一種基於ZnO納米探針篩選厭氧菌中藥抑制劑的方法與流程
2023-10-09 05:17:29
本發明涉及一種中藥配方的篩選方法。
背景技術：
抗生素在殺菌同時，也會造成人體損害，影響肝、腎臟功能、胃腸道反應等。濫用抗生素可能引起某些細菌耐藥現象的發生，對感染的治療會變得十分困難。目前，幾乎沒有一種抗菌藥物不存在耐藥現象。開發具有抗菌作用的中藥及配方具有積極意義。
許多中藥及配方藥具有抗菌消炎作用，一些中草藥的有效成分和分子結構等也已經全部或部分地研究清楚。例如黃連和黃柏止痢的主要成分小櫱鹼（黃連素）、黃芩抗菌的主要成分黃芩素等等。大量事實證明，中國古代勞動人民通過長期實踐所積累起來的醫藥遺產是極為豐富、極為寶貴的。我們應當珍視這個祖國醫藥學的偉大寶庫，努力發掘，加以提高，從中可以開發具有抗菌消炎作用的中藥，可以取代或部分取代抗生素。
厭氧菌是一類在無氧條件下比在有氧環境中生長好的細菌，而不能在有空氣存在情況下生長的細菌。這類細菌缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝以無氧發酵的方式進行。它能引起人體不同部位的感染，包括闌尾炎、膽囊炎、中耳炎、口腔感染、心內膜炎、骨髓炎、腹膜炎等多種疾病。在傳統的開發針對某種厭氧菌的中藥新配方過程中，一般是在滅菌的培養基中接種厭氧菌後加入中藥組分，在特殊的厭氧培養箱中培養。一段時間後再取樣進行劃線培養，計算菌落數，從而確定某中藥組成配方是否有抑菌作用。劃線培養也需要在厭氧培養箱中培養，且培養周期至少要幾天，因此整個周期長，效率低。本方法是針對上述問題發明的一種中藥配方的快速篩選方法。
本方法的基本原理：單克隆抗體或抗原分子通過共價鍵結合，這種結合不會改變單克隆抗體、抗原的免疫學特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗原結合。而ZnO材料具有磁性，其元素Zn外層具有多個未成對電子，具有高飽和磁化強度，在粒徑小到一定程度的納米材料會對周圍水分子的核磁共振自旋-晶格弛豫時間的影響非常大，具有放大核磁共振馳豫信號的作用。非常微量的ZnO納米材料就會造成水的核磁共振弛豫時間大幅下降。因此可以通過構建ZnO納米探針，從磁共振的角度來做檢測是否存在目標菌，從而間接評估中藥成分的抑菌作用。
主要步驟：
1）. ZnO納米探針製備。從市場上購買磁性ZnO納米材料，也可以通過其他方法製備納米級的ZnO。使用矽烷偶聯劑，其通式為:Y(CH2)nSiX3。此處，n為0-3；X為可水解的基團；Y為有機官能團。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙醯氧基等，這些基團水解時即生成矽醇(Si(OH)3)，而與無機物質結合，形成矽氧烷。Y是乙烯基、氨基、環氧基、甲基丙烯醯氧基、巰基。這些反應基團可與有機物質反應而結合。因此，通過使用矽烷偶聯劑，可在無機物質和有機物質的界面之間架起「分子橋」，把兩種性質懸殊的材料連接在一起提高複合材料的性能和增加粘接強度的作用。通過矽烷偶聯劑反應可以得到表面修飾的氨基化或羧基化的ZnO納米材料。進一步通過偶聯抗體，可實現表面功能化，形成特異性免疫探針，封閉多餘的活性位點，離心分離後可以將過量的抗體分離，即可以得到抗性修飾的ZnO納米探針。
2）. 採用聚苯乙烯材料製作的樣品管進行中藥篩選。聚苯乙烯材料與酶標板類似，探針表面抗體會由於吸附作用而結合在聚苯乙烯材料的表面，但是，探針表面的抗體吸附到聚苯乙烯材料表面的速度與探針表面抗體結合目標菌的速度相比，前者速度慢的多，兩者是競爭關係。因此，在聚苯乙烯樣品管中加入滅菌的厭氧菌的培養基，接種目標厭氧菌後加入需要篩選的中藥提取液，密閉厭氧培養一段時間後，加入步驟1）所製備的ZnO納米探針，充分混合震蕩反應一段時間，若樣品管中有目標菌生長，則ZnO納米探針表面的抗體首先會與目標菌結合，從而使得ZnO納米探針留在液體中。若樣品管中沒有目標菌，則ZnO納米探針表面的抗體會逐漸吸附在聚苯乙烯樣品管表面，從而使液體中沒有ZnO納米探針。前已述及，微量的ZnO納米材料就會造成水的核磁共振弛豫時間大幅下降。以無菌的沒有接種目標菌的培養基液體為空白，測得的懸濁液的弛豫時間相比有顯著降低，則說明液體中含有探針，從而間接證明樣品中有目標菌，探針的量與弛豫時間的下降值呈正比，通過加標定量探針可以間接定量出目標菌的量。有目標菌存在，則說明中藥抑菌作用不明顯，反之則說明有抑菌作用。
該方法的主要優點就是快速、靈敏度高。在一定程度上可以對目標菌實現連續在線監控。相對於厭氧菌培養2-3天甚至幾天的時間，核磁共振檢測只需幾分鐘。此方法不需要厭氧培養箱，只需在無氧條件下接種後將樣品管密封即可培養，檢測時用注射器將定量的探針注入即可進行後續的核磁共振檢測。因此，用該方法可做大規模中藥及配方的篩選。
技術實現要素：
一種基於ZnO納米探針篩選厭氧菌中藥抑制劑的方法。該方法是一種客觀有效的檢出樣品中目標菌的方法，可以做大規模中藥及配方的快速篩選，從而在某種程度上大大縮減針對某種厭氧菌有效的中藥開發時間。
一種基於ZnO納米探針篩選厭氧菌中藥抑制劑的方法。利用核磁共振儀對磁性物質的響應敏感性，提出核磁共振弛豫參數變化與ZnO納米粒子磁性免疫探針含量的相關性指標。該方法依賴於磁性納米ZnO納米探針用於樣品中目標菌的檢測來評估中藥配方的抑菌效果。採用偶聯了特異性單克隆抗體的磁性ZnO納米探針，可以對樣品中的特異性厭氧菌進行檢測。由於核磁共振儀對ZnO納米粒子非常敏感，存在微量的磁性ZnO納米粒子，則水的自旋-晶格弛豫時間和/自旋-自旋弛豫就會顯著下降。通過空白對照及加標定量檢測出樣品中的免疫探針含量，從而可以間接定量出樣品中的厭氧菌菌落數。檢測出的厭氧菌含量與探針含量線性相關，擬合度較好。最終以磁性ZnO納米探針與厭氧菌間的對應關係為紐帶，確定樣品中的厭氧菌菌落數。從而間接確定中藥的抑菌作用是否有效。相對於厭氧菌培養2-3天甚至幾天的時間，核磁共振檢測只需幾分鐘。因此，用該方法可做大規模中藥及配方的篩選。
本發明是這樣實現的，步驟如下：
1）目標菌抗體包被磁性納米ZnO納米探針的製備。
2）在聚苯乙烯樣品管中加入滅菌的厭氧菌的培養基，接種目標厭氧菌。加入需要篩選的中藥提取液，培養一段時間後，培養一段時間後，加入步驟1）所製備的ZnO納米探針，充分混合震蕩反應一段時間，若樣品管中有目標菌，則首先會與ZnO納米探針表面的抗體結合，從而使得ZnO納米探針留在液體中。若樣品管中沒有有目標菌，則ZnO納米探針表面的抗體會逐漸吸附在聚苯乙烯樣品管表面而與液體分離。此時，對樣品管進行核磁共振弛豫時間的測定。以無菌的沒有接種目標菌的培養基液體為空白，測得的懸濁液的弛豫時間相比有顯著降低，則說明含有探針，從而間接證明樣品中有目標菌，探針的量與弛豫時間的下降呈正比，通過加標定量探針而間接定量出目標菌的量。
所述ZnO納米探針為具有磁性特性的納米級ZnO材料，納米粒徑小於300納米。
所述的目標菌的最終檢出評價方法基於核磁共振技術的弛豫時間的變化，弛豫時間包括自旋－晶格弛豫時間和自旋－自旋弛豫時間。
本發明的有益效果：本發明提供一種客觀的快速篩選對厭氧菌有抑制作用的中藥配方的方法，其特徵是以磁性ZnO納米探針與厭氧菌間的對應關係為紐帶，確定樣品中的厭氧菌菌落數。從而間接確定中藥的抑菌作用是否有效。相對於厭氧菌培養2-3天甚至幾天的時間，核磁共振檢測只需幾分鐘。因此，用該方法可做大規模中藥及配方的篩選。
具體實施方式
實例1
篩選對痤瘡桿菌（厭氧菌）有抑制或治療作用的中藥配方。
１）納米ZnO免疫探針製備：
ZnO納米粒子可以從市場上購買，也可以參考文獻用物理或化學方法合成。
二氧化矽包被納米ZnO：取47.5g矽酸鈉，用去離子水溶解於燒杯中，用鹽酸調節pH值為12-13。取5.0g納米ZnO加入到此燒杯中，機械攪拌(用玻璃棒)5min。將混合液超聲30min，適時攪拌。升溫到85˚C，逐滴加入鹽酸調節pH值6-7，生成沉澱。邊磁分離邊用去離子水洗滌沉澱，洗滌3-4次。然後，將沉澱分散於250mL甲醇中。以上過程重複三次，保證矽依附在ZnO上。
胺基矽烷化ZnO納米材料：將製得的二氧化矽包被的納米ZnO加入到25mL甲醇中，用1mLH2O和甲醇稀釋到150mL。然後加入150mL甘油混合。超聲30min，轉移到有攪拌裝置的500mL三口燒瓶中。加入10mL氨基矽烷偶聯劑（AEAPS），在80-90 ˚C下快速攪拌3h後，轉移出產物。產物用去離子水洗滌3次，甲醇洗滌2次(用布氏漏鬥抽濾)。真空乾燥。需要注意的是，抽濾由於有甘油，所以比較慢，抽一段時間後可適時用吸管吸去上層液體，抽濾過程約需6-8h。最後將得到的氨基矽烷化ZnO納米材料真空乾燥12h。
抗體修飾：稱取一定量的氨基修飾的ZnO納米粒子，加入2倍質量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各1mL。放在混勻儀上，轉速15轉，反應45min。）將活化時間到的樣品進行10000r/min離心，時間5min，然後再加入0.01M的PBS進行洗滌離心，重複3次。將離心完的樣品各加入過量痤瘡桿菌抗體，在混勻儀上偶聯1h。偶聯完成後加入的10%BSA封閉液45min。封閉結束後，轉速8000r/min離心分離5min，用0.01M的PBS清洗離心，重複3次，則將多餘的抗體、BSA洗去，最後加入PBS進行重懸。製備的抗性修飾的ZnO納米粒子即為免疫探針，保存在4 ℃待用。
2）在一批聚苯乙烯樣品管中各自加入適量滅菌的培養基，在無氧條件接種痤瘡桿菌，分別加入需要篩選的中藥提取液密封后，培養一段時間後，加入步驟1）所製備的ZnO納米探針，充分混合震蕩反應，若樣品管中有目標菌，則首先會與ZnO納米探針表面的抗體結合，從而使得ZnO納米探針留在液體中；若樣品管中沒有有目標菌，則ZnO納米探針表面的抗體會逐漸吸附在聚苯乙烯樣品管表面。反應1小時後，對樣品管進行核磁共振弛豫時間的測定（上海紐邁NMR20核磁共振儀）。以無菌的沒有接種目標菌的培養基液體為空白，測得的懸濁液的弛豫時間自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間相比有顯著降低，則說明含有探針，說明樣品管中有目標菌，從而間接說明中藥的抑菌作用不明顯，反之則反。探針的量與自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間的下降呈正比，通過加標定量探針而間接定量出目標菌的量。有目標菌存在說明加入的中藥沒有抑制作用。反之則反。
具體實施方式
實例2
篩選對梭狀芽孢桿菌（厭氧菌）有抑制或治療作用的中藥配方。
１）納米ZnO免疫探針製備：
ZnO納米粒子可以從市場上購買，也可以參考文獻用物理及化學方法合成。
二氧化矽包被納米ZnO：取47.5g矽酸鈉，用去離子水溶解於燒杯中，用鹽酸調節pH值為12-13。取5.0g納米ZnO加入到此燒杯中，機械攪拌(用玻璃棒)5min。將混合液超聲30min，適時攪拌。升溫到85˚C，逐滴加入鹽酸調節pH值6-7，生成沉澱。邊磁分離邊用去離子水洗滌沉澱，洗滌3-4次。然後，將沉澱分散於250mL甲醇中。以上過程重複三次，保證矽依附在ZnO上。
胺基矽烷化ZnO納米材料：將製得的二氧化矽包被的納米ZnO加入到25mL甲醇中，用1mLH2O和甲醇稀釋到150mL。然後加入150mL甘油混合。超聲30min，轉移到有攪拌裝置的500mL三口燒瓶中。加入10mL氨基矽烷偶聯劑（AEAPS），在80-90 ˚C下快速攪拌3h後，轉移出產物。產物用去離子水洗滌3次，甲醇洗滌2次(用布氏漏鬥抽濾)。真空乾燥。需要注意的是，抽濾由於有甘油，所以比較慢，抽一段時間後可適時用吸管吸去上層液體，抽濾過程約需6-8h。最後將得到的氨基矽烷化ZnO納米材料真空乾燥12h。
抗體修飾：稱取一定量的氨基修飾的ZnO納米粒子，加入2倍質量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各1mL。放在混勻儀上，轉速15轉，反應45min。）將活化時間到的樣品進行10000r/min離心，時間5min，然後再加入0.01M的PBS進行洗滌離心，重複3次。將離心完的樣品各加入過量梭狀芽孢桿菌抗體，在混勻儀上偶聯1h。偶聯完成後加入的10%BSA封閉液45min。封閉結束後，轉速8000r/min離心分離5min，用0.01M的PBS清洗離心，重複3次，則將多餘的抗體、BSA洗去，最後加入PBS進行重懸。製備的抗性修飾的ZnO納米粒子即為免疫探針，保存在4 ℃待用。
2）在一批聚苯乙烯樣品管中各自加入適量滅菌的培養基，在無氧條件接種梭狀芽孢桿菌，分別加入需要篩選的中藥提取液密封后，培養一段時間後，加入步驟1）所製備的ZnO納米探針，充分混合震蕩反應，若樣品管中有目標菌，則首先會與ZnO納米探針表面的抗體結合，從而使得ZnO納米探針留在液體中。若樣品管中沒有有目標菌，則ZnO納米探針表面的抗體會逐漸吸附在聚苯乙烯樣品管表面。反應1小時後，對樣品管進行核磁共振弛豫時間的測定（上海紐邁NMR20核磁共振儀）。以無菌的沒有接種目標菌的培養基液體為空白，測得的懸濁液的自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間相比有顯著降低，則說明含有探針，說明樣品管中有目標菌，從而間接說明中藥的抑菌作用不明顯，反之則反。探針的量與自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間的下降呈正比，通過加標定量探針而間接定量出目標菌的量。有目標菌存在說明加入的中藥沒有抑制作用。反之則反。