惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片的製作方法
2023-10-09 12:45:59
專利名稱：惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片的製作方法
技術領域：
本發明惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片涉及一種蛋白質晶片，蛋白質晶片技術是將蛋白或多肽有序地點陣在固體片基上，利用免疫學方法對蛋白質進行檢測、識別、鑑定的新興技術。具有體積小，信息含量高、並可依不同需要進行組合設計等特點。
背景技術：
近年來，惡性腫瘤已成為危害人類健康的常見病，多發病。它不僅對患者生命造成威脅，且治療費用高昂。但是惡性腫瘤並非不治之症，只要及早發現，儘早治療，治癒率可達90％以上，儘早治療的費用也相對極其低廉。所以目前世界許多科學工作者都致力於惡性腫瘤早期診斷工作。
現有臨床進行惡性腫瘤早期診斷的方法分為兩類一，免疫學檢測；二，分子生物學檢測。免疫學檢測包括1，酶免技術；2，螢光免疫檢測；3，放射免疫檢測；4，免疫細胞化學檢測。分子生物學檢測主要是指基因診斷技術。
目前臨床常用的免疫學方法檢測試劑盒多是多種腫瘤標誌物。其中，腫瘤標誌物是腫瘤組織產生或機體對腫瘤組織的反應而產生的物質的逐一檢測，存在操作複雜、重複、費時、費力、費錢等缺點。然而，最近新出的腫瘤特異性生長因子(Tumor Specific GrowthFactor，TSGF)試劑盒在早早癌診斷上有一定作用，但其最大的缺點是不能檢測出到底是哪個部位發生了惡性腫瘤，需藉助超聲波、核磁共振等物理方法或用其他有器官特異性腫瘤標誌物配合檢測以確定病變部位。而分子生物學檢測需聚合酶鏈反應(PCR)等煩復操作，且PCR容易產生假陽性，是一種不可靠的方法。
發明內容
本發明的目的在於提供一種通過一次檢測，既可檢出被檢者體內是否存在惡性腫瘤，而且可以直接判定腫瘤到底發生於患體內哪個部位的惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片。
本發明的目的可通過下述技術方案實現本發明利用高速全自動點樣機器人把多種腫瘤標記物抗體及陽性對照(對應腫瘤標誌物)、陰性對照(人血清白蛋白)點陣於蛋白晶片的同一腔室內，蛋白質通過化學鍵連接於固相載體上固定。本發明固相載體如活性基團修飾的玻璃片等。
在上述方案基礎上，多種腫瘤標記物抗體能特異結合最普遍存在於眾多惡性腫瘤中的腫瘤標誌物，將其以及陽性對照點在一個晶片上製成普通型惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片，應用於體檢普查，通過一次檢測，既可檢出被檢者體內是否存在惡性腫瘤，而且可以直接判定腫瘤到底發生於患體內的哪個部位。
在上述方案基礎上，多種腫瘤標記物抗體是按人體器官分類，每一類分別點上一種器官常發的惡性腫瘤對應的腫瘤標記物的抗體，製成臨床檢測型惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片，可以依據臨床需要按病人不適部位進行，也是一次檢測即可達到檢測目的。
本發明用於檢測病人血清中的腫瘤標誌物，是將病人血清滴加於晶片表面，血清中的腫瘤標誌物分別與固定在晶片上的相應抗體結合，洗去末結合的其他物質後，按設計一，加入螢光標記的抗腫瘤標記物抗體混合物，反應後洗去未結合者，樣品點的螢光強度與血清中的腫瘤標記物的含量成正相關，如圖1雙抗體夾心法原理圖所示。
本發明用於檢測病人血清中的腫瘤標誌物，按設計二，可在血清反應後，加入生物素標記的抗腫瘤標記物抗體混合物，反應後洗去未結合物，再加入螢光標記的親和素鏈親和素，反應後洗去未結合者，點樣點的螢光強度與血清中的腫瘤標誌物的含量呈正相關。設計二與設計一相比，設計二具有信號放大作用，提高了檢測靈敏度。如圖2引入生物素放大系統的原理圖所示。
本發明製備方法第一步點樣、製作技術(1)根據樣品數量設計適當的陣列排布，使用高速全自動點樣機器人把多種腫瘤標記物抗體1及陽性對照物(對應腫瘤標誌物)、陰性對照(人血清蛋白)點陣於蛋白晶片的同一腔室內；(2)室溫常溫(25℃左右)過夜，使蛋白質的氨基與玻璃片上的醛基發生縮合反應，以固定樣品；(3)利用製作蛋白晶片的常規方法進行封閉、洗滌、乾燥、包裝、保存。
本發明的雜交反應有下述二種方法方法一(1)在點好的蛋白晶片上滴加待檢血清，37℃孵育1小時；(2)用低濃度鈉鹽洗去多餘樣品；(3)加封閉液進行封閉，再次洗脫並晾乾；(4)滴加封閉液稀釋過的螢光標記的多種腫瘤標記物抗體2混合物，37℃攝氏度孵育半小時後洗去未結合物並晾乾。
方法二(1)在點好的蛋白晶片上滴加待檢血清，37攝氏度孵育1小時。(2)用低濃度鈉鹽洗去多餘樣品。(3)加封閉液進行封閉，再次洗脫並晾乾。(4)滴加封閉液稀釋過的以生物素標記的腫瘤標記物抗體2混合物，37攝氏度孵育半小時後洗去未結合物並晾乾。(5)滴加封閉液稀釋過的螢光標記親和素/鏈親和素，37攝氏度孵育半小時後洗去未結合物並晾乾。
結果檢測反應結束後，利用專業的晶片掃描分析儀進行結果的判讀和分析。
本發明的優越性在於使用本發明不僅可以具有靈敏度高、特異性強、結果穩定、重複性好等優點，而且操作簡便、一次即可，既方便了醫務工作者，提高了勞動效率，節省國家財力，又使患者在省錢的同時更早診更早治，提高治癒率。同時，把相關指標高度集成，能提高判斷的準確性，特別利於早期診斷。
附圖1，雙抗體夾心法原理圖。附圖2，引入生物素放大系統的原理圖。附圖3，肝癌診斷蛋白質晶片。附圖4，胰腺癌診斷晶片。
具體實施方法實施例一，如圖3一種肝癌診斷蛋白質晶片所示，其中，A1抗甲胎蛋白(AFP)抗體A2抗γ-穀氨醯轉肽酶同工酶(γ-GT)I』，II，II』抗體A3抗異常凝血酶原(DPC)抗體A4抗α-L巖藻糖苷酶抗體B1抗5』-核苷酸磷酸二酯酶同工酶V、VI抗體B2抗胎盤型穀胱甘肽S轉移酶抗體B3抗α1-抗糜蛋白酶抗體B4抗鐵蛋白抗體C1抗酸性同工鐵蛋白抗體C2抗B肝表面抗原抗體C3C型肝炎抗原D1陽性對照D2陰性對照迄今為止，AFP仍是診斷肝癌的主要實驗指標。但是部分良性肝病、生殖系統畸胎瘤和胃腸道的一些惡性腫瘤AFP也可升高，而另一些肝細胞癌患者AFP始終持續是低濃度，檢出困難。我們用1、抗人LCA(小扁豆凝集素)結合型AFP單克隆抗體；2、抗人伴刀豆球蛋白(ConA)結合型AFP抗體；3、抗人AFP抗體點樣。抗人LCA(小扁豆凝集素)結合型AFP單克隆抗體，使低濃度AFP或小肝癌的陽性檢出率由傳統方法的33.3％提高到86.7％，假陽性率僅1.2％。因為原發性肝癌以ConA結合型AFP為主，ConA非結合型AFP僅佔少數，而繼發性肝癌和生殖系統畸胎瘤則正好相反，γ-GTI』，II，II』僅見於肝癌患者，所以伴刀豆球蛋白(ConA)結合型AFP抗體、抗人AFP抗體和抗(γ-GT)I』，II，II』抗體點樣即可達到區分它們的目的。當AFP＜400ng/ml，DPC的陽性率達57％，且DPC用於肝癌診斷具有高度的特異性。AFP陰性的肝癌，γ-GTII』的陽性率為84.6％。
同樣道理，其他多種指標也是按照上述多種指標相互取長補短而設計點樣的。如此設計方便醫生綜合考慮，真正做到一次驗血即可確診。
實施例二，如圖4胰腺癌診斷晶片所示，A1抗CA19-9抗體A2抗CA242抗體A3抗CA50抗體
B1抗CA72-4抗體B2抗CA125抗體B3抗組織合成肽抗原抗體C1抗癌胚抗原(CEA)抗體C2抗膚脈癌肽抗原(POA)抗體C3抗半乳糖苷轉移酶同工酶II(GalTII)抗體D1陽性對照D2陰性對照同上述製作方法，可設計出其他器官的臨床檢測型惡性腫瘤診斷蛋白晶片。
實施例三，普查型惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片，系將兩種或兩種以上臨床檢測型惡性腫瘤診斷蛋白晶片的已知指標組合在一起即成。
權利要求
1，一種惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片，特徵在於利用高速全自動點樣機器人把多種腫瘤標記物抗體及陽性對照、陰性對照點陣於蛋白晶片的同一腔室內，蛋白質通過化學鍵連接於固相載體上，所述陽性對照為對應腫瘤標誌物，陰性對照為人血清白蛋白。
2，根據權利要求1所述的惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片，特徵在於固相載體為活性基團修飾的玻璃片。
3，根據權利要求1、2所述的惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片，特徵在於所述陽性對照是指最普遍存在的眾多惡性腫瘤的腫瘤標記物的抗體。
4，根據權利要求1、2所述的惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片，特徵在於所述陽性對照是指按人體器官分類，每一類分別點上一種器官常發的惡性腫瘤對應的腫瘤標記物的抗體。
5，根據權利要求1、2所述的惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片，特徵在於將病人血清滴加於晶片表面，血清中的腫瘤標誌物分別與固定在晶片上的相應抗體結合，洗去未結合的其他物質後，加入螢光標記的抗腫瘤標記物抗體混合物，反應後洗去未結合者，樣品點的螢光強度與血清中的腫瘤標記物的含量成正相關。
6，根據權利要求1、2所述的惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片，特徵在於將病人血清滴加於晶片表面，血清中的腫瘤標誌物分別與固定在晶片上的相應抗體結合，洗去未結合的其他物質後，在血清反應後，加入生物素標記的抗腫瘤標記物抗體混合物，反應後洗去未結合物，再加入螢光標記的親和素/鏈親和素，反應後洗去未結合者，點樣點的螢光強度與血清中的腫瘤標誌物的含量呈正相關。
7，惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片的製備方法，特徵在於第一步點樣，是根據樣品數量設計適當的陣列排布，使用高速全自動點樣機器人把多種腫瘤標記物抗體及陽性對照物、陰性對照點陣於蛋白晶片的同一腔室內；其後，在常溫條件下過夜，使蛋白質的氨基與玻璃片上的醛基發生縮合反應，以固定樣品；再後，利用製作蛋白晶片的常規方法進行封閉、洗滌、乾燥、包裝、保存。
8，惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片的檢測方法，特徵在於，(1)在點好的蛋白晶片上滴加待檢血清，37℃孵育1小時；(2)用低濃度鈉鹽洗去多餘樣品；(3)加封閉液進行封閉，再次洗脫並晾乾；(4)滴加封閉液稀釋過的螢光標記的多種腫瘤標記物抗體混合物，37℃孵育半小時後洗去未結合物並晾乾；(5)反應結束後，利用專業的晶片掃描分析儀進行結果的判讀和分析。
9，惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片的檢測方法，特徵在於，(1)在點好的蛋白晶片上滴加待檢血清，37℃孵育1小時；(2)用低濃度鈉鹽洗去多餘樣品；(3)加封閉液進行封閉，再次洗脫並晾乾；(4)滴加封閉液稀釋過的以生物素標記的腫瘤標記物抗體混合物，37℃孵育半小時後洗去未結合物並晾乾；(5)滴加封閉液稀釋過的螢光標記親和素/鏈親和素，37℃孵育半小時後洗去未結合物並晾乾；(6)反應結束後，利用專業的晶片掃描分析儀進行結果的判讀和分析。
全文摘要
本發明惡性腫瘤早期診斷的蛋白晶片涉及一種蛋白質晶片,其利用高速全自動點樣機器人把多種腫瘤標記物抗體及陽性對照、陰性對照點陣於蛋白晶片的同一腔室內,蛋白質通過化學鍵連接於固相載體上,所述陽性對照為對應腫瘤標誌物,陰性對照為人血清白蛋白。使用本發明不僅可以具有靈敏度高、特異性強、結果穩定、重複性好等優點,而且操作簡便、一次即可,既方便了醫務工作者,提高了勞動效率,節省國家財力,又使患者在省錢的同時更早診更早治,提高治癒率。同時,把相關指標高度集成,能提高判斷的準確性,特別利於早期診斷。
文檔編號G01N33/96GK1338634SQ0112693
公開日2002年3月6日 申請日期2001年9月29日 優先權日2001年9月29日
發明者張濤, 李賓, 彭永濟, 李紅梅, 任一萍 申請人:上海晶泰生物技術有限公司