離單元B以流通模式運行。
[0039]在另一優選的實施方案中，當將樣品裝載於分離單元Al上時，分離單元Al的流體出口至少部分與分離單元A2的流體入口流體連通，使得能夠將開始浙濾的靶分子從分離單元Al中捕獲以結合至分離柱A2上。並且當將樣品裝載於分離單元A2上時，分離單元A2的流體出口優選至少部分與分離單元Al的流體入口流體連通,使得能夠將開始浙濾的革巴分子從分離單元A2中捕獲以結合至分離單元Al上。[0040]在另一優選的實施方案中，當從分離單元Al中衝洗未結合的樣品時，分離單元A2至少部分與包含樣品溶液的儲液器和分離單元Al流體連通。這意味著分離單元A2同時裝載從單元Al中洗脫的未結合的樣品和裝載來源於儲液器中的樣品溶液。並且從分離單元A2中衝洗未結合的樣品時，分離單元Al與包含樣品溶液的儲液器和分離單元A2流體連通。
[0041]在另一優選的實施方案中，當分離單元B與分離單元Al流體連通時，它還與緩衝劑儲液器流體連通。並且當分離單元B與分離單元A2流體連通時，它還與緩衝劑儲液器流體連通。
[0042]在一優選的實施方案中，在用所述靶分子裝載單元Al和A2之後，將病毒滅活緩衝劑泵送通過分離單元Al和A2。
[0043]在另一實施方案中，如果分離單元B以結合/洗脫模式運行，則在用所述靶分子裝載單元B之後，將病毒滅活緩衝劑泵送通過分離單元B。
[0044]在一優選的實施方案中，用於本發明方法中的樣品是澄清的樣品。這意味著在將樣品裝載於分離單元Al或A2上之前，樣品要進行一或多項下列處理進行澄清:離心、過濾和/或靜置。在一非常優選的實施方案中，樣品用沉澱劑處理，之後通過離心、過濾和/或靜置來澄清。
[0045]MM
圖1顯示本發明設備一優選實施方案的示意圖。該圖顯示2個捕獲分離單元(CIEX)、I個精純分離單元(AIEX)、儲液器(CIP、V1、E.A、E.B、Dil.、進料、CIP、E.A、E.B)以及連接線、閥、泵和檢測器。
[0046]圖2、3和4圖示性顯示本發明設備的不同實施方案。圖2顯示一種設置，其主要限制於基本特徵，但例如在分離單元B之前具有附加的流體入口(入口 C)。圖3顯示一種設置，其另外包括在分離單元Al的出口與分離單元A2的入口之間的流體連接以及在分離單元A2的出口和分離單元A2的入口之間的流體連接(連接線FF)。
[0047]圖4顯示一種設置，其帶有使得分離單元Al的出口與分離單元A2的入口之間流體連接的兩條連接線以及使得分離單元A2的出口與分離單元A2的入口之間流體連接的兩條連接線(連接線F-F，連接線W-F)。
[0048]圖5顯示本發明設備的一實施方案，其帶有3個捕獲分離單元A1、A2和A3，和2個精純分離單元BI和B2。
[0049]定義
在詳細說明本發明之前，應清楚的是本發明並不限定於特定的組成或工藝步驟，因為這些是可以變化的。必須注意的是，本說明書和所附的權利要求書中所用的單數形式「一」、「一個」和「該」包括複數的對象，上下文中明確指出例外的除外。因此，例如，提及的「配體」包括複數的配體，而提及的「抗體」包括複數的抗體等。
[0050]除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語，都具有本發明涉及領域中普通技術人員一般理解的相同的意義。出於本文所述的本發明目的而定義下列術語。
[0051]本文所用術語「靶分子」指應從樣品中的一或多種雜質中離析、分離或純化出來的任何分子、物質或化合物或其混合物。在一優選的實施方案中，靶分子是蛋白質或者兩種以上蛋白質的混合物。在一特別優選的實施方案中，靶分子是抗體。
[0052]術語「抗體」指具有與抗原特異性結合能力的蛋白質。一般地，抗體具有基本的四-多肽鏈結構，其由兩個重鏈和兩個輕鏈組成，所述鏈例如通過鏈間的二硫鍵被穩定。抗體可以是單克隆或多克隆的，並可以以單體或聚合體形式存在，例如以五聚體形式存在的IgM抗體和/或以單體、二聚體或多聚體形式存在的IgA抗體。抗體還可包括多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們保持、或被修飾為包含配體特異性結合區域即可。術語「片段」指局部或部分的抗體或抗體鏈，其包含比完整的或完全的抗體或抗體鏈少的胺基酸殘基。片段可以通過化學或酶處理完整的或完全的抗體或抗體鏈獲得。片段還可以通過重組的方法獲得。當重組製備時，片段可單獨表達或者作為稱為融合蛋白的較大蛋白的部分來表達。示例性的片段包括Fab、Fab』、F(ab』)2、Fc和/或Fv片段。示例性的融合蛋白包括Fe融合蛋白。本發明的融合蛋白也被術語「抗體」所囊括。
[0053]如上所述，在某些實施方案中，抗體是一種包含Fe區域的蛋白質，例如免疫球蛋白。在某些實施方案中，包含Fe區域的蛋白質是重組蛋白質，其包括與另一種多肽或其片段融合的免疫球蛋白的Fe區域。示例性的多肽包括例如腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素α-鏈；胰島素β-鏈；胰島素原；促濾泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝固因子，如VIIIC因子、IX因子、組織因子和血管假性血友病因子(von Willebrandsfactor);抗凝血因子，如蛋白質C ;心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);蛙皮素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β ;腦啡肽酶；RANTES (調節激活正常T細胞表達及分泌因子)；人巨噬細胞炎症蛋白(ΜΙΡ- l-α );血清白蛋白，如人血清白蛋白；Muellerian-抑制物質；鬆弛素α-鏈；鬆弛素β_鏈；鬆弛素原(prorelaxin);小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白質，如β_內醯胺酶；脫氧核糖核酸酶；IgE ;細胞毒性T-淋巴細胞相關抗原(CTLA)(例如CTLA-4);抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF);激素或生長因子的受體；蛋白質A或D ;類風溼因子；神經營養因子，如骨源神經營養因子(BDNF)、神經營養因子-3、-4、-5或-6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT- 6)，或者神經生長因子，如NGF-β ;血小板源生長因子(I3DGF);纖維母細胞生長因子，如aFGF和β FGF;表皮生長因子(EGF);轉化生長因子(TGF)，如TGF-a和TGF-β，包括 TGF-β l、TGF-3 2、TGF-3 3、TGF-3 4 或TGF-βδ ;胰島素樣生長因子-1 和-1I(IGF-1 和 IGF-1I) ；des (1-3)-1GF-1 (腦 IGF-1);胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD 19、⑶20、CD34和CD40 ;紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態生成蛋白(BMP);幹擾素，如幹擾素-a、和-Y ;集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF,GM-CSF和G-CSF ;白介素(IL)，例如IL-1至IL-1O ;超氧化物歧化酶；Τ_細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，如AIDS被膜的一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；整聯蛋白，如CDl Ia、CDl Ib、CDl Ic、CD 18、ICAM、VLA_4和VCAM ;腫瘤相關抗原，如HER2、HER3或HER4受體；以及任何以上所列多肽的片段和/或變體。另外，本發明抗體是與任何以上所列的多肽特異性結合的任何蛋白或多肽、其片段或變體。
[0054]除另有說明，本文所用術語「樣品」指包含靶分子的任何組合物或混合物。樣品可以源自生物或其它來源。生物來源包括真核生物和原核生物源，如植物和動物細胞、組織和器官。所述樣品還可包括被發現與靶分子混合的稀釋劑、緩衝劑、清潔劑和汙染物、碎片等。所述樣品可以是「部分純化的」(即已經進行了一或多個純化步驟，如過濾步驟)或者可直接從產生靶分子的宿主細胞或有機體中獲得(例如樣品可包含收穫的細胞培養液)。[0055]本文所用術語「雜質」或「汙染物」指任何外來的或不能採用的分子，包括生物大分子，如DNA、RNA、一或多種宿主細胞蛋白質、內毒素、脂質和一或多種添加劑，其可存在於包含靶分子的樣品中，所述靶分子通過使用本發明過程從一或多種外來的或不能採用的分子中分離出來。此外，這種雜質可包括在進行本發明方法之前發生的步驟中所使用的任何試劑。
[0056]本文可交換使用的術語「純化」、「分離」或「離析」指從包含靶分子和一或多種雜質的組合物或樣品中增加靶分子的純度。一般地，靶分子的純度可通過從組合物中移除(完全或部分)至少一種雜質來增加。
[0057]本文可交換使用的術語「流通過程」、「流通模式」和「流通色譜法」指一種產品分離技術，其中連同一或多種汙染物包含在樣品中的至少一種產品(例如含有Fe區域的蛋白質)意圖流通色譜樹脂或介質，同時至少一種可能的汙染物或雜質結合於色譜樹脂或介質。「流通模式」一般是等度操作(即期間流動相的組成不變的色譜過程)。
[0058]在所要求保護的方法的某些實施方案中和按本文提出的實施例中所述，所述方法例如使用以流通模式進行的陰離子和/或陽離子交換色譜步驟。
[0059]本文可交換使用的術語「結合和洗脫模式」和「結合和洗脫過程」指一種產品分離技術，其中包含在樣品(例如含有Fe區域的蛋白質)中的至少一種產品(靶分子)與色譜樹脂或介質結合併隨後被洗脫。
[0060]本文所用術語「儲液器」指任何任何容器、槽或袋，其可用於儲存進行本發明方法時要使用的任何緩衝劑，或者樣品，或者應在本發明方法中使用的任何其它液體。另外，「儲液器」是用於收集工藝步驟的排出物(例如柱的洗脫液)的任何容器、槽或袋。
[0061]本文所用術語「在線稀釋」指緩衝劑更換步驟或在線溶液條件調整，其一般是很多常規過程中對使用收集器的備選方案。在典型的在線稀釋中，使用在管道或混合容器、過濾裝置或設備中的溶液混合，可在轉移過程中將兩種溶液混合或滴定。例如，可通過將溶液與另一種較低電導率的溶液混合，將需要降低電導率的溶液稀釋。緩衝劑更換可在過濾裝置的輔助(如透析過濾、超濾等)下完成。在所要求保護的本發明的某些實施方案中，所述方法提供用於純化蛋白質的改進的過程，其消除了對緩衝劑更換步驟的需要。
[0062]術語「色譜法」指從混合物中存在的其它分子中分離出目標分析物(例如靶分子)的任何種類的技術。通常地，由於混合物中各個分子在流動相影響下遷移通過固定介質的速率上的差異，或者結合和洗脫過程中的差異，將靶分子從其它分子中分離出來。
[0063]本文可交換使用的術語「基質」和「色譜基質」指在分離過程中從混合物中存在的其它分子中分離出靶分子(例如包含Fe區域的蛋白質，如免疫球蛋白)的任何種類的吸附齊U、樹脂或固相。通常地，由於混合物中各個分子在流動相影響下遷移通過基質的速率上的差異，或者結合和洗脫過程中的差異，將靶分子從其它分子中分離出來。非限定性的實例包括微粒、單片或纖維樹脂以及可置於柱或筒內的膜。形成基質的材料的實例包括多糖(如瓊脂糖和纖維素)；和其它機械穩定的基質，如二氧化矽(例如可控多孔玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯醯胺、陶瓷顆粒和任何上述物的衍生物。適用於本發明方法的典型的基質類型的實例是陽離子交換樹脂、親和性樹脂、陰離子交換樹脂或混合模式樹脂。
[0064]「配體」是一種官能團，其連接於色譜基質上並決定所述基質的結合特性。「配體」的實例包括但不限於離子交換基團、疏水作用基團、親水作用基團、親硫作用基團、金屬親和性基團、親和性基團、生物親和性基團以及混合模式基團(上述提及物的組合)。本發明中可用的某些優選的配體包括但不限於強陽離子交換基團，如磺丙基、磺酸；強陰離子交換基團，如氯化三甲銨；弱離子交換基團，如羧酸；弱陰離子交換基團，如N5N 二乙胺或DEAE ；疏水作用基團，如苯基、丁基、丙基、己基；和未和性基團，如蛋白質A、蛋白質G和蛋白質L。
[0065]術語「親和色譜法」指一種蛋白分離技術，其中靶蛋白(例如包含Fe區域的目標蛋白或抗體)特異性地與對所述靶蛋白具有特異性的配體相結合。這種配體一般被稱為生物特異性配體。在某些實施方案中，生物特異性配體(例如蛋白質A或其官能變體)與色譜基質材料共價結合，並當溶液與色譜基質接觸時易於接近溶液中的靶蛋白。靶蛋白在色譜步驟期間一般保持其對所述生物特異性配體的特異性結合的親和力，同時混合物中的其它溶質和/或蛋白質並不明顯地或特異性地與配體結合。靶蛋白與固定化配體的結合使得汙染性蛋白質和蛋白雜質穿過色譜基質，同時靶蛋白保持特異性地與固相材料上的固化的配體結合。然後在適合的條件下(例如低pH、高pH、高鹽、競爭性配體等)，所述特異性結合的靶蛋白以活性形式從固定化配體移出，並伴隨洗脫緩衝劑穿過色譜柱，不含汙染性蛋白質或蛋白雜質，後者早期已穿過色譜柱。可使用任何成分作為純化其各自特異性結合蛋白(例如抗體)的配體。但是，在本發明的多種方法中，蛋白質A用作包含Fe區域靶分子的配體。從靶蛋白(例如包含Fe區域的蛋白)的生物特異性配體(例如蛋白質A)中洗脫的條件可由本領域技術人員很容易地確定。在某些實施方案中，蛋白質G或蛋白質L或其官能變體可用作生物特異性配體。在某些實施方案中，在PH範圍為5-9下使用生物特異性配體(如蛋白質A)以用於結合包含Fe區域的蛋白質，衝洗或再平衡所述生物特異性配體/靶蛋白軛合物，然後用包含至少一種鹽的PH約4或低於4的緩衝劑洗脫。
[0066]術語「離子交換」和「離子交換色譜法」指一種色譜過程，其中混合物中的目標溶質或分析物(例如含有Fe區域的靶分子)與鍵合(如通過共價連接)在固相離子交換物質上的帶電荷化合物相互作用，使得目標溶質或分析物，比混合物中溶質雜質或汙染物更多或更少地，非特異性地與所述帶電荷的化合物相互作用。混合物中汙染性溶質比目標溶劑更快或更慢地從所述離子交換物質的柱中洗脫，或者相對於目標溶質結合到樹脂中或從樹脂中排除。「離子交換色譜法」具體包括陽離子交換、陰離子交換和混合模式離子交換色譜法。例如，陽離子交換色譜法可結合靶分子(例如含有Fe區域的靶蛋白)隨後洗脫(陽離子交換結合和洗脫色譜法或「CIEX」)，或者可主要結合雜質而靶分子「流通」柱(陽離子交換流通色譜法FT- CIEX)。陰離子交換色譜法可結合靶分子(例如含有Fe區域的靶蛋白)隨後洗脫，或者可主要結合雜質而靶分子「流通」柱。在某些實施方案中和如本文提出的實施例中所示，陰離子交換色譜步驟以流通模式進行。
[0067]短語「離子交換基質」指帶有負電荷(即陽離子交換樹脂)或正電荷(即陰離子交換樹脂)的色譜基質。電荷可通過將一或多種帶電配體連接到基質上(例如通過共價鍵合)來提供。或者，或者另外，電荷可以是基質的固有特性(例如為二氧化矽的情況，其整體帶有負電荷)。
[0068]本文所用「陽離子交換基質」指帶有負電荷的色譜基質，因此其具有與經過或通過固相的水溶液中的陽離子交換的游離陽離子。連接於固相形成陽離子交換樹脂的帶負電荷的配體可以是例如羧酸根或磺酸根。市售提供的陽離子交換樹脂包括羧基-甲基-纖維素、固定在瓊脂糖上的磺丙基(SP，sulphopropyl)(例如SP-SEPHAROSE FAST FLOW?或SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE ?，源於Pharmacia)和固定在瓊脂糖上的磺醯基(例如S-SEPHAROSE FAST FLOW?，源於 Pharmacia)。優選是 Fractogel? EMD SO3^Fractogel EMDSE Hi ghcap、Eshmuno ? S 和 Fractogel ? EMD COO (Merck)。
[0069]「混合模式」基質是一種帶有至少兩種類型的可與靶分子和/或雜質相互作用的官能度的色譜基質。這些官能度可以是離子交換基團、疏水作用基團、親水作用基團、親硫作用基團、金屬親和性基團、親和性基團和生物親和性基團。本發明所用的優選的混合模式基質是至少攜帶陰離子交換和陽離子交換基團的基質或混合模式離子交換基質。「攜帶至少兩種類型的官能度」在一種實施方案中指提供一種類型的基質，其被至少兩種類型的不同官能度共價改性。還可能是所述混合模式基質由各具有至少一種官能度的兩種以上不同基質的組合製成，憑此所述組合通過在一個分離單元中合併這些基質實現。該情況下，混合模式基質可以是兩種不同基質的混合物，各基質攜帶至少一種官能度，例如為陽離子交換基質和陰離子交換基質的混合物，例如兩者均以可易於在分離單元中混合的吸附劑顆粒形式存在。還可能將一根填充第一基質的柱與另一根填充第二基質的柱偶聯到一個分離單元上，使得樣品液流過兩種基質。
[0070]「混合模式離子交換基質」指用陽離子和/或陰離子和疏水基團共價改性的色譜基質。市售提供的混合模式離子交換樹脂是BAKERBOND ABX? (J.T.Baker, Phillipsburg,N.J.)，其包含連接在矽膠固相載體基質上的疏水性配體和弱陽離子交換基團——低濃度的陰離子交換基團。混合模式陽離子交換基質一般具有陽離子交換基團和疏水性基團。適合的混合模式陽離子交換基質是Capto? MMC (GE Healthcare)和Eshmuno ? HCX(Merck) 0混合模式陰離子交換基質一般具有陰離子交換基團和疏水基團。適合的混合模式陰離子交換基質是Capto ? Adhere (GE Healthcare)。
[0071]本文所用「陰離子交換基質」指帶有正電荷的色譜基質，例如在其上連接有一或多種帶正電荷的配體，如季銨基團。市售提供的陰離子交換樹脂包括DEAE纖維素、QAESEPHADEXm^PFAST Q SEPHAROSE ? (Pharmacia)。優選的物質是 Fractogel? EMD TMAE,Fractogel? EMD TMAE highcap、Eshmuno ? Q 和 Fractogel? EMD DEAE。
[0072]術語「蛋白質A」和「Prot A」在本文可交換使用並包含從其天然來源回收的蛋白質A、合成製備的蛋白質A (例如通過肽合成或通過重組技術)，以及保持結合具有CH2/CH3區域(如Fe區域)的蛋白質的能力的其變體。蛋白質A可從商業上購自RepligeruPharmacia和Fermatech。蛋白質A—般被固定在色譜基質上。術語「ProA」也指包含共價性連接有蛋白質A的色譜固體載體基質的親和色譜基質或柱。
[0073]本發明方法中所用的蛋白質A的官能衍生物、片段或變體可表徵為:對於小鼠IgG2a或人IgGl的Fe區域，結合常數至少為Κ=Ι0"8Μ，並優選Κ=Ι0"9Μ。在本文語境中，將具有結合常數的這些值的相互作用依從性稱為「高親和力結合」。優選蛋白質A的此類官能衍生物或變體包含至少部分野生型蛋白質A的官能IgG結合區域，其選自天然區域E、D、A、B、C或其保持了 IgG結合官能度的工程化突變體。
[0074]再者，也可將經工程化以允許單點連接的蛋白質A衍生物或變體用於所要求保護的方法中的親和色譜步驟中。
[0075]單點連接通常指蛋白部分通過單一共價鍵與蛋白質A親和色譜的色譜載體物質連接。這類單點連接還可通過使用適合的活性殘基發生，所述殘基位於暴露的胺基酸位置，即環內，接近於N-或C-末端或蛋白摺疊的外圓周上的某些位置上。適合的活性殘基是例如疏基或氣基官能。
[0076]本文所用術語「親和色譜基質」指攜帶適合於親和色譜的配體的色譜基質。一般地，所述配體(例如蛋白質A或其官能變體)與色譜基質材料共價連接，並且當溶液與色譜基質接觸時可易於接近溶液中的靶分子。親和色譜基質的一實例是蛋白質A基質。
[0077]本文中用於描述靶分子(例如包含Fe區域的蛋白質)和連接於基質的配體(例如結合於固相基質或樹脂上的蛋白質A)之間的相互作用的術語「結合」，指靶分子與配體通過結合部位處例如蛋白和配體結構的空間互補性偶合結合部位處的靜電力、氫鍵、疏水力和/或範德華力的聯合效應的一般可逆性結合。一般地，結合位置處空間互補性越大，其它力越強，則蛋白質對其相應配體的結合特異性越大。特異性結合的非限定實例包括抗體-抗原結合、酶-底物結合、酶-輔因子結合、金屬離子螯合、DNA結合蛋白-DNA結合、調節蛋白-蛋白相互作用等。理想地，在親和色譜中，出現的特異性結合具有在游離溶液中約10〃4 - 10〃8 M的親和力。
[0078]術語「清潔劑」指離子或非離子表面活性劑，如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80);泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188) ；Triton ;十二烷基硫酸鈉(SDS);月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；十二烷基_、十四烷基_、亞油烯基-(Iinoleyl)或硬脂基-磺基甜菜鹼；十二烷基_、十四烷基_、亞油烯基-或硬脂基-肌氨酸；亞油烯基_、十四烷基-或十六烷基-甜菜鹼；月桂醯胺基丙基_、椰油醯胺基丙基_、亞油醯胺基丙基_、肉豆蘧醯胺基丙基_、棕櫚醯胺基丙基-或異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼(如月桂醯胺基丙基)；肉豆蘧醯胺基丙基_、棕櫚醯胺基丙基-或異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺；甲基椰油醯基牛磺酸鈉或甲基油烯基牛橫酸二鈉；和 MONAQU AT?系列(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.)。有用的清潔劑是聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20 (TWEEN 20?.)或聚山梨醇酯80 (TWEEN 80?.)或各種酸，如辛酸。
[0079]「緩衝劑」是一種通過其酸-鹼軛合成分的作用而對抗pH變化的溶液。依據例如緩衝劑所要求的pH可使用的各種緩衝劑描述於:Buffers.A Guide for the Preparationand Use of Buffers in Biological Systems (緩衝劑,製備指南和緩衝劑在生物系統中的用途)，Gueffroy, D.,編輯Calbiochem Corporation (1975)中有述。非限定的緩衝劑的實例包括MES、M0PS、M0PS0、Tris、HEPES、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和銨緩衝劑及其組合。
[0080]本發明中術語「緩衝劑」或「溶劑」用於任何液體組合物，其用於裝載、衝洗、洗脫和再平衡分離單元。
[0081]當「裝載」分離柱時，可用緩衝劑將包含靶分子(例如包含Fe區域的靶蛋白)和一或多種雜質的樣品或組合物裝載至色譜柱上(例如親和性柱或離子交換柱)。緩衝劑具有一定的電導率和/或pH，使得靶分子結合到色譜基質上，而理想上所有雜質都不結合併流通柱。
[0082]當「裝載」分離柱以「流通」靶分子時，用緩衝劑將包含靶分子(例如包含Fe區域的靶蛋白)和一或多種雜質的樣品或組合物裝載至色譜柱上(例如親和性柱或離子交換柱)。緩衝劑具有一定的電導率和/或PH，使得靶分子不結合到色譜基質上而流通柱，同時理想上所有雜質都結合到柱上。[0083]術語「再平衡」指裝載靶分子之前使用緩衝劑再平衡色譜基質。一般地，使用裝載緩衝劑進行再平衡。
[0084]「衝洗」色譜基質指將適合的緩衝劑通過或經過基質。一般地，衝洗用於在洗脫靶分子之前除去基質中弱結合的汙染物。
[0085]在這種情況下，衝洗緩衝劑和裝載緩衝劑一般是相同的。在使用病毒滅活緩衝劑時，其用於在洗脫靶分子之前滅活某些存在的病毒。在這種情況下，一般地，病毒滅活緩衝劑不同於裝載緩衝劑，原因是其可能含有清洗劑(一種/多種)或者具有不同的性質(PH/電導率/鹽及其量)。
[0086]從色譜基質中「洗脫」分子(例如目標多肽或雜質)指通過改變溶液條件使得緩衝劑與目標分子競爭色譜樹脂上的配體位置，而從色譜基質中除去分子。非限定性實例是從離子交換樹脂中洗脫分子，其通過改變圍繞離子交換物質的緩衝劑的離子強度，使得緩衝劑與分子競爭離子交換物質上的帶電荷的位置。
[0087]本文中可交換使用的術語「病毒滅活」或「VI」指可致使病毒不能感染細胞或通過物理-化學途徑抑制病毒功能的任何過程。典型的病毒滅活方法包括但不限於低pH處理(例如低於PH 4.5，低於4.0或低於3.8)、熱處理、用表面活性劑和輻射處理(例如紫外線暴露)。在某些實施方案中，病毒滅活方法指向對抗逆轉錄病毒。
[0088]在特定實施方案中，可用低pH條件進行病毒滅活，因為這些條件一般破壞病毒脂質包膜，由此將病毒滅活。
[0089]在特定實施方案中，可用某些表面活性劑進行病毒滅活，因為它們一般能破壞病毒，由此將病毒滅活(如Tween、Triton X-100、SDS)。
[0090]本發明中「分離單元」是一種在其上可進行色譜分離步驟的裝置。分離單元一般是填充有吸附劑基質的色譜柱或色譜管筒。色譜柱對於本領域技術人員是已知的。它們一般包含帶有流體入口和流體出口的末端配件的柱管。所述柱管填充有適合的色譜基質。
[0091]本發明中「連續的」過程是一種不以間歇模式運行的過程。在本發明的連續過程中，新樣品不是僅僅一次性裝載於分離單元Al或A2上，而是以交替的方式循序裝載於分離單元Al或者分離單元A2上,期間僅有極短的中斷或者優選無中斷。
[0092]本發明中「循序」是2次或多於2次。
[0093]本發明中「連接線」是適合於流動液體在其中流過的任何管、軟管、導管或通路。連接線可被一或多個閥中斷。連接線可以是直型或分枝型。
[0094]本發明中如果設備的兩個部件「流體連接」，其意味著該設備的兩個部件之間存在連接線，使得液體可從一個部件流向另一部件。該連接線可以是直接的或者可被一或多個閥、被分離單元或者被設備的其它部件中斷。術語「流體連接」不僅包含一種永久性的流體連接，而且還包含一種非永久性的流體連接，其由例如被一或多個閥中斷的連接線構成，使得通過該連接線的液體流動可在任何必要之時開始和停止。一般地，設備流體連接的絕大多數部件都具有非永久性的流體連接。例如，如果緩衝劑儲液器與分離單元流體連接，其意味著如果必要，可實現緩衝劑向柱的流動，但一般有至少一個閥位於儲液器和分離單元之間的連接線中，使得液體流動可必要時停止和必要時開始。
[0095]如果液體流動實際上在處於液體連接的所述設備的兩個部件之間實現，由此液體在兩個部件之間流通連接線，那麼這兩個部件處於「流體連通」。因此，本發明的「流體連通」描述其中通過液體流通連接線而實際使用「流體連接」的狀態。如果該系統的兩個部件部分流體連通，其意味著所述流體連通不是永久性的，且液體不是永久性地從一個部件流向另一部件，而僅僅為部分時間。一般地，該系統的兩個部件之間的液體流動是在引導液體流動的閥的幫助下開始和/或停止的。
[0096]「流體入口 」或「入口」是能引入液體的任何途徑。分離單元入口是例如可與連接線連接的色譜柱末端配件。入口也可以是在連接線中提供液體引入的閥。入口還可以是連接線的末端。
[0097]「出口」或「流體出口 」是能排出液體的任何途徑。分離單元出口是例如可與連接線連接的色譜柱末端配件。出口也可以是在連接線中提供液體引入的閥。出口還可以是連接線的末端。
[0098]「流體選擇閥」是能在任何連接的流體和系統部件之間選擇性使流體連通的任何途徑。流體選擇閥是例如分離單元入口之前的閥，其可連接並且選擇性選擇能在所選擇的線和分離單元入口之間引起流體連通的連接線。流體選擇閥是例如分離單元出口之後的閥，其可連接並且選擇性選擇能在所選擇的線和分離單元出口之間引起流體連通的連接線。流體選擇閥也可以是在連接線中提供液體引入的閥。流體選擇閥也可以是連接線的末端。
[0099]「溶劑選擇閥」是能在任何連接的溶劑儲液器和系統部件之間選擇性使流體連通的流體選擇閥。溶劑選擇閥是例如溶劑泵之前的閥，其可從溶劑儲液器連接並且選擇性選擇能在所選擇的溶劑和泵之間引起流體連通的連接線。
[0100]「流體選擇閥」和「溶劑選擇閥」可具有相同的類型或不同的類型。
[0101]溶劑遞送系統是一種能夠遞送液體的系統。一般地，設備的溶劑遞送系統包含至少一個儲液器和至少一個泵，其用以將液體從儲液器中運送到與所述儲液器液體連接的設備另一部件。本領域技術人員了解每次液體從儲液器中轉移到分離單元，都是在泵的幫助下進行。泵也可用於混合來自兩個或更多個儲液器的兩種或更多種液體流。
[0102]發明詳沭
本發明首次提供一種僅需要三根分離柱的適合於連續色譜過程的方法和設備。該過程是一種包含兩個色譜步驟的兩步程序。如果設備具有三個分離單元，則第一色譜步驟(捕獲)交替且循序在兩個分離單元上進行，第二色譜步驟(精純)也循序在第三個分離單元上進行。具有相同色譜基質的頭兩個分離單元被交替裝載樣品。這意味著其中一個單元在裝載樣品時，同時另一單元可進行其它工藝步驟，如平衡、衝洗、靶分子的洗脫等。具有不同於頭兩個單元的基質的色譜基質的第三個分離單元，用從頭兩個單元洗脫的靶分子進料。由於頭兩個單元循序裝載，因此它們也循序洗脫。這意味著當一個單元裝載時，另一個已經裝載的單元被任選衝洗，並將靶分子從該單元上用洗脫緩衝劑洗脫，所述靶分子優選直接輸送到第三單元上。
[0103]由於在第三單元上進行第二色譜分離，因此隨後可從第三單元的流體出口回收純化的靶分子。
[0104]本發明的方法和設備容許高載量的第一方面(dimension)的分離單元，由此得到高動態結合容量和縮短停留時間的較快生產能力。
[0105]另外，本發明的方法和設備能將第一分離方面(捕獲)與第二分離方面(精純)連接起來，並且一般無需附加調節(conditioning)，原因是所捕獲的產物優選在適合於第二(精純)方面的條件下從第一方面洗脫。
[0106]本發明的方法可用於不同的色譜模式，例如CIEX捕獲結合AIEX精純、Prot A捕獲結合CIEX精純和AIEX捕獲結合CIEX精純，但概念和技術方案不變。因此，這是適合於寬範圍靶分子(例如具有Pi 2-14的生物藥物分子)純化的不僅經濟而且穩健的純化技術。
[0107]在一優選的實施方案中，分離單元Al和A2具有親和色譜基質，而分離單元B具有陽離子交換色譜基質。
[0108]在另一優選的實施方案中，分離單元Al和A2具有親和色譜基質，而分離單元B具有陰離子交換色譜基質。
[0109]在另一優選的實施方案中，分離單元Al和A2具有陽離子交換色譜基質，而分離單元B具有陰離子交換色譜基質。
[0110]在另一實施方案中，分離單元Al和A2具有陰離子交換色譜基質，而分離單元B具有陽離子交換色譜基質。
[0111]在另一實施方案中，分離單元Al和A2具有親和色譜基質，而分離單元B具有混合模式色譜基質。
[0112]在另一實施方案中，分離單元Al和A2具有親和色譜基質，而分離單元B具有混合模式陽離子和陰離子交換色譜基質，或者混合模式陰離子和陽離子交換色譜基質，或者混合模式陽離子和混合模式陰離子交換色譜基質。
[0113]在另一實施方案中，分離單元Al和A2具有陽離子交換基質，而分離單元B具有混合模式色譜基質。
[0114]本發明的設備的示意圖在圖2中顯示。在圖2中，分離單元Al和A2的出口與分離單元B的入口之間的連接線被命名為連接線C-P。
[0115]本發明的設備包含3個分離單元——2個具有相同色譜基質的捕獲分離單元Al和A2和I個精純分離單元B。除分離單元外，一般還包括至少2個泵、一或多個閥、液體連接和儲液器。其另外還可包含過濾單元、檢測單元或其它在色譜分離程序中需要或適用的裝置。
[0116]本發明的設備可以是常規的色譜系統或者單次使用系統。它包含柱、閥、儲液器和一般用於色譜系統的其它裝置。分離單元可以例如是不鏽鋼柱、塑料柱或玻璃柱，填充有各自的色譜基質並具有適合的用於溶劑入口和出口的末端配件。
[0117]在某些實施方案中，本發明的設備可包含多於3個的分離單元，例如其可具有3或4個具有相同色譜基質的捕獲分離單元和2或3個具有相同色譜基質的精純分離單元，但精純分離單元的色譜基質不同於捕獲分離單元的基質。在一示例性實施方案中，其可具有:
-2個捕獲分離單元Al和A2結合2個精純分離單元BI和B2 -3個捕獲分離單元Al、A2和A3結合I個精純分離單元B -3個捕獲分離單元Al、A2和A3結合2個精純分離單元BI和B2。
[0118]在一優選的實施方案中，本發明的設備具有5個分離單元，3個具有相同色譜基質的捕獲分離單元Al、A2和A3和2個精純分離單元BI和B2。
[0119]為確保分離單元Al的流體出口或者分離單元A2的流體出口或者分離單元A3的流體出口可以與分離單元BI的入口或者與分離單元B2的入口能夠流體連通，至少一個閥位於分離單元Al、A2和A3的流體出口與分離單元BI和B2的流體入口之間。優選有閥位於各分離單元Al和A2和A3的出口後，其能使得與分離單元BI的入口或者與分離單元B2的入口流體連通。所述設備還包含至少2個緩衝劑儲液器和至少2個泵，也稱為溶劑遞送系統，其提供例如裝載、衝洗和靶分子洗脫所需緩衝劑的儲存和供應。一般地，分離單元Al、A2和A3具有至少一個流體入口，其與至少一個緩衝劑儲液器連接，並且分離單元BI和B2具有至少一個流體入口，其與至少一個緩衝劑儲液器連接。一般地，分離單元BI和B2具有至少一個流體出口。
[0120]在一特別優選的實施方案中，本發明設備具有3個分離單元，2個具有相同色譜基質的捕獲分離單元Al和A2和I個精純分離單元B。
[0121]下文中，將所述設備和方法的描述集中在一種帶有2個具有相同色譜基質的捕獲分離單元Al和A2和I個精純分離單元B的設備上。這並不意味著限定而是為更詳盡的說明。本領域技術人員還可以將這種說明轉移到上述帶有多於3個單元的系統中。
[0122]為確保分離單元Al的流體出口或者分離單元A2的流體出口均可以與分離單元B的入口流體連通，至少一個閥位於分離單元Al和A2的流體出口與分離單元B的流體入口之間。
[0123]所述設備還包含至少2個緩衝劑儲液器和至少2個泵，也稱為溶劑遞送系統，其提供例如裝載、衝洗和靶分子洗脫所需緩衝劑的儲存和供應。一般地，對於各色譜步驟，需要一種裝載緩衝劑和一種洗脫緩衝劑。
[0124]在本發明的一實施方案中，所述設備僅包含用於結合和洗脫緩衝劑的兩個緩衝劑儲液器，一個儲液器用於緩衝劑A，另一儲液器用於緩衝劑B。緩衝劑A對於第一方面是裝載緩衝劑因此為結合緩衝劑，其提供靶分子在分離單元A1/A2上被捕獲的條件。另外，緩衝劑A對於第二方面是洗脫緩衝劑，其提供靶分子從分離單元B中被洗脫的條件。緩衝劑B對於第一方面(分離單元A1/A2)是洗脫緩衝劑，但對於第二方面(分離單元B)是結合緩衝劑。
[0125]在其它實施方案中，所述設備可包含附加的用於其它緩衝劑、原位清洗、病毒滅活等的儲液器。
[0126]一般地，儲液器和分離單元通過連接線、閥和泵連接。用於泵前溶劑選擇的優選溶劑選擇閥是具有6個溶劑入口和I個可直接與泵連接的溶劑出口的閥。確保溶劑流動的任何泵都可使用，包括螺動泵、等度泵(isocratic pump)、梯度泵、高壓泵等、低壓泵等。用於系統部件入口前流體引入的選擇的優選流體選擇閥是具有6個流體入口和I個可與所述系統部件入口連接的出口的閥。用於系統部件出口後流體排出的選擇的優選流體選擇閥是具有6個流體出口和I個可與所述系統部件出口連接的入口的閥。
[0127]在一優選的實施方案中，所述設備在兩個捕獲分離單元Al和A2之間另外包含連接線，其能使柱Al出口和柱A2入口之間液體連接，反之亦然。該實施方案的示意圖在圖3中顯示，其中將所述附加連接線命名為連接線F-F。該設置能使得在第二分離單元(剛剛再平衡和準備捕獲)上捕獲從第一捕獲分離單元(在裝載結束時)浙濾的產物。這使得能在無靶分子損失下，使用較高生產量和結合容量。
[0128]在一優選的實施方案中，溶劑遞送系統與兩個捕獲分離單元Al和A2之間的連接線連接，優選樣品溶劑遞送系統，以保證將樣品連續進料至任何所選擇的捕獲分離單元中。[0129]在另一優選的實施方案中，所述設備還包含一或多個檢測器。檢測器可用於控制色譜柱之間的樣品傳送、用於分析樣品質量、監測等。檢測器可位於任何適合的地方，一般位於分離柱的流體入口之前和/或流體出口之後。適合的檢測器的實例是PH檢測器、UV檢測器、紅外檢測器或測量電導率的檢測器。
[0130]優選檢測器位於所有分離柱的流體入口之前和流體出口之後。這種設置確保控制分離單元之間的樣品傳送。
[0131]在另一優選的實施方案中，所述設備還包含計算機系統。檢測器以及泵和閥連接在計算機系統上。該計算機系統能控制泵和閥以及檢測器。該計算機系統優選包含能使該設備用於部分或全部自動化模式的軟體和算法。
[0132]在另一優選的實施方案中，附加的流體入口，即指優選到一或多個儲液器的連接線，位於分離單元B的流體入口之前。在圖2、3和4中，這種附加的入口被命名為入口 C。一般地，附加的流體入口位於分離單元Al和A2的出口之後且分離單元B的流體入口之前。優選其位於閥之後且分離單元B的流體入口之前，所述閥位於分離單元Al和A2的出口與分離單元B的流體入口之間的連接線上。這保證輸送到柱B上的不僅僅有來自分離單元Al和A2的洗脫液還有附加的緩衝劑或試劑，例如用於在線稀釋、洗脫、平衡、原位清洗、病毒滅活等。
[0133]在另一優選的實施方案中，所述設備還包含附加的用於原位清洗的儲液器。原位清洗(CIP)是一種本領域技術人員已知的技術。原位清洗從色譜基質中除去結合非常堅固的、沉澱的或變性的物質。如果這類汙染物不從色譜基質中除去，它們可能影響柱的色譜特性、降低結合容量 和在隨後的運行中脫離，導致在循環之間攜帶汙染物或產品。
[0134]標準CIP方案一般包括用1-3個柱體積的包含諸如下列成分的水性緩衝劑進行的1-5次衝洗:
-6 M鹽酸胍 -10 mM - 500 mM NaOH,
-10 mM - 500 mM NaOH 和 I M NaCl,
-50 mM NaOH 和 I M Na2SO4,
-150mM磷酸溶液，
-6M 脲，
-20%乙醇，
-20%乙醇和0.5M乙酸，
-20%乙醇和2M乙酸，
-1%吐溫或Triton?表面活性劑X-100等。
[0135]成分(如NaOH)的濃度、CIP緩衝劑在柱上接觸的時間以及進行CIP的頻次可由本領域技術人員進行調整和確定。
[0136]本發明設備優選具有至少一個包含CIP緩衝劑的儲液器。CIP緩衝劑可用於所有分離單元的CIP (如果適合)。然後以一種可將CIP緩衝劑流動獨立導向各柱的方式，將所述緩衝劑儲液器與所有分離單元液體連接。在另一實施方案中，所述設備包含帶有兩種不同CIP緩衝劑的兩個儲液器。一個儲液器與分離單元Al和A2液體連接，藉此可獨立實現向分離單元Al和分離單元A2的流動，另一個儲液器與分離單元B液體連接。原位清洗衝洗可在各分離循環後進行。CIP —般在每第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9或第10分離循環後進行，其取決於樣品從而樣品量和可能汙染分離單元的汙染物的類型。本領域技術人員知道對於單次使用系統，可以擯棄CIP或者可將其顯著簡化的這個事實。
[0137]在另一優選的實施方案中,所述設備包含附加的用於病毒滅活(VI)的儲液器。
[0138]雜質純化，特別是病毒滅活和除去，在生物藥物化合物製造中發揮主要作用，因為生物藥物化合物中病毒水平被FDA規定。可在附加的純化步驟中進行病毒滅活，其中根據所述生物藥物化合物，病毒滅活例如可通過溶劑/清潔劑滅活、巴氏消毒法、酸性pH滅活或UV滅活來進行。
[0139]已發現當採用本發明的設備和本發明的程序時，還可在純化過程中包括病毒滅活。為此,或者分離單元Al和A2或者分離單元B或者所有的分離單元與包含病毒滅活緩衝劑的附加儲液器流體連接。然後該病毒滅活緩衝劑流通分離單元，在其上發生病毒滅活作用，同時靶分子結合到所述分離單元的基質上。分離單元優選與用於低PH或清潔劑病毒滅活的儲液器或者兩者連接，病毒滅活步驟優選在陽離子交換基質上進行。如果病毒滅活在捕獲單元Al和A2上進行，則可以以獨立實現向分離單元Al和分離單元A2的流動的方式，將包含病毒滅活緩衝劑的儲液器與分離單元Al和分離單元A2流體連接。如果病毒滅活在精純單元B上進行，則包含病毒滅活緩衝劑的儲液器與分離單元B流體連接。適用於整合的低PH病毒滅活的緩衝劑是具有酸性pH的緩衝劑，優選具有pH 3-4的緩衝劑。適合的緩衝劑的實例是乙酸鹽、甘氨酸等等。適用於整合的表面活性劑病毒滅活的緩衝劑是具有至少一種表面活性劑或清潔劑的緩衝劑。適合的清潔劑的實例為辛酸、吐溫或Triton表面活性劑X-100。病毒滅活在靶分子「上柱」(表示靶分子結合到分離單元的基質上)的同時進行，導致降低純化步驟的總數目，原因是可避免病毒滅活的蓄積，後者一般在色譜步驟之外進行。
[0140]在一優選實施方案中，所述設備不包含任何用於蓄積的儲液器。在已知的色譜分離程序中，通常將從第一根柱中洗脫的並包括靶分子的所有級分先蓄積，然後裝載於第二根色譜柱上。已發現本發明的方法和設備提供其中不必要這種蓄積的設置。優選裝載和衝洗之時、之後，靶分子從分離單元Al或A2中洗脫，所有包含靶分子的洗脫液無需蓄積而直接導向分離單元B的入口並裝載於分離單元B上。
[0141]這另外加速了純化過程。為此，分離單元Al和A2與分離單元B液體連接，而無需任何儲液器中斷此連接。如果該設備僅包含用於上述結合和洗脫的兩個緩衝劑儲液器，這是特別優選的。如果分離模式需要使用多於兩種的緩衝劑，蓄積也可通過在分離單元B的流體入口之前引入附加的流體入口(如上所述)來避免，所述附加的流體入口可用於在線稀釋和緩衝劑更換。
[0142]在一實施方案中，所述設備包含兩個帶有親和性色譜基質的分離單元和一個帶有離子交換(優選陽離子交換)基質的分離單元。適合的親和性基質是具有下列物質的基質:蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L或蛋白質r官能團(例如Prosep? Highcap(Merck Millipore)、Prosep? Ultra Plus (Merck Millipore)、Poros? Prot A (LifeTechnologies)、A650F (Tosoh)、MabSelect? Sure (GE)。適合的陽離子交換基質是具有但不限於強陽離子交換基團(例如磺丙基、磺酸)的基質(Fractogel EMD?S03,Fractogel EMD?SE highcap (Merck) Eshmuno? S (Merck) SP-SEPHAROSE FAST FLOW ?或 SP-SEPHAROSEHIGH PERFORMANCE?，來源於Pharmacia)，或者具有但不限於弱陽離子交換基團(例如羧酸)的基質，如 Fractogel? EMD Carboxy (Merck)。
[0143]在另一實施方案中，所述設備包含兩個帶有陽離子交換基質的分離單元和一個帶有陰離子交換基質的分離單元。
[0144]適合的陽離子交換基質是具有但不限於強陽離子交換基團(如磺丙基、磺酸)或者具有但不限於弱陽離子交換基團(如羧酸及上述提及的基團)的基質。
[0145]適合的陰離子交換基質是具有但不限於一或多種帶正電荷配體(如季銨基團)的基質。商業上提供的陰離子交換樹脂包括DEAE纖維素、QAE SEPHADEX "*和FAST QSEPHAROSE ? (Pharmacia) > Fractogel? TMAE (M)、Fractogel? TMAE HC (M)或 Eshmuno?Q (Merck)。
[0146]在另一實施方案中，所述設備包含兩個帶有陰離子交換基質的分離單元和一個帶有陽離子交換基質的分離單元。適合的陽離子交換基質和陰離子交換基質以上已有列舉。
[0147]在所有實施方案中，還可使用混合模式的基質代替離子交換基質及其組合。一實例為陰離子交換和疏水性官能度的組合(Capto Adhere (GE Healthcare)或者陽離子交換和疏水性官能度的組合，如(Capto ? MMC (GE Healthcare)、Eshmuno? HCX (Merck KGaA)、P0R0S?XS (Applied Biosystems)。
[0148]圖1顯不本發明設備的一優選的實施方案。柱Al和A2被稱為「CIEX」,表明這兩根柱具有相同的色譜基質，例如陽離子交換樹脂。柱B被稱為AIEX，指該柱可能具有陰離子交換色譜基質。電導率檢測器(「Cond.」)位於所有三根柱的流體入口之前。UV和pH檢測器(「UV、pH」)位於所有三根柱的流體出口處。柱Al和A2與用於原位清洗(「CIP」)、病毒滅活(「VI」)、裝載緩衝劑(「E.A」)、洗脫緩衝劑(「E.B」)、稀釋緩衝劑(「Dil.」)和樣品進料(「進料」)的6個儲液器連接。柱B與用於原位清洗(「CIP」)、裝載緩衝劑(「E.A」)、洗脫緩衝劑(「E.B」)的3個儲液器連接。優選柱A1/A2所用的洗脫緩衝劑與柱B所用的裝載緩衝劑相同，反之亦然。儲液器與柱通過連接線連接。優選所有的連接線被能夠控制液體流動的閥中斷至少一次。液體傳送藉助泵實現。
[0149]本發明還提供從包含靶分子和一或多種雜質的樣品中連續純化靶分子的方法。本發明方法在所述各本發明設備上進行。適合的設備的示意圖在圖2、3和4中顯示。該方法包含循序重複的步驟。將第一色譜方面的分離單元Al和A2連續、循序裝載樣品，使得當樣品裝載於分離單元Al上時，分離單元A2至少部分與分離單元B流體連通，以使靶分子被洗脫至分離單元B上，分離單元A2再平衡，而當樣品裝載於分離單元A2上時，分離單元Al至少部分與分離單元B流體連通，使得靶分子被洗脫至分離單元B上，分離單元Al再平衡。
[0150]此外，第二色譜步驟發生在分離單元B上，其導致從分離單元B的流體出口回收經純化的靶分子。
[0151]為確保本發明方法以連續模式運行，需要調節所述兩個色譜分離步驟的速度。一般地，第二色譜步驟中分離單元B上的裝載、色譜分離和再平衡快於分離單元Al和A2上的裝載、色譜分離和再平衡，使得每次靶分子從分離單元Al或分離單元A2洗脫時，分離單元B都準備新裝載。否則從分離單元Al或分離單元A2洗脫的靶分子被耽誤，直至分離單元B準備新裝載，或者可在系統中集成第二個分離單元B2。
[0152]當進行本發明方法時，將靶分子從分離單元A1/A2中洗脫至分離單元B意味著可將包含靶分子的所有級分都裝載於分離單元B上，或者僅部分級分。為降低所述雜質的量，可取的是僅將含有極少雜質的包含靶分子的那些部分級分裝載於分離單元B上。也可在第一分離步驟之後，取出部分的靶分子級分用於過程控制中，分析靶分子的純度和其它性質。
[0153]下面進一步描述示例性實施方案。設備的構件的標記指圖2中所用的標記。
[0154]A)實施方案，其中在兩種色譜步驟(捕獲和精純)中靶分子與各分離單元的基質相結合(結合-結合模式):
在一實施方案中，本發明方法通過下列步驟進行:
a)將樣品通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離柱Al (例如陽離子交換物質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離柱A2(例如陽離子交換物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一 PH下緩衝劑A衝洗結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，而當分離單元A2與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接以在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元A2進料靶分子，接著用緩衝劑B衝洗，用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B與出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0155]b)將樣品通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2(例如陽離子交換物質)上，其中所述樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2(例如陽離子交換介質)上而未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al (例如陽離子交換物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一 pH下緩衝劑A衝洗結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元A。當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，而當分離單元Al與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗，用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0156]對於優選的連續模式，步驟a)和b)至少重複2次。
[0157]在一優選實施方案中，當將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質)上時，其中樣品處於能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上的第一pH和電導率下，為了使結合的靶分子達到特別高的量而無合理損失，在裝載結束時(意味著當裝載幾乎完成時)，分離單元A2的出口與分離單元Al的入口通過連接線F-F連接,使得能夠捕獲從分離單元A2中開始浙濾的祀分子並結合至分離單元Al上。檢測到來自分離單元A2的靶分子過多浙濾時，立即將樣品進料從分離單元A2切換到分離單元Al。同時將Al上的靶分子衝洗並洗脫至分離單元B上。分離單元Al再平衡後，將其入口與分離柱A2的出口連接，以保證從分離單元Al中開始浙濾的靶分子結合到分離單元A2上。
[0158]兩個分離單元A1和A2的這種特定的中間連接，通過用非常大量的靶分子裝載分離單元Al和A2而提供安全時間的獨特可能性。在已知的色譜系統中，一般將柱裝載至約60-80%的動態結合容量。帶有所述兩個分離單元Al和A2的特定中間連接的本發明的設備和方法，為將分離單元Al和A2在無靶分子損失下裝載超過80%的動態結合容量，優選80-95%的動態結合容量，提供了可能性。所述色譜介質的動態結合容量是在未結合蛋白的顯著突圍出現之前，介質在實際流動條件下會結合的靶分子的量。
[0159]如果將樣品裝載於分離單元Al上，且特別是當裝載接近於完成和靶分子開始從分離單元浙濾出時，分離單元Al的出口可與分離單元A2的入口連接，使得否則必須收集並再次放入樣品進料的靶分子被直接進料到分離單元A2上。本領域技術人員能夠確定何時是最佳時間點停止向分離單元Al的樣品進料並切換樣品進料到分離單元A2。同時也中斷分離單元Al的出口到分離單元A2的入口的連接,而當分離單元A2進一步裝載樣品進料時，將分離單元Al衝洗並隨後與分離單元B的入口連接，以洗脫靶分子到分離單元B上。分離單元Al再平衡後，再將其與分離單元A2的出口連接，以在樣品裝載結束時捕獲可能從柱A2中浙濾的靶分子。
[0160]適用於本實施方案的設備的示意圖在圖3中顯示。採用圖3中所示的示意圖的設備，可例如如下進行本發明方法:
a)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離柱Al (例如陽離子交換物質)上，其中樣品處於能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口Al-W被排出的第一 pH和電導率下，同時分離柱A2 (例如陽離子交換物質)與入口 A (例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一 PH下緩衝劑A衝洗結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，而當分離單元A2與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫的步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，以便在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，接著用緩衝劑B衝洗，用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0161]b)當柱Al上裝載接近於完成時，通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上，而未結合的靶分子通過連接線F-F被直接轉移至柱A2，且未結合的分子通過出口 A2-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0162]c)將所述樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質)上，其中所述組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如陽離子交換介質)上並且未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al (例如陽離子交換物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一PH下緩衝劑A衝洗結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元A。當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所述衝洗和再平衡的步驟，而當分離單元Al與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，以便在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗，用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0163]d)當柱A2上裝載接近完成時，通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上，而未結合的靶分子通過連接線F-F被直接轉移至柱Al，且未結合的分子通過出口 Al-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0164]對於優選的連續模式，步驟a) - d)重複至少2次。
[0165]已發現通常在衝洗過程中由於洗脫未結合的靶分子而造成的靶分子的損失，可通過實施本發明方法的下列途徑來降低:
在一優選的實施方案中，在分離單元A2 (或Al各自地)通過入口 B (例如溶劑遞送系統)已裝載大量結合的靶分子時，衝洗過程中將未結合的靶分子衝洗至分離單元Al上，以轉移未結合的祀分子而無合理損失。這意味著當裝載完成時，分離單元A2的出口與分離單元Al的入口例如通過連接線W-F連接，以使得能夠捕獲從分離單元A2中衝洗的靶分子並結合至分離單元Al上(見圖4)。檢測到來自分離單元A2的靶分子過少時，立即中斷流體連通，並將柱A2出口切換到出口位置A2-W，以排出未結合的分子。同時將靶分子進一步裝載於分離單元Al上，同時將分離單元A2上的靶分子進一步衝洗並洗脫至分離單元B上。分離單元A2再平衡後，將其入口與分離柱Al出口連接，以保證從分離單元Al中開始浙濾的靶分子結合到分離單元A2上。
[0166]兩個分離單元Al和A2的這種特定的中間連接，提供安全時間的獨特可能性，並避免通過衝洗引起的靶分子損失。在已知的色譜系統中，一般將柱衝洗級分取出廢棄或者收集返回到進料儲液器。本發明的設備和方法為在靶分子低損失下衝洗分離單元Al和A2提供了可能性，通過採用這種優選的純化過程，優選到總靶分子的2-3%損失。
[0167]適用於本實施方案的設備的示意圖在圖4中顯示。採用圖4中所示的示意圖的設備，可例如如下進行本發明方法:
a)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離柱Al (例如陽離子交換物質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離柱A2 (例如陽離子交換物質)與入口 A(例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一 PH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，而當分離單元A2與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫的步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，以便在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，接著用緩衝劑B衝洗，用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0168]b)當柱Al上的裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 pH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上，而未結合的靶分子通過連接線F-F被直接轉移至柱A2，且未結合的分子通過出口 A2-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0169]c)當分離單元Al的裝載完成時，來自分離單元Al的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元Al用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元A2連接。檢測到來自分離單元Al中的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱Al出口切換到出口位置Al-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元A2上，而未結合的分子通過出口 A2-W被排出。
[0170]d)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如陽離子交換介質)上而未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al(例如陽離子交換物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元A。當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，而當分離單元Al與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，以便在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗，用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0171]e)當柱A2上裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱Al，且未結合的分子通過出口 Al-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0172]f)當分離單元A2的裝載完成時，來自分離單元A2的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元A2用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元Al連接。檢測到來自分離單元A2中的靶分子過少時，立即中斷連接，然後將柱A2出口切換到出口位置A2-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元Al上，而未結合的分子通過出口 Al-W被排出。
[0173]對於優選的連續模式，步驟a) - f)重複至少2次。
[0174]B)實施方案，其中在第一色譜步驟(捕獲)中，靶分子與各分離單元的基質相結合，在第二色譜步驟(精純)中，靶分子與基質弱結合或者不結合，而雜質結合(結合-流通模式):
在一實施方案中，將第一色譜方面的分離柱Al和A2用所述樣品連續、循序裝載，使得當將樣品裝載於分離柱Al上時，分離柱A2與分離柱B至少部分流體連接，由此將靶分子洗脫至分離柱B上，而柱A2再平衡，當將樣品裝載於分離柱A2上時，分離柱Al與柱B至少部分流體連接，由此靶分子被洗脫至分離柱B上，而柱Al再平衡。
[0175]另外，流通模式中的第二色譜步驟在分離柱B上進行，引起從分離柱B的流體出口回收純化的靶分子。[0176]為保證本發明的方法以連續模式進行，需要調整所述結合-和-洗脫色譜分離步驟的洗脫條件為在柱B上進行流通步驟的裝載條件。如果不可能在適於在分離單元B上裝載的條件下從分離單元Al和A2中洗脫靶分子，一般，用以調節至柱B上靶分子的弱結合條件或不結合條件，可使用入口 C。為獲得最佳和穩定的弱結合或不結合性能，必須要求穩定的溶液性質，如PH和電導率。這在通過入口 C，例如通過在線稀釋或緩衝劑更換，調節從分離單元Al或A2洗脫的靶分子之時進行。
[0177]有時生物藥物產品的純化包括從非常相似的雜質中分離靶分子，並且需要敏感的分離方法，如弱離子交換色譜法。應用本發明方法，可以結合洗脫模式進行親和性分離，和在靶蛋白的弱結合或不結合條件下(流通)進行陰離子交換色譜。這表明是一種非常有效的工具。特別是，用於這種流通精純的數種基質的組合能夠通過數種不同官能度(如陽離子交換或陰離子交換或疏水性官能度及其混合物)吸附雜質，來達到所要求的產物純度。
[0178]對於流通色譜步驟，還可使用非常弱的離子交換基質或弱的混合模式基質，如活性炭。有關含碳物質、活性炭和其在流通純化過程中的用途的進一步細節可在美國臨時專利申請N0.61/575349中發現，其通過引用結合到本發明中。在下列示例性實施方案中進一步描述。設備構件的標記指圖2中所用的標記。
[0179]在一實施方案中，本發明方法通過下列步驟進行:
a)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離柱Al (例如陽離子交換物質或親和性物質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離柱A2 (例如陽離子交換物質或親和性物質)與入口 A (例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，而當分離單元A2與分離單元B (例如陰離子交換介質或混合模式介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫的步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，以便在能使靶分子與分離單元B弱結合或不結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，接著用緩衝劑B再平衡分離單元B。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行進料步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0180]b)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質或親和性物質)上，其中所述組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2(例如陽離子交換物質或親和性物質)上而未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al (例如陽離子交換物質或親和性物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一 PH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元A。當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，而當分離單元Al與分離單元B (例如陰離子交換介質或混合模式介質)通過連接線C-P直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，以便在能使靶分子與分離單元B弱結合或不結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，接著用緩衝劑B再平衡分離單元B。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行進料步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。[0181]對於優選的連續模式，步驟a)和b)重複至少2次。
[0182]在一優選的實施方案中，當將所述組合物通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質或親和性物質)上時，其中所述組合物處於能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上的第一 pH和電導率下，為了使結合的靶分子達到特別高的量而無合理損失，裝載結束時(意味著當裝載幾乎完成時)，分離單元A2的出口與分離單元Al的入口通過連接線F-F連接，使得能夠捕獲從分離單元A2中開始浙濾的靶分子並結合至分離單元Al上(見圖3)。檢測到來自分離單元A2的靶分子的過多浙濾時，立即將樣品進料從分離單元A2切換到分離單元Al。同時將Al上的靶分子衝洗並洗脫至分離單元B上。分離單元Al再平衡後，將其入口與分離柱A2的出口連接，以保證分離單元Al中開始浙濾的靶分子結合到分離單元A2上。
[0183]兩個分離單元Al和A2的這種特定的中間連接，通過用非常大量的靶分子裝載分離單元Al和A2而提供安全時間的獨特可能性。在已知的色譜系統中，一般將柱裝載至約60-80%的動態結合容量。本發明的設備和方法為將分離單元Al和A2裝載至超過80%的動態結合容量，優選至80-95%的動態結合容量，提供了可能性。
[0184]適用於本實施方案的設備的示意圖在圖3中所示。採用圖3中所示的示意圖的設備，可例如如下進行本發明方法:
a)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離柱Al (例如陽離子交換物質或親和性物質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離柱A2 (例如陽離子交換物質或親和性物質)與入口 A (例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，而當分離單元A2與分離單元B (例如陰離子交換介質或混合模式介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫的步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，以便在能使靶分子與分離單元B弱結合或不結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，接著用緩衝劑B再平衡分離單元B。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行進料步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0185]b)當柱Al上裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱A2，且未結合的分子通過出口 A2-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0186]c)將所述樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質或親和性物質)上，其中所述組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如陽離子交換介質或親和性物質)上並且未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al (例如陽離子交換物質或親和性物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元A。當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所述衝洗和再平衡的步驟，而當分離單元Al與分離單元B (例如陰離子交換介質或混合模式介質)通過連接線C-P直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，以便在能使靶分子與分離單元B弱結合或不結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，接著用緩衝劑B再平衡分離單元B。當分離單元B和出口 B-W連接時進行再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行進料步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0187]d)當柱A2上裝載接近完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F轉移至柱Al，且未結合的分子通過出口 Al-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0188]對於優選的連續模式，步驟a) - d)重複至少2次。
[0189]在一優選實施方案中，當分離單元A2 (例如陽離子交換物質或親和性物質)通過其中所述組合物處於能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上的第一 pH和電導率下的入口 B (例如溶劑遞送系統)，被裝載至特別大量的結合的靶分子而無合理損失時，未結合的靶分子被衝洗至分離單元Al，以轉移所述未結合靶分子而無合理損失。這意味著當裝載完成時，分離單元A2的出口與分離單元Al的入口通過連接線W-F連接，使得能夠捕獲從分離單元A2中衝洗的靶分子並結合至分離單元Al上(見圖4)。檢測到來自分離單元A2的靶分子過少時，立即中斷連接，將柱A2出口切換到出口位置A2-W，以排出未結合的分子。同時將靶分子再裝載至分離單元Al上，同時分離單元A2上的靶分子進一步被衝洗和洗脫至分離單元B上。分離單元A2再平衡後，將其入口與分離柱Al的出口連接，以保證來自分離單元Al的開始浙濾的靶分子結合到分離單元A2上。
[0190]兩個分離單元Al和A2的這種特定的中間連接，提供安全時間的獨特可能性，並避免靶分子通過衝洗造成的損失。在已知的色譜系統中，一般將柱衝洗級分取出廢棄或者收集返回到進料儲液器。本發明的設備和方法為以靶分子低損失衝洗分離單元Al和A2提供了可能，在優選的純化過程中，優選到總靶分子的2-3%損失。
[0191]適用於本實施方案的設備的示意圖在圖4中顯示。採用圖4中所示的示意圖的設備，可例如如下進行本發明方法:
a)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離柱Al (例如陽離子交換物質或親和性物質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離柱A2 (例如陽離子交換物質或親和性物質)與入口 A (例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，當分離單元A2與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫的步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，以便在能使靶分子與分離單元B弱結合或不結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，用緩衝劑B再平衡分離單元B。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行進料步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0192]b)當柱Al上的裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品在第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F轉移至柱A2，且未結合的分子通過出口 A2-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0193]c)當分離單元Al的裝載完成時，來自分離單元Al的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元Al用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元A2連接。檢測到來自分離單元Al的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱Al出口切換到出口位置Al-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元A2上，而未結合的分離通過出口 A2-W被排出。
[0194]d)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質)上，其中組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如陽離子交換介質)上而未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al (例如陽離子交換物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，以便用第一pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元A。當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，而當分離單元Al與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，以便在能使祀分子與分離單元B弱結合或不結合的條件下從分離單元Al中進料祀分子,接著用緩衝劑B再平衡分離單元B。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行進料步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0195]e)當柱A2上的裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱Al，且未結合的分子通過出口 Al-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0196]f)當分離單元A2的裝載完成時，來自分離單元A2的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元A2用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元Al連接。檢測到來自分離單元A2的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱A2出口切換到出口位置A2-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元Al上，而未結合的分子通過出口 Al-W被排出。
[0197]對於優選的連續模式，步驟a) - f)重複至少2次。
[0198]已發現在本發明方法中，優選使用緩衝劑，其提供pH依賴性結合和洗脫。已發現特別是當使用PH不同於裝載緩衝劑的pH的洗脫緩衝劑時，從分離單元Al和A2中洗脫靶分子更為有效和快速。換言之，當使用具有的PH不同於裝載緩衝劑的pH的洗脫緩衝劑時，洗脫分布更為有利。特別優選PH梯度洗脫。適合於pH依賴性結合和洗脫的緩衝劑對本領域技術人員是已知的。適合的緩衝劑組合的實例為PBS-甘氨酸、乙酸鹽-TRIS等。
[0199]在一優選的實施方案中，本發明方法包含使用僅僅兩種裝載和洗脫緩衝劑，緩衝劑A和緩衝劑B，從而緩衝劑A是對於第一方面的裝載緩衝劑，其提供靶分子被捕獲在分離柱A1/A2上的條件。另外，緩衝劑A是對於第二方面的洗脫緩衝劑，其提供靶分子從分離柱B中被洗脫的條件。緩衝劑B對於第一方面(柱A1/A2)是洗脫緩衝劑，但對於第二方面(柱B)是捕獲緩衝劑。
[0200]如果分離單元Al和A2具有親和性色譜基質，如Prot A基質，則結合緩衝劑(緩衝劑A) —般具有在6-8之間的pH和10 mM-2 M之間的鹽濃度(典型的鹽是磷酸鹽、乙酸鹽、氯化物等)。優選結合緩衝劑具有pH 6.8-7.3和鹽濃度50 mM-Ι Μ。洗脫緩衝劑一般具有pH 2-5和鹽濃度(典型的鹽是甘氨酸、乙酸鹽等)20 mM-200mM。優選洗脫緩衝劑具有pH 2.5-4.5和鹽濃度20如果例如洗脫緩衝劑具有pH 4，則這種適合從分離
單元Al和A2的Prot A基質中洗脫靶分子的緩衝劑，也適合於將靶分子裝載於帶有陽離子交換基質的分離單元B上。
[0201]如果分離單元Al和A2具有陽離子交換基質，則結合緩衝劑一般具有的pH在4_7之間和鹽濃度(典型的鹽是磷酸鹽、乙酸鹽、NaCl等)在10 mM _300mM之間。優選結合緩衝劑具有的PH在4.5-6之間和鹽濃度在20 mM-lOOmM之間。洗脫緩衝劑一般具有的pH在7-10之間和鹽濃度(典型的鹽是TRIS、PBS、NaCl)在10 mM-300mM之間。優選洗脫緩衝劑具有的pH在8-9之間和鹽濃度在10 mM-150mM之間。如果例如洗脫緩衝劑具有pH 8.5，則這種適合從分離單元Al和A2的陽離子交換基質中洗脫靶分子的緩衝劑，也適合於將靶分子裝載於帶有陰離子交換基質的分離單元B上。
[0202]如果分離單元Al和A2具有陰離子交換基質，所述結合緩衝劑一般具有的pH在7-10之間，具有的鹽濃度(典型的鹽為TRIS、PBS、NaCl)在10mM-300mM之間。優選結合緩衝劑具有的PH在7.5-9.5之間，具有的鹽濃度在10mM-300mM之間。洗脫緩衝劑一般具有的pH在4-7之間，具有的鹽濃度(典型的鹽為PBS、乙酸鹽、NaCl等)在IOmM -1OOmM之間。優選洗脫緩衝劑具有的PH在4.5-6.5之間，具有的鹽濃度在IOmM-1OOmM之間。如果例如洗脫緩衝劑具有PH 5.5，那麼適合於從分離單元Al和A2的陰離子交換基質中洗脫靶分子的這種緩衝劑也適合於將所述靶分子裝載於帶有陽離子交換基質的分離單元B上。
[0203]在一優選的實施方案中，經曆本發明方法的樣品為澄清的樣品。這意味著在將樣品裝載於分離單元Al或A2上之前要進行澄清步驟。
[0204]所述澄清步驟旨在將一或多種可溶性和/或不溶性雜質與靶分子分離。例如，從所述樣品中移除不溶性雜質，如細胞和細胞碎片，產生在溶液中包含靶細胞和其它可溶性雜質的澄清流體。澄清步驟可包含一或多種下列單獨或者任何組合的步驟:離心、靜置和/或過濾，優選切向流過濾或深度過濾。優選所述澄清步驟不包含離心，而僅包含過濾和/或靜置。在一優選的實施方案中，過濾為深度過濾。
[0205]在某些實施方案中，深度過濾用於除去一或多種不溶性雜質。深度濾器是使用多孔過濾介質使得顆粒保留在整個介質中，而非僅僅保留在介質的表面之上的濾器。常用類別的這種深度濾器是那些包含纖維結合(或者固定)的無規基質的濾器，所述纖維結合(或者固定)形成流道的複雜、彎曲的迷宮。這些濾器中的顆粒分離一般由通過纖維基質的截留或吸附至纖維基質上所引起。細胞培養肉湯和其它原料的生物工藝所最常用的深度濾器介質通常由纖維素纖維、助濾劑如DE (硅藻土)，以及帶正電荷的樹脂粘合劑組成。
[0206]已發現如果所述多孔深度濾器為各向異性的，則可取得初步除去微粒性雜質的特別好的結果。在某些實施方案中，孔具有的標稱孔徑額定值〉約25 μπι。在某些實施方案中，深度濾器包含至少2個無紡布纖維的遞變層(graded layer)，其中所述遞變層具有約0.3 cm -約3 cm的總厚度。
[0207]在某些實施方案中，深度濾器包含無紡布纖維、纖維素和硅藻土的遞變層的複合物。無紡布纖維包含聚丙烯、聚乙烯、聚酯、尼龍或其混合物。
[0208]示例性的深度濾器可在美國臨時專利申請N0.61/571994中發現，其通過引用結合到本發明中。
[0209]在某些實施方案中，離心和/或切向流過濾步驟可在深度過濾步驟之前進行。或者，可進行深度過濾步驟，而無需離心和/或切向流過濾步驟。
[0210]在一實施方案中，在通過離心和/或過濾和/或靜置來澄清之前，將樣品用沉澱組合物預處理以從樣品中沉澱和除去不要的汙染物。所述沉澱組合物至少包含沉澱劑，其能從樣品中沉澱出汙染物，如HCP、DNA、激素等。沉澱劑引起化合物從水性和/或可溶性狀態沉澱為非水性和/或不可溶狀態，或者從溶液中聚集和凝集細顆粒，導致它們從液相中沉降和溶液濁度的降低。
[0211]適合的沉澱劑的實例是有機酸(例如辛酸)、無機酸(例如HCl)、顯著降低pH至酸性的其它酸性劑、鹽(例如苯甲酸鈉、膽酸鈉(sodium chalate)、脫氧膽酸鈉等)、其它一價鹽或者在酸性介質中沉澱的有機酸。沉澱劑的另一實例是短鏈脂肪酸，如辛酸。在溫和酸性條件下，加入諸如辛酸的短鏈脂肪酸一般使非IgG蛋白質沉澱，而IgG不沉澱。
[0212]其它適合的沉澱劑是聚合電解質聚合物(參見例如國際PCT專利申請N0.W02008/091740，通過引用結合到本發明中)。
[0213]在一優選的實施方案中，用刺激響應性聚合物來沉澱一或多種雜質。這些刺激響應性聚合物的實例可見於美國公開N0.，20080255027, 20090036651, 20090232737和20110020327中，通過引用結合到本發明中。刺激響應性聚合物在某一組工藝條件如pH、溫度和/或鹽濃度下，基本可溶於基於水性的溶劑中，而在一或多個這類條件變化時變為不溶性，隨後沉澱出來。示例性的刺激響應性聚合物包括但不限於聚烯丙胺、用苄基改性的聚烯丙胺或者聚乙烯胺和用苄基改性的聚乙烯胺，其中所述刺激是磷酸鹽或檸檬酸鹽。
[0214]所述沉澱組合物還可包含清潔劑(Triton X-100、triton X-114、NP-40、Tween-20、OTD, SDS, CHAPS 和 / 或聚乙二醇(PEG) (PEG-1000, PEG 10000)和 / 或聚乙烯醇和/或聚合電解質。
[0215]然後，通過在將樣品裝載於分離單元之前澄清，將沉澱的汙染物從樣品中除去。
[0216]在一優選的實施方案中，沉澱後接著進行深層過濾，無需離心步驟，得到澄清的樣品O
[0217]在一優選的實施方案中，樣品的澄清可在與本發明方法色譜純化進行的至少部分持續時間內同時進行。換言之，包含靶分子的液體樣品澄清後並不儲存於蓄樣槽中等待所有的樣品體積澄清，而是，澄清的樣品一由所述澄清過程生成，就連續用作用於本發明方法的樣品溶液並裝載於分離單元Al或A2上。
[0218]因此，當使用澄清的樣品溶液時，本發明方法也無需使用能夠儲存整個樣品溶液體積的蓄樣槽。優選不使用蓄樣槽，或者僅使用可儲存總樣品溶液體積的少於25%，優選少於10%的蓄樣槽。
[0219]在某些實施方案中，在分離單元B上進行第二次色譜步驟之後，可進行一或多次附加的流通純化步驟。為此，可將分離單元B的出口與一或多個附加的分離單元流體連接。可將一或多個閥置於分離單元B的出口和第一附加分離單元的入口之間和/或置於任選的後續附加分離單元(一般串聯連接)之間的連接線之中，以確保在線稀釋和/或緩衝劑更換的可能性。所述附加流通設備的基質一般選自:
-活性炭 -陽離子交換 -混合模式 -體積排阻 -陰離子交換。
[0220]可使根據本發明方法得到的純化的靶分子進一步經歷附加工藝步驟如配製/滅菌/濃縮步驟，其中將含有靶分子的溶液滅菌並配製成以所需濃度在所需緩衝劑中的製劑。
[0221]下面列舉本發明方法的進一步的實施方案:
在包含CIEX捕獲和AIEX精純的示例性程序中，本發明的方法通過下列步驟實施:a)將樣品通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元Al (例如陽離子交換物質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al(例如陽離子交換介質)上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離單元A2 (例如陽離子交換物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元Al的步驟，其中當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所稱的衝洗、再平衡步驟，當分離單元A2與分離單元B (例如陰離子交換介質)直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗、用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡的步驟，當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0222]b)將樣品通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元Al (例如陽離子交換物質)上，其中所述組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合於分離單元Al至高的結合靶分子量而無合理損失，同時將分離單元Al與分離單元A2直接連接，使得能夠捕獲從分離單元Al中開始過濾的靶分子並結合至分離單元A2上，其中分離單元A2與出口 A2-W連接以排出未結合的分子，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接用於例如分離單元B的再平衡，同時分離單元B與出口 B-W連接。
[0223]c)將所述組合物通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質)上，其中所述組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如陽離子交換介質)上並且未結合的分子通過出口 B被排出，同時分離單元Al (例如陽離子交換物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元Al的步驟，其中當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所稱的衝洗、再平衡的步驟，而當分離單元Al與分離單元B (例如陰離子交換介質)直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗、用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡的步驟，其中當分離單元B和出口B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。[0224]d)將所述組合物通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質)上，其中所述組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合於分離單元A2至高的結合靶分子量而無合理損失，同時將分離單元A2與分離單元Al直接連接，使得能夠捕獲從分離單元A2中開始浙濾的靶分子並結合至Al上，其中分離單元Al與出口 Al-W連接以排出未結合的分子，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於例如分離單元B的再平衡步驟，同時分離單元B與出口 B-W連接，用第三種緩衝劑在線稀釋洗脫抗體溶液，以將洗脫抗體結合在陰離子交換物質上；
優選步驟a) - d)循序進行，這意味著它們以相同的次序進行2次以上。
[0225]在一實施方案中，所述方法包含CIEX捕獲、高通量和AIEX精純。在包含CIEX捕獲、高通量和AIEX精純的示例性程序中，本發明的方法通過下列步驟實施:
a)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離柱Al (例如陽離子交換物質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離柱A2 (例如陽離子交換物質)與入口 A(例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 PH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，當分離單元A2與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，接著用緩衝劑B衝洗、用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0226]b)當柱Al上的裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱A2，且未結合的分子通過出口 A2-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0227]c)當分離單元Al的裝載完成時，來自分離單元Al的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元Al用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元A2連接。檢測到來自分離單元Al的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱Al出口切換到出口位置Al-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元A2上，而未結合的分離通過出口 A2-W被排出。
[0228]d)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如陽離子交換介質)上而未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al(例如陽離子交換物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元A。當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，當分離單元Al與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗、用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0229]e)當柱A2上的裝載接近於完成時，通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱Al，且未結合的分子通過出口 Al-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0230]f)當分離單元A2的裝載完成時，來自分離單元A2的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元A2用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元Al連接。檢測到來自分離單元A2的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱A2出口切換到出口位置A2-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元Al上，而未結合的分離通過出口 Al-W被排出。
[0231]優選步驟a) - f)循序進行，這意味著它們以相同的次序進行2次以上。
[0232]在一實施方案中，所述方法包括CIEX捕獲、病毒滅活和AIEX精純(結合&洗脫或流通)。
[0233]在包含CIEX捕獲、病毒滅活和AIEX精純的示例性程序中，本發明的方法通過下列步驟實施:
a)將所述組合物通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元Al (例如陽離子交換物質)上，其中組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al (例如陽離子交換介質)上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離單元A2 (例如陽離子交換物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑C進行病毒滅活，用第三pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元A2的步驟，其中當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所稱的衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，而當分離單元A2與分離單元B (例如陰離子交換介質)直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗、用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡的步驟，其中當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0234]b)將所述組合物通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質)上，其中組合物在第一PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如陽離子交換介質)上，而未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al (例如陽離子交換物質)與入口 B(例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑C進行病毒滅活，用第三pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元Al的步驟，其中當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所稱的衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，而當分離單元Al與分離單元B (例如陰離子交換介質)直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗、用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡的步驟，其中當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0235]優選步驟a) - b)循序進行，這意味著它們以相同的次序進行2次以上。
[0236]在一實施方案中，所述方法包含CIEX捕獲、高通量、病毒滅活和AIEX精純。在包含CIEX捕獲、高通量、病毒滅活和AIEX精純的示例性程序中，本發明的方法通過下列步驟實施:
a)將所述樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離柱Al (例如陽離子交換物質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離單元A2 (例如陽離子交換物質)與入口 A (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用病毒滅活緩衝劑進行病毒滅活，用第二 PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所述衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，而當分離單元A2與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，接著用緩衝劑B衝洗、用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0237]b)當柱Al上的裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱A2，且未結合的分子通過出口 A2-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0238]c)當分離單元Al的裝載完成時，來自分離單元Al的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元Al用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元A2連接。檢測到來自分離單元Al的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱Al出口切換到出口位置Al-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元A2上，而未結合的分子通過出口 A2-W被排出。
[0239]d)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陽離子交換物質)上，其中組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如陽離子交換介質)上而未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al (例如陽離子交換物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用病毒滅活緩衝劑進行病毒滅活步驟，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱Al。當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所述衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，而當分離單元Al與分離單元B (例如陰離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗、用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。[0240]e)當柱A2上裝載接近於完成時，通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱Al，且未結合的分子通過出口 Al-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0241]f)當分離單元A2的裝載完成時，來自分離單元A2的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元A2用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元Al連接。檢測到來自分離單元A2的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱A2出口切換到出口位置A2-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元Al上，而未結合的分子通過出口 Al-W被排出。
[0242]優選步驟a) - f)循序進行，這意味著它們以相同的次序進行2次以上。
[0243]在一實施方案中，所述方法包含ProtA捕獲、CIEX精純(結合&洗脫)和病毒滅活。在包含ProtA捕獲、CIEX精純(結合&洗脫)和病毒滅活的示例性程序中，本發明的方法通過進行下列步驟實施:
a)將所述組合物通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元Al (例如ProtA柱親和性基質)上，其中組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離單元A2 (例如ProtA物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元Al的步驟，其中當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所稱的衝洗、再平衡步驟，而當分離單元A2與分離單元B (例如陽離子交換介質)直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗、用緩衝劑C病毒滅活和用緩衝劑A洗脫靶分子及用緩衝劑B再平衡的步驟，其中當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0244]b)將所述組合物通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元Al上，其中所述組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合分離單元Al至高的結合靶分子量而無合理損失，同時分離單元Al與分離單元A2直接連接，使得能夠捕獲從分離單元Al中開始浙濾的靶分子並結合至分離單元A2上，其中分離單元A2與出口 A2-W連接以排出未結合的分子，而分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接用於例如分離單元B的再平衡，同時分離單元B與出口 B-W連接。
[0245]c)將所述組合物通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如ProtA物質)上，其中所述組合物處於第一 pH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如ProtA介質)上並且未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al (例如親和性物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離單元Al的步驟，其中當分離單元Al與出口 A連接時，進行所稱的衝洗和再平衡的步驟，而當分離單元Al與分離單元B (例如陽離子交換介質)直接連接時，進行所稱的洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗、用在第三PH下的緩衝劑C病毒滅活，用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡的步驟，其中當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0246]d)將所述組合物通過入口 A (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如親和性物質)上，其中所述組合物處於第一PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合分離單元A2至高的結合靶分子量而無合理損失，同時分離單元A2與分離單元Al直接連接，使得能夠捕獲從分離單元A2中開始浙濾的靶分子並結合至Al上，其中分離單元Al與出口Al-W連接以排出未結合的分子，而分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接用於例如分尚單兀B的再平衡，同時分尚單兀B與出口 B-W連接。
[0247]優選步驟a) - d)循序進行，這意味著它們以相同的次序進行2次以上。
[0248]在一實施方案中，所述方法包含ProtA捕獲、高通量和CIEX精純。在一包含ProtA捕獲、高通量和CIEX精純的示例性程序中，本發明的方法通過下列步驟實施:
a)將所述樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離柱Al (例如ProtA柱親和性基質)上，其中樣品處於第一PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離柱A2 (例如ProtA親和性基質)與入口 A (例如溶劑遞送系統)連接，用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用病毒滅活緩衝劑進行病毒滅活步驟，用第二 PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所述衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，而當分離單元A2與分離單元B (例如陽離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，接著用緩衝劑B衝洗、用緩衝劑A洗脫靶分子及用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0249]b)當柱Al上裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱A2上，且未結合的分子通過出口 A2-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0250]c)當分離單元Al的裝載完成時，來自分離單元Al的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元Al用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元A2連接。檢測到來自分離單元Al的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱Al出口切換到出口位置Al-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元A2上，而未結合的分子通過出口 A2-W被排出。
[0251]d)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如ProtA親和性基質)上，其中所述組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如ProtA親和性基質)上而未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al (例如ProtA親和性基質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一PH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用病毒滅活緩衝劑進行病毒滅活步驟，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所述衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，而當分離單元Al與分離單元B (例如陽離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗、用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗和再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0252]e)當柱A2上的裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱Al，且未結合的分子通過出口 Al-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0253]f)當分離單元A2的裝載完成時，分離單元A2的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元A2用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元Al連接。檢測到來自分離單元A2的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱A2出口切換到出口位置A2-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元Al上，而未結合的分子通過出口 Al-W被排出。
[0254]優選步驟a) - f)循序進行，這意味著它們以相同的次序進行2次以上。
[0255]在一實施方案中，所述方法包含以結合-洗脫模式ProtA捕獲、高通量和以流通模式的混合模式精純。在一包含ProtA捕獲、高通量和混合模式精純的示例性程序中，本發明的方法通過下列步驟實施:
a)將所述樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離柱Al (例如ProtA親和性基質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離柱A2 (例如ProtA親和性基質)與入口 A (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用病毒滅活緩衝劑進行病毒滅活步驟，用第二 PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與出口 A2-W連接時，進行所述衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，而當分離單元A2與分離單元B (例如混合模式介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B弱結合或不結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，接著用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行再平衡步驟，當分離單元B與出口 B-P連接時，進行進料步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0256]b)當柱Al上裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱A2上，且未結合的分子通過出口 A2-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0257]c)當分離單元Al的裝載完成時，來自分離單元Al的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元Al用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元A2連接。檢測到來自分離單元Al的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱Al出口切換到出口位置Al-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元A2上，而未結合的分子通過出口 A2-W被排出。
[0258]d)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如ProtA親和性基質)上，其中所述組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如ProtA親和性基質)上而未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al (例如ProtA親和性基質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一PH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用病毒滅活緩衝劑進行病毒滅活步驟，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元Al與出口 Al-W連接時，進行所述衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，當分離單元Al與分離單元B (例如陽離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B弱結合或不結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，接著用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行再平衡步驟，而當分離單元B與出口 B-P連接時，進行進料步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0259]e)當柱A2上裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱Al，且未結合的分子通過出口 Al-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0260]f)當分離單元A2的裝載完成時，來自分離單元A2的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元A2用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元Al連接。檢測到來自分離單元A2的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱A2出口切換到出口位置A2-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元Al上，而未結合的分子通過出口 Al-W被排出。
[0261]優選步驟a) - f)循序進行，這意味著它們以相同的次序進行2次以上。
[0262]在一實施方案中，所述方法包含AIEX捕獲、高通量、CIEX精純(結合&洗脫)和病毒滅活。在一包含AIEX捕獲、高通量、CIEX精純(結合&洗脫)和病毒滅活的示例性程序中，本發明的方法通過下列步驟實施:
a)將所述樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離柱Al (例如陰離子交換物質)上，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上而未結合的分子通過出口 Al-W被排出，同時分離柱A2 (例如陰離子交換物質)與入口 A (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二PH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與出口A2-W連接時，進行所述衝洗和再平衡步驟，當分離單元A2與分離單元B (例如陽離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行洗脫步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C (例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元A2中進料靶分子，接著用緩衝劑B衝洗、用病毒滅活緩衝劑進行病毒滅活步驟，用緩衝劑A洗脫靶分子及用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0263]b)當柱Al上裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 pH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元Al上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱A2上，且未結合的分子通過出口 A2-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0264]c)當分離單元Al的裝載完成時，來自分離單元Al的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元Al用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元A2連接。檢測到來自分離單元Al的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱Al出口切換到出口位置Al-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元A2上，而未結合的分子通過出口 A2-W被排出。
[0265]d)將樣品通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進料到分離單元A2 (例如陰離子交換物質)上，其中所述組合物處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2 (例如陰離子交換物質)上而未結合的分子通過出口 A2-W被排出，同時分離單元Al (例如陰離子交換物質)與入口 B (例如溶劑遞送系統)連接，用於用第一 pH下緩衝劑A衝洗所述結合的靶分子，用第二 pH下緩衝劑B洗脫結合的靶分子和用緩衝劑A再平衡分離柱A2。當分離單元A2與分離單元B (例如陽離子交換介質)通過連接線C-P直接連接時，進行衝洗和再平衡步驟以將靶分子轉移到分離單元B，同時分離單元B與入口 C(例如溶劑遞送系統)連接，用於在能使靶分子與分離單元B結合的條件下從分離單元Al中進料靶分子，用緩衝劑B衝洗、用病毒滅活緩衝劑進行病毒滅活步驟，用緩衝劑A洗脫靶分子和用緩衝劑B再平衡。當分離單元B和出口 B-W連接時，進行進料、衝洗、病毒滅活和再平衡步驟，當分離單元B與出口 B-P連接時，進行洗脫步驟，排出純化的靶分子(例如抗體)。
[0266]e)當柱A2上裝載接近於完成時，它通過入口 B (例如溶劑遞送系統)進一步裝載，其中樣品處於第一 PH和電導率下，其能使靶分子(例如抗體)結合到分離單元A2上，而未結合的靶分子直接通過連接線F-F被轉移至柱Al，且未結合的分子通過出口 Al-W被排出。同時柱B與入口 C連接進行再平衡。
[0267]f)當分離單元A2的裝載完成時，來自分離單元A2的未結合靶分子採用入口 A衝洗，同時分離單元A2用連接線W-F與通過入口 B裝載的分離單元Al連接。檢測到來自分離單元A2的靶分子過少時，立即中斷連接，並將柱A2出口切換到出口位置A2-W以排出未結合的分子，同時靶分子被進一步裝載在分離單元Al上，而未結合的分子通過出口 Al-W被排出。
[0268]優選步驟a) - f)循序進行，這意味著它們以相同的次序進行2次以上。
[0269]本發明的設備和方法首次提供了純化靶分子(如抗體)的省時兩步色譜程序的可能性。如果需要獨特的選擇性，則採用例如親和性捕獲和陽離子交換精純進行該程序，並且如果要避免親和性吸附劑，則通過以採用陽離子捕獲和陰離子精純或者陰離子捕獲和陽離子精純的離子交換色譜更換親和色譜步驟(Prot A)，來進行所述純化過程。這具有較長樹脂使用時間、原位清洗、樹脂廉價的優點，並可適用於多種生物藥物化合物。
[0270]本發明通過柱上病毒滅活的純化過程最優化能夠縮短處理時間。經常可將處理時間降低至一半或更少的時間。
[0271]上文摘引的所有申請、專利和出版物的全部公開內容以及2011年10月4日提交的對應EP申請EP 11008021.5和2012年6月29日提交的對應的美國臨時申請61/666，338 的全部內容均通過弓I用結合到本發明中。
實施例
[0272]下列實施例代表本發明的實際應用。
[0273]1.將單克隆抗體細胞培養溶液，其具有佔該溶液中所有成分17%的分數的0.9 mg/ml單克隆抗體(根據分析性SEC測得)，其中HCP的量為600000 ng/mg抗體(根據免疫酶分析SP 2/0測得)，在下列條件下，以第一種模式(類似於柱Al和A2)在Eshmuno? S樹脂上和以第二種模式(類似於柱B)在Capto? Adhere上純化。色譜條件:第一種模式_將33.5ml Eshmuno? S樹脂填裝於16 x 150 mm柱內；然後將柱用pH 4.5的包含20mM NaCl的25 mM憐酸鹽緩衝劑以30 ml/min (1000cm/hr)平衡。第二種模式-將33.5 ml Capto?Adhere樹脂填裝於16 x 150 mm柱內；然後將柱用pH 9的包含20mM NaCl的50 mM TRIS緩衝劑以15 ml/min (500cm/hr)平衡。樣品製備:將單克隆細胞培養溶液用水1:2稀釋，加入0.5%辛酸，同時攪拌10分鐘。將形成的沉澱再靜置20分鐘。將得到的溶液通過0.45Mm濾器過濾，然後滴定至pH 5.5,電導率約為6 mS/cm。將3000 ml樣品裝載於Eshmuno? S柱上，接著將柱用PH 4.6的25 mM乙酸鹽衝洗。然後將柱用pH 6.3的25 mM磷酸鹽衝洗。之後將流速降低至300 cm/hr (10 ml/min)，將抗體用10個柱體積以至50mM TRIS, 20mMNaCl, pH?7.5 (電導率約3.3 mS/cm)的線性梯度洗脫至Capto? Adhere柱上。使用用50mM TRIS緩衝劑的在線稀釋，將洗脫溶液的pH值增加至8.5。然後將Capto? Adhere柱用pH 8.5的50mM TRIS緩衝劑衝洗，並將抗體用10個柱體積以至10 mM檸檬酸、10 mM磷酸鹽和20mM NaCl, pH 3.5的線性梯度洗脫。洗脫的級分含有3.2 mg/ml抗體，其佔所有成分的99.9% (根據分析性SEC測得)，其中HCP的量為33 ng/mg抗體(根據免疫酶分析SP 2/0測得)。洗脫後，將兩個柱先後用IM NaCl和I M NaOH解吸(strip)。
[0274]2.陽離子捕獲+陰離子流通
將單克隆抗體細胞培養溶液，其具有佔該溶液中所有成分17%的分數的0.9 mg/ml單克隆抗體(根據分析性SEC測得)，其中HCP的量為600000 ng/mg抗體(根據免疫酶分析SP 2/0測得)，在下列條件下，以第一種模式(類似於柱Al和A2)在Eshmuno? S樹脂上和以第二種模式(類似於柱B)在Fractogel? TMAE (M)上純化。色譜條件:第一種模式_將33.5 ml Eshmuno? S樹脂填裝於16 x 150 mm柱內；然後將柱用pH 4.5的包含20mMNaCl的25 mM磷酸鹽緩衝劑以30 ml/min (1000cm/hr)平衡。第二種模式_將33.5 mlFractogel? TMAE (M)樹脂填裝於16 x 150 mm柱內；然後將柱用pH 8.6的包含20禮NaCl的50 mM TRIS緩衝劑以15 ml/min (500cm/hr)平衡。樣品製備:將單克隆細胞培養溶液用水1:2稀釋，加入0.5%辛酸，同時攪拌10分鐘。將形成的沉澱再靜置20分鐘。將得到的溶液通過0.45 Mm濾器過濾，然後滴定至pH 5.5，電導率約為6 mS/cm。將3000 ml樣品裝載於Eshmuno? S柱上，接著將柱用pH 4.6的25 mM乙酸鹽衝洗。然後將柱用pH 6.3的25 mM磷酸鹽衝洗。之後將流速降低至300 cm/hr (10 ml/min),將抗體用10個柱體積用 IOOmM TRIS, 20mM NaCl, pH ?8.5 (電導率約 4.6mS/cm)洗脫至 Fractogel? TMAE(M)柱上。使用用IOOmM TRIS緩衝劑的在線稀釋，將洗脫溶液的pH值保持至8.6。然後將Fractogel? TMAE (M)柱用pH 8.5的50mM TRIS緩衝劑衝洗，並將剩餘的抗體用2個柱體積衝洗掉。流通的級分含有2.8mg/ml抗體，其佔所有成分的99.9% (根據分析性SEC測得)，其中HCP的量為30 ng/mg抗體(根據免疫酶分析SP 2/0測得)。洗脫Eshmuno? S和衝洗Fractogel? TMAE (M)柱後，將兩個柱先後用IM NaCl和I M NaOH解吸。
[0275]3.ProtA捕獲+陽離子精純
將單克隆抗體細胞培養溶液，其具有佔該溶液中所有成分17%的分數的0.9 mg/ml單克隆抗體(根據分析性SEC測得)，其中HCP的量為600000 ng/mg抗體(根據免疫酶分析SP 2/0測得)，在下列條件下，以第一種模式(類似於柱Al和A2)在Prosep? Ultra Plus樹脂上和以第二種模式(類似於柱B)在Eshmuno? S上純化。色譜條件:第一種模式_將33.5 ml Prosep Ultra? Plus樹脂填裝於16 x 150 mm柱內；然後將柱用pH 7.2的包含20mM NaCl的25 mM磷酸鹽緩衝劑以30 ml/min (1000cm/hr)平衡。第二種模式_將33.5 ml Eshmuno? S樹脂填裝於16 x 150 mm柱內；然後將柱用pH 4.0的包含20mM NaCl的10 mM甘氨酸緩衝劑以30 ml/min (1000cm/hr)平衡。樣品製備:將單克隆細胞培養溶液通過0.45 Mm濾器過濾，然後滴定至pH 7.2，電導率約為16 mS/cm。將1500 ml樣品裝載於Pros^)? Ultra Plus柱上，接著將柱用pH 7.2的包含20mM NaCl的25 mM磷酸鹽緩衝劑衝洗。然後將流速降低至300 cm/hr (10 ml/min)，將抗體用10個柱體積用pH~5.0的包含20mM NaCl的1OOmM甘氨酸緩衝劑(電導率約3.6mS/cm)洗脫至Eshmuno? S柱上。使用用IOmM甘氨酸緩衝劑的在線稀釋，將洗脫溶液的pH值保持至飛.5。然後將Eshmuno?S柱用pH 4.0的1OmM甘氨酸緩衝劑衝洗，並將抗體用10個柱體積以至pH 7.2的包含20mMNaCl的25 mM磷酸鹽緩衝劑的線性梯度洗脫。洗脫的級分含有4.5 mg/ml抗體，其佔所有成分的99.9% (根據分析性SEC測得)，其中HCP的量為40 ng/mg抗體(根據免疫酶分析SP 2/0測得)。洗脫後，將Pros印Ultra Plus柱用0.15M H3PO4解吸，Eshmuno? S柱先後用 IM NaCl 和 I M NaOH 解吸。
[0276]4.ProtA捕獲+混合離子交換流通
將單克隆抗體細胞培養溶液，其具有佔該溶液中所有成分10%的分數的1.25 mg/ml單克隆抗體(根據分析性SEC測得)，其中HCP的量為250000 ng/mg抗體(根據免疫酶分析CHO測得)，在下列條件下，以第一種模式(類似於柱Al和A2)在ProSep?-vA高容量樹脂上和以第二種模式(類似於柱B)在Eshmuno? S和Fractogel? TMAE Hicap上純化。色譜條件:第一種模式-將17.3 ml Prosep?-vA高容量樹脂填裝於16 x 8.6 mm柱內；然後將柱用 pH 7.0 的包含 20mM NaCl 的 25 mM TRIS 緩衝劑以 30 ml/min (1000cm/hr)平衡。第二種模式_將16.75 ml Eshmuno? S樹脂填裝於16 x 75 mm柱內，並將16.75 mlFractogel? TMAE Hicap樹脂填裝於16 x 75 mm柱內，將兩根柱組合在一個分離單元中；然後將該分離單元用pH 7.4的包含20mM NaCl的25 mM TRIS緩衝劑以30 ml/min (1000cm/hr)平衡。樣品製備:將單克隆細胞培養溶液通過具有0.8 Mm和0.2 Mm孔的深度濾器過濾，然後滴定至pH 7.2,電導率約為18 mS/cm ο將220 ml樣品裝載於Prosep?_vA高容量柱上，接著將柱用PH 7.2的包含500mM NaCl的25 mM TRIS緩衝劑衝洗。然後將流速降低至300 cm/hr (10 ml/min)，將抗體用10個柱體積用pH~4.0的包含20mM NaCl的IOmM甘氨酸緩衝劑(電導率約3.6mS/cm)洗脫至Eshmuno? S/ Fractogel? TMAE Hicap柱上。使用用IOOmM TRIS緩衝劑的在線稀釋，將洗脫溶液的pH值保持至1.4。流通的級分含有5.67 mg/ml抗體，其佔所有成分的99.9% (根據分析性SEC測得)，其中HCP的量為〈50 ng/mg抗體(根據免疫酶分析CHO測得)。洗脫後，將Proi^p?-VA高容量柱用0.15M H3PO4解吸，Eshmuno? S/ Fractogel? TMAE Hicap 柱先後用 IM NaCl 和 I M NaOH 解吸。
[0277]5.ProtA捕獲+混合模式流通
將單克隆抗體細胞培養溶液，其具有佔該溶液中所有成分10%的分數的1.25 mg/ml單克隆抗體(根據分析性SEC測得)，其中HCP的量為250000 ng/mg抗體(根據免疫酶分析CHO測得)，在下列條件下，以第一種模式(類似於柱Al和A2)在ProSep?-vA高容量樹脂上和以第二種模式(類似於柱B)在Eshmuno? S和Fractogel? TMAE Hicap上純化。色譜條件:第一種模式-將17.3 ml Prosep?-vA高容量樹脂填裝於16 x 8.6 mm柱內；然後將柱用 pH 7.0 的包含 20mM NaCl 的 25 mM TRIS 緩衝劑以 30 ml/min (1000cm/hr)平衡。第二種模式-將16.75 ml Capto? Adhere樹脂填裝於16 x 75 mm柱內，並將16.75 mlCapto? MMC樹脂填裝於16 x 75 mm柱內，將兩根柱組合在一個分離單元中；然後將該分離單元用 pH 7.4 的包含 50mM NaCl 的 25 mM TRIS 緩衝劑以 30 ml/min (1000 cm/hr)平衡。樣品製備:將單克隆細胞培養溶液通過具有0.8 Mm和0.2 Mffl孔的深度濾器過濾，然後滴定至pH 7.2，電導率約為18 mS/cm。將220 ml樣品裝載於Pros^)?-vA高容量柱上，接著將柱用pH 7.2的包含500mM NaCl的25 mM TRIS緩衝劑衝洗。然後將流速降低至300 cm/hr (10 ml/min),將抗體用10個柱體積用pH~4.0的包含50mM NaCl的50mM甘氨酸緩衝劑(電導率約7.6mS/cm)洗脫至Capto? Adhere/Capto? MMC柱上。使用用IOOmM TRIS緩衝劑的在線稀釋，將洗脫溶液的PH值保持至1.2。流通的級分含有6.15 mg/ml抗體，其佔所有成分的99.9% (根據分析性SEC測得)，其中HCP的量為〈30 ng/mg抗體(根據免疫酶分析CHO測得)。洗脫後，將Pros^)?-vA高容量柱用0.15M H3PO4解吸，Capto? Adhere/Capto? MMC 柱先後用 IM NaCl 和 I M NaOH 解吸。
【權利要求】
1.一種設備，其包含 -兩個分離單元Al和A2以及分離單元B，分離單元Al和A2兩者具有相同的色譜基質，分離單元B具有不同於分離單元Al和A2的色譜基質的色譜基質，所有的分離單元都具有流體入口和流體出口，由此，至少在分離單元Al的流體出口與分離單元B的流體入口之間有流體連接和在分離單元A2的流體出口與分離單元B的流體入口之間有流體連接， -在分離單元Al和A2與分離單元B之間的流體連接中的至少一個閥，其允許在分離單元Al的出口與分離單元B的流體入口之間的流體連通以及分離單元A2的出口與分離單元B的流體入口之間的流體連通之間切換， -至少兩個緩衝劑儲液器和至少兩個泵， -包含樣品溶液的儲液器，其與分離單元Al和A2的入口流體連接。
2.權利要求1的設備，其特徵在於分離單元Al和A2具有親和色譜基質、陽離子交換色譜基質、混合模式陽離子交換色譜基質或陰離子交換色譜基質。
3.權利要求1或2的設備，其特徵在於分離單元B具有陽離子交換色譜基質、混合模式陰離子交換色譜基質或陰離子交換色譜基質。
4.權利要求1-3中一或多項的設備，其特徵在於分離單元Al和A2具有親和色譜基質，分離單元B具有陽離子交換色譜基質、混合模式陽離子交換色譜基質或陰離子交換色譜基質。
5.權利要求1-3中一 或多項的設備，其特徵在於分離單元Al和A2具有陽離子交換色譜基質或混合模式陽離子交換色譜基質，分離單元B具有陰離子交換色譜基質或混合模式陰離子交換色譜基質。
6.權利要求1-5中一或多項的設備，其特徵在於該設備還包含在分離單元Al的流體出口與分離單元A2的流體入口之間的連接線，和在分離單元A2的流體出口與分離單元Al的流體入口之間的連接線。
7.權利要求1-6中一或多項的設備，其特徵在於該設備包含在分離單元Al和A2的出口與分離單元B的流體入口之間的連接線中的流體入口。
8.權利要求1-7中一或多項的設備，其特徵在於該設備包含具有病毒滅活緩衝劑的附加的儲液器，其至少與三個分離單元中一個的入口流體連接。
9.權利要求1-8中一或多項的設備，其特徵在於該設備包含具有用於原位清洗的緩衝劑的至少一個附加的儲液器，其至少與三個分離單元中一個的入口流體連接。
10.一種採用權利要求1-9中一或多項的設備從樣品中的一或多種雜質純化靶分子的方法，該方法包括以下步驟: -交替將樣品裝載於分離單元Al和A2上，使得當樣品裝載於其中樣品處於能使靶分子與分離單元Al結合的第一 pH和電導率下的分離單元Al上時，分離單元A2在至少部分該時間內與分離單元B流體連通，使得裝載於分離單元A2上的靶分子被洗脫至分離單元B上，且分離單元A2再平衡，並且當樣品裝載於其中樣品處於能使靶分子與分離單元A2結合的第一 pH和電導率下的分離單元A2上時，分離單元Al在至少部分該時間內與分離單元B流體連通，使得裝載於分離單元Al上的靶分子被洗脫至分離單元B上，且分離單元Al再平衡， -從分離單元B的流體出口中回收所述靶分子。
11.權利要求10的方法，其特徵在於所述靶分子是抗體。
12.權利要求10-11中一或多項的方法，其特徵在於當將樣品裝載於分離單元Al上時，分離單元Al的流體出口在至少部分該時間內與分離單元A2的流體入口流體連通,使得能夠將開始浙濾的靶分子從分離柱Al中捕獲以結合至分離柱A2上，並且當將樣品裝載於分離單元A2上時，分離單元A2的流體出口在至少部分該時間內與分離單元Al的流體入口流體連通，使得能夠將開始浙濾的靶分子從分離柱A2中捕獲以結合至分離柱Al上。
13.權利要求10-12中一或多項的方法，其特徵在於，將所述靶分子裝載於分離單元Al之後，將病毒滅活緩衝劑泵送通過分離單元Al，和將所述靶分子裝載於分離單元A2之後，將病毒滅活緩衝劑泵送通過分離單元A2。
14.權利要求10-13中一或多項的方法，其特徵在於，當從分離單元Al中衝洗未結合的樣品時，分離單元A2在至少部分該時間內與包含樣品溶液的儲液器和分離單元Al流體連通，並且當從分 離單元A2中衝洗未結合的樣品時，分離單元Al在至少部分該時間內與包含樣品溶液的儲液器和分離單元A2流體連通。
15.權利要求10-14中一或多項的方法，其特徵在於所述樣品是澄清樣品。
【文檔編號】B01D15/36GK103842045SQ201280049023
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年9月15日 優先權日:2011年10月4日
【發明者】R.斯庫達斯 申請人:默克專利股份公司