用於哮喘的生長因子治療的製作方法

2023-10-09 14:35:34 1

專利名稱：用於哮喘的生長因子治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及對於哮喘的治療介入的新策略。特別是，它涉及某些上皮生長因子(EGF)類似物的用途，涉及靶向、或防止哮喘患者中的支氣管上皮細胞的損害。它也涉及用於相同治療目的的角質形成細胞生長因子(KGF)或KGF類似物的備選用途。
背景技術：
哮喘是一種氣道的慢性炎性病症，其中所述氣道響應於常見的環境因素而收縮，所述環境因素諸如變態反應原(例如室內塵蟎)、病毒感染和大氣汙染物，導致透不過氣、喘息和咳嗽。所述疾病隨著對於所述氣道的上皮細胞襯裡的反覆炎性損害和對於所述氣道壁的結構交替(重建)而發展(Holgate，S.T.(1999)J.Allergy Clin.Immunol.104，11139-11146)。
對於哮喘主要依靠的治療是通過減少氣道收縮緩解哮喘症狀的支氣管擴張藥，和減少炎症的皮質類固醇。然而，在急性和慢性哮喘的患者組織中，所述氣道中的重建導致疾病進展和對於皮質類固醇治療的耐受性。這些不良控制的患者導致大於哮喘治療總成本的40％。關於急性和慢性哮喘患者中氣道上皮細胞損害的屬性已經知道了很多，然而以前還沒有直接靶向該問題的臨床有效的方法。
這類損害的特徵是帶有結構改變的高度異常的支氣管上皮，所述結構改變涉及柱狀細胞從它們的基部附屬物分離。在該受損結構之下，存在增加數量的沉積間質膠原的上皮下成肌纖維細胞，引起上皮下的基膜變厚和增加的密度。在顯示廣泛支氣管上皮細胞損害的哮喘患者中，這樣的上皮表示生長停滯的標誌(Puddicombe等，(2003)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.28，61-68)並且恢復所述上皮細胞屏蔽的增殖證據很少(Demoly等，(1994)Am.J.Respir.Crit.Care Med.150，214-217)。慢性哮喘中延長的上皮細胞修復增強所述上皮細胞的間充質(mesenchmyal)營養單位(EMTU)之內的細胞-細胞通訊，導致肌成纖維細胞活化和進入黏膜下層的重建反應的傳播(Holgate等(2000)J.Allergy Clin.Immunol.105，193-204)和HolgateDavies(2001)The Immunologist，8，131-135))。在EMTU之內的介體維持炎症，同時過敏性的介體(Th-2細胞因子)與EMTU反應而增強或放大這些反應(Richter等(2001)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.25，385-391；Davies等(2003)J.Allergy Clin.Immunol，111，215-225)。因而相信損傷上皮細胞的損傷-修復周期中的失敗在異常上皮細胞-間充質相互作用的發展中起重要作用。
美國專利號5,455,226提出EGF用於伴有支氣管上皮損害的支氣管肺病理的治療。然而，所述說明書沒有提供哮喘治療中使用EGF的特定方向並且不認為EGF在哮喘治療中具有任何臨床價值。實際上，它預期會加重哮喘中現有的上皮下的纖維化。這通過氣道上皮細胞損傷的轉基因鼠模型中的人轉化生長因子α(TGFα)的超表達的研究證實。TGFα是EGF的結構同系物並且是EGF受體的配體。在所述研究模型中，TGFα導致顯著的氣道纖維化(Korfhagen等，Respiratory epithelial cell expression of humantransforming growth factor-alpha induces lung fibrosis in transgenic mice.J.Clin.Invest.(1994)93，1691-1699)。在美國專利號5,455,226中具體提到的人支氣管上皮的唯一損害是有纖毛的呼吸上皮細胞損傷，所述損傷由意外的中毒、支氣管肺的感染、慢性支氣管炎和肺氣腫引起。而且，使用EGF以治療這樣損傷的提議僅依賴於證明人呼吸上皮的體外損傷模型上的EGF有益效果，所述模型主要依賴於上皮細胞遷移而不是所述上皮細胞開始增殖反應的能力缺陷。由此，這樣的模型不是用於哮喘患者中的上皮細胞損害和氣道重建的好模型。而且，預先不知道損傷的哮喘上皮中的損傷-修復周期中的失敗是否由於哮喘上皮細胞開始增殖反應的能力內在缺陷或者由於存在諸如作為上皮細胞生長拮抗劑的TGFβ的因子，或者二者的組合。
目前已經發現來自人哮喘患者的支氣管上皮細胞需要外源的EGF用於原代培養中最大增殖，然而來自相同病症之下的非-哮喘患者的支氣管上皮細胞的增殖不受該生長因子的影響。該觀察對於提出一種用於靶向或防止哮喘患者中的上皮損害的新策略提供基礎，其依賴於EGF的非天然的、重組體類似物的使用，與氣道成纖維細胞相比，所述類似物顯示促進這樣的支氣管上皮細胞增殖的選擇性能力。經由實例，在Puddicombe等(1996)J.Biol.Chem.271，30392-30397中公開了這樣一種EGF類似物。那篇論文公開了嵌合的生長因子，其中小鼠EGF的羧基末端11個胺基酸殘基用小鼠TGFα相應的7個胺基酸殘基替代(mEGF/TGFα44-50；參見

圖1)。與EGF相比較，發現該嵌合的生長因子對於EGF受體(EGFR)具有相對低的親合性，並且正如所料，當在正常的人包皮成纖維細胞上測試時，該嵌合的生長因子是不良的促細胞分裂劑。相反，當在NR6/HER細胞(用人EGFR轉染的NR6小鼠成纖維細胞)上測試時，嵌合的生長因子是比通過它的親合性預測的還更有效的促細胞分裂劑(即超激動劑(superagonist))。已經用數個遺傳修飾的EGFR配體觀察了該超激動劑活性，並且認為該激動劑活性是由於EGFR結合和低親和配體解離的重複周期並由於活化的EGFR的備選運輸(trafficking)(Lenferink等(1998)Differential endocytic routing ofhomo-and hetero-dimeric ErbB tyrosine kinases confers signaling superiorityto receptor heterodimers.EMBO J.17，3385-3397；Lenferink等(2000)Superagonistic activation of ErbB-1 by EGF-related growth factors withenhanced association and dissociation rate constants.J.Biol.Chem.275，26748-53)。然而，本發明人認為用於測量所述超激動劑反應的細胞被遺傳修飾以在比正常成纖維細胞中發現的約10×高的水平上表達EGFR。因為該水平的EGFR表達是上皮細胞的特徵，所以本發明人認為所述配體可以證明上皮細胞的有效激活劑並且，因而，可以提供在哮喘治療中有用的對於具有纖維化-不足性質的上皮生長因子所需要的選擇性。本發明人目前已經在有絲分裂發生測定中利用H292人支氣管上皮細胞系、建立的支氣管上皮細胞模型、和人氣道成纖維細胞測試了該重組體嵌合生長因子，並且發現它在支氣管上皮細胞上顯示高約100倍的促進DNA合成的能力。因此，目前將該嵌合的生長因子，其種類同系物，特別是其人同系物，及其在氣道成纖維細胞存在下將維持優先促進哮喘的支氣管上皮細胞增殖的能力的其它的多肽類似物提出作為用於靶向哮喘患者中支氣管上皮損害的治療劑。
和EP-B 0555205中所描述的成纖維細胞對比，首次將角質形成細胞生長因子識別為具有對上皮細胞的顯著特異性的生長因子。因而目前也推斷KGF和KGF類似物將在治療或防止哮喘患者的支氣管上皮損害中同樣有用。雖然以前已經提出將KGF用作肺中的治療劑，但是這樣的用途不包括哮喘。因而，Amgen Inc.的EP-B 0619370提出KGF的多種治療用途，包括抗擊由吸菸、肺氣腫和肺部炎症引起的肺中損害。這類損害的治療不是在抗擊哮喘支氣管上皮細胞缺乏以產生增殖反應中KGF、或任何KGF類似物的使用的預測。
雖然Genentech的國際專利申請WO 99/39729提出將調蛋白(HRG，也稱為神經調節蛋白)用作在包括哮喘的多種肺病中誘導上皮細胞生長的試劑，該生長因子結合到獨特的受體，即HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)(Carraway KL，Carraway CA，Carraway KL 3rd。Roles ofErbB-3 and ErbB-4 in the physiology and pathology of the mammary gland.J.Mammary Gland Biol.Neoplasia.19972(2)187-98)並且因而不能將其認為如真正的EGF類似物一樣具有相同的受體特異性特徵。而且，已經表明間充質細胞衍生的HRG在肺發育期間刺激上皮細胞增殖(Damman等Roleof neuregulin-1 beta in the developing lung.Am.J.Respir.Crit.CareMed.2003167(12)1711-6)，現在知道HRG不是上皮細胞特異的促細胞分裂劑。例如，它具有對於脈管細胞(Russell等.Neuregulin activation of ErbBreceptors in vascular endothelium leads to angiogenesis.Am.J.Physiol.1999277(6 Pt 2)H2205-11)、肌細胞和神經元細胞(Falls D.L.Neuregulins andthe neuromuscular system10 years of answers and questions.J.Neurocytol.2003 Jun-Sep；32(5-8)619-47)的活性。因為已經提出所述氣道中增加的血管分布促進哮喘患者中的氣流限制(Hashimoto等.Quantitative analysis ofbronchial wall vascularity in the medium and small airways of patients withasthma and COPD.Chest.2005 Mar.127(3)965-72)，所以HRG在所述氣道中誘導血管生成的潛力將是不符合要求的性質，所述性質可以限制它的作為促進上皮細胞的修複試劑的應用。因而應當理解，如這裡所用的術語「EGF類似物」不延伸到任何調蛋白。
發明概述在一個方面中，本發明由此提供生長因子(其是EGF類似物、KGF或KGF類似物)在製備用於治療或防止哮喘患者的支氣管上皮損害的藥物中的用途，所述EGF類似物靶向所述EGFR並且在所述患者中顯示這樣的能力與氣道成纖維細胞相比，促進支氣管上皮細胞優先增殖。應當理解，這樣的優先活性將是可以將EGF類似物以臨床有效量施用到所述氣道以促進上皮細胞修復，而不引起臨床有問題的氣道纖維化。所述EGF類似物可以將修飾結合到多肽鏈(例如加入聚乙二醇)以延長所施用的生長因子的半壽期。
在另一方面中，提供篩選測試試劑促進哮喘患者支氣管上皮細胞的增加增殖的能力的方法，所述哮喘患者支氣管上皮細胞與對照的非哮喘患者支氣管上皮細胞相比在增殖能力上是有缺陷的，所述方法包含(i)在沒有生長因子的情況下培養這類來自哮喘患者的支氣管上皮細胞；(ii)將測試試劑加入到所述培養物或等同的培養物中，並且(iii)與不加入測試試劑或生長因子並在相同條件下培養的對照支氣管上皮細胞相比，確定所述測試試劑是否減少了對於促進最大增殖或有絲分裂發生的外源EGF的需要。
在測試試劑是待測試作為EGF類似物的多肽的情況下，這樣一種篩選法也將包含，與相同種類的培養的氣道成纖維細胞相比，確定所述EGF類似物在培養的哮喘患者支氣管上皮細胞上是否顯示促進增殖或有絲分裂發生的優先能力的步驟。然而，這樣的篩選也可以用於篩選化合物，所述化合物增加具有缺陷增殖能力的哮喘患者的支氣管上皮細胞中內源生長因子生產。目前也將這樣的化合物設想作為有潛力的治療劑，用於靶向或防止哮喘患者中的支氣管上皮損害。
附圖和序列表簡述圖1mEGF/TGFα44-50的二級結構，其中TGFα的七個羧基末端殘基是以粗體顯示的。也在SEQ.ID.No.1中給出了該嵌合的生長因子的全序列。在SEQ.ID No.3中陳述了小鼠TGFα的七個羧基末端殘基。小鼠EGF-衍生的序列陳述在SEQ.ID No.2中。
圖2EGF對於正常和哮喘支氣管上皮細胞增殖的影響。單獨或在如實施例2中所述EGF的存在下，將來自7名正常健康人對照(a)和10名人哮喘受試者(b)的原代支氣管上皮細胞培養物暴露於無血清培養基(SFM)。數據代表平均值、四分位差和5-95％置信區間。黑點是離群值(outliers)。利用Wilcoxon秩和檢驗評定統計學顯著性。
圖3EGF和mEGF/TGFα44-50對於支氣管上皮細胞(a)和支氣管成纖維細胞(b)的促有絲分裂的活性比較。H292支氣管上皮細胞(a)或人氣道成纖維細胞(b)是血清飢餓的並且然後用增加劑量的如實施例2中所描述的EGF(圓)或mEGF/TGFα44-50(正方形)處理。通過測量放射性胸苷摻入到酸不可溶物質中和閃爍計數，在18至24小時後測量DNA合成的誘導。
詳述如上所示，依照本發明使用的EGF類似物將是這樣的當將它以臨床有效量施用到哮喘患者時，它將在不引起臨床有問題的纖維化的情況下促進上皮細胞修復。這樣一種EGF類似物可以是EGF/TGFα嵌合類似物，其中可以是野生型或非野生型的EGF的C-末端胺基酸殘基是由TGFα的C-末端殘基置換的。因而，EGF的C-末端胺基酸殘基，特別是例如野生型或非野生型EGF的C-末端11個胺基酸殘基，可以由TGFα的C-末端7個胺基酸殘基置換，例如這樣一種人-人嵌合體(hEGF/hTGFα44-50)。將這樣一種人嵌合的生長因子(特別是其中人EGF的C-末端11個胺基酸殘基由人TGFα的C-末端處的7個胺基酸殘基置換的人嵌合的生長因子)預計為具有涉及人哮喘患病者的優選應用，然而本發明也可以對於非人的哮喘動物提供適用性。而且，可以利用這種嵌合生長因子的功能性多肽類似物在哮喘患者的支氣管上皮細胞和氣道成纖維細胞上保持所需要的差異活性。這最初可以通過利用常規的體外增殖和/或有絲分裂發生的檢測判斷，所述檢測例如如採用融合性的和休眠的支氣管上皮細胞或人支氣管上皮細胞系或人氣道成纖維細胞的原代培養的例證中所描述的有絲分裂發生檢測，所述人支氣管上皮細胞系諸如H292支氣管上皮細胞系。理想地，在這樣一種增殖的或有絲分裂發生的檢測中，與氣道成纖維細胞相比，選擇的EGF類似物將在支氣管上皮細胞上顯示約10-100倍或更多活性。適合的EGF/TGFα44-50嵌合生長因子的功能性類似物，例如hEGF/hTGFα44-50，可以具有由已知的EGF類似物的變體序列置換的野生型EGF序列或者，在該現象可以轉變成所述類別中的其它生長因子的基礎上，可以是具有點突變(例如L47A)或者在減少EGFR結合親合性的關鍵受體結合殘基處的截短(如EGF 1-46)的野生型EGF(或EGF的同系物)序列(見例如Groenen等(1994)Structure-function relationships for the EGF/TGFα family ofmitogens.Growth Factors11，235-257)，但與成纖維細胞相比在支氣管上皮細胞上保持所需要的差異活性。適合的EGF截短可以包括具有N-末端和/或內部缺失的EGF變體，導致維持所需差異活性的較短的肽序列。例如，如上所述的嵌合生長因子的適合的功能性類似物可以具有一種或多種置換，例如單獨或者與一種或多種缺失組合的一種或多種保守置換，與成纖維細胞相比，其在支氣管上皮細胞上保持所需的差異活性。
如上所示，還預計如上所述的EGF類似物可以由用於相同治療目的的KGF或KGF類似物置換。這樣一種生長因子可以是KGF的天然形式諸如人KGF的天然形式。它可以是重組體生長因子。術語「KGF類似物」應當理解成包括天然KGF的任何變體，其保持用於如上所述的臨床使用所需的特異性。這樣一種變體可以等於在休眠的BALB/MK表皮角質化細胞中刺激DNA合成超過500倍的能力，同時在成纖維細胞上基本上缺少促有絲分裂的活性，例如在5nM在NIH/3T3成纖維細胞背景上顯示小於一倍的刺激。備選地，適當的KGF變體可以如下所鑑定並且如EP-A 1016716中所說明(i)引發BALB/MK角質化細胞的最大刺激的變體的量引發小於1/50的NIH/3T3成纖維細胞的最大胸苷結合，所述結合由酸性成纖維細胞生長因子或鹼性成纖維細胞生長因子所刺激；或(ii)引發BALB/MK角質化細胞最大刺激的變體的量引發小於1/10的NIH/3T3成纖維細胞的最大胸苷結合，所述結合由EGF或TGF-α所刺激。已經描述了許多這樣的KGF類似物。關於主題發明特別有興趣的是，例如，截短的KGF類似物與天然KGF相比在表皮細胞上顯示增加的活性。例如，以Chiron Corporation名義的EP-B 0706563描述這樣一種截短的類似物，其中從天然成熟的KGF失去N-末端23個胺基酸殘基。可以將其它修飾結合在全長成熟的KGF或活性的截短的KGF中，例如一種或多種置換諸如一種或多種保守置換，保留對於如上提出的治療用途的所需活性和特異性。根據本發明使用的KGF或KGF類似物也可以將修飾結合到多肽鏈以便在如上所述涉及EGF類似物的給藥時延長半壽期。
可以將如上所述選擇的生長因子結合到任何常規形式的氣道遞送的藥物組合物中，例如對於其它生物活性肽開發的氣溶膠遞送的液體或粉末製劑(例如Owens等.(2003)Alternative routes of insulin delivery.Diabet.Med.20，886-898；Codrons等.(2003)Systemic delivery of parathyroid hormone(1-34)using inhalation dry powders in rats.Pharm.Sci.92938-950)。所述生長因子的適合劑量可以是，例如，在每天約0.5-50μg範圍內並且可以包括如上所涉及的延長所述生長因子半壽期的修飾(例如加入聚乙二醇)。
在另一方面中，提供治療或防止哮喘患者優選人患者的支氣管上皮損害的方法，所述方法包括將EGF類似物、KGF或KGF類似物施用到所述患者的氣道，所述EGF類似物靶向所述EGFR並且在這樣一種患者中顯示與氣道成纖維細胞相比促進支氣管上皮細胞優先增殖的能力。
篩選測定如上所示，本發明在另一方面也延伸到試劑的篩選測定法，所述試劑能夠促進哮喘患者的支氣管上皮細胞增加的增殖，所述患者在這樣的增殖中是有缺陷的，所述篩選測定依賴於測定所述測試試劑是否減少外源EGF的需要以促進這樣的細胞在體外的最大增殖或有絲分裂發生。在另一方面中，提供篩選測試試劑促進哮喘患者的支氣管上皮細胞德增加增殖的能力的方法，所述哮喘患者支氣管上皮細胞與對照的非哮喘患者支氣管上皮細胞相比在增殖能力上是有缺陷的，所述方法包含(i)在沒有生長因子的情況下培養這類來自哮喘患者優選人哮喘患者的支氣管上皮細胞；(ii)將測試試劑加入到所述培養物或等同的培養物中並且(iii)與不加入測試試劑或生長因子並在相同條件下培養的所述對照細胞相比，確定所述測試試劑是否減少了對於促進最大增殖或有絲分裂發生的外源EGF的需要。
這樣的篩選可以採用常規形式的細胞增殖或有絲分裂發生測定。在測試試劑是待測試作為EGF類似物的多肽的情況下，這樣一種篩選法也將包含確定與同樣種類的氣道成纖維細胞相比，EGF類似物是否在哮喘患者支氣管上皮細胞上顯示優先增殖或促有絲分裂的活性的步驟，理想地是在支氣管上皮細胞上有約10-100倍或更大的活性，最理想地是在支氣管上皮細胞上有100倍或更大的活性。然而，同樣如上所示，也可以將這樣的篩選應用於其它化合物，著眼於選擇有潛力的治療利益的化合物，所述化合物可以在哮喘患者的支氣管上皮細胞中增加內源生長因子的生產並且因此改善增殖的能力並減少氣道上皮損害。
實施例實施例1mEGF/TGFα44-50和野生型mEGF的生產將所述嵌合生長因子mEGF/TGFα44-50和野生型小鼠EGF在巴斯德畢赤酵母(Pischia pastoris)中利用來自Invitrogen BV，Leek，荷蘭的pPIC9載體產生並且如之前在Chamberlin等，(2001)Eur.J.Biochem.268，6247-6255和Puddicombe等，(1996)J.Biol.Chem.271，30392-30397中所描述進行表徵。
實施例2增殖和有絲分裂發生測定(i)原代上皮細胞培養使非-特異反應性的、非-哮喘的對照受試者和哮喘的受試者經受支氣管刷檢(brushing)。根據症狀、肺機能和藥物療法表徵志願者。根據關於哮喘診斷和處理的GINA準則(Bousquet(2000)Global initiative forasthma(GESfA)and its objectives.Clin Exp Allergy30Suppl 12-5)評價哮喘嚴重性。全部受試者是非-吸菸者並且在進入所述研究之前至少4周無呼吸道感染。在參與之前獲得來自全部志願者的書面通知的同意，並且從JointEthics Committee of Southampton University Hospital Trust獲得倫理批准。表1中顯示了受試者詳細資料。利用一組常見的空氣變態反應原測試全部受試者的特異性反應並且通過標準酶聯免疫吸附測定(ELISA)測量血清IgE水平。通過組胺吸入激發評定氣道超-響應性並且表示為PC20(在1秒鐘內從基線產生強制吐氣體積(Forced Expiratory Volume)[FEV1]下降20％所需的組胺累積劑量)。
表1提供支氣管刷檢用於原代支氣管上皮細胞培養的志願者特徵
依照標準公開準則(Hurd S.Z.(1991)J.Allergy Clin.Immunol.88，808-814)通過支氣管鏡檢查法利用光學纖維的支氣管鏡(Olympus FB-20D，東京，日本)獲得支氣管刷檢。利用標準無菌單鞘尼龍細胞學刷(OlympusBC 9C-26101；東京，日本)獲得支氣管上皮細胞。這通過直接視覺經由所述支氣管鏡管道通入下部氣道並且從第二和第三代支氣管的支氣管黏膜取樣五至六個連續刷拂。在每次刷拂以後將細胞收穫到5ml的無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。在所述程序完成之上，加入5ml含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI並且將所述樣品在150×g離心五分鐘來沉澱細胞懸液。通過對收穫的細胞懸液的細胞離心器(cytospins)進行差示細胞計數以評定上皮細胞純度。
通過將新鮮刷出的支氣管上皮細胞接種到含有補充了50IU/ml青黴素和50μg/ml鏈黴素的3ml無血清的激素-補充支氣管上皮生長培養基(BEGM；Clonetics，聖地牙哥，CA)的培養皿中建立原代培養(Lordan等(2002)J.Immunol.169，407-414)。當融合時，利用胰蛋白酶將所述細胞傳代(p1)並且可以進一步擴展直到在2或3代用於實驗。對照實驗證實在p2或p3的細胞應答之間不存在顯著差異。通過錐蟲藍染料的排除評定生存能力並且利用全-細胞角蛋白抗體還有對於細胞角蛋白13(CK13)和CK18特異性的抗體通過培養容器載物片(Nunc，Labtek II八孔容器，Life TechnologiesLtd，蘇格蘭)上生長的培養物的免疫組織化學染色評定細胞的上皮屬性。(ii)EGF對於增殖的影響以最少為4×104細胞/ml原代BECs的接種密度在24孔盤中製備細胞。一旦70％融合，將細胞在各自含有1％ITS和1％BSA的BEGM中血清飢餓24小時。用SFM或1.7nM的EGF將細胞處理24小時。對於每個條件，一式兩份製備細胞。在每次培育的末尾從細胞收集上清液，並且在室溫下將所述細胞在甲醛生理鹽水(0.9％(v/v)的鹽溶液中的4％(v/v)的甲醛)固定至少30分鐘。然後除去甲醛生理鹽水並將所述盤在棉紙上吸乾以除去多餘水分。將200μl的1％(v/v)亞甲藍(將5 g亞甲藍溶解並過濾在500ml的10mM的硼酸鹽緩衝液(3.82g硼酸鹽四硼酸二鈉(borate disodiumtetraborate)，在蒸餾水中達到1升，pH8.5)中)用30分鐘加入到每個孔。通過在自來水中仔細洗滌直到所述水變清澈而除去過量染料並且將所述盤在棉紙上吸乾。然後通過每孔添加200μl的1∶1的乙醇0.1％HCl溶液(200ml乙醇200ml的0.1M HCl)洗脫所述染料並且放置30分鐘。在用1∶1的乙醇0.1％HCl的1∶10稀釋以後，利用Multiskan斜板(ascent plate)讀出器測定洗脫液的吸光度以提供在所述板讀出器線性範圍之內的吸光度。利用630nm濾色片讀出吸光度並且將每個樣品一式兩份測試。通過直接細胞計數以使細胞數目與亞甲藍閱讀相關來產生標準曲線。1.0的A630等於5.5×105細胞/ml。
結果來自正常受試者的原代支氣管上皮細胞的EGF處理不影響如利用亞甲藍結合確定的細胞數目(參見圖2a)。相反，EGF處理的哮喘細胞顯示細胞數目小而顯著的增加，其接近在對照中所見到的數目(參見圖2b)。這些數據表明在哮喘支氣管上皮中觀察到的減少的增殖速率可以延緩響應於損害的上皮修復並且有助於延續上皮屏蔽的破裂和由此的哮喘患者的疾病進展。
(ii)有絲分裂發生測定在標準有絲分裂發生測定的變體中測量EGF或mEGF/TGFα44-50在融合和休眠H292支氣管上皮細胞或原生氣道成纖維細胞中誘導DNA合成的能力(Puddicombe等.(2000)FASEB J.14，1362-1374；Puddicombe等(1996)J.Biol.Chem 271，30392-30397)。簡言之，在96-孔不透明細胞培養盤中在RPMI/10％FBS中將細胞生長到融合併且通過血清減少使其休眠。將生長因子加入到有絲分裂發生測定緩衝液中的細胞並且在18h後通過經過2h的脈衝周期結合3H胸苷或胸苷類似物、[125I]UdR測定DNA合成。將所述細胞固定並用5％三氯乙酸接著是甲醇洗滌。乾燥後，將酸-不可溶物質溶解在40μl/孔的0.2M的NaOH中並且在向每孔加入150μl的Microscint-40(Canberra Packard，Pangbourne，Berks，RG8 7AN)以後在Topcount閃爍計數器(Canberra Packard)上確定放射性。
結果如圖3a中所示，野生型EGF和嵌合生長因子刺激支氣管上皮細胞上的促有絲分裂反應的能力不存在差異。然而，在它們對於支氣管成纖維細胞的促有絲分裂的性質中存在顯著差異(參見圖3b)。因而推論EGF/TGFα44-50嵌合生長因子及其功能性類似物代表用於加速哮喘患者中支氣管上皮修復的手段。
序列表110南安普敦大學120對於哮喘的生長因子治療130CI.P53296WO150GB 0420265.11512004-09-13150GB 0425281.31512004-11-1716031703.3版的專利210121149212PRT213人工的220
223全嵌合蛋白質序列4001Asn Ser Tyr Pro Gly Cys Pro Ser Ser Tyr Asp Gly Tyr Cys Leu Asn1 5 10 15Gly Gly Val Cys Met His Ile Glu Ser Leu Asp Ser Tyr Thr Cys Asn20 25 30Cys Val Ile Gly Tyr Ser Gly Asp Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu35 40 45Ala210221142212PRT213Mus sp.
4002Asn Ser Tyr Pro Gly Cys Pro Ser Ser Tyr Asp Gly Tyr Cys Leu Asn1 5 10 15
Gly Gly Val Cys Met His Ile Glu Ser Leu Asp Ser Tyr Thr Cys Asn20 25 30Cys Val Ile Gly Tyr Ser Gly Asp Arg Cys35 4021032117212PRT213Mus sp.
4003Glu His Ala Asp Leu Leu Ala1 權利要求
1.一種生長因子在製備用於治療或防止哮喘患者中支氣管上皮損害的藥物中的用途，所述生長因子是表皮生長因子(EGF)類似物、角質形成細胞生長因子(KGF)或KGF類似物，所述EGF類似物靶向EGF受體並在所述患者中顯示與氣道成纖維細胞相比促進支氣管上皮細胞優先增殖的能力。
2.根據權利要求1的用途，其中所述患者是人哮喘患者。
3.如權利要求1或權利要求2中所要求的用途，其中所述生長因子是EGF/TGFα44-50嵌合類似物，其中野生型或非野生型EGF的C-末端胺基酸殘基被TGFα的C-末端的7個胺基酸殘基置換。
4.如權利要求3中所要求的用途，其中所述類似物是EGF/TGFα44-50嵌合類似物，其中野生型EGF的C-末端11個胺基酸殘基被TGFα的C-末端的7個胺基酸殘基置換。
5.如權利要求2中所要求的用途，其中所述生長因子是嵌合生長因子hEGF/TGFα44-50或所述嵌合生長因子的功能類似物，在所述嵌合生長因子中人EGF的11個C-末端胺基酸殘基被人TGFα的C-末端的7個胺基酸殘基置換。
6.如權利要求1或權利要求2中所要求的用途，其中所述生長因子是KGF或KGF類似物。
7.一種篩選測試試劑促進哮喘患者的支氣管上皮細胞增加的增殖能力的方法，所述哮喘患者支氣管上皮細胞與對照的非哮喘患者支氣管上皮細胞相比在增殖能力上是有缺陷的，所述方法包含(i)在沒有生長因子的情況下培養這類來自哮喘患者的支氣管上皮細胞；(ii)將所述測試試劑加入到所述培養物或等同的培養物中並且(iii)與不加入測試試劑或生長因子並在相同條件下培養的對照支氣管上皮細胞相比，測定所述測試試劑是否減少了對於促進最大增殖或有絲分裂發生的外源EGF的需要。
8.如權利要求7中所要求的方法，其中所述測定是藉助於其中測定DNA合成的有絲分裂發生檢測來進行的。
9.如權利要求7或權利要求8中所要求的方法，其中所述細胞是人細胞。
10.如權利要求7至9任一項中所要求的方法，其中所述測試試劑是EGF類似物並且所述方法還包含確定所述類似物在培養的哮喘患者支氣管上皮細胞上與同樣物種的培養的氣道成纖維細胞相比是否顯示促進增殖或有絲分裂發生的優先能力的步驟。
11.權利要求7至9任一項中所要求的方法，其中所述測試試劑不同於EGF類似物或含有EGF類似物的組合物。
12.一種治療或防止哮喘患者中支氣管上皮損害的方法，所述方法包括將生長因子施用到所述患者的氣道，所述生長因子是EGF類似物、KGF或KGF類似物，所述EGF類似物靶向EGFR並在這樣一種患者中與氣道成纖維細胞相比顯示促進支氣管上皮細胞優先增殖的能力。
全文摘要
本發明涉及對於治療或防止哮喘患者的10種支氣管上皮損害的生長因子的用途，所述生長因子是表皮生長因子(EGF)類似物、KGF或KGF類似物。用於該目的的適合的EGF類似物靶向EGF受體並在哮喘患者中顯示與氣道成纖維細胞相比促進支氣管上皮細胞優先增殖的能力。
文檔編號G01N33/50GK101056649SQ200580038645
公開日2007年10月17日 申請日期2005年9月13日 優先權日2004年9月13日
發明者唐娜·伊莉莎白·戴維斯, 史蒂芬·T·霍爾蓋特, 林恩塞·M·漢密爾頓, 薩拉·瑪格麗特·普迪庫姆, 奧德麗·裡克特 申請人:南安普敦大學