用於檢測人乳頭瘤病毒的試劑的製作方法
2023-10-10 00:08:04 3
專利名稱：用於檢測人乳頭瘤病毒的試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測人乳頭瘤病毒的試劑。
背景技術：
國際癌症研究組織(IARC)調查顯示宮頸癌是婦女當中第三大常見的惡性腫瘤， 在中國每年約有8萬的新發病例和3萬的死亡病例。研究表明，人乳頭瘤病毒與宮頸癌的 發生密切相關，99%以上的宮頸癌患者當中可檢測出HPV的感染。到目前為止已發現了 100 多個型別的HPV，其中感染生殖道的有40多個(de Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU, zur Hausen H. Classification of papillomaviruses. Virology. 2004. 324 17-27.)。根據流行病學調查以及分子進化樹分析，HPV可分為高危型和低危型，其中高 危型 HPV 包括 15 種(HPV-16,18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82)，低危型 HPV 包括 12 禾中(HPV-6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81，CP6108) (Munoz N, BoxchFX, de Sanjose S,Herrero R,Castellsague KV,Shanh,Snijders PJ,Meijer CJ. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N. Engl. J. Med. 2003. 348 :518_527.)。在宮頸癌患者當中，HPV 16的感染最多，其次是HPV 18，而在中國HPV 58和52這兩個型別的感染率相對較高(Clifford GM,GalIusS,Herrero R, Munoz N, Snijders PJ, Vaccarella S, Anh PT, Ferreccio C, Hieu, MatosE, Molano Μ, Rajkumar R,Ronco G,de Sanjose S,Shin HR,Sukvirach S,Thomas JO,Tunsakul S,Meijer CJ, Franceschi S, and the IARC HPV Prevalence Surveys Study Group. Worldwide distribution of human papillomavirus types in cytologically normal women in the International Agency for Research on Cancer HPV prevalence surveys :a pooled analysis. Lancet. 2005. 366 :991_998.)。現在最常用的HPV分子檢測方法有(i)信號放大法，如美國食品和藥物管理局(FDA)通過的第二代雜交捕獲技術 (HC2)和Cervista HPV HR。HC2是現在臨床上用的最多的一種檢測方法，它採用兩組特異 的RNA探針與HPV DNA雜交，利用抗體捕獲RNA =DNA雜交子並通過結合二抗使雜交信號放 大的方法來檢測13種高危型HPV和5種低危型HPV。雜交捕獲法敏感性較好，重複性高，缺 點是不能測定具體的HPV型別，同時也存在著高危型HPV探針與一些低危型HPV發生交叉 反應，從而降低了特異性。另外，這種檢測成本太高，並不能作為一種篩查方法在發展中國 家得以推廣。Cervista HPV HR通過螢光共振能量轉移(FRET)的方法使檢測信號放大，同 樣也不能對HPV進行分型並存在交叉反應。(ii)基於PCR擴增的方法。以聚合酶鏈式反應(PCR)為基礎的檢測方法是用 PCR方法先進行目的基因的擴增，然後再用各種方法(如特異探針雜交、酶切圖譜鑑定和 質譜)進行分型。雜交法可以很好的對常見的高危型和低危型分型，同時可以檢測混合感 染的樣品。現在實驗室階段常用的試劑盒大部分都是基於這種方法設計的，如Roche公司 的 Linear Array HPVGenotyping, Innogenetics 幵發的 INNO-LiPa HPV GenotypingJfIHybribio公司的HPVGenoArray Test Kit.這種方法同樣也存在著交叉反應的問題，並且只 能檢測出針對探針設計的幾種常見的高危型和低危型HPV。酶切圖譜鑑定是通過一種或幾 種限制性內切酶對PCR產物進行酶切，然後進行瓊脂糖電泳分析帶型，這種方法工作量很 大，並且易受主觀因素影響。基質輔助雷射解析電離_飛行時間質譜利用型別特異的延伸 引物獲得短片段，然後根據延伸產物的荷質比不同將其分型。這種方法需要昂貴的儀器，並 且對實驗技術要求很高。病毒檢測的金標方法是對全基因組測序，但這在臨床上大規模應用是不現實的。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於檢測人乳頭瘤病毒的試劑。本發明提供的用於輔助檢測人乳頭瘤病毒的試劑，包括引物組合物甲；所述引物 組合物甲包括序列表的序列1至序列18所示的DNA。所述引物組合物甲具體可由序列表的序列1至序列19所示的DNA組成，序列19 所示DNA為測序引物。所述試劑還可包括引物組合物乙；所述引物組合物乙由序列表的序列20至序列 43所示的DNA組成。所述試劑具體可由所述引物組合物甲、所述引物組合物乙和質控引物對組成；所 述質控引物對由序列表的序列44所示DNA和序列表的序列45所示DNA組成。以上任一所述試劑均可用於製備輔助檢測人乳頭瘤病毒的試劑盒。本發明還保護一種製備輔助檢測人乳頭瘤病毒的試劑盒，包括以上任一所述試 劑。所述試劑還可包括陽性對照和陰性對照。所述陽性對照可為克隆有HPV16全長的 質粒。所述陰性對照可為無菌水和人的外周血DNA。所述試劑可用於輔助鑑定人乳頭瘤病毒。所述人乳頭瘤病毒為高危型毒株或低危型毒株；所述高危型毒株為HPV-16毒株、 HPV-18 毒株、HPV-31 毒株、HPV-33 毒株、HPV-35 毒株、HPV-39 毒株、HPV-45 毒株、HPV-51 毒 株、HPV-52毒株、HPV-56毒株、HPV-58毒株、HPV-59毒株、HPV-66毒株或HPV-68毒株；所 述低危型毒株為HPV-6毒株、HPV-Il毒株、HPV-40毒株、HPV-42毒株、HPV-43毒株、HPV-44 毒株、HPV-54毒株、HPV-61毒株、HPV-70毒株、HPV-72毒株、HPV-81毒株或CP6108毒株。本發明提供了一種人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)檢測和分型的方 法及試劑盒，可檢測出感染女性生殖道的所有HPV型別，包括14種高危型HPV和12種低危 型HPV。本發明主要解決了現有的檢測方法中不能對感染的HPV進行分型，或者因為交叉反 應造成的分型不準確的技術問題，從而提供了一種準確、靈敏度高且經濟實用的檢測方法， 適用於臨床HPV檢測和大規模人群HPV篩查使用。本發明提供的試劑可用於檢測待測樣本中是否含有人乳頭瘤病毒，方法如下(1)以待測樣本的基因組DNA為模板，用引物組合物甲中的序列1至序列18所示 DNA同時進行PCR擴增，用序列表的序列19作為測序引物將PCR擴增產物進行測序，如果得 到測序結果，根據與現有毒株靶序列的同源性判斷待測樣本中含有哪種人乳頭瘤病毒(同 源性95%以上，可判斷為相應毒株)，如果無法得到測序結果，進行步驟(2)；
(2)以待測樣本的基因組DNA為模板，用引物組合物乙中的每對引物分別進行PCR 擴增，將每對引物中的上遊引物作為測序引物將PCR產物進行測序，根據測序結果與現有 毒株靶序列的同源性判斷待測樣本中含有哪種人乳頭瘤病毒(同源性95%以上，可判斷為 相應毒株)。使用本發明的試劑檢測HPV具有以下優點(1)適用於各種型別的HPV病毒檢 測，包括常見的高危型 HPV-16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68 以及低危型 HPV-6,11，40，42，43，44，54，61，70，72，81 和 CP6108 等；(2)檢測靈敏度高，對於症狀彡高度 鱗狀內上皮細胞病變(HSIL)，本發明的檢測靈敏度為90. 5% ； (3)準確性好，由於結果判讀 是由測序儀完成，所以不易受個人主觀因素影響，使結果更加準確，客觀；(4)通量大，一臺 3730x1測序儀一次可進行96個樣品的序列分析，耗時1. 5-2小時；(5)成本低，一個樣品的 檢測成本在50元人民幣左右，遠低於臨床上常用的HC2方法。
(圖1至31中，Query為測序結果，Sbjct為NCBI的序列)圖1為臨床樣本1的測序峰圖和比對結果；圖2為臨床樣本2的測序峰圖和比對結果；圖3為臨床樣本3的測序峰圖和比對結果；圖4為臨床樣本4的測序峰圖和比對結果；圖5為臨床樣本5的測序峰圖和比對結果；圖6為臨床樣本6的測序峰圖和比對結果；圖7為臨床樣本7的測序峰圖和比對結果；圖8為臨床樣本8的測序峰圖和比對結果；圖9為臨床樣本9的測序峰圖和比對結果；圖10為臨床樣本10的測序峰圖和比對結果；圖11為臨床樣本11的測序峰圖和比對結果；圖12為臨床樣本12的測序峰圖和比對結果；圖13為臨床樣本13的測序峰圖和比對結果；圖14為臨床樣本14的測序峰圖和比對結果；圖15為臨床樣本15的測序峰圖和比對結果；圖16為臨床樣本16的測序峰圖和比對結果；圖17為臨床樣本17的測序峰圖；圖18為臨床樣本18的測序峰圖；圖19為HPV-16特異引物對臨床樣品17的測序峰圖和比對結果；圖20為HPV-18特異引物對臨床樣品17的測序峰圖和比對結果；圖21為HPV-16特異引物對臨床樣品18的測序峰圖和比對結果；圖22為HPV-52特異引物對臨床樣品18的測序峰圖和比對結果；圖23為HPV-58特異引物對臨床樣品18的測序峰圖和比對結果；圖24為HPV-31特異引物對混合樣本的測序峰圖和比對結果；圖25為HPV-33特異引物對混合樣本的測序峰圖和比對結果；圖26為HPV-35特異引物對混合樣本的測序峰圖和比對結果；圖27為HPV-39特異引物對混合樣本的測序峰圖和比對結果；
圖28為HPV-51特異引物對混合樣本的測序峰圖和比對結果；圖29為HPV-56特異引物對混合樣本的測序峰圖和比對結果；圖30為HPV-66特異引物對混合樣本的測序峰圖和比對結果；圖31為HPV-68特異引物對混合樣本的測序峰圖和比對結果；
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平 均值。實施例1、引物組合物甲和引物組合物乙的設計一、引物組合物甲HPV已發現了 100多個型別，不同型別之間序列上存在約10%的鹼基差異。由於 HPVLl基因序列相對保守，所以可以針對一致性較好的區域設計通用引物，同時對多個亞型 進行擴增。引物組合物甲由表1所列的19條引物組成，各引物單獨包裝。序列1至序列5 所示DNA為正向通用引物；序列6至序列18所示DNA為反向通用引物。序列19所示DNA 為測序通用引物。表1引物組合物甲中各條引物的核苷酸序列
權利要求
用於輔助檢測人乳頭瘤病毒的試劑，包括引物組合物甲；所述引物組合物甲包括序列表的序列1至序列18所示的DNA。
2.如權利要求1所述的試劑，其特徵在於所述引物組合物甲由序列表的序列1至序 列19所示的DNA組成。
3.如權利要求1或2所述的試劑，其特徵在於所述試劑還包括引物組合物乙；所述引 物組合物乙由序列表的序列20至序列43所示的DNA組成。
4.如權利要求1至3中任一所述的試劑，其特徵在於所述試劑由所述引物組合物甲、 所述引物組合物乙和質控引物對組成；所述質控引物對由序列表的序列44所示DNA和序列 表的序列45所示DNA組成。
5.如權利要求1至4中任一所述的試劑，其特徵在於所述人乳頭瘤病毒為高危型毒 株或低危型毒株；所述高危型毒株為HPV-16毒株、HPV-18毒株、HPV-31毒株、HPV-33毒株、 HPV-35 毒株、HPV-39 毒株、HPV-45 毒株、HPV-51 毒株、HPV-52 毒株、HPV-56 毒株、HPV-58 毒 株、HPV-59毒株、HPV-66毒株或HPV-68毒株；所述低危型毒株為HPV-6毒株、HPV-Il毒株、 HPV-40 毒株、HPV-42 毒株、HPV-43 毒株、HPV-44 毒株、HPV-54 毒株、HPV-61 毒株、HPV-70 毒株、HPV-72毒株、HPV-81毒株或CP6108毒株。
6.權利要求1至5中任一所述試劑在製備輔助檢測人乳頭瘤病毒的試劑盒中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於所述人乳頭瘤病毒為高危型毒株或低危型 毒株；所述高危型毒株為HPV-16毒株、HPV-18毒株、HPV-31毒株、HPV-33毒株、HPV-35毒 株、HPV-39 毒株、HPV-45 毒株、HPV-51 毒株、HPV-52 毒株、HPV-56 毒株、HPV-58 毒株、HPV-59 毒株、HPV-66毒株或HPV-68毒株；所述低危型毒株為HPV-6毒株、HPV-Il毒株、HPV-40毒 株、HPV-42 毒株、HPV-43 毒株、HPV-44 毒株、HPV-54 毒株、HPV-61 毒株、HPV-70 毒株、HPV-72 毒株、HPV-81毒株或CP6108毒株。
8.一種輔助檢測人乳頭瘤病毒的試劑盒，包括權利要求1至5中任一所述的試劑。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特徵在於所述人乳頭瘤病毒為高危型毒株或低危 型毒株；所述高危型毒株為HPV-16毒株、HPV-18毒株、HPV-31毒株、HPV-33毒株、HPV-35毒 株、HPV-39 毒株、HPV-45 毒株、HPV-51 毒株、HPV-52 毒株、HPV-56 毒株、HPV-58 毒株、HPV-59 毒株、HPV-66毒株或HPV-68毒株；所述低危型毒株為HPV-6毒株、HPV-Il毒株、HPV-40毒 株、HPV-42 毒株、HPV-43 毒株、HPV-44 毒株、HPV-54 毒株、HPV-61 毒株、HPV-70 毒株、HPV-72 毒株、HPV-81毒株或CP6108毒株。
10.權利要求1至5中任一所述的試劑在輔助鑑定人乳頭瘤病毒中的應用；所述人 乳頭瘤病毒為高危型毒株或低危型毒株；所述高危型毒株為HPV-16毒株、HPV-18毒株、 HPV-31 毒株、HPV-33 毒株、HPV-35 毒株、HPV-39 毒株、HPV-45 毒株、HPV-51 毒株、HPV-52 毒 株、HPV-56毒株、HPV-58毒株、HPV-59毒株、HPV-66毒株或HPV-68毒株；所述低危型毒株 為 HPV-6 毒株、HPV-Il 毒株、HPV-40 毒株、HPV-42 毒株、HPV-43 毒株、HPV-44 毒株、HPV-54 毒株、HPV-61毒株、HPV-70毒株、HPV-72毒株、HPV-81毒株或CP6108毒株。
全文摘要
本發明公開了一種用於檢測人乳頭瘤病毒的試劑。本發明提供的試劑，包括引物組合物甲；所述引物組合物甲包括序列表的序列1至序列18所示的DNA。所述試劑還可包括引物組合物乙；所述引物組合物乙由序列表的序列20至序列43所示的DNA組成。所述試劑可用於輔助鑑定人乳頭瘤病毒。本發明提供的試劑可檢測出感染女性生殖道的所有HPV型別，包括14種高危型HPV和12種低危型HPV。本發明主要解決了現有的檢測方法中不能對感染的HPV進行分型，或者因為交叉反應造成的分型不準確的技術問題，從而提供了一種準確、靈敏度高且經濟實用的檢測方法，適用於臨床HPV檢測和大規模人群HPV篩查使用。
文檔編號C12N15/11GK101956024SQ201010517520
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月18日 優先權日2010年10月18日
發明者向陽, 張瑞芬, 朱寶利, 楊毅, 王志雲, 蔡玉品 申請人:中國科學院微生物研究所