從cDNA中回收非節段性負鏈RNA病毒的改進方法

2023-09-22 11:04:00 1

專利名稱：從cDNA中回收非節段性負鏈RNA病毒的改進方法
技術領域：
本發明涉及產生稱為單分子負鏈RNA病毒(Mononegavirales)目的感染性、複製性、非節段性負鏈RNA病毒的改進方法和組合物。該方法和組合物也適用於產生生長或複製缺陷型的這些病毒。
背景技術：
有包膜、非節段性、負義、單鏈RNA病毒組成和表達獨特。負義、單鏈病毒的基因組RNA在核衣殼內容中具有兩種模板功能作為信使RNA(mRNA)的合成模板和作為反義基因組(+)鏈的合成模板。負義、單鏈RNA病毒編碼和包裝它們自己的RNA-依賴性RNA聚合酶。僅當其核衣殼進入受感染細胞的胞質時，才合成信使RNA。病毒複製發生在mRNA合成之後，需要病毒蛋白的連續合成。新合成的反義基因組(+)鏈用作進一步產生(-)鏈基因組RNA拷貝的模板。
RNA-依賴性聚合酶複合物通過在基因組的3』端，具體說，在啟動子區產生順式作用信號而驅動和實現轉錄和複製。然後由基因組模板從3』至5』端單方向地轉錄病毒基因。相對於它們的上遊鄰居(如核蛋白基因(N))來說，下遊基因(如聚合酶基因(L))產生的mRNA較少。因此，諸基因根據相對於基因組3』端的位置，其mRNA豐度呈梯度分布。
對於許多非節段性負鏈RNA病毒來說，沒有任何種類的有效疫苗可用。因此，非常需要開發改進的免疫原性組合物和方法，以抵抗這些人和動物的病原體。
在尋求開發抵抗非節段性負鏈RNA病毒的免疫原性組合物和方法中可使用各種方法，包括使用(1)純化的單個病毒蛋白疫苗(亞單位疫苗)；(2)滅活的全病毒製劑；和(3)減毒活病毒。
亞單位疫苗具有的優良特徵是純、成分明確和用各種方法，包括重組DNA表達方法大量產生相對容易。迄今，明顯地除了B型肝炎表面抗原以外，病毒亞單位疫苗通常僅引發短期和/或不充分的免疫力，尤其是在初次受試者中。
已證明，經福馬林滅活的脊髓灰質炎(IPV)和A型肝炎全病毒製劑是安全和有效的。相反，用類似方法滅活的全病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)和麻疹病毒疫苗免疫會引發不良的免疫應答和/或使疫苗接種者後來遇到天然產生的或「野生型」病毒時易發生過度的或異常的疾病反應。
免疫幼兒的早期嘗試(1966)採用胃腸道外給予福馬林滅活的RSV疫苗。不幸的是，該疫苗的幾次現場試驗顯示有嚴重的副反應，包括後來天然感染RSV後，發生不尋常特徵的嚴重疾病(Kapikian等，Am J Epidemiol.4405-21，1969；Kim等，Am J Epidemiol.4422-34，1969；Collins等，呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytial Virus)「現場病毒學(Field’s Virology)」，第3版。Lippincott-Raven，1443-1475，2001；Collins等，Adv.Virus.Res.，54423-451，1999)。有人提出，此種福馬林處理的RSV抗原引發異常或不平衡的免疫應答，使疫苗接種者易患RSV疾病(Collins等，呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)「現場病毒學(Field’s Virology)」第3版。Lippincott-Raven，1443-1475，2001；Collins等Adv.Virus.Res.，54423-451)。
此後，通過冷傳代或化學誘變產生候選的減毒活RSV疫苗。發現這些RSV株在血清陽性成人中毒力降低。不幸的是，當給予血清陰性的嬰兒時，證明它們是過度減毒或減毒不足的；在一些情況下，也發現它們缺乏遺傳穩定性(Collins等，R，呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)「現場病毒學(Field’s Virology)」第3版。Lippincott-Raven，1443-1475，2001；Collins等，Adv.Virus.Res.，54423-451)。另一採用胃腸道外給予活病毒進行免疫的方法無效，沿此路線進行的努力已停止(Collins等，呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)「現場病毒學(Field’s Virology)」第3版。Lippincott-Raven，1443-1475，2001；Collins等，Adv.Virus.Res.，54423-451)。值得注意的是，這些RSV活疫苗從來不伴有上述福馬林滅活RSV疫苗觀察到的病情加重。目前，沒有批准給予人的RSV疫苗，但是採用各種RSV減毒突變體的臨床試驗正在進行當中。
野生型病毒的適當減毒的活衍生物為用於免疫原性組合物和方法提供了獨特優點。因為是活的複製因子，它們可引發受試者感染，在此期間，病毒基因產物被表達、加工並與免疫接種者的特定的MHC I和II類分子一起提呈。在此方式中，減毒活病毒候選疫苗有效引發體液和細胞介導的免疫應答，以及刺激協同細胞因子和趨化因子，此與天然感染存活者的免疫應答特性類似。
這種有利的免疫應答模式與滅活或亞單位疫苗引發的有界限的應答反應完全不同，後者一般主要限於體液免疫監督臂。而且，一些福馬林滅活的全病毒疫苗，例如，1960年代開發的麻疹和呼吸道合胞病毒疫苗引起的免疫應答特性，不僅不能提供持續保護，而且實際上當疫苗接種者後來遇到野生型病毒時，導致易於發生異常、過度、甚至致命的疾病。
雖然對用於免疫原性組合物和方法來說，減毒活病毒具有所需特徵，但證明產生和評價它們很困難。困難的癥結在於需要分離得到失去致病潛力(即毒力)，但仍保留足夠的複製能力能感染接受者並引發足量所需免疫應答的野生型病毒衍生物。
歷史上，曾在改變的生長條件(如溫度)下，通過不同宿主組織或細胞連續傳代野生型病毒分離物實現毒力和減毒之間的這種微妙平衡。該方法推測有利於病毒變體(突變體)的生長，其中有些病毒具有令人鼓舞的減毒特徵。偶爾也可通過化學誘變達到進一步減毒。
這種增殖/傳代方案一般導致出現溫度敏感型(ts)、冷適應型(ca)和/或宿主範圍(hr)改變的病毒衍生物—其中一個或全部由野生型、致病病毒變化而來—即可能發生與減毒相關的改變。
此方法已產生了幾種病毒活疫苗，包括預防麻疹和腮腺炎(副粘病毒)以及預防脊髓灰質炎和風疹(正鏈RNA病毒)的疫苗，並為整個世界提供了目前兒童時期免疫的主要方案。
然而，這種產生候選減毒病毒活疫苗的方法時間很長，可能不能預測，很大程度上依賴於選擇性產生具有所需減毒特徵的隨機發生的基因組突變體。產生的用於免疫原性組合物的候選病毒在免疫對象中常常是減毒不足或過度減毒的。
即使目前已有使用的疫苗，仍需要更有效的候選減毒活病毒，以產生改進的免疫原性組合物和方法。例如，目前的麻疹疫苗能提供相當好的保護。然而，最近麻疹流行病學資料說明目前疫苗的效率有缺陷。即使母親有免疫力，低於一歲的兒童中發生急性麻疹感染的比例仍然很高，這反映出這些疫苗不能誘導麻疹抗體水平達到相當於後來野生型麻疹感染所產生的水平(Griffin，麻疹病毒(Measles Virus)「現場病毒學(Field’s Virology)」，第3版。Lippincott-Raven，1401-1442，2001；Cutts等，J.Infectious Dis.，170S32-S41，1994)。結果，疫苗免疫的母親不大可能透過胎盤給她們的嬰兒提供足以在新生兒生命的最初幾個月中保護他們的被動抗體。
在曾經免疫過的青少年和青年中發生的急性麻疹感染指出另一問題。這些第二次疫苗接種失敗說明目前的疫苗誘導和維持足量和長效抗病毒保護的能力有限(Atkinson等，United States.Annu.Rev.Med.，43451-463，1992)。最近，又揭示了另一潛在問題。過去15年中分離的野生型麻疹病毒的血凝素蛋白顯示與疫苗株的距離不斷增加(Bellini等，Emerging Infectious Diseases，429-35，1998)。這種「抗原性漂變」引起了大家的合理關注，這些疫苗可能不含有提供最優保護所需的理想抗原組分。因此，需要改進的免疫原性組合物。
從cDNA中回收重組非節段性負鏈RNA病毒需要特殊的拯救系統，因為將病毒基因組RNA(vRNA)本身引入細胞不足以啟動病毒複製。啟動病毒複製循環還需要在細胞內合成三種或多種病毒反式作用蛋白，包括病毒核衣殼和聚合酶複合體的諸組分。
嘗試了許多不同的拯救方法從cDNA中回收重組非節段性負鏈RNA病毒。這些報導的方法大多數包括共轉染步驟，其中用多個質粒，包括病毒基因組cDNA克隆加編碼必需病毒蛋白如核衣殼蛋白(N或NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶亞基(L)的表達載體，來轉染宿主細胞。
已採用特別為非節段性負鏈病毒、T7RNA聚合酶的胞內表達設計的拯救方法來促進轉染的DNA轉錄。為此目的，已使用了T7RNA聚合酶，因為i)用適當設計的病毒cDNA質粒，可迫使T7聚合酶在病毒基因組的精確5』端啟動vRNA合成，ii)T7RNA聚合酶導致在這類病毒複製的場所—胞質中高水平表達，和iii)RNA的胞質合成消除了通過核剪切或聚腺苷酸化途徑加工vRNA的可能性。這些特徵使設計以T7RNA聚合酶為基礎的拯救系統具有很大優勢。
雖然在拯救系統中使用T7RNA聚合酶伴有重要優勢，但也有不足之處。為實現T7RNA聚合酶的高水平胞內表達，大多數救援系統還需要用表達噬菌體聚合酶基因(如MVA/T7)的重組牛痘病毒感染該轉染細胞(參見，例如，Pattnaik等，J.Virol.642948-2957，1990)。Lawson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481，1995)報導，通過採用這種通用拯救方法成功回收了水泡性口炎病毒(VSV)。類似地，Conzelmann於2000年3月7日提交美國專利號6,033,886報導，通過將RV cDNA基因組與編碼RV N、P和L蛋白的質粒共轉染入感染了重組牛痘病毒vTF7-3可表達T7RNA聚合酶的幼倉鼠腎(BHK)細胞中，從cDNA中成功回收了狂犬病病毒(RV)。
即使這些和其它成功報導涉及了基於牛痘的回收系統，但在病毒回收系統中使用重組牛痘病毒仍然伴有重要不足。具體說，這種回收方法需要從牛痘輔助病毒中純化游離的所需病毒。具體說，必須從受拯救的病毒中分離得到牛痘輔助病毒以實現回收。使這種回收複雜化，牛痘病毒實際上可幹擾被拯救病毒的複製。對於像RV和VSV這樣複製到高滴度的病毒來說，這些因素的問題較小。然而，很多其他非節段性負鏈RNA病毒生長較慢，可能在基於牛痘的系統中難以回收，例如，呼吸道合胞病毒(RSV)，人副流感病毒(HPIVs)，3型牛副流感病毒(BPIV3)和麻疹病毒(MV)。由於牛痘病毒可在宿主細胞群中，甚至幾代後引起廣泛的細胞病變效應(CPE)，基於牛痘的回收系統存在相關缺點。牛痘病毒引起的CPE可妨礙被拯救病毒所形成噬斑的檢測，也可通過降低細胞培養物支持複製的能力而減少被拯救病毒的產率。牛痘病毒誘導的CPE也可能通過限制轉染細胞保持活力的時間窗口而阻礙、或甚至排除對生長緩慢的減毒病毒的拯救。最後，如果想要使被拯救的重組病毒成為製備免疫原性組合物或開發基因治療載體的種子貯液，殘餘牛痘病毒感染是一個重要問題。
非節段性負鏈RNA病毒的另一種拯救系統採用特殊的組成性表達噬菌體聚合酶基因的「輔助」細胞系。據報導，示例性T7輔助細胞系有效規避了牛痘病毒系統的相關問題。Billeter等(國際公告號WO 97/06270，引入本文作為參考)報導的一個開發系統可從cDNA中回收感染性麻疹病毒(MV)。Billeter等的系統用組成性表達RNA聚合酶如T7RNA聚合酶的輔助細胞系取代了輔助病毒。該輔助細胞系還提供MV的N和P蛋白的組成性「基因組表達」。將含有操作性連接有表達控制序列的MV全部(+)鏈序列的cDNA質粒引入此特殊修飾的細胞系。將編碼MV的L蛋白的質粒與MVcDNA共轉染入輔助細胞系中進行瞬時表達。
雖然據報導，此種替代的T7輔助細胞回收系統是MV回收的成功工具，但它也具有與上述牛痘輔助系統不同的缺點。最重要的是，Billeter等的系統用組成性表達T7RNA聚合酶，以及MV的N和P蛋白的特殊輔助細胞系取代輔助病毒，似乎並不適合拯救其它非節段性負鏈RNA病毒。而且，當使用這種特殊的輔助細胞系時，必須為每個不同的待拯救病毒構建一個新細胞系。
用於回收非節段性負鏈RNA病毒的另一種細胞系也具有在輔助細胞中僅組成性表達T7聚合酶的特徵。因此，Buchholz等(J.Virol.73251-259，1999，引入本文作為參考)構建了組成性表達T7RNA聚合酶的BHK-21細胞系。該系統的優點是其細胞系較不特殊，因為它也不組成性表達具體病毒的N、P或L蛋白，據報導，細胞系在100次連續傳代後，T7聚合酶的表達仍是穩定的。
但是，所有輔助細胞系的類似缺點是它們難以構建，並且這些細胞系對回收廣泛範圍的不同非節段性負鏈RNA病毒中的用途有限。目前，僅開發了幾個高水平表達聚合酶並支持病毒拯救的T7輔助細胞系。經驗說明，可能難於分離得到滿足不同病毒和新形成毒株的具體需要的新T7細胞系。這大大限制了可用於拯救的T7細胞系的數量，並對產生許多非節段性負鏈RNA病毒的合格細胞系提出了嚴重問題。顯示特異性細胞嗜性不能生長於任何可利用的T7輔助細胞系中的非節段性負鏈RNA病毒產生了相關問題。
雖然在回收和產生非節段性負鏈RNA減毒活病毒上已有很多進展，但是本領域仍然明確需要其它工具和方法，以工程改造產生安全有效的免疫原性組合物來減輕這些病原體所引起的嚴重健康問題。該領域的其餘挑戰需要採用基於cDNA的回收系統更有效地拯救非節段性負鏈RNA病毒的其它工具。為有助於達到這些目的，必須擴展從cDNA中回收非節段性負鏈RNA病毒的現有方法。在這方面，尤其需要開發回收和遺傳操縱非節段性負鏈RNA病毒的方法和組合物，該方法和組合物不需要採用重組牛痘病毒或經修飾組成性表達T7RNA聚合酶的特殊細胞系。令人驚訝的是，本發明滿足了這些需求並具有其它目的和優點，如下所述。
發明概述本發明採用不依賴於輔助病毒(如牛痘病毒)和不需要經工程改造組成性表達RNA聚合酶的特殊輔助細胞系的組合物和方法，從克隆的cDNA中有效回收大量非節段性負鏈RNA病毒。
在本發明的一個方面，產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的方法包括將含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體引入宿主細胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物，在宿主細胞中表達N蛋白、P蛋白和L蛋白，並由瞬時轉染的表達載體瞬時表達RNA聚合酶，然後從宿主細胞中回收組裝的感染性、非節段性負鏈RNA病毒。
在本發明的另一實施方式中，提供了產生單分子負鏈RNA病毒目的生長或複製缺陷型、非節段性負鏈RNA病毒的方法。對這些實施方式而言，需要產生生長或複製缺陷型或不能隨後拯救的缺陷型病毒，例如體外或體內生長或複製能力受限的病毒。在本發明的這些實施方式中，將編碼生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的cDNA表達構建物引入宿主細胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物，在宿主細胞中表達N蛋白、P蛋白和L蛋白，並由瞬時轉染的表達載體瞬時表達RNA聚合酶。然後從宿主細胞中回收生長或複製缺陷型、非節段性負鏈RNA病毒，用於免疫原性組合物或其它目的。生長和複製缺陷型病毒和亞病毒顆粒將用作「載體」，如本文下面所詳述。
在本發明的其它實施方式中，產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的方法包括將含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體引入宿主細胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物，宿主細胞瞬時表達(1)RNA聚合酶，(2)N蛋白，(3)P蛋白，和(4)L蛋白，其中RNA聚合酶和N、P和L蛋白各自由瞬時轉染的表達載體表達；然後從宿主細胞中回收組裝的感染性、非節段性負鏈RNA病毒。
在另一實施方式中，產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的方法，包括將含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體和編碼和指導RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體引入合適的宿主細胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由病毒cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物，然後從宿主細胞中回收組裝的感染性、非節段性負鏈RNA病毒。
在本發明的更詳細方面，產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的方法，包括將含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體和編碼和指導RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體引入合適的宿主細胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由病毒cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物。在將一種或多種病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體引入宿主細胞後，對宿主細胞在足以提高重組病毒的回收的條件下進行有效熱激。
在本發明的其它方面，產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的方法，包括將含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體和編碼和指導RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體，在足以共表達這些載體並產生重組病毒的條件下引入合適的宿主細胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由病毒cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物。然後將該宿主細胞轉移，與噬斑擴增細胞，一般為單層擴展細胞共培養，從共培養物中回收組裝的感染性、非節段性負鏈RNA病毒。
本發明中也提供用於產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的組合物。該組合物包含含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以在合適的宿主細胞中指導由cDNA合成病毒RNA轉錄物；和在宿主細胞中編碼和指導(1)RNA聚合酶，(2)N蛋白，(3)P蛋白，和(4)L蛋白瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體，以及在所述宿主細胞中編碼和指導RNA聚合酶瞬時表達的瞬時表達載體。
在另一實施方式中.，如上所述提供的組合物中，非節段性負鏈RNA病毒是生長或複製缺陷型病毒。可以各種製備性或活性製劑和混合物方式提供本發明的這些和相關組合物。例如，可提供的上述組合物中，將病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體組合成共轉染混合物。或者，可將上述諸組分在共轉染的宿主細胞中或轉染的宿主細胞和噬斑擴增細胞的共培養物中組合。
本發明的其它實施方式涉及根據上述方法產生的重組非節段性負鏈RNA病毒，以及含有這些病毒的免疫原性組合物，在哺乳動物對象中引發免疫應答的方法包括將所述病毒和免疫原性組合物給予該對象。
附圖簡要說明

圖1描述了用質粒供給T7而不是MVA-T7來拯救RSV。
圖2A-2C提供了瞬時T7聚合酶表達載體，質粒pCl-Neo-Bcl-T7的示例性序列(SEQ ID NO1)。ATG是T7 pol起始密碼子。T7 pol的第二個密碼子是從AAC變化為gAC，以優化翻譯起始序列(Kozak序列)。還加入序列GCCACC，以優化翻譯起始序列。在加入T7RNA聚合酶編碼序列之前，將該序列的小寫部分get agcctcgagtgatcagaatt c插入pCI-Neo載體中取代T7啟動子。該序列包括NheI、XhoI、Bell和EcoRI限制性位點。
圖3A和3B(圖A-C)說明可將異源負鏈RNA病毒中鑑定的各種突變摻入本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒中(在本文中摻入HPIV1構建物中)，以產生減毒或其它所需的表型改變。
發明詳述本發明採用不依賴於輔助病毒(如牛痘病毒)和不需要經工程改造組成性表達RNA聚合酶的特殊輔助細胞系的組合物和方法，從克隆的cDNA中有效回收大量非節段性負鏈RNA病毒。
在本發明的一個方面，提供了有效拯救非節段性負鏈RNA病毒的方法和組合物，即將瞬時表達載體摻入能夠支持拯救所述病毒的宿主細胞中以瞬時表達RNA聚合酶。在此種瞬時(表達)聚合酶載體拯救系統中，將編碼，如T7RNA聚合酶的表達載體與病毒基因組或反義基因組cDNA協同引入宿主細胞，在宿主細胞中表達支持病毒拯救所必需的病毒支持蛋白(如N、P和L蛋白)。圖1描述說明了本發明的拯救系統，如採用質粒提供T7來拯救RSV。
因此，在本發明的病毒回收方法和組合物中，通過在細胞核中轉錄的瞬時轉染質粒使宿主細胞程序化地表達RNA聚合酶，從而支持在非牛痘病毒系統中和在適於拯救不同種類和類型的非節段性負鏈RNA病毒的細胞中進行病毒回收。
本文所述方法和組合物的應用和多能性(例如，與基於牛痘和基於輔助細胞的回收系統相比)克服了這些預計障礙，如瞬時載體表達系統常伴有的轉染效率低和表達時間短。與T7輔助細胞系統不同，當所有細胞都組成性表達T7聚合酶時，瞬時表達系統中的轉染效率通常低至約10-20％。此外，預計瞬時表達，如T7聚合酶的瞬時表達會在約72小時的有限時間內衰減和停止。據此，本文公開的多能系統採用瞬時RNA聚合酶共轉染有效地拯救非節段性負鏈RNA病毒，包括許多不同的生長緩慢和減毒種類和毒株，這是出人意料的。
用本發明的瞬時RNA聚合酶表達系統拯救負鏈RNA病毒與現有系統相比具有幾個優點。具體說，不需要用重組牛痘病毒感染細胞來提供RNA聚合酶，從而消除了CPE和其他因素對病毒回收效率和保真度以及開發有效免疫原性組合物的不良影響。一個相關的優點是開始拯救後，在轉染期間轉染細胞保持活力和支持病毒拯救的時間較長。這有助於促進拯救非節段性負鏈RNA病毒中常見的生長緩慢的病毒種和毒株。此外，本拯救系統不需要從所需重組病毒中純化去除重組牛痘病毒。對開發免疫原性組合物和基因治療載體而言，也消除了對拯救病毒製備物中重組牛痘病毒汙染的擔心。最後，本方法和組合物無需開發特殊的輔助細胞系，任何可以被轉染的細胞系都可用於回收多種不同的非節段性負鏈RNA病毒。
可通過實施本發明的方法和組合物從cDNA中成功回收多種不同的重組非節段性負鏈RNA病毒。根據1993年國際病毒分類學委員會修訂的重新分類，設立了稱為單分子負鏈RNA病毒目的非節段性負鏈RNA病毒目。該目包括三個具有負極性(負義)的單鏈、非節段性RNA基因組的有包膜病毒科。這些非節段性負鏈RNA病毒科是副粘病毒科，彈狀病毒科和線狀病毒科。副粘病毒科進一步分為兩個亞科副粘病毒亞科和肺病毒亞科。副粘病毒亞科包括三個屬呼吸道病毒屬(Respirovirus)(以前稱為副粘病毒)，腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)和麻疹病毒屬(Morbillivirus)。肺病毒亞科包括肺病毒屬。表1表示單分子負鏈RNA病毒的目前的分類學地位，以及各屬的非限制性例子，它們代表了可經本發明方法和組合物拯救的非節段性負鏈RNA病毒的種和屬。
表1單分子負鏈RNA病毒目的非節段性負義、單鏈RNA病毒分類副粘病毒科副粘病毒亞科呼吸道病毒屬仙臺病毒(1型小鼠副流感病毒)1和3型人副流感病毒(PIV)3型牛副流感病毒(BPV)腮腺炎病毒屬猴病毒5(SV)(2型犬副流感病毒)腮腺炎病毒新城疫病毒(NDV)(禽副粘病毒1)2、4a和4b型人副流感病毒麻疹病毒屬麻疹病毒(MV)海豚麻疹病毒犬瘟熱病毒(CDV)小反芻獸疫病毒海豹疫熱病毒牛瘟病毒未分類亨得拉病毒立百病毒肺病毒亞科肺病毒屬人呼吸道合胞病毒(RSV)牛呼吸道合胞病毒小鼠肺炎病毒肺炎後病毒(metapneumovirus)屬人肺炎後病毒(human metapneumovirus)禽肺炎病毒(以前稱為土耳其鼻氣管炎病毒)彈狀病毒科狂犬病病毒屬狂犬病病毒水泡病毒屬水泡性口炎病毒短時熱病毒屬牛短時熱病毒線狀病毒科絲狀病毒屬馬伯格病毒單分子負鏈RNA病毒成員的現行分類方案是根據形態學標準、病毒基因組構成、生物學活性以及病毒基因和基因產物的序列相關性分類。副粘病毒亞科的有包膜病毒的形態學區別特徵是核衣殼的大小和形狀。相關的生物學特徵是1)屬成員之間的抗原交叉反應性，和2)呼吸道病毒屬、腮腺炎病毒屬有神經氨酸酶活性，麻疹病毒屬沒有該活性。此外，要考慮P基因編碼可能不同，因為腮腺炎病毒屬有一個額外的基因(SH)。
可通過形態學特徵將肺炎病毒與副粘病毒亞科區別開來，因為肺炎病毒含有狹窄的核衣殼。此外，肺炎病毒與副粘病毒亞科不同的主要區別在於編碼蛋白的順反子數量不同(肺炎病毒有10個而副粘病毒亞科有6個)和有一種連接蛋白(G)。雖然副粘病毒和肺炎病毒的六個蛋白似乎在功能上相對應(N、P、M、G/H/HN、F和L)，但只有後兩個蛋白在兩個亞科之間顯示出顯著的序列相關性。幾種肺炎病毒蛋白，即非結構蛋白NS1和NS2，小疏水蛋白SH和第二蛋白M2在大多數副粘病毒中缺少相似物。一些副粘病毒蛋白，即C和V，在肺炎病毒中缺少相似物。然而，肺炎病毒和副粘病毒的基本基因組構成是相同的，彈狀病毒和絲狀病毒也是如此。
本發明回收非節段性負鏈RNA病毒的總的方法總結如下。將從所需病毒基因組克隆的DNA等價物(正鏈，信使正義)置於合適的DNA依賴性RNA聚合酶啟動子(如T7、T3或SP6RNA聚合酶啟動子)和插入合適的轉錄載體(如可增殖的細菌質粒)中的自身切割核酶序列(如丁型肝炎核酶)之間。該轉錄載體提供容易操縱的DNA模板，RNA聚合酶(例如，T7RNA聚合酶)可從該模板忠實地轉錄出具有準確或幾乎準確的5』和3』端的病毒反義基因組(或基因組)的單鏈RNA拷貝。基因組的病毒DNA拷貝的方向以及側翼啟動子和核酶序列決定反義基因組或基因組RNA等價物是否被轉錄。
根據本發明拯救新病毒後代還需要病毒特異性反式作用支持蛋白把裸露的單鏈病毒反義基因組或基因組RNA轉錄物衣殼化成為功能性核衣殼模板。這些蛋白通常包括病毒核衣殼(N)蛋白、聚合酶相關磷蛋白(P)和聚合酶(L)蛋白。不同病毒科或屬中，這些蛋白的命名可能略有不同。例如，在彈狀病毒科中，磷蛋白可稱為「P」或「NS」。在呼吸道病毒和腮腺炎病毒屬中，核衣殼蛋白稱為「NP」。本文所用術語「N蛋白」和「N基因」適合指N或NP核衣殼蛋白和基因，術語「P蛋白」和「P基因」適合指P或NS磷蛋白和基因。選作拯救的某些病毒可能需要其它蛋白。一般說，雖然不排他，但拯救非節段性負鏈RNA病毒還需要在攜帶有病毒cDNA的宿主細胞中表達RNA聚合酶，以驅動含cDNA的轉錄載體和編碼支持蛋白的載體的轉錄。
在本發明中，從cDNA中回收非節段性負鏈RNA病毒的新拯救方法，包括將編碼目標病毒的基因組或反義基因組的病毒cDNA表達載體引入宿主細胞，並共同引入編碼和指導RNA聚合酶瞬時表達的瞬時聚合酶表達載體。本文所用的RNA聚合酶包括但不限於T7、T3或SP6噬菌體聚合酶。宿主細胞也在共同引入病毒cDNA和瞬時聚合酶表達載體之前、期間或之後在宿主細胞中表達N、P和L支持蛋白，這是產生複製性、感染性病毒或亞病毒顆粒所必需的。
一般來說，用編碼或指導支持蛋白表達的一種或多種附加表達載體將病毒cDNA和瞬時聚合酶表達載體共同轉染入宿主細胞。支持蛋白可能是待拯救病毒的野生型或突變蛋白，或可選自異源非節段性負鏈RNA病毒相應的支持蛋白。在另一實施方式中，可以在宿主細胞中共表達其它病毒蛋白，如聚合酶延伸因子(如RSV的M2-1)或能提高回收或在所述方法和組合物內提供其它所需結果的其它病毒蛋白。在其他實施方式中，可通過在宿主細胞中組成性表達支持蛋白或通過用編碼支持蛋白的輔助病毒共感染宿主細胞，在宿主細胞中表達一種或多種支持蛋白。
在本發明的更詳細方面，病毒cDNA表達載體含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物。將該病毒cDNA載體引入瞬時表達RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白的宿主細胞。可從一種或多種瞬時轉染的表達載體，表達各RNA聚合酶和N、P和L蛋白。經常由各個表達載體，通常是瞬時表達質粒表達各RNA聚合酶和N、P和L蛋白。經過足夠時間後並在合適的條件下，從宿主細胞中回收組裝的感染性非節段性負鏈RNA病毒。
為從cDNA表達的基因組或反義基因組產生感染性非節段性負鏈RNA病毒，將該基因組或反義基因組與產生能夠進行RNA複製的核衣殼，並賦予後代能夠進行RNA複製和轉錄的核衣殼所必需的那些病毒蛋白共表達。基因組核衣殼的轉錄提供了其它病毒蛋白並啟動了產毒性感染。或者，共表達可提供產毒性感染所需的其它病毒蛋白。
在本發明的某些實施方式中，用一種或多種輔助病毒提供編碼產生轉錄、複製病毒核衣殼所必需的蛋白的互補序列。這些輔助病毒可以是野生型或突變體。在某些實施方式中，可從表型上將輔助病毒與重組病毒cDNA編碼的病毒區分。例如，可能需要提供與輔助病毒而非重組病毒cDNA編碼的病毒發生免疫應答的單克隆抗體。這種抗體可以是中和抗體。在一些實施方式中，該抗體可用於親和層析，來分離重組病毒與輔助病毒。為幫助獲得這種抗體，可在病毒cDNA中引入突變，以提供輔助病毒的，如糖蛋白基因的抗原多樣性。
可利用，例如以集合的完整基因組或反義基因組提供的組裝克隆的cDNA節段，通過病毒mRNA或基因組RNA逆轉錄拷貝的聚合酶鏈反應等(PCR；見美國專利號4,683,195和4,683,202中描述，PCR方法方法和應用指南(PCR protocolsA Guideto Methods and Applications，Innis等編，Academic Press，San Diego，1990)構建用於本發明的重組病毒基因組或反義基因組。例如，可產生包含含有反義基因組的左手端、跨越合適的啟動子(如T7、T3或SP6RNA聚合酶啟動子)和在合適的表達載體(如質粒、粘粒、噬菌體或DNA病毒載體)中組裝的cDNA的第一構建物。可用誘變和/或插入合成的含有經設計有助於組裝的獨特限制性位點的多聚接頭修飾該載體。如需要反義基因組質粒的右手端可含有其它序列，如側翼核酶和一個或串聯T7轉錄終止子。該核酶可以是錘頭型，它會產生含有一個非病毒核苷酸的3』端，或者可以是任何其它合適的核酶，如丁型肝炎病毒的核酶(Perrotta等，Nature 350434-436，1991)，它會產生沒有非病毒核苷酸的3』端。
構建編碼病毒基因組或反義基因組的cDNA的替代方法包括用改進的PCR條件進行逆轉錄PCR(例如，Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915695-5699，1994中所述，引入本文作為參考)，將亞基cDNA組件的數目降低到少至一或兩個。在其它實施方式中，可使用不同啟動子(如T3或SPQ)。對於增殖可用不同DNA載體(如粘粒)來更好地容納大尺寸的基因組或反義基因組。
非節段性負鏈RNA病毒的「感染性克隆」或「感染性cDNA」指合成的cDNA或其產物，以及能夠直接摻入可轉錄成基因組或反義基因組病毒RNA的感染性病毒粒子的RNA，其中基因組或反義基因組病毒RNA能夠用作產生感染性病毒或亞病毒顆粒基因組的模板。如上所述，可通過各種常規技術(如定位誘變)將確定的突變引入感染性病毒克隆的基因組或反義基因組的cDNA拷貝。如本文所述用基因組或反義基因組cDNA亞片段組裝完整的基因組或反義基因組cDNA具有以下優點可分別操作各區域，其中小的cDNA構建物比大cDNA構建物更易於操作，然後容易地組裝成完整的cDNA。
構建或修飾本發明的某些重組病毒，以限制該重組病毒的生長能力、複製活性或感染性。這些生長或複製缺陷型病毒和亞病毒顆粒用作載體和免疫原，它們不具給予宿主完全感染性(即具有接近野生型病毒的生長和/或複製活性水平)病毒時的某些風險。複製缺陷型指其在宿主細胞或哺乳動物對象中生長或複製的能力有限，或在細胞中或細胞間傳染和/或增殖的能力有缺陷的病毒或亞病毒顆粒。複製缺陷型病毒的複製能力常常僅限於在宿主細胞或對象中複製一輪或兩輪。常常將生長和複製缺陷型病毒和亞病毒顆粒用作「載體」，見本文以下的詳述。
因此，為產生生長和/或複製缺陷型、非節段性負鏈RNA病毒提供各種方法和組合物。在更詳細的實施方式中，與相應野生型或親代病毒的生長、複製和/或感染性相比，生長或複製缺陷型病毒的生長、複製和/或感染性特徵受到很大損傷。本文中，與野生型或親代病毒的生長、複製和/或感染水平相比，其生長、複製和/或感染性在體外和/或體內受到的損傷至少約10-20％、20-50％、50-75％和高達95％或更高。
一般用下面詳述的熱激(蛋白)/T7-質粒聯合拯救系統拯救具有不同程度的生長或複製缺陷的病毒。示例性毒株包括摻入了以下所述修飾的VSV高減毒株(如C-末端G蛋白截短或易位基因)(參見，例如，Johnson等，J.Virol.715060-5078，1997，Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9311359-11365，1996；Schnell等，Cell90849-857，1997；Roberts等，J.Virol.724704-4711，1998；和Rose等，Cell106539-549，2001，各自引入本文作為參考)。一些目標病毒包含僅部分受損的缺陷，例如其中某些病毒在沒有遺傳補充時仍可增殖。可通過在編碼、非編碼和調節序列中引入胺基酸取代、核苷酸取代、部分或完全的基因缺失或敲除等實現本文所述的這種缺陷，例如在RSV、PIV和VSV中描述的特殊ts或ca表型。
當重組非節段性負鏈RNA病毒在細胞系中增殖時，該病毒常常具有不導致嚴重生長損傷但在天然宿主中複製大受限制的部分或全部基因缺失或基因「敲除」。本文中的示例性突變體包括SH、NS1和NS2基因或蛋白的一種或多種部分或全部缺失或敲除的RSV。在其它實施方式中，通過引入損傷基因功能但不阻斷複製的突變或其它改變來構建生長或複製缺陷型病毒。例如，上述參考文獻描述了有用的具有C末端缺失而影響G蛋白胞質尾的VSV候選病毒。例如，通過將異源抗原決定簇摻入重組載體基因組或反義基因組中將這些和同樣的生長或複製缺陷型病毒用作「載體」。在具體實施例中，將MV或HIV糖蛋白、糖蛋白結構域或一種或多種抗原決定簇摻入VSV載體或「骨架」中。
其它生長或複製缺陷型病毒具有的鹼基取代或小缺失對其在細胞系中生長不需要但能影響其對哺乳動物宿主的致病性的蛋白表達有抑制作用。此方面的示例性構建物包括C、D和/或V ORF中一種或多種全部或部分切除或缺失的HPIV(參見，例如，Durbin等，Virology 261319-30，1999，引入本文作為參考)，和V蛋白全部或部分缺失或敲除(Schneider等，Virology 227314-22，1997，引入本文作為參考)或突變(參見，例如，Parks於2003年12月16日提交的美國專利號6,664,066，引入本文作為參考)的MV。
其它生長或複製缺陷型病毒具有能切除(敲除)或降低基因表達的部分或全部基因缺失或其它類型的修飾，其中所述缺陷是部分損傷，但不完全阻斷在細胞系中的複製。本文中有用候選物的例子包括缺失或敲除了基質蛋白的MV，Cathomen等，EMBOJ.173899-908，1998(引入本文作為參考)，和缺失和或敲除NS1、NS2、M2-2和/或SH中一種或多種的RSV(Jin等，Virology 273210-8，2000，引入本文作為參考)。
在其它實施方式中，重排了生長或複製缺陷型病毒或位置「改組」了導致生長受損但不阻止複製的基因。本文引用的參考文獻中描述了各種所述位置改變的RSV突變體。本文中描述了VSV的這類其它示例性重組物(參見，例如，Wertz等於2003年7月22日發表的美國專利號6,596,529；Ball等於2000年10月24日發表的美國專利號6,136,585；和Wertz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 953501-6，1998，各自引入本文作為參考)。
在其它實施方式中，生長或複製缺陷型病毒具有損害其生長的部分或全部基因取代。在這個方面，可以用感染另一物種的相關病毒的基因取代一種或多種病毒基因，如表達HPIV或RSV抗原決定簇的各種宿主範圍受限的人-牛PIV(HBPIV)(Skiadopoulos等，J.Virol.771141-8，2003；Bailly等，J.Virol.743188-95，2000，Schmidt等，J.Virol.754594-603，2001，各自引入本文作為參考)和用另一RSV或VSV的F和/或G基因取代其F和/或G基因的RSV(參見，例如Oomens等，J.Virol.773785-98，2003，引入本文作為參考)。
在本發明的其它詳述實施方式中，構建生長或複製缺陷型病毒使其具有必須用補充細胞系、輔助病毒、轉染或提供所缺失功能的一些其它方式來補充的缺陷。示例性構建物包括其G蛋白表達降低或消除的VSV。通過轉染或利用一些類型的輔助病毒系統(『假型』)來提供缺失的G蛋白表達(參見，例如，Lefkowitz等，Virology 178373-83，1990，引入本文作為參考)。或者，用補充細胞系(參見，例如，Schnell等，Cell 90849-57，1997，引入本文作為參考)或用G蛋白融合物(例如，其中VSV G蛋白包括融合於異源序列(如麻疹病毒的F或H基因)的VSV跨膜序列和胞質結構域)(參見，例如，Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9311359-11365，1996；Schnell等，Cell 90849-857，1997Roberts等，J.Virol.724704-4711，1998；和Rose等，Cell 106539-549，2001，各自引入本文作為參考)來提供缺失的G功能。在本文描述的一個示例性實施方式中，通過第二步將病毒轉染細胞與轉染了編碼功能性G蛋白的質粒的細胞共培養，回收G功能受損的重組VSV。在其它示例性候選物中，用一種雜交G蛋白代替VSV G蛋白，該雜交G蛋白構成了將病毒靶向特定細胞，如CD4+細胞的受體(Johnson等，J.Virol.715060-5078，1997，引入本文作為參考)。
通過前導區或尾隨區的修飾構建部分生長或複製缺陷型的其它病毒，例如用見於前導區序列中的弱啟動子的一個拷貝取代尾隨區(Finke等，J.Virol.733818-25，1999，引入本文作為參考)。
為易於製備，可將N、P、L和其它所需病毒蛋白組裝到一種或多種單獨載體中。很多合適的表達載體是本領域已知的，可用於摻入和指導編碼RNA聚合酶和支持蛋白的多核苷酸表達，包括例如質粒、粘粒或噬菌體載體、缺陷型病毒載體、所謂「複製子」(例如辛德畢斯或委內瑞拉馬腦炎病毒複製子)和其它用於指導瞬時和/或組成性表達的載體。與聚合酶和/或支持載體操作性整合的瞬時表達控制元件指導RNA聚合酶和(當可應用時)N、P和L蛋白的瞬時表達。在一個示例性實施方式中，RNA聚合酶的瞬時表達控制元件是RNA聚合酶II調節區，如人巨細胞病毒[hCMV]的立即早期啟動子和增強子(參見，例如，美國專利5,168,062，引入本文作為參考)。
可通過本領域已知的任何各種方法，包括轉染、電穿孔、機械插入、轉導等，將編碼病毒cDNA、瞬時表達的RNA聚合酶以及N、P和L蛋白的載體引入合適的宿主細胞。在某些示例性實施方式中，通過磷酸鈣介導的轉染(Wigler等，Cell 14725，1978；Corsaro等，Somatic Cell Genetics 7603，1981；Graham等，Virology52456，1973)、電穿孔(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)，DEAE-右旋糖苷介導的轉染(Ausubel等編，《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987)或陽離子脂質介導的轉染(Hawley-Nelson等，Focus 1573-79，1993)將所述載體引入培養的細胞中。在另一實施方式中，加入轉染促進劑以提高細胞對DNA的攝入。很多這些試劑是本領域已知的。LIPOFECTACE_(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和EFFECTENE_(Qiagen，Valencia，CA)是常見的例子。LIPOFECTACE_和EFFECTING_二者也是。這些試劑是包裹DNA並增強細胞的攝入DNA的陽離子脂質。LIPOFECTACE_可形成包圍DNA的脂質體而EFFECTINE_可包被DNA但不形成脂質體。另一種促進DNA攝入的商業試劑是LIPOFECTAMINE-2000_(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
用於本發明的合適的宿主細胞能夠支持所述非節段性負鏈RNA病毒的產毒性感染，並允許支持病毒產生所必需的載體及其編碼產物的表達。這種宿主細胞可選自原核細胞或真核細胞。合適的細胞包括昆蟲細胞如Sf9和Sf21，具有合適啟動子的細菌細胞如大腸桿菌，和酵母細胞如釀酒酵母。宿主細胞一般選自脊椎動物，如靈長類動物的細胞。由於本發明所用的很多RNA病毒是人類病原體，所以在這種情況下常用靈長類動物細胞。例如，麻疹病毒(MV)主要限於感染靈長類動物細胞。也有例外，如犬瘟熱病毒和感染非人哺乳動物的其它麻疹病毒。對增殖病毒而言，一些真核細胞系比其它細胞系運作得更好，對某些病毒一些細胞系根本不運作。一般採用產生可檢測細胞病變效應的細胞系，以便可以容易地檢測到拯救的活病毒。宿主細胞常常衍生自人細胞，如人胚腎(HEK)細胞。Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)，以及很多其它類型的細胞也可用作宿主細胞。就麻疹和可能還有其它病毒而言，將其轉染的細胞在Vero細胞上培養，因為這類病毒在Vero細胞上快速擴散而產生容易檢測的噬斑。下面是其它合適的宿主細胞的例子(1)人雙倍體原代細胞系如WI-38和MRC-5細胞；(2)猴雙倍體細胞系如Cos、胎恆河猴肺(FRhL)細胞；(3)準原代連續細胞系如AGMK-非洲綠猴腎細胞；(4)人293細胞(合格的)和(5)嚙齒類(如CHO、BHK)、犬如，Madin-Darby犬腎(MDCK)和原代雞胚成纖維細胞。本發明方法和組合物所用的示例性具體細胞系包括HEp-2、HeLa、HEK(如HEK293)、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。
在本文提供的方法和組合物中，將RNA聚合酶載體、病毒cDNA克隆和支持載體(如編碼N、P和L的質粒)同時協同引入宿主細胞。例如，可將所有所述DNA組合到一個DNA轉染(如磷酸鈣轉染)混合物中，同時加入宿主細胞培養物中實現協同轉染。在另一實施方式中，可對所述聚合酶和支持載體及病毒cDNA載體的任何兩種或多種分別進行轉染。一般說，在有效的共轉染步驟中以接近的時間順序分別進行轉染而協同引入聚合酶和支持載體及病毒cDNA載體。在一個這種協同轉染方法中，將病毒cDNA和/或N、P和L支持質粒引入宿主細胞，然後轉染RNA聚合酶質粒。在其它實施方式中，在將RNA聚合酶質粒轉染到宿主細胞中的同時或之後，但在RNA聚合酶在宿主細胞中開始實質性表達之前(例如，在T7聚合酶累積到可檢測水平之前，或在T7水平累積到足以激活T7啟動子驅動的質粒表達之前)將病毒cDNA和/或N、P、L支持質粒引入宿主細胞。
在本發明的其它詳細方面，產生感染性、非節段性負鏈RNA病毒的方法包括額外熱激處理宿主細胞，以提高重組病毒的回收率。將一種或多種病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白的一種或多種瞬時表達載體引入宿主細胞後，使該宿主細胞接觸有效熱激刺激而提高重組病毒的回收率。
在這樣的一種方法中，使宿主細胞暴露於有效熱激溫度，暴露時間足以實現對細胞的熱激，進而促使病毒回收增加。有效的熱激溫度高於本領域所認為進行病毒拯救可接受的、推薦的或優化的溫度。在許多情況下，有效熱激溫度高於37℃。當在有效熱激溫度下實施本發明改良的拯救方法時，導致所需重組病毒的回收率比不提高溫度進行拯救時重組病毒的回收率水平提高。有效熱激溫度和暴露時間因所用拯救系統而不同。這種溫度和時間的不同可能是由於所選病毒或宿主細胞類型的不同而異。
雖然溫度可能不同，但可用具體重組病毒進行幾次試驗性拯救程序，並測定所需重組病毒的回收百分數隨溫度和暴露時間不同而變化，而容易地確定有效熱激溫度。確定的是，進行拯救的任何溫度範圍的上限是轉染組分受到破壞，或轉染組分的功能在轉染中缺失或消失的溫度。用於本發明這個方面的示例性有效熱激溫度範圍是約37℃至約50℃，約38℃至約50℃，約39℃至約49℃，約39℃至約48℃，約40℃至約47℃，約41℃至約47℃，約41℃至約46℃。所選的有效熱激溫度範圍常用約42℃至約46℃。在更具體的實施方式中，採用約43℃、44℃、45℃或46℃的有效熱激溫度。
在進行確定所選有效熱激溫度或溫度範圍的測試中，也可選擇進行熱激程序的有效時間。施加有效熱激溫度的足夠時間是所需重組病毒的回收率比在上述不提高溫度進行拯救時重組病毒回收水平有可檢測增加的時間。有效熱激時間可因拯救系統，包括所選病毒和宿主細胞而不同。雖然時間不同，但用具體重組病毒進行幾次試驗性拯救程序，並測定所需重組病毒的回收率或百分數隨溫度和時間不同而變化，而容易地確定施加有效熱激溫度的時間量。進行拯救所用的任何時間變化範圍的上限是轉染組分受到破壞，或轉染組分的功能在轉染中損失或消失的時間量。熱激程序的時間可不同，從幾分鐘至幾小時，只要獲得所需重組病毒回收率增加。用於本發明這個方面的示例性有效熱激時間用分鐘表示是約5至約300分鐘，約5至約200分鐘，約15至約300，約15至約240，約20至約200，約20至約150。有效熱激時間常用約30分鐘至約150分鐘。
可用許多方法確定通過使宿主細胞暴露於有效熱激而提高的重組非節段性負鏈RNA病毒回收水平。例如，氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)報導基因可用於監測已知方法對重組病毒的拯救。該報導基因的相應活性確定了基線水平和重組病毒表達水平的提高。其它方法包括檢測所獲重組病毒噬斑數量和通過測序確認拯救病毒的產生。一種測定回收率提高的示例性方法包括製備許多相同的轉染細胞培養物，使它們暴露於不同的熱激條件(不同時間和溫度)下，然後將這些培養物的回收率值與對照細胞(如轉染並維持在恆溫37℃下的細胞)的相應值作比較。轉染後72小時，將轉染的細胞轉移到含約75％鋪滿的單層Vero細胞(或選用於測定重組病毒噬斑形成的細胞類型)的10釐米板中，繼續培養直到噬斑可見。然後，計數噬斑並與對照細胞獲得的值相比。優化熱激條件應該使噬斑的數量最大。
根據本發明的這些實施方式，病毒回收率的提高至少約為10％或25％，常常至少約40％。在某些實施方式中，由於暴露於有效熱激的重組病毒回收的增加比不用熱激法所見的或回收的重組病毒量增加了2倍、5倍、高達10倍和更高。
在本發明的另一實施方式中，對其中導入了病毒cDNA和瞬時RNA聚合酶載體(和任選的編碼必需的支持蛋白的一種或多種載體)的宿主細胞進行「噬斑擴增」步驟。一般在足以允許病毒cDNA表達載體和編碼和指導RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白的瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體進行表達的一段時間後(如轉染後)，進行該步驟。為實現噬斑擴增，將支持病毒進一步擴增能力常常受損的宿主細胞與相同或不同類型細胞的噬斑擴增細胞共培養。此共培養步驟可使受拯救的病毒擴散到噬斑擴增細胞中，這更適於該病毒的大量擴增。一般將宿主細胞培養物轉移到一層或多層噬斑擴增細胞上。例如，可使宿主細胞培養物擴散到單層噬斑擴增細胞上，然後，重組非節段性負鏈RNA病毒將感染該噬斑擴增細胞並在其中進一步擴增。在另一實施方式中，宿主細胞與噬斑擴增細胞的細胞類型相同或不同。
本發明改進的噬斑擴增方法和組合物提供了產生重組的單分子負鏈RNA病毒的改進的拯救方法。該方法一般包括，將含有編碼單分子負鏈RNA病毒目的非節段性負義單鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的分離的核酸分子的轉錄載體，和編碼和指導RNA聚合酶瞬時表達的瞬時轉錄載體，與至少一種包含編碼衣殼化、轉錄和複製所必須的反式作用蛋白的至少一種分離的核酸分子的表達載體一起，在足以使所述載體共表達和產生重組病毒的條件下引入宿主細胞。然後將該宿主細胞轉移到至少一層噬斑擴增細胞上。
為了實現噬斑擴增，一般將受轉染細胞轉移到噬斑擴增細胞的共培養容器中。本領域已知的各種培養板或容器都可用於噬斑擴增步驟。在某些實施方式中，將轉染細胞轉移到至少約50％鋪滿的單層噬斑擴增細胞上。或者，噬斑擴增細胞至少約60％鋪滿，或甚至至少約75％鋪滿。在某些實施方式中，噬斑擴增細胞的表面積大於用於準備用於轉染病毒的表面積。如需要可將表面積比例提高到2∶1至100∶1。常常需要至少提高到10∶1的表面積比例。
根據天然或重組病毒在何種細胞中成功生長來選擇噬斑擴增細胞。用於進行轉染的宿主細胞常常不是所需重組病毒生長的最優宿主。因此，可通過選擇天然病毒或重組病毒在其中顯示出生長增加的噬斑擴增細胞來提高從受轉染細胞中的重組病毒回收。可根據上述選擇用於本發明這個方面的各種噬斑擴增細胞。可用於支持本發明重組非節段性負鏈RNA病毒的回收和擴增的示例性具體噬斑擴增細胞選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。PCT公布的WO99/63064中提供了用於本發明的有關熱激和噬斑擴增方法的其它詳情，引入本文作為參考。
本發明也提供了用於產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的組合物。該組合物包括含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體和編碼和指導RNA聚合酶、N、P和L蛋白在宿主細胞中瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導從cDNA合成病毒RNA轉錄物。在本發明的這個方面，該組合物在無細胞共轉染混合物中可包含病毒cDNA表達載體和編碼和指導RNA聚合酶、N、P和L蛋白瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體。或者，宿主細胞中可提供病毒cDNA表達載體和編碼和指導所述RNA聚合酶、N、P和L蛋白瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體(例如，向該宿主細胞中轉染了所述載體後)。在某些實施方式中，RNA聚合酶選自T7、T3或SP6RNA聚合酶。在其它實施方式中，編碼RNA聚合酶的瞬時表達載體是質粒。在又一實施方式中，上述組合物還包括與宿主細胞的細胞類型相同或不同的噬斑擴增細胞，使被拯救的病毒得以從該宿主細胞擴散到噬斑擴增細胞而有助於重組病毒擴增。
在下述本發明的一個示例性實施方式中，將T7RNA聚合酶瞬時表達載體(pSC6-T7，由蘇黎世大學的Martin Billeter博士提供)與麻疹病毒(MV+)全長cDNA克隆，以及操作性連接有表達控制序列(如T7RNA聚合酶啟動子)的編碼MV N、P和L蛋白的質粒共轉染到Vero細胞中，成功回收MV。
在其他示例性實施方式中，用本發明方法和組合物成功回收呼吸道合胞病毒(RSV)的40種不同重組構建物，包括A型和B型RSV、嵌合性A/B RSV和摻入一個或多個減毒突變和/或下述的其它重組修飾(如基因缺失)的重組RSV。提供了說明成功回收的其它例子，如3型人副流感病毒(HPIV3)、嵌合性型人副流感病毒3-1(其中用1型人副流感病毒的糖蛋白基因F和HN代替了PIV-3的糖蛋白基因F和HN)、嵌合性型人副流感病毒3-2CT(其中用2型人副流感病毒的糖蛋白基因F和HN替代了PIV-3的糖蛋白基因F和HN的胞質尾部分)、3型牛PIV(BPIV3)、嵌合性型人-牛PIV-3(其中用人PIV-3的糖蛋白基因F和HN代替了3型牛副流感病毒的糖蛋白基因F和HN)和水泡性口炎病毒(VSV)。
在本發明的其它詳述實施方式中，基於pCl-Neo骨架(Promega，Madison WI)構建T7RNA聚合酶瞬時表達質粒。在插入T7RNA聚合酶基因之前，通過去除位於多個克隆位點5』側的T7啟動子修飾該載體，產生pCl-Neo-Bcl。去除T7啟動子以增加T7RNA聚合酶基因插入物在細菌增殖期間的穩定性。T7RNA聚合酶的過表達對細菌可能有毒性，如果將T7RNA聚合酶基因克隆到T7RNA聚合酶啟動子的下遊，這可能會是一個問題。
用於克隆的T7基因採用摻入PCR引物的EcoRI(5』)和Xbal(3』)位點進行PCR擴增和克隆。ATG翻譯起始密碼子的5』端也包括Kozak共有序列，以保證高效率的蛋白合成。將T7基因插入pCl-Neo-Bcl產生pCL-Neo-Bcl-T7，這導致T7基因位於hCMV啟動子和增強子的控制下。獲得的質粒pCl-Neo-Bcl-T7具有圖2所列的序列(SEQ IDNO1)，並含有HCMV啟動子/增強子，依次後隨一個內含子、T7RNA聚合酶SV40聚A、SV40啟動子/增強子和NeoR元件。任選以新黴素抗性基因提供的選擇標記受SV40啟動子/增強子控制，它位於T7基因的3』。新黴素標記增加了該質粒的多能性，因為它可用於選擇穩定轉化的細胞系。可選擇標記基因的該位置將SV40增強子置於T7RNA聚合酶基因的3』端也值得注意。已被證明的SV40增強子的雙向轉錄刺激作用可能明顯有助於T7RNA聚合酶在質粒pCl-Neo-Bcl-T7中的全面表達。
可與被拯救病毒的各種重組修飾相結合進行本發明方法，各種重組修飾方法是本領域所熟知的。例如，可通過缺失一個完整基因、缺失某基因的一部分、編碼區的點突變、用異源核酸序列(來自另一病毒、另一病原體、編碼藥學上有用的多肽或編碼免疫調節劑)取代部分或全部基因、將異源核酸序列插入如基因間區和基因順序的重排等其它修飾，來修飾病毒基因組或反義基因組。因為本文提供的拯救系統足夠強大和有效，所以可成功實施對這些生長受損和/或減毒重組或突變衍生物的回收。
因此，可通過將明確的改變引入該重組病毒並以高頻率和高保真度產生用於含有所確定基因組序列的免疫原性組合物的候選病毒的新共表達系統，產生本發明的感染性、重組非節段性負鏈RNA病毒。這些修飾可用於各種應用，包括開發攜帶有預定、明確的減毒突變的減毒活病毒株。通過胞內共表達編碼病毒基因組或反義基因組RNA的一種或多種分離的多核苷酸分子與編碼產生轉錄性、複製性核衣殼所需或至少必要的病毒蛋白的一種或多種多核苷酸，來產生本發明的感染性非節段性負鏈RNA病毒。
構建編碼非節段性負鏈RNA病毒基因組或反義基因組的cDNA，使其與所選病毒蛋白在胞內共表達，以形成感染性病毒。「非節段性負鏈RNA病毒反義基因組」指一種分離的正義多核苷酸分子，它可用作子代病毒基因組的合成模板。一般構建的是複製性中間RNA相對應的正義病毒基因組或反義基因組的cDNA，以使與編碼產生轉錄、複製性核衣殼所必須的蛋白的互補序列的正義轉錄物雜交的可能性最少。雖然如前所述，但可採用反義病毒基因組(參見，例如，Kato等，Genes to Cells1569-579，1996，引入本文作為參考)在本發明的一些實施方式中，重組非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組僅需含有產生其編碼的感染性病毒或亞病毒顆粒所必需的那些基因或其部分。而且，可通過一種以上的多核苷酸分子提供這些基因或其部分，即可通過互補等由各個核苷酸分子提供這些基因。在其它實施方式中，所述病毒基因組或反義基因組可在沒有輔助病毒參與或質粒或輔助細胞系提供的病毒功能的情況下編碼病毒生長、複製和感染所必需的所有功能。
「重組非節段性負鏈RNA病毒」指直接或間接衍生自重組表達系統或由其產生的病毒或亞病毒顆粒增殖獲得的完整病毒或感染性亞病毒顆粒。該重組表達系統採用包含操作性連接的轉錄單元的重組病毒表達載體，該轉錄單元含有在病毒基因表達中組裝的具有調節作用的至少一個以上的遺傳元件，如啟動子、可轉錄為病毒RNA的結構或編碼序列、以及合適的轉錄起始和終止序列。
通過提供有效拯救非節段性負鏈RNA病毒的感染性克隆的方法，本發明能將多種改變用重組方法製作到各種目標病毒的基因組(或反義基因組)中，產生規定所需表型特定改變的明確突變。產生重組非節段性負鏈RNA病毒的本發明組合物和方法，能利用，例如這些明確的突變來改變所選病毒蛋白的功能或表達而易於詳細地分析和操縱病毒的分子生物學和致病機理。本領域技術人員不難理解其相關的診斷用途。用本發明方法和組合物，可以容易地區分負責所需表型改變的突變和沉默的偶然突變，從而選擇摻入重組非節段性負鏈RNA病毒基因組或反義基因組的表型特異性突變。
本文中，在構建cDNA期間或之後，可以在重組病毒基因組或反義基因組中進行各種核苷酸插入、缺失、取代和重排。例如，可以合成特異性所需核苷酸序列，用方便的限制性酶位點將其插入cDNA中的合適區域。或者，可用此類技術如位點特異性誘變、丙氨酸掃描、PCR誘變或本領域熟知的其它技術將突變引入cDNA。
本發明提供的非節段性負鏈RNA病毒的重組修飾定向產生用於診斷和免疫原性組合物的候選病毒，例如，以提高病毒的減毒和免疫原性，消除與不良免疫病理表現相關的表位，適應抗原性漂變等。為實現這些和其它目標，本發明組合物和方法允許將各種修飾引入非節段性負鏈RNA病毒基因組或反義基因組中以摻入感染性重組病毒。例如，可將編碼抗原決定簇(如保護性抗原或免疫原性表位)的外來基因或基因節段加入病毒克隆中，以產生能夠誘導對親代或「背景」病毒和產生抗原決定簇的另一「供體」病毒或病原因子的免疫力的重組病毒。或者，可將外來基因全部或部分插入編碼免疫系統的調節劑，如細胞因子中，以提高候選病毒的免疫原性。在本發明方法拯救的病毒克隆中可包括其它突變，例如，用重組病毒克隆中的對應基因或基因節段取代異源基因或基因節段(例如，編碼糖蛋白基因的胞質尾的基因節段)。或者，可以改變病毒克隆中基因的相對順序，可以將病毒基因組啟動子或其它調節元件用其反義基因組的對應物，或所選無功能的病毒基因(例如，通過功能性消除，包括引入終止密碼子來防止該基因表達)取代。可在非節段性負鏈RNA病毒中產生其它修飾，如將獨特的限制性位點插入病毒基因組或反義基因組的各種非編碼或編碼區域，以利於操縱。此外，可去除不翻譯的基因序列，以提高插入外來序列的容量。
如上所述，常常需要通過引入能提高或降低減毒或者改變重組病毒的表型來調整重組非節段性負鏈RNA病毒的表型。針對副流感病毒，在本發明中詳細示例了從cDNA產生重組非節段性負鏈RNA病毒，以及選擇、引入和測試各種減毒突變和其它修飾的有用材料和方法，這些材料和方法通常也可應用於本發明方法和組合物中的PIV和其它非節段性負鏈RNA病毒(參見，例如，Durbin等，Virology235323-332，1997；1998年5月22日提交的美國專利申請序列號09/083,793；1999年12月10日提交的美國專利申請序列號09/458,813；1999年12月10日提交的美國專利申請序列號09/459,062；1998年5月22日提交的美國專利申請序列號09/083,793(對應於國際公告號WO 98/53078)及其1997年5月23日提交的優先權美國臨時申請號60/047,575和1997年9月19日提交的60/059,385，各自引入本文作為參考)。具體說，上述引入的參考文獻描述了通過構建和表達編碼與PIV必要蛋白共表達的PIV基因組或反義基因組的cDNA產生感染性重組HPIV3的方法，包括可用於產生感染性病毒克隆的示例性質粒的描述。通過構建和表達編碼與PIV必要蛋白共表達的HPIV1重組物或嵌合基因組或反義基因組的cDNA來產生感染性重組HPIV1的方法類似於2001年9月21日提交的美國臨時申請號60/331,961，和Newman等，Virus Genes 2477-92，2002(各自引入本文作為參考)中的描述。通過構建和表達編碼與PIV必要蛋白共表達的HPIV2重組物或嵌合基因組或反義基因組的cDNA來產生感染性重組HPIV2的方法類似於2002年9月18日提交的美國臨時申請號60/412,053(引入本文作為參考)中的描述。
類似地，已經描述了從cDNA克隆呼吸道合胞病毒(RSV)的示例性方法和材料，及本發明中涉及用於構建重組非節段性負鏈RNA病毒的選擇、引入和測試減毒突變和其它修飾的其它公開內容(參見，例如，1996年9月27日提交的美國專利申請號08/720,132，對應於97年4月3日發表的國際公告WO97/12032和1995年9月27日提交的優先權美國臨時專利申請號60/007,083；1996年7月15日提交的美國臨時專利申請號60/021,773；1997年5月9日提交的美國臨時專利申請號60/046,141；1997年5月23日提交的美國臨時專利申請號60/047,634；1997年7月15日提交的美國專利申請號08/892,403，對應於1998年1月22日公開的國際公告號WO98/02530；1999年4月13日提交的美國專利申請號09/291,894，對應於2000年10月19日公開的國際公告號WO 00/61611和1999年4月13日提交的優先權美國臨時專利申請序列號60/129,006；2000年6月23日提交的美國專利申請號09/602,212和相應的2001年1月18日公開的相應的國際公告號WO 01/04335和1999年4月13日提交的優先權美國臨時專利申請號60/129,006、1999年7月9日提交的60/143,097和1999年7月9日提交的60/143,132；2000年10月19日公開的國際公告號WO00/61737；Collins等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.9211563-11567，1995；Bukreyev等，J.Virol.706634-41，1996，Juhasz等，J.Virol.715814-5819，1997；Durbin等，Virology 235323-332，1997；He等Virology 237249-260，1997；Baron等J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247232-9，1998a；Whitehead等，J.Virol.724467-4471，1998b；Jin等Virology 251206-214，1998；和Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999和Bukreyev等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.962367-72，1999，各自內容引入本文作為參考)。
這些上述引入的參考文獻描述了誘變、分離和表徵非節段性負鏈RNA病毒以獲得減毒突變株(如溫度敏感型(ts)、冷傳代(cp)冷適應的(ca)、小嗜菌斑(sp)和宿主範圍受限的(h7)突變株)的方法和步驟，及鑑定規定減毒表型的遺傳改變。與這些方法相結合，上述引入的參考文獻詳述了在與人體內活性合理相關的已接受的模型系統中，包括倉鼠或嚙齒類和非人靈長類模型系統中，確定通過生物學計數衍生的和重組產生的減毒非節段性負鏈RNA病毒的複製、免疫原性、遺傳穩定性和免疫效力的方法。此外，這些參考文獻描述了開發和測試非節段性負鏈RNA病毒的免疫原性組合物，包括單價和二價免疫原性組合物的通用方法。
上述引入的參考文獻中也公開了構建和評價感染性、重組非節段性負鏈RNA病毒的方法，該病毒經修飾摻入了在生物學方法產生的突變體，例如冷傳代(cp)冷適應的(ca)、宿主範圍受限的(hr)、小嗜菌斑(sp)和/或溫度敏感型(ts)突變體，如HPIV3 JS cp45突變株(根據布達佩斯條約保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，美國，專利保藏名為PTA-2419；保藏物引入本文作為參考)中鑑定的表型特異性突變。可將在此病毒和其它突變病毒(例如，RSV-參見上述參考文獻)中鑑定的突變容易地摻入本發明的重組PIV或其它非節段性負鏈RNA病毒中，見以下的進一步詳述。
因此，可將減毒突變和其它修飾常規引入本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒中。在本發明的某些方面，鑑定、評價用生物學方法產生的突變病毒的突變和將其引入相同或不同病毒的重組毒株中。用於摻入本發明重組病毒中的生物學方法產生的非節段性負鏈RNA病毒的減毒突變可能是天然發生的，或可通過熟知的誘變和分析方法將其引入野生株後鑑定並分析特徵。例如，可通過病毒在細胞培養物中的生長期間加入化學誘變劑進行化學誘變，通過選擇在次優溫度下傳代的病毒以引入生長限制性突變，或通過選擇在細胞培養物中產生小嗜菌斑(sp)的誘變病毒，來產生不完全減毒的親代病毒突變株，見上述引入的參考文獻中所述。
「生物學方法產生的」指任何不通過重組方法產生的病毒。因此，生物學方法產生的病毒包括具有野生型基因組序列的天然產生的病毒和具有參比野生型序列的等位基因或突變基因組變異的病毒，例如，生物學方法產生的具有確定減毒表型突變的病毒。同樣，生物學方法產生的病毒包括通過其它方法，如不包括直接重組DNA操作而通過人工誘變和選擇方法，由親代毒株產生的突變體。
如需要，可以單獨或組合方式引入在生物學方法產生的突變的非節段性負鏈RNA病毒中鑑定的突變，以將本發明重組病毒調整到合適的減毒和免疫原性水平，和對減毒表型逆轉的遺傳抗性等。按照前面的描述，能從cDNA有效產生感染性重組非節段性負鏈RNA病毒使得能將經特定工程改造的變化引入重組病毒的廣泛組裝中。可用這些感染性重組病毒進一步鑑定生物學方法產生的減毒株中的特異性突變，例如規定ts、ca、att和其它表型的突變。將這個和其它方法鑑定的所需突變引入其它重組病毒株。本文提供的從cDNA產生新的非節段性負鏈RNA病毒的獨特能力得以將這些突變以單獨或各種所選組合的方式常規摻入新病毒的cDNA克隆中，隨後不難測定含引入突變的被拯救的重組病毒的表型。
在本發明其它實施方式中，通過製作異源突變病毒的突變圖譜、用常規序列排列對比鑑定受體重組病毒的相應位點、和將受體病毒的天然序列突變為在該異源突變基因型中觀察到的相同或保守突變，而「轉移」異源負鏈RNA病毒中鑑定的所需突變。此種轉移突變的通用性合理設計方法的描述見2000年4月12日提交的國際申請號PCT/US00/09695,10/19/00公開的WO 00/61737，對應於01/08/02提交的美國國家階段申請09/958,292，並要求1999年4月13日提交的美國臨時專利申請序列號60/129,006的優先權，各自引入本文作為參考。Newman等，Virus Gene 2477-92，2002；Feller等，Virology 10；276190-201，2000；Skiadopoulos等，Virology260125-35，1999；和Durbin等，Virology 261319-30，1999中提供了關於本發明這個方面的其它描述，各自引入本文作為參考。
常常需要修飾受體重組病毒基因組或反義基因組，使其編碼目標突變位點中的改變，該改變保守地對應於異源突變病毒中所鑑定的改變。例如，如果與相應的野生型序列相比，某胺基酸取代標誌著該突變病毒中的一個位點突變，那麼可在該重組病毒的相應殘基上經工程改造產生一個類似取代。一般這種取代特指與該突變病毒蛋白中存在的取代殘基相同或保守的胺基酸。然而也可以改變該突變蛋白中的取代殘基的非保守突變位點的天然胺基酸殘基(例如，利用任何其它胺基酸來破壞或削弱野生型殘基的功能)。鑑定到其中含有示例性突變並將其轉移入本發明重組病毒的負鏈RNA病毒包括PIV(如HPIV1、HPIV2、HPIV3、BPIV3和MPIV1)、RSV、新城疫病毒(NDV)、猴病毒5(SV5)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒、犬瘟熱病毒(CDV)、腮腺炎病毒、狂犬病病毒(RaV)和水泡性口炎病毒(VSV)等。
如上所述，可以通過幾種已知方法來產生足夠減毒的生物學方法產生的病毒突變株。一種這樣的方法包括使部分減毒的病毒在細胞培養物中在逐漸降低的減毒溫度下傳代。例如，通過在細胞培養物中，在次優溫度下傳代來產生部分減毒的突變株。因此，冷適應的(ca)突變株或其它部分減毒的病毒株適應了在較低溫度下培養傳代而有效生長。這種在冷傳代期間選出的突變病毒與部分減毒的親代相比，衍生株的殘餘毒力大大降低。或者，可通過對部分減毒的親代病毒進行化學誘變將特定突變引入生物學方法產生的病毒，例如，引入ts突變，或者在對已含ts的病毒而言，引入足以提高該減毒衍生物的減毒效果和/或ts表型穩定性的其它ts突變。將ts突變引入非節段性負鏈RNA病毒的方法包括在誘變劑如5-氟尿嘧啶的存在下根據公知方法複製病毒。也可使用其它化學誘變劑。雖然幾乎任何病毒基因中的ts突變均可導致減毒，但發現對於此目的特別適合的靶是聚合酶(L)基因。例如，通過比較在許可溫度下的複製與幾種限制溫度下的複製，來確定用於本發明的示例性減毒病毒複製的溫度敏感性水平。與病毒在許可溫度下的複製相比，使病毒複製降低100倍或更多的最低溫度稱為截斷(shutoff)溫度。在實驗性動物和人中，非節段性負鏈RNA病毒的複製和毒力與該突變體的截斷溫度相關。
如圖3(A-C圖)所示，可將在異源負鏈RNA病毒中鑑定的各種突變摻入本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒，產生減毒或其它所需表型改變。該圖提供HPIV2野生型(wt)、HPIV3wt、HPIV1wt或BPIV3wt之間的示例性序列排列對比，鑑定異源病毒中含有的已知減毒突變區域。根據這些和類似比較，將以前在異源病毒中鑑定的突變繪製到本發明目標病毒的相應位置圖上，以便「轉移」(即通過引入相同的保守或非保守突變，可能包括在通過排列對比鑑定的同源或相應位置上的取代、缺失或插入)到本發明的所述重組病毒中。將已可得到的這種突變的大組裝物(參見，例如，Newman等，Virus Genes 2477-92，2002；Feller等，Virology 276190-201，2000；Skiadopoulos等，Virology 260125-35，1999；和Durbin等，Virology 261319-30，1999，各自引入本文作為參考)摻入本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒。如圖3A和3C(A-C圖)所示，通過常規序列對比可鑑定出以前規定異源病毒的表型改變(當例如，通過取代改變了所指野生型殘基時)所示的相應胺基酸位置。從而鑑定本發明目標病毒(如HPIV1)的相應胺基酸位置，成為在重組病毒中產生減毒或其它所需表型改變進行突變的靶位點。
在某些詳述實施方式中，本發明的非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組經重組修飾，而摻入了選自以前在HPIV3 JS cp45病毒L蛋白Tyr942、Leu992和/或Thr1558相應位置上鑑定的胺基酸取代的一個突變或其任意組合。例如，摻入這些示例性突變的野生型(wt)HPIV2 L的相應靶位置是Tyr948、Ala998和Leu566。在其它示例性實施方式中，修飾重組的HPIV或其它非節段性負鏈RNA病毒基因組或反義基因組，以在與異源性突變非節段性負鏈RNA病毒，如另一種HPIV、非人PIV如牛PIV3(BPIV3)或鼠PIV1(MPIV1)，或非PIV病毒如呼吸道合胞病毒(RSV)中所鑑定的減毒突變某胺基酸位置相對應的胺基酸位置上摻入減毒突變。在一個示例性實施方式中，將在BPIV3病毒L蛋白的胺基酸位置Thr 1711中鑑定的減毒突變摻入重組HPIV2的相應位置(Ser1724)，如常規排列對比方法所鑑定的位置中(圖3A和3C，A-C圖；也參見Schmidt等，J.Virol.748922-9，2000，引入本文作為參考)。
在本發明的其它詳述實施方式中，非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組在與呼吸道合胞病毒(RSV)中所鑑定的減毒突變的某胺基酸位置相對應的胺基酸位置上摻入了規定減毒突變的重組修飾。在一個特定實施方式中，與例如HPIV2、HPIV3和HPIV1 L蛋白中的保守位置對比在RSV中鑑定的減毒突變包含RSV L蛋白521位置上的苯丙氨酸取代。在HPIV2中，突變的示例性保守靶位點對應於HPIV2 L蛋白的Phe460，圖3A和3B(A-C圖)。因此，在一個示例性實施方式中，HPIV2 L蛋白的Phe460被替換為Leu殘基，或另一胺基酸。
下表2說明和描述了用於摻入本發明的重組RSV中和其它非節段性負鏈RNA病毒的RSV中的各種示例性突變，並在本文以下的實施例中進一步詳述。
表2RSV cDNA突變野生型RSV與RSV cDNA突變的序列對比
可經工程改造摻入到本發明重組非節段性負鏈RNA病毒中的許多上述示例性突變已在基於重組HPIV3的候選病毒中被成功地工程改造和回收(Durbin等，Virology235323-332，1997；Skiadopoulos等，J.Virol.721762-1768，1998；Skiadopoulos等，J.Virol.731374-1381，1999；1998年5月22日提交的美國專利申請序列號09/083,793；1999年12月10日提交的美國專利申請序列號09/458,813；1999年12月10日提交的美國專利申請序列號09/459,062；1997年5月23日提交的美國臨時申請號60/047,575(對應於國際公告號WO 98/53078)和1997年9月19日提交的美國臨時申請號60/059,385，各自引入本文作為參考)。此外，上述引入的參考文獻描述了構建嵌合性PIV重組病毒，例如，其HPIV 1的HN和F基因被替換為HPIV3的部分背景基因組或反義基因組，經進一步修飾而攜帶有在HPIV3 JS cp45中鑑定的一個或多個減毒突變。一種這樣的嵌合重組病毒摻入了在cp45的L基因中鑑定的所有減毒突變。已顯示，可將異源(HPIV1)HN和F基因外的所有cp45突變摻入HPIV3-1重組病毒中，來產生減毒的嵌合性候選病毒。
如上所述，生物學方法產生的非節段性負鏈RNA病毒的這些和其它突變代表一個大「菜單」，可從其中選擇單個突變並與其它突變組合，以調整本發明重組病毒的減毒、免疫原性和遺傳穩定性水平。在本文中，許多重組候選病毒包括一種或多種，常常是兩種或多種生物學方法產生的非節段性負鏈RNA病毒的突變，例如，HPIV3 JScp45、BPIV3和RSV中鑑定的任何一個突變或其組合。本發明的許多重組病毒將摻入多個如此鑑定的突變。在規定這些突變的密碼子中進行多個核苷酸取代而使重組病毒中的突變穩定化，以抵制重組病毒(毒力)的回覆。
通過鑑定與所需表型，如ca或ts表型相關的特定突變並將其摻入感染性重組病毒中，本發明在所鑑定的突變位置上或其附近提供了其它的位點特異性修飾。生物學方法產生的非節段性負鏈RNA病毒中產生的大多數減毒突變是單核苷酸改變，但也可通過重組技術將其它「位點特異性」突變摻入本發明重組病毒中。本文使用的位點特異性突變包括1-3個，高達約5-15個或更多個核苷酸的改變(例如，從野生型病毒序列、從所選突變病毒株序列、或從經過誘變的親代重組病毒克隆改變而產生)的插入、取代、缺失或重排。可將這種位點特異性突變摻入所選的生物學方法產生的點突變的區域內。或者，可將突變引入重組病毒克隆中的其它不同部分中，例如，引入順式作用調節序列或編碼蛋白活性位點、結合位點、免疫原性表位等的核苷酸序列中或其附近。在各種實施方式中，將位點特異性核苷酸取代、增加、缺失或重排引入相對於靶核苷酸5』或3』位置的上遊或下遊，如距離1-3個、5-10個和多達15個或更多個核苷酸，例如，以構建或消除原有的順式作用調節元件。
除了單點和多點突變和位點特異性突變外，對本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒的改變包括一個或多個基因或基因組節段的缺失、插入、取代或重排。特別有用的是參與產生其它所需表型影響的一個或多個基因或基因組節段的缺失。本文中描述了對HPIV的各種修飾(參見，例如，Durbin等於2002年6月25日發表的美國專利號6,410,023，引入本文作為參考)。例如，在HPIV3中，可通過修飾重組的HPIV3基因組或反義基因組，例如摻入改變起始密碼子的編碼分配的突變、引入一個或多個終止密碼子或使ORF的全部或部分編碼序列缺失，而降低或消除C、D或V開放閱讀框(ORF)或另一輔助基因中的一種或多種的表達(參見，例如，Durbin等於2002年6月25日提交的美國專利號6,410,023，引入本文作為參考)。對HPIV1和HPIV2的其它示例性修飾包括能改變或消除C、C』、Y1和/或Y2ORF或其它輔助基因中一種或多種表達的修飾。這些重組病毒將擁有非常理想的用於開發免疫原性組合物的表型特徵。具體說，所述修飾是高度穩定的，可規定一種或多種所需表型改變，包括(i)在細胞培養物中生長性能的改變，(ii)在哺乳動物的上和/或下呼吸道中減毒，(iii)病毒噬斑大小的改變，(iv)細胞病變效應的改變，和(v)免疫原性的改變。
因此，在本發明的更詳細方面，重組非節段性負鏈RNA病毒摻入了部分或全部基因缺失、敲除突變或僅降低或提高所選基因表達的突變中的一種或多種。這可通過，例如，在所選編碼序列中引入移碼框突變或終止密碼子，改變翻譯起始位點，改變某基因位置或引入一個上遊起始密碼予以改變其表達速率，改變基因起始(GS)和/或基因終止(GE)轉錄信號以改變表型，或修飾RNA編輯位點(例如，生長轉錄、溫度限制等)實現。在本發明的更詳細方面，提供的重組非節段性負鏈RNA病毒中在沒有缺失基因或其節段的情況下，通過例如將多個翻譯終止密碼子引入翻譯開放閱讀框、改變起始密碼子或修飾某編輯位點而能在翻譯或轉錄水平上消除一種或多種基因的表達。這些形式的敲除病毒常常顯示在組織培養中生長速率降低，噬斑尺寸小。因此，這些方法提供了另一類型的減毒突變，可消除病毒基因，一般不是主要的病毒保護性抗原之一的基因的表達。本文中，可通過上述缺失誘變替代在沒有基因或基因組節段缺失的情況下所產生的敲除病毒表型，以有效預防可恢復靶蛋白合成的校正突變。用本領域已知的替代設計和方法進行其它基因敲除(如Kretschmer等，Virology 216309-316，1996；Radecke等，Virology 217418-421，1996；Kato等，EMBO J.16578-587，1987；和Schneider等，Virology 277314-322，1996中的描述，各自引入本文作為參考)。
可引入本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒的核苷酸修飾可改變基因組或反義基因組中的少量鹼基(如15-30個鹼基、多達35-50個鹼基或更多)，大段核苷酸(如50-100、100-300、300-500、500-1,000個鹼基)，或幾乎全部或全部基因(例如1,000-1,500個核苷酸、1,500-2,500個核苷酸、2,500-5,000個核苷酸、5,000-6,000個核苷酸或更多)，這取決於修飾的性質和所需效應。例如，可通過改變少量鹼基插入或消除某免疫原性表位或改變小的基因組節段，而當添加(插入，addition)、取代、缺失或重排諸基因或大基因組節段時，涉及大量鹼基。
在相關方面，本發明提供的適合於在衍生自生物學方法產生的非節段性負鏈RNA病毒的重組非節段性負鏈RNA病毒中的補充突變(例如，ca和ts突變)，涉及進一步修飾的重組病毒中相同或不同基因的其它突變類型。例如，可根據表達水平選擇性改變，或加入、缺失或取代一種或多種天然或異源基因的整體或一部分，可單獨或與其它所需修飾組合地進行這些修飾，以產生具有新特徵的重組病毒。或者或此外，可以改變基因在該重組病毒中的順序，可用基因組啟動子的反義基因組對應物取代該基因組啟動子，反之亦然。可以在該序列中進行不同或額外的修飾，以有助於操縱，如在各基因間區或其它地方插入獨特的限制性位點。可去除不翻譯的基因序列，以增加插入外來序列的容量。
用於摻入本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒中的其它突變包括針對順式作用信號的突變，這可通過例如病毒微型基因組的突變分析容易地鑑定。例如，對前導區、尾隨區和/或側翼序列的插入和缺失分析可鑑定病毒啟動子和轉錄信號，並提供與RNA複製或轉錄的不同程度降低相關的一系列突變。也可利用這些順式作用信號的飽和誘變(藉此將各位置修飾為各替代的核苷酸)來鑑定影響RNA複製或轉錄的許多突變。可將這些突變之一如本文所述插入病毒的反義基因組或基因組中。利用病毒微型基因組幫助採用完整的反義基因組cDNA評價和操縱反式作用蛋白和順式作用RNA序列，見上述引用的參考文獻中所述。
本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒中的其它突變還可包括用其反義基因組對應物取代基因組的3』端，反之亦然，這與RNA複製和轉錄的改變相關。在一個示例性實施方式中，可通過用合成方法製備的和設計的能有效翻譯的序列取代天然序列，以提高特定病毒蛋白，如PIV的保護性HN和/或F抗原的表達水平。本文中顯示了密碼子的採用可能是哺乳動物病毒蛋白翻譯水平的主要影響因素(Haas等，CurrentBiol.6315-324，1996，引入本文作為參考)。通過重組方法優化編碼重組病毒所述蛋白的mRNA的密碼子採用將提高這些基因的表達。
在另一示例性實施方式中，單獨或與引入上遊啟動密碼子結合修飾了圍繞所選病毒基因翻譯起始位點的序列(常常包括相對於AUG起始位點-3位置的核苷酸)，以通過規定上調或下調翻譯來調節基因表達。或者，與本文揭示的其它重組修飾結合，可通過改變轉錄GS或GE信號調節重組病毒任一所選基因的表達。在另一實施方式中，在轉錄水平調節重組非節段性負鏈RNA病毒中的基因表達水平。在一個方面，改變所選基因在病毒基因圖中的位置，使其更接近啟動子或更遠離啟動子，從而分別更有效或更不有效地表達該基因。根據這個方面，可實現調節特定基因的表達，使該基因的表達與常常伴隨的位置上互補取代的基因表達水平降低程度相當的野生型水平相比，降低或升高2倍，更通常是4倍，高達10倍或更高。這些和其它轉座性改變產生，例如由於所選涉及RNA複製的病毒蛋白的表達降低而具有減毒表型或具有其它需要性能如抗原表達增加的新重組病毒。
在其它實施方式中，可方便地修飾用於免疫原性組合物中的重組病毒，以適應循環病毒中的抗原性漂變。一般該修飾位於抗原性糖蛋白中，例如PIV的HN和/或F蛋白，或RSV的F、G或SH蛋白中。通過替換不同毒株或群受體克隆中的相應區域，或通過加入一個或多個拷貝的能提呈多個抗原形式的基因或基因組節段，將一個病毒株或群的整個糖蛋白基因，或編碼其具體免疫原性區域的基因組節段摻入重組基因組或反義基因組cDNA中。然後，可將該修飾的重組病毒產生的後代病毒用於免疫方法中對抗新出現的毒株。
在本發明的某些方面，用異源性(即，來自不同種病毒或株)對應序列取代非節段性負鏈RNA病毒的編碼序列或非編碼序列(如啟動子、基因末端、基因起點、基因間元件或其它順式作用元件)，產生具有各種可能的減毒和其它表型效應的嵌合性病毒。例如，可將牛PIV3(BPIV3)或鼠PIV1(MPIV1)的基因或基因組節段輸入重組HPIV「背景」基因組或反義基因組中來工程改造其宿主範圍和其它所需效應，其中牛或鼠基因不能在人細胞中起有效作用(例如，由於該異源序列或蛋白和通常與被取代序列合作行使病毒轉錄、翻譯、組裝等的生物學相互作用的HPIV序列或蛋白不相容，或更通常是在宿主範圍限制上，與在許可和不太許可的宿主之間功能不同的細胞蛋白不相容)。
在示例性實施方式中，根據牛和異源性人PIV結構和功能的已知方面，選擇用於引入HPIV的牛PIV序列。在更詳細方面，本發明提供了以構建的HPIV和非人PIV，例如MPIV1(仙臺病毒)、BPIV3、SV5、SV41和NDV之間嵌合體為基礎使重組HPIV候選物減毒的方法(例如，Schmidt等於2000年6月1日提交的美國專利申請序列號09/586,479(對應於PCT公告WO 01/04320)；Schmidt等，J.Virol.748922-9，2000中所述，各自引入本文作為參考)。該減毒方法基於因將非人PIV的一個或多個基因或基因組節段引入人PIV載體的嵌合病毒中而產生的宿主範圍效應。例如，BPIV和HPIV之間有許多核苷酸和胺基酸序列差異，這反映為宿主範圍不同。HPIV3和BPIV3之間，各下述蛋白的胺基酸相同性百分數為N(86％)、P(65％)、M(93％)、F(83％)、HN(77％)和L(91％)。與BPIV3的兩種不同株在相同動物中的限制性複製相比，HPIV3在恆河猴中高度許可地生長說明宿主範圍不同(van Wyke Coelingh等，J.Infect.Dis.157655-662，1988，引入本文作為參考)。雖然HPIV3和BPIV3之間宿主範圍不同的基礎還有待完全闡明，但已顯示涉及到多個基因和多個胺基酸差異。涉及的多個基因和可能的順式作用調節序列，各包括多個胺基酸或核苷酸不同，為減毒對逆轉高度穩定性提供了廣泛基礎。這與通過一個或幾個點突變減毒的其它減毒HPIV3活病毒的情況相反。在後一種情況下，任何單個突變的逆轉都可能產生明顯的毒力回復，或者在僅有一個殘基減毒的情況下，毒力完全回復。在本發明示例性實施方式中，重組HPIV基因組或反義基因組與異源基因或基因組節段，如來源於BPIV3的ORF的N、P、M或L，或其它動物的副粘病毒相組合。
因此，本文提供的嵌合性人-牛或人-鼠重組HPIV，包含部分或完整的「背景」HPIV基因組或反義基因組，其衍生自或模仿HPIV與非人PIV的一個或多個異源基因或基因組節段相組合後形成了該嵌合性PIV基因組或反義基因組。在本發明的某些方面，這種類型的嵌合性HPIV摻入了與例如牛PIV的一個或多個異源基因或基因組節段組合的部分或完整的HPIV背景基因組或反義基因組。該部分或完整的HPIV背景基因組或反義基因組一般起受體骨架的作用，其中摻入了對應的非人PIV的異源基因或基因組節段。該對應的PIV的異源基因或基因組節段代表「供體」基因，或代表與背景基因組或反義基因組相組合或在其中含有取代的多核苷酸，從而產生與一個或兩個供體PIV相比具有新表型特徵的嵌合性HPIV。例如，在所選受體HPIV株中加入異源基因或基因組節段或取代，與未修飾的受體和/或供體的相應表型相比，可導致減毒增加或降低、生長改變、免疫原性改變或其它所需的表型改變(Schmidt等於2000年6月1日提交的美國專利申請序列號09/586,479；Schmidt等，.J.Virol.748922-9，2000，各自引入本文作為參考)。
可選擇用於在嵌合性PIV載體中作為異源取代或加入的基因和基因組節段，包括編碼PIV N(或者稱為NP、核衣殼蛋白)、V、P、M、F、HN和/或L蛋白或其部分的基因或基因組節段。此外，可將編碼見於其它PIV病毒的蛋白質，以及非PIV蛋白質(如見於腮腺炎、RSV和SV5病毒中的SH蛋白)的基因和基因組節段，摻入本發明的其它嵌合性HPIV重組物中，反之亦然。調節區，如基因外3』前導區或5』尾隨區，和基因起點、基因末端、基因間區、或者3』或5』非編碼區也可用作異源取代或加入。在示例性方面，攜帶有一個或多個牛或鼠PIV基因或基因組節段的嵌合性HPIV，例如在人PIV感染的哺乳動物模型，如倉鼠和非人靈長類的呼吸道中顯示出高度的宿主範圍限制。在更詳細的實施方式中，通過加入或取代選自N、M、L、V和P基因和基因組節段的一個或多個牛PIV3基因或基因組節段，將HPIV減毒成為部分或完整的HPIV背景基因組或反義基因組。
一般說，用於本發明免疫原性組合物的人-牛和其它嵌合病毒表現出的宿主範圍限制程度與各非人病毒或其它「供體」株表現出的宿主範圍限制程度相當。在某些實施方式中，該限制與真正的宿主範圍表型相對應，即，應對所述宿主特異，體外應不限制在合適細胞系中的複製。此外，攜帶有一個或多個異源基因或基因組節段的嵌合病毒應能在易於被受體病毒感染的宿主中引發所需的免疫應答。因此，本發明提供了根據宿主範圍效應對活的非節段性負鏈RNA病毒的減毒，用於開發防禦這些病毒和其它病原體的免疫原性組合物。
與本發明嵌合病毒中提供的宿主範圍表型效應結合，常常需要通過引入使嵌合性病毒減毒提高或降低的其它突變來調整減毒表型。因此，在本發明的其它方面，通過在得到的病毒或亞病毒顆粒中引入規定減毒表型的一種或多種減毒突變進一步修飾產生的減毒嵌合病毒的嵌合基因組或反義基因組。這些可包括根據上述合理設計的誘變策略從頭產生的突變並測試其減毒效果。例如，可鑑定現有的生物學方法產生的突變病毒中的減毒突變，然後將其摻入本發明的嵌合病毒。示例性突變具體指RNA調節序列或編碼蛋白中的損傷。
本發明的某些候選減毒病毒和嵌合病毒，與相應的野生型或突變體親代病毒株的生長相比，以在已接受的動物模型(如倉鼠、恆河猴或黑猩猩-其中該病毒顯示了與人體中所見到的相關複製和免疫原活性)的下和/或上呼吸道中複製為標誌的減毒降低了至少約兩倍，更經常約5倍、10倍或20倍，有時50-100倍和高達1,000倍或更高(例如，在感染後3-8天之間測定)。
可將各種添加的或取代的基因或基因組節段用常規方法引入本發明重組和嵌合性病毒。例如，可在重組或嵌合基因組或反義基因組內的各種位點之一，例如在HPIV中N的3』位置，N/P、P/M和/或HN/L基因之間，或在HPIV基因組或反義基因組的其它基因間連接區或非編碼區中插入各種額外的異源基因或基因組節段。插入的基因可以在受體基因的共同控制下，或在一組獨立的轉錄信號的控制下。本文中感興趣基因包括編碼細胞因子，如白介素(IL-2至IL-18，如白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL6)、白介素12(IL-12)、白介素18(IL-18)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、幹擾素γ(IFNγ)或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的基因(參見，例如，2000年7月12日提交的美國申請號09/614,285和1999年7月13日提交的優先權美國臨時申請序列號60/143,425，各自引入本文作為參考)。這些額外蛋白的共表達能夠定量和/或定性地修飾和改進針對本發明重組病毒的免疫應答。
在本發明的其它方面，分別採用將異源核苷酸序列插入重組非節段性負鏈RNA病毒來調節候選重組病毒的，例如對上呼吸道感染的減毒水平。因此，可將核苷酸序列插入重組非節段性負鏈RNA病毒，指導外來蛋白的表達和在動物宿主中減毒該病毒，或分別用核苷酸插入來減毒候選病毒。為明確支配基因插入物對減毒的影響的一些規律，可將不同長度的基因單位插入野生型病毒骨架中，並檢測基因單位長度對減毒的影響。在這個方面，考慮了不含明顯ORF的基因單位插入物，允許在不受該基因表達的蛋白的影響下鑑定基因單位長度的影響。可將這些異源序列作為不同大小的額外基因單位插入，例如，長度從約150或更多個核苷酸至長度長達3,000個核苷酸或更長。如本文所證明的，基因插入或延伸的長度大於約3,000個核苷酸。
長度約1,000或2,000個核苷酸的基因單位(GU)插入物將使用於哺乳動物對象上呼吸道的本發明非節段性負鏈RNA病毒大大減毒。此外，基因單位插入物可具有使候選病毒減毒和誘導抗第二病毒的免疫應答的雙重效果。或者，在不能表達其它蛋白的病毒基因3』非編碼區(NCR)的基因延伸也可使其自身減毒。在本發明這些方法中，基因插入長度是減毒的決定因素。
本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒中的GU和NCR插入物所產生的減毒表型特徵是在體外有效複製，而在體內複製降低。GU插入所引起的減毒機制可能是由於一種或多種下述因素在體內起到支配性作用所致。由於在轉錄梯度中接近啟動子的基因的轉錄速率比遠離啟動子的基因高，所以額外基因單位的加入可降低下遊基因的轉錄水平。如果下遊基因產物有限或如果改變了有效複製所需的基因產物的特定比率，由於下遊基因產物的mRNA豐度降低所引起它們的表達降低可導致減毒。據認為，轉錄梯度是轉錄期間以及在跨越基因連接處轉移期間轉錄酶複合物從模板上脫落的結果。或者，基因組總長度的增加和轉錄了額外的mRNA可提高產生的病毒雙鏈RNA的水平，進而可誘導幹擾素系統的抗病毒活性達到較高水平。最後，由於基因組和反義基因組長度的增加，可降低基因組複製的總水平。這可能是由於在複製基因組RNA或反義基因組RNA期間複製酶複合物從模板上脫離。降低可用於包裝入病毒粒子中的基因組的量可致使導致減毒病毒產率降低。
涉及本發明重組非節段性負鏈RNA病毒中全病毒基因或基因組節段改變的缺失、插入、取代和其它突變可產生高度穩定的候選病毒，這對免疫抑制的個體而言尤其重要。許多這些改變將導致獲得減毒的毒株，然而其它改變將規定不同類型的所需表型改變。例如，附屬(即不是體外生長必需的)基因是編碼特異性幹擾宿主免疫力的蛋白的優秀候選物(參見，例如，Kato等，EMBO.J.16578-87，1997，引入本文作為參考)。預計消除候選病毒中的這種基因能降低毒力和致病性和/或提高免疫原性。
在本發明其它詳述實施方式中，用經重組修飾摻入異源病原體的一種或多種抗原決定簇的「載體」基因組或反義基因組，構建嵌合性非節段性負鏈RNA病毒。該載體基因組或反義基因組包含部分或整個非節段性負鏈RNA病毒基因組或反義基因組，本身可摻入核苷酸修飾如減毒突變。通過摻入異源基因或基因組節段修飾該載體基因組或反義基因組形成嵌合性結構。更具體說，通過基於cDNA的病毒回收系統構建本發明嵌合性病毒，該回收系統產生摻入與編碼異源抗原決定簇的一種或多種「供體」核苷酸序列相結合的部分或整個載體或「背景」病毒基因組或反義基因組。在示例性實施方式中，修飾非節段性負鏈RNA病毒載體基因組或反義基因組，使其摻入編碼一種或多種異源非節段性負鏈RNA病毒(如HPIV、HMPV、MV或RSV)和/或非病毒病原體的抗原決定簇的一種或多種基因或基因組節段。這樣構建的本發明嵌合性病毒可引發針對特異性非節段性負鏈RNA病毒(如HPIV1、HPIV2、HPIV3、RSV-A、RSV-B、HMPV或MV)或針對非病毒病原體的免疫應答。或者，提供採用嵌合性病毒的組合物和方法能引發針對多個非節段性負鏈RNA病毒(例如，多個HPIV，或者HPIV和RSV或MV)的多特異性免疫應答的組合物和方法。在又一實施方式中，提供了用嵌合性病毒引發抗節段性負鏈RNA病毒(如流感A或B或冠狀病毒)、正鏈RNA病毒(如披膜病毒、α病毒(包括腦炎病毒)、黃病毒(包括西尼羅河病毒、登革熱病毒)，和小核糖核酸病毒(包括脊髓灰質炎病毒和其它腸道病毒))或DNA病毒(如單純皰疹和帶狀皰疹病毒、B型肝炎病毒、EB病毒和細胞巨化病毒)的免疫應答反應。
在更詳細方面，部分或整個載體基因組或反義基因組通常的作用是作為骨架摻入到不同病原體的異源基因或基因組節段中。異源病原體常常是不同的非節段性負鏈RNA病毒，這些病毒的一種或多種基因或基因組節段與載體基因組或反義基因組相組合或被取代。除提供新免疫特性之外，在載體病毒中加入或代之以異源基因或基因組節段，與未修飾的載體和供體病毒的相應表型相比可產生減毒提高或降低、生長改變或其它所需表型改變。
引入異源免疫原性蛋白、蛋白結構域和免疫原性表位以產生嵌合性病毒，對於在免疫宿主中產生新免疫應答尤其有用。在受體載體基因組或反義基因組中加入或代之以一種供體病原體的免疫原性基因或基因組節段可產生針對該供體病原體、該載體或這二者的免疫應答。
對於HPIV3已開發了用於工程改造嵌合性病毒的通用方法和組合物(Durbin等，Virology 235323-332，1997；Skiadopoulos等，J.Virol.721762-1768，1998；Tao等，J Virol 722955-2961，1998；Skiadopoulos等，J.Virol.731374-1381，1999；Skiadopoulos等，Vaccine 18503-510，1999；Tao等，Vaccine171100-1108，1999；Tao等，Vaccine 181359-1366，2000；1998年5月22日提交的美國專利申請序列號09/083,793；1999年12月10日提交的美國專利申請序列號09/458,813；1999年12月10日提交的美國專利申請序列號09/459,062；1997年5月23日提交的美國臨時申請號60/047,575(對應於國際公告號WO 98/53078)和1997年9月19日美國臨時申請號60/059,385，各自引入本文作為參考)。具體說，上述引入的參考文獻描述了嵌合性PIV重組病毒的構建，例如HPIV 1的HN和F基因被取代為部分HPIV3背景基因組或反義基因組，再經進一步修飾使其攜帶有在HPIV3 JS cp45中鑑定的一種或多種減毒突變。一種這類嵌合性重組病毒摻入了在異源(HPIV1)HN和F基因以外cp45的L基因中鑑定的所有減毒突變，產生了一種減毒的候選嵌合病毒。在上述引入的參考文獻中對於RSV提供了產生嵌合性非節段性負鏈RNA病毒的其它代表性內容。
也可構建表達嵌合性蛋白，如對融合有不同非節段性負鏈RNA病毒或非病毒病原體的異源胞外結構域的載體具有特異性胞質尾和/或跨膜結構域的免疫原性糖蛋白的本發明嵌合性非節段性負鏈RNA病毒，提供的融合蛋白能引發抗該異源病原體的免疫應答。例如，可將編碼HPIV1或HPIV3的HN糖蛋白胞外結構域或F糖蛋白的異源基因組節段與編碼相應HPIV2 HN或F糖蛋白胞質和跨膜結構域的基因組節段連接，形成的HPIV2-1或HPIV2-3嵌合性糖蛋白引發抗HPIV1或HPIV3的免疫應答。在更詳細的實施方式中，該異源基因組節段編碼糖蛋白胞外結構域或其免疫原性部分或表位，任選地還可包含異源糖蛋白或「供體」糖蛋白的其它部分，例如被載體基因組或反義基因組中對應的糖蛋白胞外和跨膜結構域取代的胞外結構域和跨膜區。Tao等於1999年12月10日提交的美國專利申請序列號09/459,062中說明了有關本發明這些方面的其它詳情，引入本文作為參考。
本發明的這種嵌合性非節段性負鏈RNA病毒的另一例子，是表達有效促進該重組病毒與靶細胞膜融合的異源融合蛋白或其多肽片段的嵌合性蛋白，其與編碼病毒G蛋白一部分，具體是該蛋白的羧基端近膜胞外區(「尾」)部分的cDNA融合。在一個實施方式中，該異源融合蛋白是CD4，所述病毒是VSV。Whitt等於2002年12月24日發表的美國專利號6,497,873中說明了有關本發明這些方面的其它詳情，引入本文作為參考。
本文所用術語「基因」一般指編碼mRNA的非節段性負鏈RNA病毒基因組的一部分，它一般在上遊端的基因起始(GS)信號處開始，在下遊端的基因終止(GE)信號處終止。術語基因也可與術語「翻譯開放閱讀框」或ORF互換使用，尤其是當蛋白由另一ORF而非獨特的mRNA表達時。病毒基因組也含有基因外前導區和尾隨區，具有病毒複製和轉錄所需的啟動子部分，以及非編碼和基因間區。轉錄在3』端開始，並通過依次的停止-啟動機制進行，該機制受基因邊界處的短保守基序指導。各基因的上遊端含有基因起始(GS)信號，它指導其對應mRNA的啟動。各基因的下遊端含有指導聚腺苷酸化和終止的基因終止(GE)基序。
「基因組節段」指任意長度的PIV基因組的連續核苷酸，可以是ORF、基因或基因外區的一部分，或它們的組合。當所述基因組節段編碼抗原決定簇時，該基因組節段編碼至少一個能夠在哺乳動物宿主中引發體液或細胞介導的免疫應答的免疫原性表位。該基因組節段也可編碼免疫原性片段或蛋白結構域。在其它方面，供體基因組節段可編碼多個免疫原性結構域或表位，包括經重組方法合成的含多個、重複或不同的免疫原性結構域或表位的序列。
對於人PIV3株JS(GenBank登錄號Z11575，引入本文作為參考)和Washington(Galinski M.S.Kingsbury，D.W.(編)，《副粘病毒》(TheParamyxoviruses)，第537-568頁，Plenum Press，New York，1991，引入本文作為參考)；HPIV1/Wash64(GenBank登錄號AF457102，引入本文作為參考)；HPIV2(2002年9月18日提交的美國臨時申請號60/412,053，引入本文作為參考)；牛PIV3(BPIV3)株910N(GenBank登錄號D80487，引入本文作為參考)；BPIV3堪薩斯(GenBank登錄號AF178654，引入本文作為參考)；BPIV航運熱(GenBank登錄號AF178655，引入本文作為參考)；RSV A2(GenBank登錄號AF035006，引入本文作為參考)；和HMPV(GenBank登錄號AF371337，引入本文作為參考)已描述了用於構建本發明的嵌合性非節段性負鏈RNA病毒的示例性異源病毒基因組序列。例如，在1998年5月22日提交的美國專利申請序列號09/083,793；1999年12月10日提交的美國專利申請序列號09/458,813；1999年12月10日提交的美國專利申請序列號09/459,0629；1997年5月23日提交的美國臨時申請號60/047,575(對應於國際公告號WO98/53078)，1997年9月19日提交的美國臨時申請號60/059,385；1999年12月10日提交的美國臨時申請號60/170,195；和2000年12月8日提交的美國專利申請序列號09/733,692(對應於國際公告號WO 01/42445A2)中提供了關於構建用於本發明的嵌合性非節段性負鏈RNA病毒的其它詳情，各自引入本文作為參考。
可容易地修飾本發明的嵌合性非節段性負鏈RNA病毒，使其表達廣範圍病原體的一種或多種主要抗原決定簇。在此方面，本發明提供了開發的摻入有下述病毒抗原決定簇能夠引發有效的抗下述病毒的免疫應答的重組病毒呼吸道合胞病毒(RSV)亞組A和亞組B、HMPV、麻疹病毒、人肺炎後病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、1型和2型人免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、狂犬病病毒、人肺炎後病毒(metapneuomovirus)、EB病毒、線狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、冠狀病毒(如SARS相關人冠狀病毒)、α病毒和流感病毒等其它病原體。可作為開發本發明方法所用免疫原性組合物的靶標的病原體包括病毒和細菌病原體，以及原生動物和多細胞細胞病原體。本文所述可用於摻入本發明嵌合性病毒中的許多重要人病原體的有用抗原決定簇是已知的或不難鑑定。因此，已鑑定了上述示例性病原體的主要抗原，包括麻疹病毒HA和F蛋白；RSV的F、G、SH和M2蛋白，腮腺炎病毒HN和F蛋白，人乳頭瘤病毒L1、L2、E6或E7蛋白，1型和2型人免疫缺陷病毒gpl20和gpl60蛋白，單純皰疹病毒和巨細胞病毒gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL和gM蛋白，狂犬病病毒G蛋白，人肺炎後病毒F和G蛋白，EB病毒gp350蛋白；線狀病毒G蛋白，布尼亞病毒G蛋白，黃病毒E和NS1蛋白，肺炎後病毒G和F蛋白，冠狀病毒刺突(S)和小膜(E)蛋白，和α病毒E蛋白。已良好地表徵了這些主要抗原，以及所列病原體和其它病原體的本領域已知的其它抗原，對它們的許多抗原決定簇，包括全長蛋白和它們的組成性免疫原性結構域、片段和表位作了鑑定、繪圖，並表徵了各自的免疫原活性。
在鑑定和表徵用於本發明的各種病原體主要抗原的眾多示例性繪圖研究中，表位作圖研究了HPIV3的血凝素-神經氨酸酶(HN)基因(van Wyke Coelingh等，J.Virol.611473-1477，1987，引入本文作為參考)。該報導利用抗HN蛋白的單克隆抗體(MAb)(抑制神經氨酸酶、血凝或二者活性)對選出的HPIV3變體的16個抗原變體作了詳細的抗原結構分析。各變體在HN基因中含有的單-點突變編碼HN蛋白中的一個胺基酸取代。HN蛋白的操作性和拓撲學圖譜與取代的相對位置良好相關。HN蛋白的計算機輔助分析預測出二級結構，主要由隨機親水性螺旋結構互連的疏水β摺疊組成。HN表位位於預測的螺旋區。抑制該病毒神經氨酸酶活性的Mab所識別的表位位於一個似乎在幾種副粘病毒HN蛋白中結構保守的區域可能代表了HN分子的唾液酸結合位點。
採用常規抗原作圖方法的此示例性工作，鑑定了對HN表位完整性很重要的一個胺基酸。大多數這些表位位於該分子的C-末端一半，正如所料，一個蛋白錨定在其N末端(Elango等，J.Virol.57481-489，1986)。以前發表的PIV3 HN的操作性和拓撲圖說明所用Mab識別出組成兩個拓撲結構上分離的位點(A和B)的六組不同的表位(I至VI)，它們通過第三位點(C)部分橋接。這些表位組代表了可單獨或以各種組合方式摻入本發明嵌合病毒中的有用候選抗原決定簇(也參見Coelingh等，Virology 143569-582，1985；Coelingh等，Virology 162137-143，1988；Ray等，Virology 148232-236，1986；Rydbeck等，J.Gen.Virol.671531-1542，1986，各自引入本文作為參考)。
var Wyke Coelingh等(J.Virol.63375-382，1989)進行的其它研究提供了有關選擇用於本發明的PIV抗原決定簇的進一步信息。在本研究中，用26個單克隆抗體(MAb)(14個中和性和12個非中和性)檢查HPIV3融合(F)糖蛋白的抗原結構、生物學性質和天然變異。對實驗室選擇的抗原變體和PIV3臨床分離物的分析說明該組MAb識別至少20個表位，其中14個參與中和。競爭型結合試驗證實了這14個中和表位組成了3個非重疊的主要抗原區(A、B和C)和一個橋聯位點(AB)，6個非中和表位形成四個位點(D、E、F和G)。大多數中和性MAb參與非相互競爭性結合反應，提示它們引起了其它中和表位中的構象改變。
已鑑定並表徵了用於本發明的呼吸道合胞病毒(RSV)的其它抗原決定簇。例如，Beeler等，J.Virol.632941-2950，1989，引入本文作為參考，利用十八種對RSV A2株的融合糖蛋白的特異性中和單克隆抗體(MAb)構建了涉及RSV中和和融合表位的詳細拓撲和操縱性圖。競爭性結合試驗鑑定到三個非重疊抗原區(A、B和C)和一個橋聯位點(AB)。選出了十三種MAb抗性突變體(MARM)，MAb與MARM或RSV臨床株的中和模式鑑定到至少16個表位。用抗六個位點A和AB表位的抗體選出的MARM顯示了小噬斑表型，這與F分子的生物活性區中的改變相一致。MARM分析也表明這些中和表位佔據了拓撲學上不同但構象上相互依賴的區域，具有獨特的生物學和免疫學性能。然後，在交叉中和試驗中用18個抗F MAb檢測23個臨床分離物(18個亞組A和5個亞組B)F表位中的抗原性改變。該分析鑑定了該分子上的恆定、可變和超變區，表明RSV F糖蛋白中和表位中的抗原性改變是非累積性遺傳異源性的結果。這16個表位中，8個在所有23個亞組A或亞組B臨床分離物(除一個外)中是保守的。這些抗原決定簇包括全長蛋白和它們的組成性抗原結構域、片段和表位，都代表了用於整合入本發明上述嵌合病毒中以引發新免疫應答的有用候選病毒。(也參見Anderson等，J.Infect.Dis.151626-633，1985；Coelingh等，J.Virol.63375-382，1989；Fenner等，Scand.J.Immunol.24335-340，1986；Fernie等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.171266-271，1982；Sato等，J.Gen.Virol.661397-1409，1985；Walsh等，J.Gen.Virol.67505-513，1986；Olmsted等，J.Virol.63411-420，1989，美國專利號5,639,853，各自引入本文作為參考)。
為在嵌合非節段性負鏈RNA病毒中表達異源病原體的抗原決定簇，本發明提供了許多方法和構建物。在某些詳述實施方式中，將含有編碼抗原蛋白的基因(如麻疹病毒HA基因)的開放閱讀框(ORF)的轉錄單元加入載體基因組或反義基因組的不同位置中。在下面所述的示例性實施方式中，工程改造嵌合病毒，使其摻入編碼呼吸道合胞病毒(RSV)的保護性抗原的異源核苷酸序列以產生候選感染性減毒病毒。摻入一種或多種RSV抗原決定簇的嵌合非節段性負鏈RNA病毒一般含有與編碼RSV抗原糖蛋白、蛋白結構域(如糖蛋白胞外結構域)或一種或多種免疫原性表位的異源基因或基因組節段相組合的載體基因組或反義基因組。在下面說明的一個實施方式中，將RSV F和/或G基因的一種或多種基因或基因組節段與不同亞型的RSV載體基因組或反義基因組相組合，以形成嵌合性(如RSV A/B嵌合)病毒。
相對其它病毒載體構建物，本發明的嵌合載體構建物提供了某些優點。用作載體的大多數其它單分子負鏈RNA病毒並非衍生自人病原體(如鼠PIV1(仙臺病毒)(Sakai等，FEBS Lett.456221-6，1999)、屬於牛病原體的水泡性口炎病毒(VSV)(Roberts等，J.Virol.724704-11，1998)和犬PIV2(SV5)He等，Virolo 237249-60，1997))。對於這些非人病毒，其載體骨架上提呈的抗原只能產生很少或很弱的對任何人類病毒的免疫力。因此，表達人病原體額外基因的非人病毒載體只能誘導抗一種人病原體的抵抗力(然而，在一些情況下可能需要這種抵抗力)。
此外，可通過模擬天然感染的鼻內給藥途徑給予受試者本發明方法(例如，基於RSV或HPIV)回收的許多嵌合性載體病毒。因此，本發明的病毒和免疫原性組合物將誘導黏膜和全身性免疫力，並降低新生兒中來自母親的血清IgG的中和免疫抑制作用。
如上所述，本發明包括對重組非節段性負鏈RNA病毒的廣泛修飾，產生規定所需表型改變的明確突變。在本發明的更詳細方面，將這些明確突變引入所述病毒基因組或反義基因組的cDNA拷貝，一般採用基因組或反義基因組cDNA亞片段組裝完整的基因組或反義基因組cDNA。該構建方法具有的優點是可分別操作基因組或反義基因組的各區域，其中小cDNA構建物比大cDNA構建物更易於操作，因此可容易地組裝成完整的cDNA。因此，可將完整的反義基因組或基因組cDNA，或其所選亞片段用作寡核苷酸定向誘變的模板。這可通過單鏈噬菌粒形式的介導，如用Bio-RadLaboratories(Richmond，CA)的MUTA-gene_試劑盒，或直接將雙鏈質粒用作模板的方法如Strategene(La Jolla，CA)的CHAMELEON_誘變試劑盒，或通過採用含有感興趣突變的寡核苷酸引物或模板的聚合酶鏈反應來實現。然後，可將突變的亞片段組裝成完整的反義基因組或基因組cDNA。各種其它誘變技術是已知的，可常規採納用於在本發明病毒反義基因組或基因組cDNA中產生感興趣突變。
因此，在一個示例性實施方式中，用購自Bio-Rad Laboratories的MUTA-gene_噬菌粒體外誘變試劑盒誘導這些突變。簡要說，將編碼PIV基因組或反義基因組的cDNA克隆入質粒pTZ18U，用於轉化CJ236細胞(Life Technologies)。如產生商所推薦地製備噬菌粒製品。通過將改變的核苷酸引入該基因組或反義基因組的所需位置設計用於誘變的寡核苷酸。然後擴增含有基因組或反義基因組遺傳上改變的質粒。
對本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒的基因或基因組節段進行與相同或不同病毒或其它來源的現有「對應」基因或基因組節段的結構或功能相關的某些取代、插入、缺失或重排(例如，對編碼所選蛋白或蛋白區域，如胞質尾、跨膜結構域或胞外結構域，表位位點或區域，結合位點或區域，活性位點或含有活性位點的區域等的基因組節段進行取代)。這種修飾產生的新重組病毒與野生型或親代病毒株相比具有所需的表型改變。例如，此類型重組病毒可表達具有與異源病毒胞外結構域融合的一種非節段性負鏈RNA病毒的胞質尾和/或跨膜結構域的嵌合性蛋白。其它此類型示例性重組病毒表達重複的蛋白區域，如重複的免疫原性區域。
本文所用的「對應」基因、基因組節段、蛋白或蛋白區域，一般為異源來源(例如，來自不同基因，或代表不同種病毒或毒株的相同(即同源或等位)基因或基因組節段)。本文所選擇的典型對應物共同具有大體的結構特徵，例如，各對應物可編碼相當的蛋白或蛋白結構域，如胞質結構域、跨膜結構域、胞外結構域、結合位點或區域、表位位點或區域等。對應結構域及其編碼基因組節段包括的組裝種類，具有由所述結構域或基因組節段變體共同生物學活性而限定的大小和序列變化種類的組裝。
本文公開的用於產生本發明重組非節段性負鏈RNA病毒的對應基因和基因組節段，以及其它多核苷酸，與所選多核苷酸「參比序列」，例如與另一所選對應序列常常在序列上基本相同。本文所用的「參比序列」定義為用作序列比較的基礎序列，例如，全長cDNA或基因的某節段，或完整的cDNA或基因序列。通常，參比序列的長度為至少20個核苷酸，常常長度為至少25個核苷酸，經常長度為至少50個核苷酸。由於兩種多核苷酸可各自(1)包含在這兩種多核苷酸之間相似的序列(即整個多核苷酸序列的一部分相似)，和(2)還可包含在這兩種多核苷酸之間不同的序列，對兩種(或多種)多核苷酸之間的序列比較一般是比較這兩種多核苷酸的「比較窗口」中的序列，以鑑定和比較局部區域的序列相似性。本文所用的，「比較窗口」指至少含20個連續核苷酸位置的概念性節段，其中可將某多核苷酸序列與至少20個連續核苷酸的參比序列進行對比。對於兩個序列的最優排列對比而言，該多核苷酸序列的比較窗口中的部分序列與參比序列(不含有添加或缺失)相比，可含有20％或更少的添加或缺失(即缺口)。對於比較窗口中序列的最優排列對比，可採用Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2482，1981)，Needleman和Wunsch的同源性對比算法(J.Mol.Biol.48443，1970)，Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444，1988)(各自引入本文作為參考)，通過計算機實施這些算法(Wisconsin遺傳學軟體包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳學計算機小組，575 Science Dr.，Madison，WI，引入本文作為參考)，或通過查看所選各種方法產生的最佳對比(即產生比較窗口序列相似性的最高百分數)進行最優的序列對比。術語「序列相同性」指兩個多核苷酸序列在比較窗口中是相同的(即核苷酸-核苷酸相同)。術語「序列相同性百分數」的計算如下通過比較兩個最優排列的序列在比較窗口中的對比序列，確定兩個序列中具有相同核酸鹼基(如A、T、C、G、U或I)的位置數，以產生匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗口的位置總數(即窗口大小)，將該結果乘以100即產生序列相同性百分數。本文所用的術語「基本相同性」指某多核苷酸序列的特徵，其中將該多核苷酸所含的序列與參比序列比較窗口中的至少20個核苷酸位置、常常為至少25-50個核苷酸相比，具有至少70％序列相同性、常常是85％序列相同性、有時至少90-95％序列相同性和高達至少99％序列相同性，其中通過將參比序列與可包含參比序列對比窗口總共20％或更少的缺失或添加的多核苷酸序列作比較，計算出序列相同性百分數。參比序列可以是某較大序列的亞組。
除了這些多核苷酸序列的相關性之外，通常還選擇本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒編碼的蛋白和蛋白區域，與所選參比多肽具有保守性關係，即與所選參比多肽具有基本上的序列相同性或序列相似性。應用於多肽時術語「序列相同性」指二種肽在相應位置具有相同的胺基酸。術語「序列相似性」指二種肽在相應位置具有相同或相似的胺基酸(即保守取代)。術語「基本上序列相同性」指當，如採用默認缺口權衡的GAP或BESTFIT程序進行最優排列對比時，兩個肽序列具有至少70％的序列相同性，常常為80％序列相同性，有時至少為90％序列相同性，和高達至少95％序列相同性或更高(例如，99％序列相同性)。術語「基本上相似」指兩個肽序列具有相應百分數的序列相似性。常通過保守胺基酸取代使不相同的殘基位置不相同。保守胺基酸取代指具有類似側鏈的殘基可互換。例如，具有脂肪族側鏈的一組胺基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族羥基側鏈的一組胺基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含醯胺側鏈的一組胺基酸是天冬醯胺和穀氨醯胺；具有芳香族側鏈的一組胺基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有鹼性側鏈的一組胺基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和具有含硫側鏈的一組胺基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。保守性胺基酸組內取代包括纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬醯胺-穀氨醯胺。本文所用的二十種天然產生的胺基酸的縮寫遵循其常規用法(《免疫學-合成》Immunology-A synthesis，第二版，E.S.Golub和D.R.Gren編，Sinauer Associates，Sunderland，MA，1991，引入本文作為參考)。二十種常規胺基酸、非天然胺基酸如α，α-雙取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸和其它非常規胺基酸的立體異構體(如D-胺基酸)也可以是本發明多肽的合適組分。非常規胺基酸的例子包括4-羥基脯氨酸、γ-羧基穀氨酸、ε-N、N、N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙醯基賴氨酸、O-磷脂醯絲氨酸、N-乙醯基絲氨酸、N-甲醯基甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、間-N-甲基精氨酸和其它類似胺基酸和亞胺基酸(如4-羥基脯氨酸)。而且，可通過糖基化、磷酸化等修飾胺基酸。
為選擇本發明的候選病毒，根據熟知方法確定活力、減毒和免疫原性的標準。本發明免疫原性組合物中最需要的病毒必須維持活力，具有穩定的減毒表型，顯示能在免疫的宿主中複製(雖然水平較低)和能在接受者中有效引發產生免疫應答反應，使其足以引發所需的免疫應答。本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒不僅是活的適當減毒的病毒，它們在體內遺傳上更穩定-維持激發免疫應答和在一些情況下擴大多種修飾所引發的免疫應答的能力，例如，誘導抗不同病毒株或亞組的免疫應答，或激發不同免疫基礎，如分泌性免疫球蛋白與血清免疫球蛋白、細胞免疫等介導的應答。
可以在各種熟知和廣為接受的體外和體內模型中測試本發明的重組非節段性負鏈RNA病毒，以驗證其足夠減毒、對表型逆轉的抗性和免疫原性。在體外試驗中，測試該修飾病毒(如經多重減毒的、生物學方法產生的或重組的病毒)的病毒複製溫度敏感性，即ts表型，和小噬斑或其它所需表型。還在病毒感染的動物模型中測試該修飾病毒。本文引用的各種參考文獻中描述並總結了各種動物模型，包括評價用於免疫原性組合物和方法中的候選病毒的減毒和免疫原活性的有用的嚙齒類和非人靈長類模型。這些模型是本領域廣泛接受的，從它們獲得的數據與本發明所述病毒在人中感染性、減毒和免疫原性良好相關。
根據以上描述，本發明也提供用於免疫原性組合物中的分離的感染性重組非節段性負鏈RNA病毒。作為免疫原性組合物一種組分的減毒病毒是分離的和純化形式。分離的指不是從野生型病毒天然環境中，如感染個體的鼻咽部中分離得到的重組非節段性負鏈RNA病毒。更通常地，分離的指所包含的減毒病毒為以控制方式在細胞培養物或其它人工培養基中增殖並經特徵鑑定的一個組分。例如，可從細胞培養物中分離得到感染的細胞培養物，加入穩定劑來產生本發明的減毒非節段性負鏈RNA病毒。
為用於免疫原性組合物，可將本發明產生的重組非節段性負鏈RNA病毒直接用於製劑中，或如需要用本領域技術人員熟知的凍幹方法凍幹。凍幹的病毒一般保存在約4℃。當準備使用時，如下所述穩定溶液，如鹽水或含有SPG、Mg++和HEPES的溶液中重建凍幹病毒，加或不加佐劑。
本發明的免疫原性組合物含有免疫學有效量的如本文所述產生的重組非節段性負鏈RNA病毒，作為其活性成分。可用生理學可接受的載體和/或佐劑將該修飾病毒引入宿主。有用的載體是本領域熟知的，包括例如水、緩衝液、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質酸等。可包裝所獲的水溶液，即用形式，或凍幹後使用，在給予前將凍幹製劑與無菌溶液混合，如上所述。如需要接近生理條件，該組合物可含有藥學上可接受的輔助物質，如pH調節和緩衝劑、強度調節劑、溼潤劑等，如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨聚糖酯，油酸三乙醇胺酯等。可接受的佐劑包括不完全弗氏佐劑、MPLTM(3-O-脫醯基單磷醯脂A；Corixa，Hamilton MT)和IL-12(Genetics Institute，Cambridge MA)等本領域熟知的許多其它合適佐劑。
當如本文所述用重組非節段性負鏈RNA病毒組合物免疫時(例如，通過氣霧劑、滴劑、口服、局部、肌肉內、鼻內、肺、皮下，靜脈內或其它途徑)，宿主的免疫系統通過產生所述病毒或病毒載體構建物的特異性抗體而對該免疫原性組合物作出應答反應。用免疫學有效量的如本文所述產生的重組非節段性負鏈RNA病毒免疫的結果是，宿主對靶病毒感染至少產生部分或完全的免疫力，或對發展成中度或嚴重感染產生抵抗力。
給予該免疫原性組合物的宿主可以是易於受所述非節段性負鏈RNA病毒(或對於嵌合性載體構建物而言是供體病毒)感染的和能夠對免疫用的病毒抗原產生免疫應答的任何哺乳動物宿主。因此，本發明提供了生產各種人用和獸醫用免疫原性組合物的方法。
將含有本發明重組非節段性負鏈RNA病毒的組合物給予易受所述病毒(或供體病毒)感染的或處於所述病毒(或供體病毒)感染危險中的宿主，以增強宿主自身的免疫應答能力。所用劑量定義為「免疫學有效劑量」。在此種應用中，給予重組病毒有效劑量內的準確量將取決於宿主的健康狀況和體重、給予方式、劑型特性等，但通常的劑量範圍是每個宿主約103至約107噬斑形成單位(PFU)的病毒或更多，更常為每個宿主約104至106PFU病毒。在任何情況下，這些製劑提供的本發明修飾的病毒量應足以在宿主病人中引發抗所述病原體的可檢測的免疫應答，例如，可通過血凝抑制、補體固定、噬斑中和和/或酶聯免疫吸附試驗等其它方法測定。
可將本發明產生的重組非節段性負鏈RNA病毒與其它血清型或株的病毒結合，以引發所需的抗多種病毒血清型或株的免疫應答。或者，可如本文所述將多種血清型或株的保護性表位經工程改造組合到一個病毒中而獲得抗多種病毒血清型或株的免疫應答。一般當給予不同病毒時，將它們混合同時給予，但也可分別給予。用一個毒株進行免疫可能使(宿主)產生對相同或不同血清型不同株的免疫力。
在新生兒和嬰兒中，可能需要多次給予才能引發足夠水平的免疫力。可以在出生的第一個月中開始給予，如需要維持對天然(野生型)病毒感染的免疫應答，在整個兒童時期以一定間隔如兩個月、六個月、一年和兩年時給予。類似地，特別易患重複和嚴重感染的成年人，如衛生保健工作者、日託工作者、幼兒的家庭成員、老年人、心肺功能不全的個體可能需要多次免疫才能建立和/或維持免疫應答反應。可通過測定中和性分泌和血清抗體的量來監測所誘導的免疫力水平，如需要維持所需水平的免疫應答反應可調整劑量或重複免疫。而且，對給予不同接受者群體而言，可採用不同的候選病毒。
在本發明的又一方面，將重組非節段性負鏈RNA病毒用作，如呼吸道短時基因治療的載體。根據該實施方式，重組病毒基因組或反義基因組摻入了能夠編碼感興趣基因產物的序列。該感興趣基因產物處在相同或不同啟動子的控制下，由該啟動子控制病毒的表達。通過一種或多種上述給予途徑給予含有編碼感興趣基因產物的序列的感染性重組病毒。給予該病毒的量足以導致治療或預防水平的所需基因產物表達。可摻入該重組病毒並在本方法中給予的代表性基因產物一般是適合於短時表達的，包括例如白介素-2、白介素-4、γ-幹擾素、GM-CSF、G-CSF、促紅細胞生成素等其它細胞因子，葡糖腦苷脂酶、苯丙氨酸羥化酶、囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶、細胞毒素、腫瘤抑制基因、反義RNA等其它候選抗原。
提供以下實施例，用於說明而非限制。
將本文引用的所有專利和出版物的內容引入本文作為參考。
實施例I用於從Vero細胞中拯救非節段性負鏈RNA病毒的通用磷酸鈣轉染方法溶液下述溶液通常可用於宿主細胞轉染280mM NaCl[16.4克NaCl(或56毫升5MNaCl)]，50mM BES[10.7克BES(不含酸形式)]和1.5mM磷酸鈉
的2×BBS(每L)溶液(2×BES-緩衝鹽水)。用NaOH將BBS溶液的pH調整為6.95-6.98。然後將該溶液過濾除菌並冷凍儲存。
配製每100毫升總體積含36.8克氯化鈣的2.5M CaCl2溶液，儲存於-20℃。用硝酸纖維素(膜)過濾除菌該溶液。避免使用醋酸纖維素濾膜，因為它們會阻塞。或者，高壓滅菌該轉染溶液。然而，不大需要後一步驟，因為2×BBS溶液在高壓滅菌期間可能發生輕微改變。
通常可將下述溶液用作培養基DMEM的DMEM+FBS溶液(含穀氨醯胺的高葡萄糖；Gibco/BRL，[Grand Island，NY])，添加有10％熱滅活的合格的FBS，和10-20微克/毫升(任選可高達50微克/毫升)慶大黴素。
MEM的MEM+FBS溶液(補充有穀氨醯胺，非必需胺基酸，10％熱滅活的合格的FBS，和10-20微克/毫升(任選可高達50微克/毫升)的20-25mM Hepes緩衝液；Gibco/BRL)(Grand Island，NY)和任選地包括1X兩性黴素B)。
Hepes-緩衝鹽水洗滌溶液，20mM hepes，pH 7.0，150mM NaCl，1mM MgCl2的HBS溶液。
方法通常採用的宿主細胞可選自分裂性Vero細胞，在轉染前一天將該細胞置於DMEM+FBS中，使它們在第二天生長至大約50％鋪滿[對於RSV是80-90％鋪滿](在六孔板或12.5釐米2培養瓶中)。較高細胞密度運作效率較低。第二天，在轉染前1-4小時向各培養物中加入4.5毫升DMEM+FBS。然後，將細胞轉移到3％CO2和32℃的CO2培養箱中。Vero細胞可培養過夜，只要它們在轉染時達到約50％鋪滿。
如下所述獲得CaCl2/磷酸鹽沉澱在開始前將BBS和CaCl2維持在室溫下。在含有總體積250微升的5毫升聚丙烯管中製備DNA混合物，其中總共有2-20微克的質粒DNA和25微升CaCl2。用於全長拯救的DNA包括5微克所選非節段性負鏈RNA病毒的全長cDNA構建物，400納克N蛋白，300納克P蛋白，100-200納克L蛋白，200納克M2(僅對RSV)蛋白，和5-10微克pCl-Neo-Bcl-T7質粒(SEQ ID NO1；圖2)。在Vero細胞中的拯救效率低，因此每個被拯救的全長構建物轉染3-6個孔。
製備好所有DNA/CaCl2溶液後，加入2×BBS。這通常以連續低速渦旋溫和振蕩小管並沿小管側面逐滴加入250微升2XBBS完成。對所有小管重複這一操作，室溫再放置15-20分鐘以使DNA-磷酸鈣沉澱形成。室溫孵育後，將沉澱逐滴加入細胞培養基中，搖動培養板使細胞均勻分布。然後將該培養基在3％CO2的培養箱中孵育3小時。3％CO2水平對BBS/CaCl2轉染技術而言是重要的；如果是5％CO2，作用就非常差。3％CO2控制了培養基的pH，得以在培養基中形成有效的磷酸鈣-DNA沉澱。
然後，任選地進行熱激步驟，例如在開始轉染後3小時。將細胞轉移到44℃的水浴中。將該細胞密封在塑料儲存袋中，使培養物完全浸沒在水中。44℃3小時後，將細胞轉移回3％CO2的32℃培養箱中，繼續培養過夜。
第二天，去除轉染培養基，用HBS洗滌細胞兩次。洗滌後，加入2毫升新鮮的DMEM+FBS。PBS和Hank氏緩衝液在該洗滌步驟中作用差，可能是因為這些緩衝液中的磷酸根引起了更多的CaCl2從轉染培養基中沉澱出來。
然後，任選地進行共培養程序。在轉染後48-72小時，將轉染細胞刮入培養基，將細胞和培養基轉移到含有50％鋪滿的單層Vero細胞的T25培養瓶中收集細胞。開始此共培養後6小時，用4毫升MEM+FBS替換舊培養基。然後，孵育培養物5天。如果在此孵育期間培養基開始顯示耗盡的跡象，就去除2毫升培養基並用新鮮的MEM+FBS替換。為了保存在拯救期間在培養基中可能存在的小量病毒，不推薦替換所有培養基。在這個共培養期間，CPE可能變得明顯，但不會如此。如果沒有明顯的CPE，則可繼續拯救。
開始共培養後5天，收集細胞。首先，將0.5毫升的2.18M蔗糖，37.6mM的KH2PO4，71.0mM K2HPO4，49.0mM穀氨酸鈉溶液加入培養基，搖動培養瓶混合之。然後將細胞刮入培養基中，用移液器上下吹打以混合，然後分成等份加入運輸的冷凍管中，然後在乾冰/乙醇浴中快速冷凍，儲存於-80℃。
實施例II拯救副粘病毒的通用磷酸鈣轉染方法下述另一種轉染方法採用的磷酸鈣轉染操作程序是根據Chen和Okayama，Mol.Cell.Biol.72745-2752，1987的方法，引入本文作為參考。
示例性DNA1.全長病毒基因組cDNA克隆含有與正義鏈的5』端融合的T7啟動子和與3』端融合的核酶。
2.蛋白表達質粒，受T7RNA聚合酶啟動子控制，編碼核衣殼蛋白(N或NP)，磷蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)。
3.編碼在人巨細胞病毒立即早期轉錄控制區控制下的T7RNA聚合酶蛋白的質粒。
示例性磷酸鈣轉染試劑1. 2X BES-緩衝鹽水50nM BES(pH 6.95-6.98)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4。
2. 2.5M CaCl2。
3.Hepes-緩衝鹽水洗滌溶液(HBS)示例性操作程序1.在六孔板中用含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)培養HEp2、Vero或其它合適細胞系，至細胞密度約50-75％鋪滿。
2.轉染前1-2小時，向待轉染各孔加入4.5毫升含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)。
3.在3％CO2的32℃培養箱中孵育細胞。
4.如下所述製備磷酸鈣-DNA轉染混合物5.在5毫升聚丙烯管中混合以下DNA400納克T7-N、300納克T7-P、100納克T7L和5微克病毒基因組cDNA克隆、5微克hCMV-T7瞬時表達載體(如pCl-Neo-Bcl-T7質粒)。對於RSV拯救而言，還包括100納克T7-M2(聚合酶延伸因子)表達質粒。
6.用水將體積調整到225微升。
7.加入25微升2.5M CaCl2。
8.在溫和渦旋振蕩該小管的同時，加入250微升的2×BBS，然後讓該管在室溫下靜置15-20分鐘。
*注意，可能需要優化各質粒DNA的量以實現拯救。此外，雖然實施例I和II的磷酸鈣轉染方法在本發明中可廣泛使用，但是也可成功地採用其它轉染方法。
9.從培養箱中取出細胞，在溫和渦旋振蕩培養基的同時，將磷酸鈣-DNA混合物緩慢地加入培養基。立即將細胞放回32℃-3％CO2培養箱。
10.開始轉染實驗後3小時，將培養皿密封在塑膠袋中，完全浸沒在44℃的水浴中3小時，以誘導細胞熱激反應。該任選的熱激步驟常能提高拯救結果。然而，不同細胞類型對不同有效熱激溫度(例如，在約40-45℃的範圍內)或對不同有效熱激時間(例如，約30分鐘-3小時的範圍內)均由較好反應。
11.熱激後，將細胞放回32℃-3％CO2培養箱，繼續孵育過夜。
12.第二天，用HBS洗滌細胞2次，給予細胞2毫升補充有10％FBS的DMEM或最低必需培養基(MEM)。
在此階段，該方法對於需要用胰蛋白酶來促進病毒播散的一些PIV毒株是不同的。在48小時時，用PBS洗滌細胞以去除殘留的血清，用每毫升含有約0.5微克胰蛋白酶的無血清培養基替換舊培養基。
13.開始轉染後48小時，用足夠的Vero細胞接種10釐米2板，以在第二天產生50％鋪滿的(細胞)單層(開始轉染後72小時)。為各轉染培養物準備一個10釐米2板。
14.轉染後72小時，將轉染細胞刮入培養基中，將細胞和培養基轉移到前一天準備好的10釐米2板中。這就開始了在10釐米2板中共培養轉染細胞和單層(細胞)。將該板在5％CO2的37℃培養箱中孵育；對溫度敏感型突變病毒採用適當的較低溫度。
15.4-6小時後，用補充有10％FBS的新鮮DMEM替換舊培養基。
16.監測細胞5-7天，以檢測出現的細胞病變效應。
實施例III在Vero細胞中拯救麻疹病毒(MV)用上述實施例I中所述的示例性轉染方法在Vero細胞中拯救麻疹病毒。T7來源是質粒pSC6-T7(無MVA)或MVA/T7(Wyatt等，1995)。結果表明成功拯救了許多MV(+)，見下表3所示(A-F列表示在不同日期進行的不同拯救實驗，各實驗由多重轉染表示—實驗E和F中有多達12個單獨轉染(孔))。
表3用質粒-T7或MVA/T7拯救麻疹病毒 實施例IV用不同來源的聚合酶拯救麻疹病毒(MV)本實施例證明根據本文方法的瞬時T7聚合酶表達載體提供了足夠的T7RNA聚合酶表達水平，以支持病毒拯救。用上述實施例I的方法轉染細胞。當用T7RNA聚合酶表達質粒進行拯救時，將DNA與病毒特異性質粒共轉染。當用MVA-T7(Wyatt等，Virology 210202-5，1995)感染提供T7RNA聚合酶時，在轉染的同時將病毒以感染複數2加入培養基進行感染。Billeter等曾描述過用於此實驗的T7表達質粒(pSC6-T7)，(Radelce等，EMBO J.145773-5784，1995)。它含有在hCMV轉錄控制區控制下的T7RNA聚合酶基因。將瞬時表達質粒pCI-Neo-Bcl-T7(SEQ ID NO1；圖2)用於本文所列的所有後續病毒拯救步驟中。本實施例所用的病毒基因組克隆是含有與麻疹病毒Edmonston實驗室毒株相應的cDNA序列的p(+)MV(Radecke等，EMBOJ.145773-5784，1995)。
下表4中顯示了拯救麻疹病毒的陽性結果。
表4用質粒T7或MVA/T7拯救麻疹病毒
實施例V拯救重組副流感病毒(PIV)用上述實施例I中所述的T7質粒拯救系統在Vero細胞中拯救嵌合性牛-人PIV-3(HBPIV3)毒株。此示例性PIV克隆含有人PIV-3的F和HN基因，作為牛PIV-3載體或骨架中的取代物。如標準的血凝(fHAD)試驗所測定，五個獨立拯救樣品中五個均是陽性，fHAD試驗是將感染細胞與豚鼠紅細胞(RBC)一起孵育來測定重組病毒的存在。通過跨M/F基因連接區的標準RT-PCR進一步證實了此結果，證實該重組病毒是預計的人-牛雜交病毒。為進行RT-PCR培養了2代病毒貯存物。該貯存物在Vero細胞中的滴度是5-10×107pfu/毫升。
除HBPIV3嵌合性病毒外，根據本發明方法拯救了幾種其它重組PIV構建物，見下表5中所作的部分小結。在一個示例性實施方式中，從五個轉染的Vero細胞培養物中拯救了減毒的嵌合性重組PIV毒株PIV3cp45(3-1)(含有HPIV3cp45的冷傳代突變和取代相應PIV3基因的PIV 1的F和G糖蛋白基因)，然後用該病毒感染新鮮的單層細胞。病毒吸附後，將細胞維持在每毫升含0.5微克胰蛋白酶的無血清培養基中五天。然後對感染的培養物進行血凝試驗，感染了重組PIV的細胞能吸附RBC證實了陽性拯救結果。
表5
在另一示例性實施方式中，回收HPIV3-HPIV-2嵌合性構建物，它含有與上述HPIV3胞質結構域融合的HPIV2 F和HN跨膜域和胞外結構域的嵌合性糖蛋白(稱為PIV3-2CT)。從Vero細胞中回收此嵌合性構建物，用RT-PCR和後續限制性位點分析確認了該重組病毒的身份。
用本發明方法回收的其它PIV重組病毒包括稱為「航運熱」(SF)的BPIV毒株(Reisinger等，J.Am.Vet.Med.Assoc.135147-152，1959，引入本文作為參考)和含有L基因中的減毒突變和負責冷傳代表型的突變的重組HPIV，稱為PIV3cp45-456。在Vero細胞中拯救這二種病毒，通過RT-PCR和測序確認它們的身份。PIV3cp45-456在HN基因中含有兩個從前述在HN中含有兩個引入突變的PIV3cp45重組病毒校正的突變，因此背離了生物學方法產生的cp45突變體的序列。PIV3cp45-456克隆糾正了殘基263上取代的異亮氨酸和殘基370上取代的蘇氨酸這兩個突變，使其回復到生物學方法產生的分別編碼蘇氨酸和脯氨酸的基因型。
實施例VI在293細胞中拯救水泡性口炎病毒本發明的瞬時RNA聚合酶載體系統的精妙處在於能拯救用於免疫原性組合物中的所有重組負鏈RNA病毒。在以下實施例中，為回收水泡性口炎病毒(VSV)和相關的VSV載體毒株優化該技術。雖然大多數VSV毒株在廣泛細胞系中非常有效地複製，但迄今，證明回收重組VSV是非常困難的。文獻中描述的VSV拯救方法特地採用BHK細胞系和牛痘病毒/T7輔助病毒，但對於人類臨床應用產生免疫原性組合物所用的方法而言，這二者都不理想。
從合格的Vero細胞中拯救重組VSV的嘗試開始時採用組合的熱激/質粒T7拯救方案(如上述拯救副流感病毒和麻疹病毒的方案)並不成功。認為該系統的限制因素之一是轉染效率差，尤其是與Vero細胞相關的轉染效率低下。熱激/質粒T7拯救系統這兩種不同的修飾解決了這個問題。在一種修飾中，磷酸鈣轉染/熱激方法大部分未作改變，但採用了不同類型的宿主細胞。或者，用不同轉染方法來優化Vero細胞拯救系統(參見實施例VII)。
簡要說，採用上述基本的熱激/質粒T7系統，根據以下修訂的操作程序實現了從293細胞中成功拯救VSV。
試劑質粒DNA1.全長病毒基因組cDNA2.pT7-N3.pT7-P4.pT7-L5.pT7-M6.pT7-G7.pCI-Neo-bcl-T7(p0061)磷酸鈣轉染試劑1.2X BES-緩衝鹽水50mM BES(pH 6.95-6.98)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4。
2.2.5M CaCl2。
3.Hepes-緩衝鹽水洗滌溶液(HBS)20mM hepes(pH7.0-7.5)，140mM KCl，1mMMgCl2。
細胞培養溶液1.補充有10％合格的熱滅活FBS的DMEM(DMEM/FBS)。
2.補充有10％合格的熱滅活FBS的Iscoves改良的最低必需培養基(IMEM)(IMEM/FBS)。
3.聚L-賴氨酸0.01％溶於H2O。
4.PBS。
5.豬胰蛋白酶/EDTA。
步驟293細胞培養
293細胞難於培養，有許多不同方法處理它們。本方法已成功用作VSV和修飾的VSV載體構建物拯救系統的一部分。
常規傳代培養1.去除培養基並用5毫升溫熱的PBS洗滌鋪滿的單層(細胞)(10釐米板)；用移液器沿培養皿側面溫和地加入，以防止細胞脫離(293細胞在室溫下太長時間，或在變為鹼性(紅色)的培養基中會脫離)培養板。
2.溫和地加入2毫升胰蛋白酶，搖動板使其覆蓋整個單層(細胞)。吸棄胰蛋白酶，讓培養板在室溫下靜置約1分鐘。將板傾斜到45度角，在通風櫃的工作面上拍打板，以使細胞脫離。如果細胞不脫離，在室溫下再孵育1分鐘(在這個階段確保細胞脫離，從而可避免用移液器劇烈吹打)。
3.溫和地加入5毫升DMEM/FBS，用移液器緩慢地上下吹打，以分散細胞。
4.將1毫升細胞加入含有9毫升DMEM/FBS的板中。
5.在37℃，5％CO2中孵育。
轉染傳代培養1.用聚-L賴氨酸包被所需數量的板。每板加入約3-4毫升0.001％的聚-L賴氨酸，使板室溫靜置至少30分鐘。吸棄聚-L賴氨酸溶液。用5毫升培養基衝洗該板。
2.如上所述用胰蛋白酶消化細胞。採用在第二天產生50-75％鋪滿的板以(1∶3至1∶6)比例分瓶。
3.使細胞脫離後，加入IMEM/FBS，將細胞轉移到含有9毫升IMEM/FBS的包被板中。轉染前將細胞分瓶，在IMEM/FBS中培養過夜似乎是重要的。
4.在37℃，5％CO2中孵育。
轉染1.轉染前1-3小時，給予細胞9毫升IMEM/FBS，將細胞在3％CO2的32℃培養箱中培養。
2.磷酸鈣-DNA轉染混合物的製備如下a.在5毫升聚丙烯管中混合以下DNAi.8微克T7-Nii.4微克T7-Piii.1.2微克T7Liv.1.0微克T7-M
v.1.0微克T7-Gvi.10微克病毒基因組cDNA克隆。
vii.10微克hCMV-T7表達載體。
b.用水調整體積至終體積為450微升。
c.加入50微升2.5M CaCl2。
d.在溫和渦旋振蕩該小管的同時，加入500微升2×BBS，然後讓該小管在室溫下靜置15-20分鐘。
3.從培養箱中取出細胞，將磷酸鈣-DNA混合物緩慢加入培養基中，溫和渦旋使沉澱分散。立即將細胞放回32℃-3％CO2培養箱。
4.開始轉染實驗後3小時，將培養皿密封在塑膠袋中，完全浸沒在43℃的水浴中2小時，誘導細胞熱激反應。
5.熱激後，將細胞放回32℃-3％CO2培養箱，繼續孵育過夜。
6.第二天，用HBS洗滌細胞2次，給予細胞10毫升IMEM/FBS。在37℃，5％CO2中孵育。
7.在開始轉染後48-72小時，為將轉染細胞轉移到較大容器中，準備足夠的含有20毫升DMEM/FBS的T150培養瓶。一個T150培養瓶用於一個10釐米板的轉染。
8.用移液器溫和吹打單層(細胞)上的培養液使其從細胞面分離，轉移轉染的293細胞。避免劇烈吹打，用恰好足夠的力量分離細胞。細胞分離後，用移液器上下吹打約5次減小細胞團大小，然後將培養基和細胞轉移到含有20毫升IMEM/FBS的T150培養瓶中。
9.4-6小時後，用補充有10％FBS的新鮮DMEM替換舊培養基(注意，如果細胞沒有貼附到板上，可推遲此步驟到24小時。也可成功地跳過該步驟)。
10.監測細胞5-7天，以檢測出現的細胞病變效應。
11.當明顯出現CPE時，將50微升培養基上清轉移到含有培養基和已建立了單層Vero細胞的六孔板孔中。如果發生拯救，第二天就可觀察到CPE。(注意，此步驟重要，因為293細胞有時會從T150培養瓶的表面脫離，從而當它們實際上並未被感染時看起來被VSV感染)。
12.將小樣品轉移到單層Vero細胞後，收集T150培養瓶中的細胞和培養基並-70℃冷凍。通常用移液器吹打單層(細胞)上的培養基使細胞脫離，收集293細胞。
用上述修訂的操作程序，從293細胞中回收各種重組VSV構建物。在本文中成功回收的VSV構建物包括本文所述基礎VSV載體骨架構建物，和含有HIV包膜基因或HIV gag基因的兩種修飾的VSV載體。因此，顯然本發明的瞬時RNA聚合酶載體系統在不同細胞類型中能適應一定範圍的不同重組病毒，包括經大量修飾的(如減毒和載體)構建物。具體說，顯然293細胞可支持VSV的拯救而改進的轉染效率對在其它細胞(如Vero細胞)中實現VSV拯救可能很重要。
值得注意，用進一步修飾的方法，包括加入編碼所選病毒結構基因的表達質粒進行了其它VSV和麻疹病毒的拯救實驗。對VSV拯救而言，將表達G和M基因的質粒共轉染入宿主細胞(如在以上的修飾方案中所述)。對MV拯救而言，轉染混合物補充有編碼M、F和H的質粒。因此認為，本發明的任何一種非節段性負鏈RNA病毒的拯救可任選地包括共引入和/或共表達結構蛋白，包括相同病毒或異源病毒、亞型或毒株的蛋白的任何一種或任何組合。
實施例VII通過替代的電穿孔-介導的轉染在Vero細胞中拯救水泡性口炎病毒為進一步評價轉染效率在本發明的瞬時RNA聚合酶表達系統中的作用，研究了電穿孔作為磷酸鈣轉染Vero細胞的替代方法。確定了電穿孔Vero細胞的條件，然後將其加入改良的熱激/質粒-T7拯救方案中，詳述如下。
DNA製備1.對各電穿孔而言，在微量離心管中混合下述質粒DNA50微克表達T7的質粒(pCI-Neo-Bcl-T7)。
0微克VSV全長質粒。
8微克N質粒。
4微克P質粒。
1微克L質粒。
1微克M質粒(VSV)。
1微克G質粒(VSV)。
同時製備螢光素酶轉染對照的DNA50微克(pCI-Neo-Bcl-T7)。
5微克T7-螢光素酶質粒。
a)在生物安全櫃工作條件下，用無菌、無核酸酶的水將DNA體積調整到250微升。
b)加入50微升3M乙酸鈉(pH 5)。
c)加入750微升100％乙醇，並混合。
d)在-20℃孵育1小時至過夜e)在微量離心管中，14,000rpm、4℃、離心20分鐘沉澱DNAf)在生物安全櫃工作條件下，棄去上清，不要攪動沉澱。
g)快速離心該管，收集管底殘留的乙醇，用移液器去除h)讓沉澱在空氣中乾燥(在生物安全櫃中)5-10分鐘。
i)用50微升無菌、無核酸酶的水重懸沉澱。
溶液胰蛋白酶/EDTAHank氏緩衝鹽水用PBS製備1毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制劑培養基組分(見下)培養基
製備Vero細胞每次電穿孔需要約1.3個幾乎鋪滿細胞的T150培養瓶。
1.用約5毫升Hank氏緩衝鹽溶液洗滌單層細胞1次。
2.加入4毫升胰蛋白酶/EDTA，搖動培養瓶以均勻分布該溶液。
3.室溫孵育3-5分鐘。
4.吸乾胰蛋白酶溶液。
5.拍打培養瓶側面以分離細胞。
6.用10毫升培養基#1從培養瓶中收集細胞，將細胞轉移到50毫升圓錐管中。
7.加入1毫升胰蛋白酶抑制劑(1毫克/毫升)，並溫和地混合。
8.用臺式離心機室溫1000rpm離心細胞5分鐘。
9.吸乾上清。
10.將細胞重懸於10毫升培養基2中。
11.加入1毫升胰蛋白酶抑制劑溫和地混合。
12.如上所述用臺式離心機室溫1000rpm離心收集細胞。
13.吸乾培養基。
14.將細胞重懸於培養基2中。溫和地重懸，最終體積相當於每次電穿孔0.8毫升(考慮到細胞沉澱會佔據一定體積)。
15.將0.8毫升細胞懸液轉移到含有質粒DNA溶液的離心管中。用裝有p1000吸頭的移液器溫和地上下吹打，混合細胞和DNA。轉移到電穿孔儀臺上。
電穿孔BTX 820方波電穿孔儀1.用移液器上下吹打細胞/DNA 3次以溫和地混合，轉移到電穿孔小杯中。
2.將小杯插入電穿孔架。
3.電穿孔細胞(4個脈衝，70毫秒，140伏)。
4.電穿孔所有樣品後，將小杯放回生物安全櫃中，加入1毫升培養基1。用無菌塑料轉移移液管將細胞從小杯中轉移到含有10毫升培養基1的15毫升離心管中。
5.溫和地混合，如上所述離心收集細胞。
6.吸乾培養基。
7.將細胞重懸於10毫升培養基1中，將懸液轉移到含有25毫升培養基1的T150培養瓶中。
8.37℃(5％CO2)孵育細胞3小時。
9.43℃(3-5％CO2)熱激細胞3小時。
10.將細胞放回37℃2小時。
11.用30毫升培養基3替換舊培養基，繼續在37℃孵育。
12.每天檢查細胞有無細胞病變效應跡象。早至3-4天應出現VSV複製，但可能更長達6天。
按照上述電穿孔/熱激/T7質粒步驟，從Vero細胞中成功回收了所有的重組VSV、MV和PIV。值得注意的是，採用含有據報導能降低提前終止的一個胺基酸取代(MacDonald等，J.Mol.Biol.238145-158，1994，引入本文作為參考)的修飾的PCl-Neo-Bcl-T7質粒進行了幾次成功的VSV拯救。
實施例VIII在Vero細胞中拯救呼吸道合胞病毒本實施例說明，用本發明的瞬時RNA聚合酶載體系統(例如上述實施例II所列改良的磷酸鈣/熱激方法)成功回收了被拯救的五十個不同重組RSV株。表6說明了此法回收的重組RSV候選病毒的各種組裝包括通過摻入生物學方法產生的RSV突變株的一種或多種減毒突變修飾的RSV重組病毒；通過部分或全部缺失一種或多種基因或基因組節段(如SH、NS1、NS2、M2-2)或者敲除一種或多種基因或損傷其表達的其它修飾而修飾的RSV；RSV-RSV嵌合性構建物(如以其中含有RSV B糖蛋白取代為背景的RSV A2毒株)；含有一種或多種基因插入物的RSV；和含有相對於野生型RSV基因圖中相應基因位置發生位置改變的一種或多種基因(即「基因改組」)的RSV重組物。表6中鑑定的被拯救毒株主要包括RSV A2毒株的變體和衍生物，但用本發明方法和組合物也成功地回收了一個RSV B1毒株。在表6中所列回收的RSV重組物中，回收了各種減毒、多重減毒和嵌合性病毒，以及含有一種或多種基因缺失的RSV重組物，上述內容和上述引入的參考文獻中描述了所有這些情況。
表6RSV拯救的cDNA克隆
*MVA方法拯救的所有病毒的序列是正確的。
_僅指質粒拯救的構建物實施例IX通過質粒T7/電穿孔/熱激方法拯救其它負鏈病毒本實施例描述，通過上述實施例VII中所述改進的質粒T7/電穿孔/熱激系統成功回收了其它負鏈RNA病毒。本文中還應用此改進的回收方法產生了大量其它減毒的重組VSV(rVSV)株，以及經修飾編碼異源抗原的各種rVSV和bPIV載體。除rVSV之外，也用質粒T7/電穿孔/熱激方法從Vero細胞中拯救各種其它示例性重組負鏈RNA病毒(見下表7)。如上對rVSV的描述，在這些示例性實施方式中，電穿孔DNA的組合物任選地包括編碼除CMV-T7、基因組cDNA、N、P和L之外的基質蛋白和病毒糖蛋白的質粒。當回收被證明難以拯救的病毒時，任選地加入編碼該基質蛋白和糖蛋白的質粒可提供顯著的優點。如以上進一步討論的，本發明的這些(電穿孔)方法和組合物中也可任選地包括編碼一種或多種其它結構蛋白(如RSV的M、SH、NS1、NS2、F和/或G，以及PIV的M、HN和/或F)的質粒。
表7 通過質粒T7/電穿孔/熱激方法回收的其它負鏈RNA病毒
關於rVSV，已用質粒T7/電穿孔/熱激方法產生和回收了各種其它構建物。拯救了這些rVSV重組病毒後，在體外檢查其複製速率，在預計在人體中有活性(如減毒和免疫原性)的小動物模型系統中評價相對毒力，以確定這些病毒是否減毒到足以用於本發明免疫原性組合物和方法中。
在示例性實施方式中，產生並回收了含有編碼異源抗原，如HIV GAG蛋白或HSV-2gD糖蛋白的第六基因的許多rVSV。證明五種普通策略可有效引入阻礙病毒複製的修飾，包括(1)將參與轉錄和RNA複製(如N基因)或病毒粒子成熟(如M或G)的基因轉座或『改組』到下遊位置中導致相應mRNA轉錄降低(參見，例如，Ball等，J.Virol.734705-4712，1999；Finke等，J.Gen.Virol.841613-1621，2003；和Wertz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 953501-3506，1998，各自引入本文作為參考)；(2)截斷病毒附著蛋白(如G蛋白)的胞質尾結構域(CT缺失)(參見，例如，Roberts等，J.Virol.733723-3732，1999，引入本文作為參考)；(3)用編碼溫度敏感型多肽的同源物取代載體骨架中的基因(參見，例如，Pringle，J.Virol.5559-567，1970；Gallione等，J.Virol.54374-382，1985，各自引入本文作為參考)；(4)將突變引入編碼M蛋白的基因中降低病毒粒子成熟率和細胞病理作用(參見，例如，Jayakar等，J.Virol.768011-8018，2002，引入本文作為參考)；和(5)將CT缺失與改組基因、ts突變或M突變相組合。下表8列出了這些方法拯救的各種示例性減毒rVSV毒株。
關於上述策略(3)，可用在生物學方法產生的ts突變病毒中鑑定的突變基因取代野生型或原型基因，容易地實現溫度敏感型突變的引入。為了產生含有這種ts突變的示例性rVSV重組病毒，將用示例性的生物方法產生的ts突變株tsG11、tsG31、tsG41或tsO45轉染的BHK細胞(參見，例如，Gallione等，J.Virol.54374-382，1985；Whitt等，J.Virol.644907-4913，1990；Pringle，J.Virol.5559-567，1970，各自引入本文作為參考)培養在許可的溫度(32℃)中，直到在約75％的培養物中出現細胞病變效應，此時，將細胞刮入培養基中低速離心收集。用硫氰酸胍-酚-氯仿抽提得到細胞沉澱中感染細胞的總RNA，將純化的RNA用於逆轉錄和PCR擴增，以製備編碼蛋白的序列，然後用它取代rVSV cDNA克隆中的同源基因。通過將克隆的ts基因的序列與直接從相應的生物學方法產生的ts病毒的基因組RNA測定的序列相比，證實為克隆的ts基因的序列。序列確認後，用上述電穿孔/熱激方法拯救編碼一種或多種ts基因的rVSV毒株，除了細胞培養在32℃而不是37℃外(除非在熱激過程中)，以產生預計的ts表型。電穿孔後5-9天，在成功的拯救試驗中出現了細胞病變效應，此時收穫新毒株用於啟動噬斑純化。3輪噬斑純化後，擴增了病毒貯存液並測定了基因組序列。然後對含有所需序列的病毒在幾種溫度下(32℃、37℃和39℃)進行噬斑試驗，以評價插入的ts基因的作用。
表7 質粒T7/電穿孔/熱激方法回收的其它rVSV毒株
*命名注釋VSV基因組含有排列為3』-N(1)-P(2)-M(3)-G(4)-L(5)-5』的5個基因。除了上述的CT修飾外，許多數字命名指在所述重組病毒中的最終基因位置。因此，例如，稱為「rVSV-M5」的病毒包含改組到最後或第5個位置的M基因。從第一個基因位置具有編碼HIV GAG的基因插入物的rVSV-M5的載體衍生物含有6個基因，一致地稱為rVSV-GAG1-M6。表8中鑑定的各VSV重組物一開始是用Indiana血清型骨架建立的，但是大多數所述重組物也是用從New Jersey(NJ)血清型背景製備的伴隨載體回收的。稱謂「ts」後接特定基因或產物(如「tsG」)指該重組病毒摻入了在生物學方法產生的突變病毒中鑑定的基因或突變，如引入的參考文獻所述。通常採用已知減毒的生物學方法產生的病毒來構建突變基因的cDNA拷貝用於摻入重組的減毒病毒中。或者，當生物學方法產生的突變病毒中特定的靶突變基因座已知時，可將所述突變直接摻入重組病毒中，例如，通過定位誘變。
產生和回收表達外來或「異源」抗原或抗原決定簇—產生所需的免疫原特異性改變的其它rVSV和其它病毒構建物。例如，設計了重組VSV、牛PIV(bPIV)和hPIV3-cp45，評價其可作為遞送HIV-1、A和B型流感病毒、2型單純皰疹病毒、冠狀病毒以及A和B型RSV的抗原的可能載體。如本文所述拯救這些載體，用於後續的免疫原性和安全性研究。上表8中列出了被拯救的VSV-HIV GAG構建物和示例性VSV-HSV gD構建物，而下表9總結了設計用於表達呼吸道病毒性病原體(RSV、流感和冠狀病毒)的糖蛋白的示例性載體。
表9 表達通過質粒T7/電穿孔/熱激方法回收的病毒性呼吸道病原體的糖蛋白的VSV和bPIV載體
注意上面所列VSV載體是用Indiana血清型骨架建立的。在大多數情況下，分離的伴隨載體是用NJ血清型骨架製備的。
實施例X拯救缺少G基因或基因組節段的複製缺陷型VSV載體如上所述，常常需要構建不能從接種疫苗的部位顯著擴散，但保留感染細胞和表達靶抗原能力的載體重組物。缺少結構基因，如M或G基因的示例性載體可容易地實現這個目標。M或G基因的缺陷將通過完全阻斷病毒粒子的成熟而理想地防止感染後免疫載體的擴散，但不會干擾N、P和L蛋白介導的轉錄和基因表達。已描述了缺少全部或大多數G基因的rVSV，它們是吸引人的用於本發明免疫原性組合物和方法的候選物(參見，例如，Roberts等，J.Virol.733723-3732，1999，Jeetendra等，J.Virol.7612300-12311，2002；Robison等，J.Virol.742239-2246，2000，各自引入本文作為參考)。為了促進拯救和增殖這些複製缺陷型候選病毒，本實施例描述了改進的質粒T7/電穿孔/熱激方法。為說明該改進方法在產生和開發複製缺陷型候選病毒中的用途，工程改造並回收了兩種類型的突變病毒。一種示例性突變類型完全缺少G基因(稱為「ΔG」)。第二種突變體編碼的G蛋白缺少病毒附著所必需的G蛋白胞外結構域(稱為「G-莖」)。該突變基因編碼與最後91個殘基，包括跨膜和胞內結構域融合的G蛋白的前19個胺基酸，G蛋白中大多數胺基酸被切掉，然後將該蛋白插入平滑內質網中。
用於回收複製或生長缺陷型負鏈病毒(例如ΔG或G-莖病毒)的改進的拯救方法如下。
VSV/Vero電穿孔拯救步驟溶液胰蛋白酶/EDTAHank氏緩衝鹽水用PBS製備1毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制劑培養基組分(見下)培養基
製備Vero細胞每次電穿孔需要約1.3個鋪滿細胞的T150培養瓶。
1)用約5毫升Hank氏緩衝鹽溶液洗滌單層細胞1次。
2)加入4毫升胰蛋白酶/EDTA，搖動培養瓶以均勻分布該溶液。
3)室溫孵育3-5分鐘。
4)吸乾胰蛋白酶溶液。
5)拍打培養瓶側面以分離細胞。
6)用10毫升培養基#1收集培養瓶中的細胞，將細胞轉移到50毫升圓錐管中。
7)加入1毫升胰蛋白酶抑制劑(1毫克/毫升)，並溫和地混合。
8)用臺式離心機室溫1000rpm離心細胞5分鐘。
9)吸乾上清。
10)將細胞重懸於10毫升培養基2中。
11)加入1毫升胰蛋白酶抑制劑並溫和地混合。
12)如上所述用臺式離心機室溫1000rpm離心收集細胞。
13)吸乾培養基。
14)將細胞重懸於培養基2中。溫和地重懸，至最終體積相當於每次電穿孔0.7毫升(考慮到細胞沉澱會佔據一定體積)。
15)將0.7毫升細胞懸液轉移到含有質粒DNA溶液的離心管中。用裝有p1000吸頭的移液器溫和地上下吹打，混合細胞和DNA。轉移到電穿孔儀臺上。
DNA製備對每次拯救的電穿孔而言，電穿孔50微克CMV-Ga)在生物安全櫃工作條件下，用無菌、無核酸酶的水將DNA體積調整到250微升。
b)加入50微升3M乙酸鈉(pH 5)。
c)加入750微升100％乙醇，並混合。
d)-20℃孵育1小時至過夜e)在微量離心管中，14,000rpm、4℃、離心20分鐘沉澱DNAf)在生物安全櫃工作條件下，棄去上清，不要攪動沉澱。
g)快速離心該管，收集管底殘留的乙醇，用移液器去除。
h)讓沉澱在空氣中乾燥(在生物安全櫃中)5-10分鐘。
i)用50微升無菌、無核酸酶的水重懸沉澱。
電穿孔BTX 820方波電穿孔儀1)用移液器上下吹打細胞/DNA3次輕輕混合，轉移到電穿孔小杯中。
2)將小杯插入電穿孔架中。
3)電穿孔細胞(4個脈衝，70毫秒，140伏)。
4)電穿孔所有樣品後，將小杯放回生物安全櫃中，加入1毫升培養基1。用無菌的塑料轉移移液管將細胞從小杯轉移到含有10毫升培養基1的15毫升離心管中。
5)溫和地混合，如上所述離心收集細胞。
6)吸乾培養基。
7)將細胞重懸於10毫升培養基1中，將懸液轉移到含有25毫升培養基1的T150培養瓶中。
8)37℃(5％CO2)孵育細胞3小時。
9)43℃(3-5％CO2)熱激細胞3小時。
10)將細胞放回37℃2小時。
11)用20毫升培養基3替換舊培養基。
12)吸乾含有拯救物質的T150。加入10毫升培養基3。將細胞刮入培養基中轉移到1個含有G表達細胞的T150瓶中，繼續37℃孵育。
13)每天檢查細胞的細胞病變效應跡象。早至3-4天應出現VSV複製，但可能更長達6天。
與實施例VII中所述的替代示例性方法相比，上述改進的電穿孔方法的主要不同之處是包括了共培養步驟，在該步驟中，將用於拯救的細胞與經工程改造富表達G蛋白的細胞一起培養。簡要說，通過電穿孔含有CMV-T7質粒、病毒基因組cDNA和編碼N、P、L、M和G的載體的Vero細胞(病毒拯救細胞)啟動VSV拯救。然後，將這些細胞熱激3小時後孵育過夜。當進行病毒拯救電穿孔時，電穿孔第二組Vero細胞，以準備用於瞬時表達大量G蛋白的共培養的細胞。加入相對大量的編碼VSV G蛋白的CMV表達質粒，電穿孔這些共培養細胞。電穿孔後的第二天，將轉染了該拯救混合物的細胞刮入培養基中，轉移到G蛋白表達共培養單層細胞上。通常在2-4天後，可見明顯的病毒性細胞病變效應。
雖然以實施例的方式詳細描述了上述本發明，但本領域技術人員明白，可以在所附權利要求的範圍內實施某些改變和修改，以示例性而非限制性方式對它們進行說明。
權利要求
1.一種產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的方法，該方法包括以下步驟(a)將含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體引入宿主細胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由所述cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物，其中所述宿主細胞表達N蛋白、P蛋白和L蛋白，並由瞬時轉染的表達載體瞬時表達RNA聚合酶；和(b)從所述宿主細胞中回收組裝的感染性、非節段性負鏈RNA病毒。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述瞬時轉染的表達載體是質粒。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，將所述病毒cDNA表達載體和編碼並指導RNA聚合酶瞬時表達的瞬時表達載體混合於DNA轉染混合物中，並同時加入宿主細胞培養物以實現協同轉染。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在引入編碼RNA聚合酶的瞬時轉染的表達載體之前，將所述病毒cDNA表達載體引入宿主細胞。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在引入編碼RNA聚合酶的瞬時轉染的表達載體之後，但在所述RNA聚合酶在所述宿主細胞中累積到可檢測水平之前，將所述病毒cDNA表達載體引入宿主細胞。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，將一種或多種所述病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶的瞬時轉染的表達載體通過磷酸鈣轉染或電穿孔引入到宿主細胞中。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在將一種或多種所述病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶的瞬時轉染的表達載體引入宿主細胞後，將宿主細胞在足以有效提高重組病毒回收率的條件下，暴露於有效熱激下。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，將宿主細胞暴露於37℃以上的熱激溫度中。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，將宿主細胞暴露於約37℃-約50℃範圍的熱激溫度中。
11.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，將宿主細胞暴露於約41℃-約47℃範圍的熱激溫度中。
12.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，對宿主細胞進行至少約5分鐘的有效熱激。
13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，對宿主細胞進行約15-200分鐘的有效熱激。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，對宿主細胞進行約30-150分鐘的有效熱激。
15.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在足以讓所述病毒cDNA表達載體和編碼並指導RNA聚合酶表達的瞬時轉染的表達載體表達的時間後，將宿主細胞與相同或不同類型細胞的噬斑擴增細胞共培養，以使被拯救的病毒散播到噬斑擴增細胞中。
16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，轉移所述宿主細胞到至少一層噬斑擴增細胞上以建立宿主和噬斑擴增細胞的共培養。
17.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞是與所述噬斑擴增細胞類型不同的細胞。
18.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞和噬斑擴增細胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。
19.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞是真核細胞。
20.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞是脊椎動物細胞。
21.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。
22.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述感染性、非節段性負鏈RNA病毒是完全病毒。
23.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述N、P和L蛋白中的一種或多種是異源非節段性負鏈RNA病毒的蛋白。
24.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸分子編碼野生型非節段性負鏈RNA病毒的序列。
25.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒是副粘病毒科家族的一員。
26.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒是彈狀病毒科家族的一員。
27.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒選自呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPIV)、牛副流感病毒(BPIV)、嵌合性人-牛PIV(HBPIV)、麻疹病毒(MV)或水泡性口炎病毒(VSV)。
28.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述非節段性負鏈RNA病毒。
29.如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入了一種或多種用重組方法引入的溫度敏感型(ts)減毒突變。
30.如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入了在用生物學方法產生的突變非節段性負鏈RNA病毒中鑑定的一種或多種減毒突變。
31.如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入了與在異源性突變非節段性負鏈RNA病毒中鑑定的一種或多種突變對應的一種或多種減毒突變。
32.如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入了由其密碼子中規定突變的兩個或三個核苷酸改變所確定的至少一種減毒突變。
33.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過規定表型改變的核苷酸修飾重組修飾所述非節段性負鏈RNA病毒，所述表型改變選自生長特性、減毒、溫度敏感性、冷適應性、噬斑大小、宿主範圍限制的改變或免疫原性的改變。
34.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入了改變該病毒基因組或反義基因組中一種或多種C、C』、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3』前導區、5』尾隨區和/或基因間區的重組修飾。
35.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過RNA編輯位點的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個或多個終止密碼子或轉錄信號中的突變，導致所述非節段性負鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失、或該基因的表達降低或消除。
36.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，修飾所述非節段性負鏈RNA病毒，使其編碼選自下組的非病毒分子細胞因子、T-輔助表位、限制性位點標記或能夠在哺乳動物宿主中引發免疫應答的微生物病原體或寄生物的蛋白質。
37.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸包含部分或完整的載體基因組或反義基因組，它們與編碼一種或多種異源病原體的一種或多種抗原決定簇的一種或多種異源基因或基因組節段相組合而形成嵌合基因組或反義基因組。
38.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，將編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節段作為額外的基因或基因組節段加到部分或完整載體基因組或反義基因組的非編碼區附近或其中，或其中用編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節段取代部分載體基因組或反義基因組中的一種或多種相對應的基因或基因組節段。
39.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，在部分或完整載體基因組或反義基因組中對應基因或基因組節段的野生型基因順序位置的對應位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節段。
40.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，在與部分或完整載體基因組或反義基因組中相應基因或基因組節段的野生型基因順序位置相比更接近啟動子或更遠離啟動子的位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節段。
41.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，修飾所述載體基因組或反義基因組，使其編碼摻入異源非節段性負鏈RNA病毒的一種或多種異源抗原結構域、片段或表位的嵌合糖蛋白，以形成嵌合基因組或反義基因組。
42.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述異源病原體選自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒A亞組和B亞組、人副流感病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、1型和2型人免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、狂犬病病毒、人肺炎後病毒、EB病毒、線狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、α病毒和流感病毒。
43.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述嵌合基因組或反義基因組。
44.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述嵌合基因組或反義基因組摻入了在用生物學方法產生的突變非節段性負鏈RNA病毒中鑑定出的一種或多種減毒突變。
45.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，通過規定表型改變的核苷酸修飾重組修飾了所述嵌合基因組或反義基因組，所述表型改變選自生長特性、減毒、溫度敏感性、冷適應性、噬斑大小、宿主範圍限制的改變或免疫原性的改變。
46.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述嵌合基因組或反義基因組摻入改變該病毒基因組或反義基因組中一種或多種C、C』、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3』前導區、5』尾隨區和/或基因間區的重組修飾。
47.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，通過RNA編輯位點的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個或多個終止密碼子或轉錄信號中的突變，導致所述非節段性負鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失、或該基因的表達降低或消除。
48.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，修飾所述嵌合基因組或反義基因組，使其編碼選自下組的非病毒分子細胞因子、T-輔助表位、限制性位點標記或能夠在哺乳動物宿主中引發免疫應答的微生物病原體或寄生物的蛋白質。
49.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，與所述非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組中所述基因或基因組節段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動子或更遠離啟動子的位置上添加、取代或轉座基因或基因組節段，來修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸。
50.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸，使其摻入異源調節元件，包括基因外3』前導區或5』尾隨區、基因起始信號、基因終止信號、編輯區、基因間區或者3』或5』非編碼區。
51.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸，以在該基因組或反義基因組的非編碼區(NCR)中摻入長度在150個核苷酸(nts)至4,000個核苷酸之間的多核苷酸插入物，或作為分離的基因單位(GU)摻入，所述多核苷酸插入物缺少完整的開放閱讀框(ORF)並規定所述非節段性負鏈RNA病毒的減毒表型。
52.如權利要求1所述的方法，該方法還包括在所述宿主細胞中共引入和/或共表達相同或不同非節段性負鏈RNA病毒的結構蛋白的任何一種或任何組合。
53.一種產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟將含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體和編碼並指導RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體在足以使得所述載體共表達和產生重組病毒的條件下引入合適的宿主細胞，所述基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由所述cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物；轉移所述宿主細胞，與噬斑擴增細胞共培養；和從所述共培養物中回收組裝的感染性、非節段性負鏈RNA病毒。
54.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，將所述宿主細胞與相同或不同類型細胞的噬斑擴增細胞共培養，以使被拯救的病毒擴散到噬斑擴增細胞中。
55.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞和噬斑擴增細胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。
56.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，將一種或多種所述病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶的瞬時表達載體引入所述宿主細胞後，將所述宿主細胞在足以提高重組病毒回收率的條件下暴露於有效熱激中。
57.如權利要求53所述的方法，還包括在所述宿主細胞中共引入和/或共表達相同或不同非節段性負鏈RNA病毒的結構蛋白的任何一種或任何組合。
58.一種產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟(a)將含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體引入宿主細胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由所述cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物，該宿主細胞瞬時表達(1)RNA聚合酶、(2)N蛋白、(3)P蛋白、和(4)L蛋白，其中所述RNA聚合酶和N、P和L蛋白各自由瞬時轉染的表達載體表達；和(b)從宿主細胞中回收組裝的感染性、非節段性負鏈RNA病毒。
59.如權利要求58所述的方法，其特徵在於，將所述宿主細胞與相同或不同類型細胞的噬斑擴增細胞共培養，以使被拯救的病毒擴散到噬斑擴增細胞中。
60.如權利要求58所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞和噬斑擴增細胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。
61.如權利要求58所述的方法，其特徵在於，將一種或多種所述病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶的瞬時表達載體引入所述宿主細胞後，將所述宿主細胞在足以提高重組病毒回收率的條件下暴露於有效熱激下。
62.如權利要求58所述的方法，還包括在所述宿主細胞中共引入和/或共表達相同或不同非節段性負鏈RNA病毒的結構蛋白的任何一種或任何組合。
63.一種產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟將含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體和編碼並指導RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體引入合適的宿主細胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由所述病毒cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物；和從所述宿主細胞中回收組裝的感染性、非節段性負鏈RNA病毒。
64.如權利要求63所述的方法，其特徵在於，所述N、P和L蛋白中至少一種由表達控制質粒編碼。
65.如權利要求63所述的方法，其特徵在於，將所述宿主細胞與相同或不同類型細胞的噬斑擴增細胞共培養，以使被拯救的病毒擴散到噬斑擴增細胞中。
66.如權利要求63所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞和噬斑擴增細胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。
67.如權利要求63所述的方法，其特徵在於，將一種或多種所述病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶的瞬時表達載體引入所述宿主細胞後，將所述宿主細胞在足以提高重組病毒回收率的條件下，暴露於有效熱激下。
68.如權利要求63所述的方法，還包括在所述宿主細胞中共引入和/或共表達相同或不同非節段性負鏈RNA病毒的結構蛋白的任何一種或任何組合。
69.一種產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的組合物，該組合物包含(a)含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以在合適的宿主細胞中指導由所述cDNA合成病毒RNA轉錄物；(b)在所述宿主細胞中編碼和指導(1)RNA聚合酶、(2)N蛋白、(3)P蛋白、和(4)L蛋白表達的一種或多種支持載體；和(c)在所述宿主細胞中編碼和指導RNA聚合酶瞬時表達的瞬時表達載體。
70.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，在無細胞共轉染混合物中提供了所述病毒cDNA表達載體、編碼N、P和L的所述一種或多種支持載體、以及編碼和指導瞬時表達所述RNA聚合酶的所述瞬時表達載體。
71.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，將所述病毒cDNA表達載體、編碼N、P和L的所述一種或多種支持載體、以及編碼和指導瞬時表達所述RNA聚合酶的所述瞬時表達載體轉染入所述宿主細胞。
72.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
73.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，編碼和指導瞬時表達所述RNA聚合酶的所述瞬時表達載體是質粒。
74.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，所述組合物還包含與宿主細胞細胞類型相同或不同的噬斑擴增細胞，以使被拯救的病毒從宿主細胞擴散到噬斑擴增細胞中。
75.如權利要求74所述的組合物，其特徵在於，所述組合物還包含至少一層噬斑擴增細胞，以建立宿主和噬斑擴增細胞的共培養。
76.如權利要求74所述的組合物，其特徵在於，所述宿主細胞與所述噬斑擴增細胞的細胞類型不同。
77.如權利要求74所述的組合物，其特徵在於，所述宿主細胞和噬斑擴增細胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。
78.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，所述宿主細胞是真核細胞。
79.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，所述宿主細胞是脊椎動物細胞。
80.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，所述宿主細胞選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。
81.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，所述感染性、非節段性負鏈RNA病毒是完全病毒。
82.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，一種或多種所述N、P和L蛋白是異源非節段性負鏈RNA病毒的蛋白。
83.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸分子編碼野生型非節段性負鏈RNA病毒的序列。
84.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒是副粘病毒科家族的一員。
85.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒是彈狀病毒科家族的一員。
86.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒選自呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPIV)、牛副流感病毒(BPIV)、嵌合性人-牛PIV(HBPIV)、麻疹病毒(MV)或水泡性口炎病毒(VSV)。
87.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述非節段性負鏈RNA病毒。
88.如權利要求87所述的組合物，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入一種或多種重組引入的溫度敏感型(ts)減毒突變。
89.如權利要求87所述的組合物，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入在用生物學方法產生的突變非節段性負鏈RNA病毒中鑑定出的一種或多種減毒突變。
90.如權利要求87所述的組合物，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入與在異源、突變非節段性負鏈RNA病毒中鑑定出的一種或多種突變相對應的一種或多種減毒突變。
91.如權利要求87所述的組合物，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入了由其密碼子規定突變的兩個或三個核苷酸改變所確定的至少一種減毒突變。
92.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，通過規定表型改變的核苷酸修飾重組修飾了所述非節段性負鏈RNA病毒，所述表型改變選自生長特性、減毒、溫度敏感性、冷適應性、噬斑大小、宿主範圍限制的改變或免疫原性的改變。
93.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入改變該病毒基因組或反義基因組中一種或多種C、C』、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3』前導區、5』尾隨區和/或基因間區的重組修飾。
94.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，通過RNA編輯位點的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個或多個終止密碼子或轉錄信號中的突變，導致所述非節段性負鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達降低或消除。
95.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，修飾所述非節段性負鏈RNA病毒，使其編碼選自下組的非病毒分子細胞因子、T-輔助表位、限制性位點標記或能夠在哺乳動物宿主中引發免疫應答的微生物病原體或寄生物的蛋白質。
96.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸包含部分或完整的載體基因組或反義基因組，它們與編碼一種或多種異源病原體的一種或多種抗原決定簇的一種或多種異源基因或基因組節段相組合而形成嵌合基因組或反義基因組。
97.如權利要求96所述的組合物，其特徵在於，將編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節段作為額外的基因或基因組節段加到部分或完整載體基因組或反義基因組的非編碼區附近或之中，或其中用編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節段取代部分載體基因組或反義基因組中的一種或多種相對應的基因或基因組節段。
98.如權利要求96所述的組合物，其特徵在於，在對應於部分或完整載體基因組或反義基因組中相應基因或基因組節段的野生型基因順序位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節段。
99.如權利要求96所述的組合物，其特徵在於，與部分或完整載體基因組或反義基因組中相應基因或基因組節段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動子或更遠離啟動子的位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節段。
100.如權利要求96所述的組合物，其特徵在於，修飾所述載體基因組或反義基因組，使其編碼摻入有異源非節段性負鏈RNA病毒的一種或多種異源抗原結構域、片段或表位的嵌合糖蛋白，以形成嵌合基因組或反義基因組。
101.如權利要求96所述的組合物，其特徵在於，所述異源病原體選自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒A亞組和B亞組、人副流感病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、1型和2型人免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、狂犬病病毒、人肺炎後病毒、EB病毒、線狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、α病毒和流感病毒。
102.如權利要求96所述的組合物，其特徵在於，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述嵌合基因組或反義基因組。
103.如權利要求96所述的組合物，其特徵在於，所述嵌合基因組或反義基因組摻入了在用生物學方法產生的突變非節段性負鏈RNA病毒中鑑定出的一種或多種減毒突變。
104.如權利要求96所述的組合物，其特徵在於，通過規定表型改變的核苷酸修飾重組修飾了所述嵌合基因組或反義基因組，所述表型改變選自生長特性、減毒、溫度敏感性、冷適應性、噬斑大小、宿主範圍限制的改變或免疫原性的改變。
105.如權利要求96所述的組合物，其特徵在於，所述嵌合基因組或反義基因組摻入改變該病毒基因組或反義基因組中一種或多種C、C』、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3』前導區、5』尾隨區和/或基因間區的重組修飾。
106.如權利要求96所述的組合物，其特徵在於，通過RNA編輯位點的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個或多個終止密碼子或轉錄信號中的突變，導致所述非節段性負鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達降低或消除。
107.如權利要求96所述的組合物，其特徵在於，修飾所述嵌合基因組或反義基因組，使其編碼選自下組的非病毒分子細胞因子、T-輔助表位、限制性位點標記或能夠在哺乳動物宿主中引發免疫應答的微生物病原體或寄生物的蛋白質。
108.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，與所述非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組中所述基因或基因組節段的野生型基因順序位置相比，通過在更接近啟動子或更遠離啟動子的位置上添加、取代或轉座基因或基因組節段來修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸。
109.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸，使其摻入異源調節元件，所述元件包括基因外3』前導區或5』尾隨區、基因起始信號、基因終止信號、編輯區、基因間區或者3』或5』非編碼區。
110.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，修飾編碼所述基因組或反義基因組的所述多核苷酸，以在該基因組或反義基因組的非編碼區(NCR)中摻入長度在150個核苷酸(nts)和4,000個核苷酸之間的多核苷酸插入物，或作為分離的基因單位(GU)摻入，所述多核苷酸插入物缺少完整的開放閱讀框(ORF)並規定了所述非節段性負鏈RNA病毒的減毒表型。
111.如權利要求69所述的組合物，其特徵在於，所述一種或多種表達載體編碼相同或不同非節段性負鏈RNA病毒的結構蛋白的任何一種或任何組合。
112.一種通過下述方法產生的單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒將含有編碼非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體、編碼和指導N蛋白、P蛋白和L蛋白的一種或多種支持載體以及編碼和指導RNA聚合酶瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體引入合適的宿主細胞，所述基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物；和從所述宿主細胞中回收組裝的感染性、非節段性負鏈RNA病毒。
113.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
114.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，編碼和指導瞬時表達所述RNA聚合酶的所述瞬時表達載體是質粒。
115.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，將所述病毒cDNA表達、編碼和指導N蛋白、P蛋白和L蛋白表達的所述一種或多種支持載體，以及編碼和指導瞬時表達RNA聚合酶的所述瞬時表達載體混合於DNA轉染混合物中，並同時加入宿主細胞培養物中以實現協同轉染。
116.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，在引入編碼RNA聚合酶的瞬時表達載體之前，將所述病毒cDNA表達載體以及編碼和指導N蛋白、P蛋白和L蛋白表達的所述一種或多種支持載體引入宿主細胞。
117.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，在引入編碼RNA聚合酶的瞬時表達載體之後，但在所述RNA聚合酶在所述宿主細胞中累積到可檢測水平之前，將所述病毒cDNA表達載體和編碼並指導N蛋白、P蛋白和L蛋白表達的所述一種或多種支持載體引入所述宿主細胞。
118.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，將一種或多種(a)所述病毒cDNA表達載體和(b)所述一種或多種編碼和指導RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白表達的支持載體通過磷酸鈣轉染或電穿孔引入宿主細胞。
119.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，將一種或多種(a)所述病毒cDNA表達載體和(b)所述一種或多種編碼和指導RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白表達的支持載體，以及編碼和指導所述RNA聚合酶表達的所述瞬時表達載體引入所述宿主細胞之後，將該宿主細胞在足以提高重組病毒回收率的條件下，暴露於有效熱激下。
120.根據權利要求119所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，將宿主細胞暴露於37℃以上的熱激溫度中。
121.根據權利要求119所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，將宿主細胞暴露於約37℃-約50℃範圍的熱激溫度中。
122.根據權利要求119所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，將宿主細胞暴露於約41℃-約47℃範圍的熱激溫度中。
123.根據權利要求119所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，對宿主細胞進行至少約5分鐘的有效熱激。
124.根據權利要求123所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，對宿主細胞進行約15分鐘至約200分鐘的有效熱激。
125.根據權利要求124所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，對宿主細胞進行約30分鐘至約150分鐘的有效熱激。
126.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，在讓所述病毒cDNA表達載體和編碼並指導N蛋白、P蛋白和L蛋白表達的一種或多種支持載體以及編碼和指導RNA聚合酶表達的所述瞬時表達載體表達足夠時間後，將所述宿主細胞與相同或不同類型細胞的噬斑擴增細胞共培養，以使被拯救的病毒擴散到噬斑擴增細胞中。
127.根據權利要求126所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，將所述宿主細胞轉移到至少一層噬斑擴增細胞上，以建立宿主和噬斑擴增細胞的共培養。
128.根據權利要求126所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述宿主細胞與所述噬斑擴增細胞的細胞類型不同。
129.根據權利要求114所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述宿主細胞和噬斑擴增細胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。
130.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述宿主細胞是真核細胞。
131.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述宿主細胞是脊椎動物細胞。
132.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述宿主細胞選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。
133.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述感染性、非節段性負鏈RNA病毒是完全病毒。
134.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，一種或多種所述N、P和L蛋白是異源非節段性負鏈RNA病毒的蛋白。
135.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸分子編碼野生型非節段性負鏈RNA病毒的序列。
136.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒是副粘病毒科家族的一員。
137.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒是彈狀病毒科家族的一員。
138.根據權利要求101所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒選自呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPIV)、牛副流感病毒(BPIV)、嵌合性人-牛PIV(HBPIV)、麻疹病毒(MV)或水泡性口炎病毒(VSV)。
139.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述非節段性負鏈RNA病毒。
140.根據權利要求139所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入一種或多種重組方法引入的溫度敏感型(ts)減毒突變。
141.根據權利要求139所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入了在用生物學方法產生的突變非節段性負鏈RNA病毒中鑑定出的一種或多種減毒突變。
142.根據權利要求139所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入與在異源性突變非節段性負鏈RNA病毒中鑑定的一種或多種突變相對應的一種或多種減毒突變。
143.根據權利要求139所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入了由其密碼子規定突變的兩個或三個核苷酸改變所確定的至少一種減毒突變。
144.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，通過規定表型改變的核苷酸修飾重組修飾所述非節段性負鏈RNA病毒，所述表型改變選自生長特性、減毒、溫度敏感性、冷適應性、噬斑大小、宿主範圍限制的改變或免疫原性的改變。
145.根據權利要求144所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒摻入改變病毒基因組或反義基因組中一種或多種C、C』、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3』前導區、5』尾隨區和/或基因間區的重組修飾。
146.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，通過RNA編輯位點的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個或多個終止密碼子或轉錄信號中的突變，導致所述非節段性負鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達降低或消除。
147.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，修飾所述非節段性負鏈RNA病毒，使其編碼選自下組的非病毒分子細胞因子、T-輔助表位、限制性位點標記或能夠在哺乳動物宿主中引發免疫應答的微生物病原體或寄生物的蛋白質。
148.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸包含部分或完整的載體基因組或反義基因組，它們與編碼一種或多種異源病原體的一種或多種抗原決定簇的一種或多種異源基因或基因組節段相組合，以形成嵌合基因組或反義基因組。
149.根據權利要求148所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，將編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節段作為額外的基因或基因組節段加到部分或完整載體基因組或反義基因組的非編碼區附近或之中，或其中用編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節段取代部分載體基因組或反義基因組中的一種或多種相對應的基因或基因組節段。
150.根據權利要求148所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，在對應於部分或完整載體基因組或反義基因組中相應基因或基因組節段的野生型基因順序位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節段。
151.根據權利要求148所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，與部分或完整載體基因組或反義基因組中相應基因或基因組節段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動子或更遠離啟動子的位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節段。
152.根據權利要求148所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，修飾所述載體基因組或反義基因組，使其編碼摻入了異源非節段性負鏈RNA病毒的一種或多種異源抗原結構域、片段或表位的嵌合性糖蛋白，以形成嵌合基因組或反義基因組。
153.根據權利要求148所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述異源病原體選自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒A亞組和B亞組、人副流感病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、1型和2型人免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、狂犬病病毒、人肺炎後病毒、EB病毒、線狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、α病毒和流感病毒。
154.根據權利要求148所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述嵌合基因組或反義基因組。
155.根據權利要求148所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述嵌合基因組或反義基因組摻入了在用生物學方法產生的突變非節段性負鏈RNA病毒中鑑定出的一種或多種減毒突變。
156.根據權利要求148所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，通過規定表型改變的核苷酸修飾重組修飾了所述嵌合基因組或反義基因組，該表型改變選自生長特性、減毒、溫度敏感性、冷適應性、噬斑大小、宿主範圍限制的改變或免疫原性的改變。
157.根據權利要求148所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，所述嵌合基因組或反義基因組摻入改變該病毒基因組或反義基因組中一種或多種C、C』、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3』前導區、5』尾隨區和/或基因間區的重組修飾。
158.根據權利要求148所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，通過RNA編輯位點的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個或多個終止密碼子或轉錄信號中的突變，導致所述非節段性負鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達降低或消除。
159.根據權利要求148所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，修飾所述嵌合基因組或反義基因組，使其編碼選自下組的非病毒分子細胞因子、T-輔助表位、限制性位點標記或能夠在哺乳動物宿主中引發免疫應答的微生物病原體或寄生物的蛋白質。
160.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，與所述非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組中所述基因或基因組節段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動子或更遠離啟動子的位置添加、取代或轉座基因或基因組節段，來修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸。
161.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸，使其摻入異源調節元件，所述元件包括基因外3』前導區或5』尾隨區、基因起始信號、基因終止信號、編輯區、基因間區或者3』或5』非編碼區。
162.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，修飾編碼所述基因組或反義基因組的所述多核苷酸，以在該基因組或反義基因組的非編碼區(NCR)中摻入長度在150個核苷酸(nts)和4,000個核苷酸之間的多核苷酸插入物，或作為分離的基因單位(GU)摻入，所述多核苷酸插入物缺少完整的開放閱讀框(ORF)並規定了所述非節段性負鏈RNA病毒的減毒表型。
163.根據權利要求112所述方法產生的感染性、非節段性負鏈RNA病毒，其特徵在於，該方法還包括在所述宿主細胞中共引入和/或共表達相同或不同非節段性負鏈RNA病毒的結構蛋白的任何一種或任何組合。
164.一種在藥學上可接受的載體中含有免疫學有效量的按權利要求112所述方法產生的分離的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的免疫原性組合物。
165.如權利要求164所述的免疫原性組合物，其特徵在於，將所述非節段性負鏈RNA病毒配製成103至107PFU的劑量。
166.如權利要求164所述的免疫原性組合物，其特徵在於，將其配製成上呼吸道給藥的劑型。
167.如權利要求164所述的免疫原性組合物，其特徵在於，將其配製成氣霧劑、滴劑或氣溶膠劑型給藥。
168.如權利要求164所述的免疫原性組合物，其特徵在於，將所述宿主細胞與相同或不同類型細胞的噬斑擴增細胞共培養，以使被拯救的病毒擴散到噬斑擴增細胞中。
169.如權利要求164所述的免疫原性組合物，其特徵在於，所述宿主細胞和噬斑擴增細胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。
170.如權利要求164所述的免疫原性組合物，其特徵在於，將一種或多種所述病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶的瞬時表達載體引入所述宿主細胞後，將所述宿主細胞在足以提高重組病毒回收率的條件下，暴露於有效熱激下。
171.如權利要求164所述的免疫原性組合物，還包括在所述宿主細胞中共引入和/或共表達相同或不同非節段性負鏈RNA病毒的結構蛋白的任何一種或任何組合。
172.一種刺激哺乳動物對象免疫系統以在該對象中誘導抗非節段性負鏈RNA病毒的免疫應答的方法，該方法包括給予對象包含在藥學上可接受載體中的免疫學有效量的按權利要求112所述方法產生的分離的感染性、非節段性負鏈RNA病毒。
173.如權利要求172所述的方法，其特徵在於，以103至107PFU的劑量給予所述非節段性負鏈RNA病毒。
174.如權利要求172所述的方法，其特徵在於，將所述非節段性負鏈RNA病毒施用於上呼吸道。
175.如權利要求172所述的方法，其特徵在於，通過氣霧劑、滴劑或氣溶膠給予所述非節段性負鏈RNA病毒。
176.一種產生單分子負鏈RNA病毒目的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟(a)將含有編碼生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體引入宿主細胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由所述cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物，其中所述宿主細胞表達N蛋白、P蛋白和L蛋白，並由瞬時轉染的表達載體瞬時表達RNA聚合酶；和(b)從所述宿主細胞中回收組裝的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒。
177.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，所述病毒在所述宿主細胞中組裝後，不能完成一輪複製。
178.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，所述病毒能夠在體外生長和/或複製，但在體內是生長或複製缺陷的。
179.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，所述瞬時轉染的表達載體是質粒。
180.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，將所述病毒cDNA表達載體和編碼並指導瞬時表達RNA聚合酶的瞬時表達載體混合於DNA轉染混合物中，並同時加入到宿主細胞培養物中，以實現協同轉染。
181.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，在引入編碼RNA聚合酶的瞬時轉染的表達載體之前，將所述病毒cDNA表達載體以及編碼N、P、L蛋白的一種或多種支持載體引入宿主細胞。
182.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，將一種或多種所述病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶的瞬時轉染表達載體通過磷酸鈣轉染或電穿孔引入所述宿主細胞。
183.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，將一種或多種所述病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶的瞬時轉染表達載體引入所述宿主細胞之後，將該宿主細胞在足以提高該重組病毒回收率的條件下，暴露於有效熱激下。
184.如權利要求183所述的方法，其特徵在於，將所述宿主細胞暴露於37℃以上的熱激溫度中。
185.如權利要求183所述的方法，其特徵在於，對所述宿主細胞進行至少約5分鐘的有效熱激。
186.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，在讓所述病毒cDNA表達載體和編碼並指導RNA聚合酶表達的瞬時轉染的表達載體表達足夠時間後，將所述宿主細胞與相同或不同類型細胞的噬斑擴增細胞共培養，以使被拯救的病毒擴散到噬斑擴增細胞中。
189.如權利要求186所述的方法，其特徵在於，將所述宿主細胞轉移到至少一層噬斑擴增細胞上，以建立宿主和噬斑擴增細胞的共培養。
190.如權利要求186所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞與所述噬斑擴增細胞的細胞類型不同。
191.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，所述複製缺陷型、非節段性負鏈RNA病毒是亞病毒顆粒。
192.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，一種或多種所述N、P和L蛋白是異源非節段性負鏈RNA病毒的蛋白。
193.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒是副粘病毒科家族的一員。
194.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒是彈狀病毒科的一員。
195.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述非節段性負鏈RNA病毒。
196.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，通過規定表型改變的核苷酸修飾重組修飾所述非節段性負鏈RNA病毒，所述表型改變選自生長特性、減毒、溫度敏感性、冷適應性、噬斑大小、宿主範圍限制的改變或免疫原性的改變。
197.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，通過RNA編輯位點的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個或多個終止密碼子或轉錄信號中的突變，導致所述非節段性負鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達降低或消除。
198.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，所述編碼基因組或反義基因組的多核苷酸包含部分或完整的載體基因組或反義基因組，它們與編碼一種或多種異源病原體的一種或多種抗原決定簇的一種或多種異源基因或基因組節段相組合而形成嵌合基因組或反義基因組。
199.如權利要求198所述的方法，其特徵在於，與部分或完整載體基因組或反義基因組中相應基因或基因組節段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動子或更遠離啟動子的位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節段。
200.如權利要求198所述的方法，其特徵在於，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述嵌合基因組或反義基因組。
201.如權利要求198所述的方法，其特徵在於，通過規定表型改變的核苷酸修飾重組修飾了所述嵌合基因組或反義基因組，所述表型改變選自生長特性、減毒、溫度敏感性、冷適應性、噬斑大小、宿主範圍限制的改變或免疫原性的改變。
202.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，與所述非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組中所述基因或基因組節段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動子或更遠離啟動子的位置添加、取代或轉座基因或基因組節段，來修飾編碼所述基因組或反義基因組的所述多核苷酸。
203.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸，使其摻入異源調節元件，包括基因外3』前導區或5』尾隨區、基因起始信號、基因終止信號、編輯區、基因間區或者3』或5』非編碼區。
204.如權利要求176所述的方法，其特徵在於，修飾編碼所述基因組或反義基因組的所述多核苷酸，以在該基因組或反義基因組的非編碼區(NCR)摻入長度在150個核苷酸(nts)和4,000個核苷酸之間的多核苷酸插入物，或作為分離的基因單位(GU)摻入，所述多核苷酸插入物缺少完整的開放閱讀框(ORF)並規定了所述非節段性負鏈RNA病毒的減毒表型。
205.如權利要求176所述的方法，還包括在所述宿主細胞中共引入和/或共表達相同或不同非節段性負鏈RNA病毒的結構蛋白的任何一種或任何組合。
206.一種產生單分子負鏈RNA病毒目的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟將含有編碼生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體和編碼並指導RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體在足以使得所述載體共表達和產生重組病毒的條件下引入合適的宿主細胞，所述基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由所述cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物；轉移所述宿主細胞，與噬斑擴增細胞共培養；和從所述共培養物中回收組裝的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒。
207.如權利要求206所述的方法，其特徵在於，所述複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒在所述宿主細胞中組裝後，不能完成一輪複製，或能夠在體外生長和/或複製，但在體內是生長或複製缺陷的。
207.一種產生單分子負鏈RNA病毒目的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟(a)將含有編碼生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體引入宿主細胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由所述cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物，該宿主細胞瞬時表達(1)RNA聚合酶、(2)N蛋白、(3)P蛋白、和(4)L蛋白，其中所述RNA聚合酶和N、P和L蛋白各自由瞬時轉染的表達載體表達；和(b)從所述宿主細胞中回收組裝的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒。
209.如權利要求208所述的方法，其特徵在於，所述複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒在所述宿主細胞中組裝後，不能完成一輪複製，或能夠在體外生長和/或複製，但在體內是生長或複製缺陷的。
210.如權利要求208所述的方法，還包括在所述宿主細胞中共引入和/或共表達相同或不同非節段性負鏈RNA病毒的結構蛋白的任何一種或任何組合。
211.一種產生單分子負鏈RNA病毒目的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟將含有編碼生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體以及編碼和指導RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白的一種或多種瞬時表達載體引入合適的宿主細胞，所述基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導所述cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物；和從所述宿主細胞中回收組裝的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒。
212.如權利要求211所述的方法，還包括在所述宿主細胞中共引入和/或共表達相同或不同非節段性負鏈RNA病毒的結構蛋白的任何一種或任何組合。
213.一種用於產生單分子負鏈RNA病毒目的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的組合物，該組合物包含(a)含有編碼生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體，該基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以在合適的宿主細胞中指導由所述cDNA合成病毒RNA轉錄物；(b)在所述宿主細胞中編碼和指導(1)N蛋白、(2)P蛋白、和(3)L蛋白瞬時表達的一種或多種表達載體；和(c)在所述宿主細胞中編碼和指導RNA聚合酶瞬時表達的瞬時表達載體。
214.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，所述病毒在所述宿主細胞中組裝後，不能完成一輪複製，或能夠在體外生長和/或複製，但在體內是生長或複製缺陷的。
215.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
216.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，所述瞬時轉染的表達載體是質粒。
217.如權利要求213所述的組合物，還包含至少一層噬斑擴增細胞，以建立宿主和噬斑擴增細胞的共培養。
218.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，所述複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒是亞病毒顆粒。
219.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒是副粘病毒科家族的一員。
220.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，所述非節段性負鏈RNA病毒是彈狀病毒科家族的一員。
221.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述非節段性負鏈RNA病毒。
222.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，通過規定表型改變的核苷酸修飾重組修飾所述非節段性負鏈RNA病毒，所述表型改變選自生長特性、減毒、溫度敏感性、冷適應性、噬斑大小、宿主範圍限制的改變或免疫原性的改變。
223.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，通過RNA編輯位點的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個或多個終止密碼子或轉錄信號中的突變，導致所述非節段性負鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達降低或消除。
224.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，所述編碼基因組或反義基因組的多核苷酸包含部分或完整的載體基因組或反義基因組，它們與編碼一種或多種異源病原體的一種或多種抗原決定簇的一種或多種異源基因或基因組節段相組合以形成嵌合基因組或反義基因組。
225.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，與所述非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組中所述基因或基因組節段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動子或更遠離啟動子的位置上添加、取代或轉座基因或基因組節段，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸。
226.如權利要求213所述的組合物，其特徵在於，所述一種或多種表達載體還編碼相同或不同非節段性負鏈RNA病毒結構蛋白的一種或任何組合。
227.一種通過下述方法產生的單分子負鏈RNA病毒目的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒將含有編碼生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達載體、編碼和指導N蛋白、P蛋白和L蛋白的一種或多種支持載體以及編碼和指導RNA聚合酶瞬時表達的一種或多種瞬時表達載體引入合適的宿主細胞，所述基因組或反義基因組操作性連接有表達控制序列以指導由所述cDNA表達載體合成病毒RNA轉錄物；和從所述宿主細胞中回收組裝的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒。
228.一種在藥學上可接受的載體中的含有免疫學有效量的按權利要求227所述方法產生的分離的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒的免疫原性組合物。
229.一種刺激哺乳動物對象免疫系統以在該對象中誘導抗非節段性負鏈RNA病毒的免疫應答的方法，該方法包括給予對象在藥學上可接受載體中的免疫學有效量的按權利要求227所述方法產生的分離的生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒。
全文摘要
本發明提供了產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的方法，包括在用編碼RNA聚合酶的表達載體瞬時轉染的宿主細胞中共表達病毒的cDNA和必需病毒蛋白N、P和L。在另一種方法中，用病毒cDNA表達載體和編碼RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白的一種或多種載體轉染宿主細胞後，將宿主細胞暴露於足以提高重組病毒回收率的有效熱激條件下。在另一實施方式中，在病毒拯救開始後轉移所述宿主細胞，與噬斑擴增細胞，一般是單層擴增細胞共培養，從該共培養物中回收組裝的感染性、非節段性負鏈RNA病毒。本發明也提供用於產生單分子負鏈RNA病毒目的感染性、非節段性負鏈RNA病毒的組合物，和用上述方法和組合物產生的重組病毒和採用該重組病毒的免疫原性組合物和方法。在其它實施方式中，採用本發明方法和組合物產生生長或複製缺陷型非節段性負鏈RNA病毒和亞病毒顆粒。
文檔編號C12N7/00GK1871355SQ200480020973
公開日2006年11月29日 申請日期2004年6月8日 優先權日2003年6月9日
發明者C·L·派克斯, S·A·烏登, M·S·西德胡 申請人:惠氏