心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙及製備方法
2023-10-09 20:23:04 1
專利名稱:心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙及製備方法
技術領域:
本發明涉及一種心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙。
背景技術:
心腦血管疾病是危害人類生命和健康的第一殺手,發病趨勢也在逐年上升,美國急診部門就有4. 5億急性心肌梗塞(AMI)病人,有4億病人被確診為急性心肌梗塞,其中 2-3%的人真正有AMI,並且由於AMI的症狀的多樣性,合併症躲在臨床存在著相當大的誤診和漏診,有些心肌損傷因為不典型而被醫生和患者忽視,而沒有及時救治,出現很多的生命危險。急性心肌梗死發病急,死亡率高,AMI的早期診斷和及時救治對降低AMI死亡率非常重要。肌鈣蛋白是由肌鈣蛋白I,T,C三種亞基組成,在肌肉運動中起重要調節作用。當心肌受到損失後,心肌肌鈣蛋白複合物釋放到血液中,在三種亞基中,肌鈣蛋白I( CTnI)是唯一存在心肌細胞中,迄今為止診斷AMI靈敏度和特異性最高的血清生化指標,被廣泛研究作為心肌損傷的確定性標誌物,文獻表面,正常人血液中的cTnl水平在0. 5ng/ml以下, 發生心肌梗死後會在4-6小時內上升,所以0、ng/ml WcTnI濃度的定量對知道醫生用藥,和病人就診非常重要。心肌肌鈣蛋白I常規檢測方法有放射性免疫法,高效液相色譜法,電化學分析法, 蛋白分析儀,ELISA診斷試劑盒和免疫層析試紙條等,這些方法有的存在放射性汙染,需要專業大型儀器,耗時長,需要專業人員,不能定量等缺點。在臨床上廣泛應用具有一定局限, 不易廣泛推廣,也不適合家庭使用。國內現有類似的心肌肌鈣蛋白檢測方法的相關專利,申請號200310119332. 3、名稱為「人體心肌肌鈣蛋白I的快速測定的方法」的專利,它提供的一種快速測定心肌肌鈣蛋白I的方法,但是該方法的步驟繁瑣,而且還需要專業設備才能測定含量。申請號CN201020185781.3的專利雖能定量,但是製備過程繁雜。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是為了克服當前膠體金免疫層析試紙條在實際推廣使用中只能定性不能定量檢測的不足,提供一種不要特定的儀器和專業設備,就能快速評定檢測結果,並對檢測結果進行半定量水平的測定,同時提供該試紙的製備方法。為解決上述技術問題,本發明的一種心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙,主要由樣品墊,結合墊,吸水墊,底板,硝酸纖維膜五部分組成,其特徵在於所述硝酸纖維膜上分別劃有兩條平行的抗體捕獲線,靠近結合墊的一條含有經過確定了濃度的第一抗心肌肌鈣蛋白 I單克隆抗體,作為檢測線,另一條含有經確定了濃度的羊抗兔IgG抗體,作為標準濃度顯色對照線,兩條線相距4-7mm ;所述結合墊噴有膠體金或彩色乳膠標記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標兔IgG兩種物質。優選的,所述硝酸纖維膜與上部的吸水墊,硝酸纖維膜與下端的結合墊,結合墊與下部的樣品墊之間分別部分重疊交接,所述重疊寬度為l_4mm。
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所用的膠體金或彩色乳膠標記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的金顆粒或乳膠大小在20nm— 120nm之間。進一步優選的,分別調整所述羊抗兔IgG抗體、抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體、金標心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標兔IgG的濃度,在檢測樣品時,當樣品中的心肌肌鈣蛋白I激素濃度為2ng/ml時,檢測線與標準濃度顯色對照線的紅顏色深淺相同;當樣品中的心肌肌鈣蛋白I激素濃度低於2ng /ml時,檢測線的紅色淺於標準濃度顯色對照線的紅色; 當樣品中心肌肌鈣蛋白I激素濃度高於2ng /ml時,檢測線的紅色深於標準濃度顯色對照線的紅色。一種與權利要求4所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙配合使用的比色卡,該比色卡中含有多種紅色梯度的紅色塊,每種深淺的紅色塊,對應用心肌肌鈣蛋白I半定量檢測試紙檢測不同濃度心肌肌鈣蛋白I抗原檢測所顯示的紅色;通過對照比色卡,可以半定量確定檢測樣品中的心肌肌鈣蛋白I的濃度。本發明的檢測方法為將血液等樣品滴4-5滴到樣品墊上,含心肌肌鈣蛋白I抗原的血液通過樣品墊的毛細作用,向硝酸纖維膜方向移動,經過金標結合墊時,與金標結合墊上的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體特異性結合,並使結合物一起向硝酸纖維膜移動,當到達硝酸纖維膜上包被有抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的檢測線時,發生雙抗夾心特異性結合,樣品中的抗原和金標的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體被包被在硝酸纖維膜的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體固定,從而使檢測線顯示膠體金的紅色,其檢測線的紅色深淺與樣品中的心肌肌鈣蛋白I抗原濃度程正比。未被檢測線固定的金標心肌肌鈣蛋白I單抗和心肌肌鈣蛋白I激素抗原結合物或金標心肌肌鈣蛋白I單抗繼續沿硝酸纖維膜上移,達到質控線時,金標心肌肌鈣蛋白I單抗不與質控線上的羊抗兔IgG抗體反應,而是定量的金標兔 IgG與質控線羊抗兔反應,而被質控線固定,顯示紅色,無論樣品中是否含有心肌肌鈣蛋白 I抗原,或抗原的濃度如何變化,質控線始終顯色,且色值固定,如果質控線不顯色,說明試紙條無效。本發明還提供上述心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙的製備方法,包括以下步驟 選擇兩株抗心肌肌鈣蛋白I鼠源性特異單克隆抗體,即抗心肌肌鈣蛋白I單抗1和抗
心肌肌鈣蛋白I單抗2;
選擇抗心肌肌鈣蛋白I單抗1作為膠體金標記抗體,使用檸檬酸鈉還原法製備為 20nm^l20nm大小的納米金顆粒,10000RPM/MIN離心10分鐘,製備為儲備液,將膠體金標記單抗,並加入聚乙二醇PEG,牛血清白蛋白BSA做穩定劑;
將標記號的金標抗體1,噴聚酯膜或玻璃纖維紙,低溫乾燥,製得金標結合墊; 將玻璃纖維膜浸泡在磷酸鹽緩衝液PBS加表面活性劑的溶液中5分鐘,再撈出30度左右烘乾,製得樣品墊;
將2cm寬的硝酸纖維膜粘在PVC片材中間位置,並定量噴塗抗心肌肌鈣蛋白I單抗2 和定量的羊抗兔抗體兩條相距5mm的Imm寬的條帶,低溫乾燥10小時;
裁剪一定寬度的吸水紙,黏貼在PVC片材上硝酸纖維素膜的上部,並交疊硝酸纖維膜 l-3mm ;
將金標結合墊裁剪成5mm-13mm左右的條帶,黏貼在PVC片材上硝酸纖維膜的下部,交疊硝酸纖維膜l_3mm ;將樣品墊裁剪成25mm-30mm寬的條帶,再黏貼在金標結合墊的下部,交接金標結合墊 3mm-5mm ;
再用40mm左右的帶MAX線的不乾膠,粘在金標結合墊和樣品墊上; 用切割機將上面製得的大板,切成2. 5mm-6mm的條帶,即製備成了所述心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙,然後用鋁箔袋密封乾燥備用。本發明心肌肌鈣蛋白定量檢測試紙的製備方法簡單、成本低,檢測使用方便、能夠快速簡便,半定量的靈敏檢測人體血液樣本中的心肌肌鈣蛋白I的含量,適合家庭使用和推廣。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的技術方案作進一步具體說明。圖1為本發明心肌肌鈣蛋白定量檢測試紙的主視圖。圖2為本發明心肌肌鈣蛋白定量檢測試紙的側視圖。圖3為心肌肌鈣蛋白定量檢測試紙配合使用的比色卡主視圖。
具體實施例方式結合圖1、2所示,本發明心肌肌鈣蛋白定量檢測試紙主要由樣品墊01,結合墊 02,吸水墊06,底板07,硝酸纖維膜04五部分組成,硝酸纖維膜04上分別劃有兩條平行的抗體捕獲線,靠近結合墊的一條含有經過確定了濃度的第一抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體,作為檢測線03,另一條含有經確定了濃度的羊抗兔IgG抗體,作為標準濃度顯色對照線05,也稱為質控線,兩條線相距4-7mm ;結合墊02上噴有膠體金標記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標兔IgG兩種物質。硝酸纖維膜04與上部的吸水墊06,硝酸纖維膜04與下端的結合墊02,結合墊02與下部的樣品墊06之間分別部分重疊交接,重疊寬度分別為l-4mm。所用的膠體金標記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的金顆粒大小為 20nm—120nm。分別調整所述羊抗兔IgG抗體、抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體、金標心肌肌鈣蛋白 I單克隆抗體和金標兔IgG的濃度,在檢測樣品時,當樣品中的心肌肌鈣蛋白I濃度為2ng/ ml時,檢測線與標準濃度顯色對照線的紅顏色深淺相同;當樣品中的心肌肌鈣蛋白I激素濃度低於2ng /ml時,檢測線的紅色淺於標準濃度顯色對照線的紅色;當樣品中心肌肌鈣蛋白I濃度高於2ng /ml時,檢測線的紅色深於標準濃度顯色對照線的紅色。心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙的製備方法,包括以下步驟
購買心肌肌鈣蛋白I免疫小鼠,分別得到抗心肌肌鈣蛋白I鼠源性特異單克隆抗體兩株,抗心肌肌鈣蛋白I單抗1和抗心肌肌鈣蛋白I單抗2。選擇抗心肌肌鈣蛋白I單抗2 作為膠體金標記抗體,使用檸檬酸鈉還原法製備最20nnTl20nm大小,適合標記該抗體的納米金顆粒。10000RPM/MIN離心10分鐘,製備儲備液,將膠體金標記單抗,並加入PEG,BSA做穩定劑。將標記號的金標抗體1,噴聚酯膜或玻璃纖維紙。低溫乾燥,制的金標結合墊。將玻璃纖維膜浸泡在PBS加表面活性劑的溶液中5分鐘,再撈出30度左右烘乾,製得樣品墊。 將2cm寬的硝酸纖維膜粘在PVC片材中間位置,並定量噴塗抗心肌肌鈣蛋白I單抗2和定量的羊抗兔抗體兩條相距5mm的約Imm寬的條帶。低溫乾燥10小時。裁剪一定寬度的吸
6水紙,黏貼在PVC片材上,硝酸纖維素膜的上部,並交疊硝酸纖維膜l-3mm。將金標結合墊裁剪成5mm-13mm左右的條帶,黏貼在PVC片材上,硝酸纖維膜的下部,交疊硝酸纖維膜l_3mm 左右。將樣品墊裁剪成25mm-30mm寬的條帶,再黏貼在金標結合墊的下部,交接金標結合墊 3mm-5mm左右。再用40mm左右的帶MAX線的不乾膠,粘在金標結合墊和樣品墊上,防止其脫落。用切割機將上面製得的大板,切成2. 5mm-6mm左右的條帶,即製備成了半定量檢測人心肌肌鈣蛋白I半定量檢測試紙條。用鋁箔袋密封乾燥備用。在檢測前將鋁箔包裝袋拿出,室溫放置5min左右,取出試紙,將樣品墊下部浸於樣品溶液中,不超過MAX線,5秒鐘拿出,水平放置,5分鐘肉眼觀察檢測線和標準質控線。如果檢測線紅色大於質控線,說明樣品中肌鈣蛋白I濃度高於2ng/ml,樣品的來源人有心肌損傷的可能。如果檢測線紅色淺於質控線,說明樣品中的肌鈣蛋白I濃度低於 2ng/ml。如果想知道樣品中心肌肌鈣蛋白I的具體濃度,可以將檢測線的顯色結果與色卡對照,色卡中顏色與檢測線相近的色塊值,即為樣品中肌鈣蛋白I的濃度。即能快速,方便, 快捷的檢測樣品中肌鈣蛋白I的具體濃度,估量出心肌損傷程度。本發明製備的心肌肌鈣蛋白I半定量分析檢測層析試紙條和與ELISA試劑盒,對選取157份武漢市內九家醫院的心梗急診部的血清樣本進行了檢測,結果如下
心肌肌鈣蛋白I半定量分析檢測層析試紙條142份陽性,15陰性。ELISA試劑盒141份陽性,16份陰性。心肌肌鈣蛋白I半定量分析檢測層析試紙條檢測結果與ELISA試劑盒檢測結果總符合率為99. 4%。最後所應說明的是,以上具體實施方式
僅用以說明本發明的技術方案而非限制, 儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明,本領域的普通技術人員應當理解,可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換,而不脫離本發明技術方案的精神和範圍,其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。
權利要求
1.一種心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙,主要由樣品墊,結合墊,吸水墊,底板,硝酸纖維膜五部分組成,其特徵在於所述硝酸纖維膜上分別劃有兩條平行的抗體捕獲線,靠近結合墊的一條含有經過確定了濃度的第一抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體,作為檢測線,另一條含有經確定了濃度的羊抗兔IgG抗體,作為標準濃度顯色對照線,兩條線相距4-7mm ;所述結合墊噴有膠體金或彩色乳膠標記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標兔IgG兩種物質。
2.根據權利要求1所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙,其特徵在於,所述硝酸纖維膜與上部的吸水墊,硝酸纖維膜與下端的結合墊,結合墊與下部的樣品墊之間分別部分重疊交接,所述重疊寬度為l_4mm。
3.根據權利要求1所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙,其特徵在於,所用的膠體金或彩色乳膠標記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的金顆粒或乳膠大小在20nm—120nm 之間。
4.根據權利要求1-3之一所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙,其特徵在於,分別調整所述羊抗兔IgG抗體、抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體、金標心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標兔IgG的濃度,在檢測樣品時,當樣品中的心肌肌鈣蛋白I激素濃度為2ng/ml時,檢測線與標準濃度顯色對照線的紅顏色深淺相同;當樣品中的心肌肌鈣蛋白I激素濃度低於 2ng /ml時,檢測線的紅色淺於標準濃度顯色對照線的紅色;當樣品中心肌肌鈣蛋白I激素濃度高於2ng /ml時,檢測線的紅色深於標準濃度顯色對照線的紅色。
5.一種與權利要求4所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙配合使用的比色卡,該比色卡中含有多種紅色梯度的紅色塊,每種深淺的紅色塊,對應用心肌肌鈣蛋白I半定量檢測試紙檢測不同濃度心肌肌鈣蛋白I抗原檢測所顯示的紅色;通過對照比色卡,可以半定量確定檢測樣品中的心肌肌鈣蛋白I的濃度。
6.一種根據權利要求5所述的心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙的製備方法,其特徵在於包括以下步驟選擇兩株抗心肌肌鈣蛋白I鼠源性特異單克隆抗體,即抗心肌肌鈣蛋白I單抗1和抗心肌肌鈣蛋白I單抗2;選擇抗心肌肌鈣蛋白I單抗1作為膠體金標記抗體,使用檸檬酸鈉還原法製備為 20nm^l20nm大小的納米金顆粒,10000RPM/MIN離心10分鐘,製備為儲備液,將膠體金標記單抗,並加入聚乙二醇PEG,牛血清白蛋白BSA做穩定劑;將標記好的金標抗體1,噴聚酯膜或玻璃纖維紙,低溫乾燥,製得金標結合墊;將玻璃纖維膜浸泡在磷酸鹽緩衝液PBS加表面活性劑的溶液中5分鐘,再撈出30度左右烘乾,製得樣品墊;將2cm寬的硝酸纖維膜粘在PVC片材中間位置,並定量噴塗抗心肌肌鈣蛋白I單抗2 和定量的羊抗兔抗體兩條相距5mm的Imm寬的條帶,低溫乾燥10小時;裁剪一定寬度的吸水紙,黏貼在PVC片材上硝酸纖維素膜的上部,並交疊硝酸纖維膜 l-3mm ;將金標結合墊裁剪成5mm-13mm左右的條帶,黏貼在PVC片材上硝酸纖維膜的下部,交疊硝酸纖維膜l_3mm ;將樣品墊裁剪成25mm-30mm寬的條帶,再黏貼在金標結合墊的下部,交接金標結合墊3mm-5mm ;再用40mm左右的帶MAX線的不乾膠,粘在金標結合墊和樣品墊上; 用切割機將上面製得的大板,切成2. 5mm-6mm的條帶,即製備成了所述心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙,然後用鋁箔袋密封乾燥備用。
全文摘要
本發明涉及一種心肌肌鈣蛋白半定量檢測試紙,主要由樣品墊,結合墊,吸水墊,底板,硝酸纖維膜五部分組成,硝酸纖維膜上分別劃有兩條平行的抗體捕獲線,靠近結合墊的一條含有經過確定了濃度的第一抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體,作為檢測線,另一條含有經確定了濃度的羊抗兔IgG抗體,作為標準濃度顯色對照線,兩條線相距4-7mm;結合墊噴有膠體金或彩色乳膠標記的第二抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和金標兔IgG兩種物質。本發明心肌肌鈣蛋白定量檢測試紙的製備方法簡單、成本低,檢測使用方便、能夠快速簡便,半定量的靈敏檢測人體血液樣本中的心肌肌鈣蛋白I的含量,適合家庭使用和推廣。
文檔編號G01N33/532GK102207507SQ20111007176
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月24日 優先權日2011年3月24日
發明者周軍, 王健斌, 龔貽洲 申請人:武漢璟泓萬方堂醫藥科技有限公司