一種基於伊波拉病毒樣顆粒的體外和體內新型感染模型的製作方法
2023-10-09 17:17:29 2
本發明屬於生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種基於伊波拉病毒樣顆粒的體外和體內新型感染模型。
背景技術：
伊波拉病毒病(Ebola virus disease,EVD)是由伊波拉病毒(Ebola viruses,EBOV)引起的急性出血性傳染病，是最具致命性的傳染病之一。EBOV屬於絲狀病毒科(filoviridae family)伊波拉病毒屬(Ebolavirus genus)，目前已知共有5個種；其中，薩伊伊波拉病毒(Zaire Ebola virus)的致死率最高，並引起了2013-2015在西非的大爆發，這是1976年首次發現EBOV以來發生的最大規模的伊波拉疫情。據估計，此次疫情的病死率高達70.8％，且據世界衛生組織(WHO)統計，目前已造成超過25000例感染，超過11000人死亡，造成了公眾一定程度的恐慌，引起了各國政府的高度重視。
雖然一些針對伊波拉的候選疫苗和藥物正在進行臨床試驗，但目前市場上還沒有獲得許可上市的產品。當今，全球化進程使得人員流動日益增多，也加劇了EBOV在全世界範圍內傳播的風險，EBOV已成為全球公共健康和社會穩定的重大威脅。此外，由於其具有高傳染性和高致命性，EBOV也被認為是一種理想的生物武器，對世界各國的生物反恐事業同樣構成巨大的威脅。因此，研發針對EBOV的疫苗和治療方法迫在眉睫。然而，作為一個生物安全四級(biosafety level 4,BSL-4)病原體，EBOV只能在BSL-4實驗室中操作，這極大地阻礙了疫苗和藥物的研發進程。目前在全球範圍內，只有不到30個BSL-4實驗室，並且只分布在少數幾個國家。因此，建立一個安全、快速、簡易的體外體內感染系統，對於EBOV疫苗和藥物的篩選評價具有重大意義。
除了天然EBOV，之前已經有關於建立EBOV體外感染模型的報導。一種是基於慢病毒或逆轉錄病毒的假病毒，即將EBOV包膜蛋白(EBOV GP)展示到慢病毒或逆轉錄病毒的核心顆粒gag蛋白包裝而成的病毒顆粒表面上[1]。另外，表達EBOV GP和綠色螢光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重組水皰口炎病毒(recombinant Vesicular Stomatitis Virus,rVSV)[2]也被用來作為體外感染模型。假病毒系統的優點是容易包裝，並能高效的將報告基因整合到感染細胞基因組中並表達。rVSV的優點是具有複製能力，可以通過細胞病變效應(cytopathic effects,CPE)和GFP的表達兩個指標判定病毒是否感染細胞。然而，不論是假病毒還是VSV顆粒，通常都是球形或者子彈形，這與EBOV多形態絲狀結構的特性並不相符。manicassamy等[1]將β-內醯胺酶與EBOV VP40融合表達，形成含有β-內醯胺酶的VLP，將這種VLP感染細胞後，加入底物，以β-內醯胺酶的活性作為指標，檢測病毒是否進入細胞。然而，β-內醯胺酶會阻礙病毒樣顆粒的形成[1]。更重要的是，β-內醯胺酶活性測定的通量較低，且用於檢測的底物(CCF2-AM或CCF4-AM)價格昂 貴，因此該系統沒有得到廣泛的應用。
因此，本領域迫切需要開發容易操作，且成本較低，易於推廣應用的伊波拉感染模型。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種基於伊波拉病毒樣顆粒的體外和體內新型感染模型。
本發明的第一方面，提供了一種VLP(virus-like particles，病毒樣顆粒)，所述VLP包含伊波拉病毒VP40多肽或其活性片段，和報告蛋白。
在另一優選例中，所述報告蛋白被包裹在所述VLP的內部。
在另一優選例中，所述報告蛋白為螢光素酶、或螢光蛋白。
在另一優選例中，所述報告蛋白為Fluc(firefly luciferase,螢火蟲螢光素酶)多肽或其活性片段、或Rluc(Renilla luciferase，海腎螢光素酶)。
在另一優選例中，組成所述VLP的結構蛋白包含所述伊波拉病毒VP40多肽或其活性片段，並且所述報告蛋白(Fluc多肽或其活性片段)被包裹在所述VLP的內部。優選地，根據本發明的VLP，由VP40組成結構蛋白從而構成空心的顆粒，而Fluc被包裹在顆粒內部，即，Fluc並不是同VP40一起組成VLP的結構蛋白。
在另一優選例中，所述VP40多肽自下組：
(A)具有SEQ ID NO:2所示胺基酸序列的多肽；
(B)具有與SEQ ID NO:2所示胺基酸序列≥80％同源性(優選地，≥90％的同源性；等優選地≥95％的同源性；最優選地，≥97％的同源性)的多肽，且所述多肽在細胞內能夠形成VLP；
(C)將SEQ ID NO:2中所示胺基酸序列經過1-5個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且在細胞內能夠形成VLP的衍生多肽。
在另一優選例中，所述Fluc多肽自下組：
(A)具有SEQ ID NO:8所示胺基酸序列的多肽；
(B)具有與SEQ ID NO:8所示胺基酸序列≥80％同源性(優選地，≥90％的同源性；等優選地≥95％的同源性；最優選地，≥97％的同源性)的多肽，且具有野生型Fluc特性的多肽；
(C)將SEQ ID NO:8中所示胺基酸序列經過1-5個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有野生型Fluc特性的衍生多肽。
在另一優選例中，所述VLP為絲狀VLP；優選地所述絲狀VLP長度≥1μm；更優選地直徑為約50～150nm。
在另一優選例中，所述VLP中報告蛋白(如Fulc)和VP40的質量比為0.1～1：1～0.1，優選地質量比為0.2～1：1～0.2；更優選地質量比為0.25～0.5：1。
在另一優選例中，所述VLP中報告蛋白(如Fulc)和VP40的摩爾比為0.1～1：1～0.1，優選地摩爾比為0.15～0.5：1～0.1；更優選地摩爾比為0.15～0.3：1。
在另一優選例中，所述VLP還包含伊波拉病毒GP多肽；優選地，組成所述VLP的結構蛋白包含所述GP多肽。
在另一優選例中，所述GP多肽包含SEQ ID NO.:4所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述VLP還包含伊波拉病毒NP多肽；優選地，所述NP多肽被包裹在所述VLP的內部。
在另一優選例中，所述NP多肽包含SEQ ID NO.:6所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述VLP具有感染細胞(進入細胞)的能力，並且在進入細胞後能夠將所述報告蛋白導入(釋放於)細胞中。
在另一優選例中，所述細胞為能夠被伊波拉病毒感染的細胞，優選為肝細胞或腎細胞。
本發明的第二方面，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞表達本發明第一方面所述的VLP。
在另一優選例中，所述宿主細胞為真核細胞、或原核細胞。
在另一優選例中，所述真核細胞包括動物細胞(如，293T細胞、CHO細胞、Vero細胞等)、植物細胞、或真菌。
在另一優選例中，所述原核細胞包括：大腸桿菌。
在另一優選例中，所述宿主細胞培養液上清中Fluc的活性≥106，優選地≥107。
本發明的第三方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括本發明第一方面所述的VLP、和/或本發明第二方面所述的宿主細胞。
在另一優選例中，所述試劑盒中還包括螢光素酶底物。
在另一優選例中，所述螢光素酶底物為螢光素。
在另一優選例中，所述試劑盒用於動物體內的生物發光成像。
本發明的第四方面，提供了一種製備本發明第一方面所述的VLP的試劑盒，所述試劑盒包括：
編碼VP40多肽或其活性片段的質粒，和
編碼報告蛋白或其活性片段的質粒。
在另一優選例中，所述試劑盒還包括編碼伊波拉病毒GP多肽的質粒。
在另一優選例中，所述試劑盒還包括編碼伊波拉病毒NP多肽的質粒。
本發明的第五方面，提供了一種製備如本發明第一方面所述的VLP的方法，所述方法包括步驟：
在適合表達的條件下，培養本發明第二方面所述的細胞，從而表達出本發明第一方面所述的VLP；和
分離所述VLP。
在另一優選例中，將編碼VP40多肽或其活性片段的質粒，和編碼報告蛋白或其活性片段的質粒共轉染宿主細胞，從而製得本發明第二方面所述的細胞。
在另一優選例中，在製備本發明第二方面所述的細胞的步驟中，將編碼VP40多肽或其活性片段的質粒，和編碼報告蛋白或其活性片段的質粒，以及編碼GP多肽的質粒和/或編碼NP多肽的質粒共轉染宿主細胞，從而製得本發明第二方面所述的細胞。
在另一優選例中，在轉染過程中，編碼報告蛋白或其活性片段的質粒濃度≥0.1ug/(2×105個細胞)；優選地，≥0.5ug/(2×105個細胞)；更優選的，≥2.5ug/(2×105個細胞)；最優選地≥5ug/(2×105個細胞)。
在另一優選例中，在轉染過程中，編碼報告蛋白或其活性片段的質粒濃度≤50ug/(2×105個細胞)。
在另一優選例中，在轉染過程中，編碼VP40多肽或其活性片段的質粒濃度≥0.1ug/(2×105個細胞)；優選地，≥0.2ug/(2×105個細胞)；更優選的，≥0.5ug/(2×105個細胞)；最優選地≥1ug/(2×105個細胞)。
在另一優選例中，在轉染過程中，編碼VP40多肽或其活性片段的質粒濃度≤10ug/(2×105個細胞)。
在另一優選例中，在轉染過程中，編碼VP40多肽或其活性片段的質粒和編碼GP多肽的質粒的濃度比為1～2：2～1；優選為1：1。
在另一優選例中，在轉染過程中，編碼VP40多肽或其活性片段的質粒和編碼NP多肽的質粒的濃度比為1～2：2～1；優選為1：1。
本發明的第六方面，提供了如本發明第一方面所述的VLP、本發明第二方面所述的宿主細胞、或本發明第三方面所述的試劑盒的用途，用於篩選伊波拉病毒抑制劑。
在另一優選例中，所述用途還包括用於製備試劑，所述試劑用於製備篩選伊波拉病毒抑制劑的模型；優選地所述模型包括細胞模型或動物(優選為小型哺乳動物，如齧齒動物(如小鼠)模型。
在另一優選例中，所述用途還包括用於動物體內的生物發光成像。
在另一優選例中，所述伊波拉病毒抑制劑包括：多肽(如抗體)、和化合物。
本發明的第七方面，提供了一種篩選影響(包括促進或抑制)伊波拉病毒感染的抑制劑或促進劑的方法，包括步驟：將本發明第一方面所述的VLP、動物細胞和待測試物質接觸，然後檢測細胞內部的所述報告蛋白的活性。
如果報告蛋白的活性被抑制，則表明待測試物質為伊波拉病毒抑制劑；如果報告蛋白的活性被促進，則表明待測試物質為伊波拉病毒促進劑。
在另一優選例中，所述方法包括步驟：(1)在實驗組中，在待測試物和本發明第一方面所述的VLP存在下，培養動物細胞，然後檢測所述細胞內的報告蛋白(優選螢光素酶)的數量或活性，記為Mt；並且在待測試物不存在且其他條件相同的條件下，培養相同類型的動物細胞，並檢測所述細胞內的報告蛋白(優選螢光素酶)的數量或活性，記為Mc；
(2)將Mt與Mc進行比較，
其中，如果Mt顯著低於Mc，則表明所述待測物為抑制博拉病毒感染的抑制劑；如果Mt顯著高於Mc，則表明所述待測物為促進博拉病毒感染的促進劑。
在另一優選例中，所述的顯著低於指Mt/Mc≤1/1.5，較佳地≤1/2，更佳地≤1/3。
在另一優選例中，所述的顯著高於指Mt/Mc≥1.5，較佳地≥2，更佳地≥3。
在另一優選例中，所述步驟(1)中VLP的濃度為：以所述VLP中VP40的 濃度計算，0.1～0.5μg/ml；優選為≥0.1μg/ml；更優選為≥0.2μg/ml。
在另一優選例中，所述的方法還包括步驟(3)：對於步驟(2)中選出的抑制博拉病毒感染的抑制劑，進一步在非人模型動物中測試其對伊波拉病毒的抑制效果。
如果報告蛋白的活性被抑制，則表明待測試物質為伊波拉病毒抑制劑。
在另一優選例中，所述動物細胞為能被所述VLP和/或伊波拉病毒感染的細胞；優選為肝細胞、或腎細胞。
在另一優選例中，所述動物細胞選自：體外培養的細胞、和動物體內的細胞。
在另一優選例中，所述細胞選自下組：Hepa1-6細胞株,NIH3T3細胞株和L929細胞株。
在另一優選例中，所述方法包括步驟：在實驗組中，將待測試物和本發明第一方面所述的VLP同時或先後注射入動物體內，並檢測動物體內的報告蛋白的活性(優選地，檢測動物肝臟中的報告蛋白活性)。
在另一優選例中，如果所述動物體內的報告蛋白的活性被抑制，則表明該物質為伊波拉病毒抑制劑。
在另一優選例中，所述注射為靜脈注射。
在另一優選例中，所述動物為非人小型哺乳動物，優選地選自：小鼠、大鼠。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
附圖說明
圖1顯示了EBOVLP/Fluc在293T細胞上清中的表達情況，以及對其成分和功能的鑑定。(A)用於轉染293T細胞生產EBOVLP/Fluc的質粒示意圖。(B)以不同的質粒組合共同轉染293T細胞後，通過western blot檢測各蛋白在細胞上清中的表達情況，以及通過加入螢光素酶底物測定細胞上清中Fluc的活性。(C)檢測EBOVLP/Fluc或EBOVLP/Fluc/GP-感染Vero細胞和Huh7.5.1細胞後，每隔6小時細胞中Fluc的活性。(D-E)將表達GP,VP40,NP以及Fluc的質粒共轉染293T細胞生產EBOVLP/Fluc並感染Vero細胞時，不同Fluc質粒的量(5μg,2μg,0.5μg和0.05μg)對於包裝細胞中Fluc活性(D)以及對於感染靶細胞中的Fluc活性(E)的影響。(F)EBOVLP對於報告基因Renilla luciferase的包裝。將表達GP,VP40,NP以及Rluc的質粒共轉染293T細胞，生產EBOVLP/Rluc。EBOVLP/Rluc感染Vero細胞後可以檢測到很高的細胞內Rluc活性。(G-H)EBOVLP對於IRF-3蛋白的包裝。將表達GP,VP40,NP以及帶有HA標籤的IRF-3的質粒以圖示不同組合共轉染293T細胞，並通過western blot檢測細胞上清中IRF-3的存在(G)；收集上述各組合產生的上清並用來感染Vero細胞，檢測感染後Vero細胞中IRF-3的存在(H)。
圖2顯示了EBOVLP/Fluc依賴功能完善的GP進入細胞。(A)用於包裝病毒樣顆粒和假病毒的包膜蛋白表達質粒示意圖。(B)當EBOVLP/Fluc或HIV/EBOVpv裝載不同的GP，感染Huh7.5.1細胞或Vero細胞時，細胞中Fluc的活性。(C)裝載野生型GP或帶有F88A點突變的GP的EBOVLP感染細胞後， 細胞中Fluc的活性，以及兩種GP蛋白在轉染293T細胞中的表達情況。(D)EBOVLP/Fluc或EBOVLP/Fluc/GP-感染NPC1過表達細胞和GFP過表達細胞時，細胞中Fluc的活性。
圖3顯示了EBOVLP/Fluc組裝而成的病毒樣顆粒的形態學與組成成份鑑定。(A)EBOVLP/Fluc表達樣品經蔗糖密度梯度離心後，western blot檢測各層蛋白組分，PCR檢測Fluc的DNA，檢測Fluc的活性和測量各層密度。(B)EBOVLP/Fluc最終純化樣品的考馬斯亮藍染色結果以及組成分析。組成VLP的蛋白如圖中箭頭標註。(C)EBOVLP/Fluc和HIV/EBOVpv的負染電鏡結果。
圖4顯示了EBOVLP/Fluc的Western blot定量方法。(A)以大腸桿菌中表達的重組VP40為參考標準蛋白，抗VP40小鼠血清作為檢測抗體的western blot結果。(B)以圖A中的條帶灰度為X值，VP40的質量為Y值，生成的標準曲線。根據該標準曲線，可由樣品的灰度計算出VP40的量。
圖5顯示了EBOVLP/Fluc在小鼠體內的感染實驗。(A)EBOVLP/Fluc和EBOVLP/Fluc/GP-感染三種小鼠細胞即Hepa1-6,NIH3T3和L929後，細胞中Fluc的活性。(B-C)EBOVLP/Fluc和EBOVLP/Fluc/GP-通過尾靜脈注射感染BALB/c小鼠，感染後12h，將小鼠肝細胞分離並檢測細胞中Fluc活性(B)或將小鼠置於活體成像儀中測定體內生物發光讀數(C)。尾靜脈高壓注射(hydrodynamic injection,h.i.)pLenti6-Fluc質粒的小鼠作為陽性對照。
圖6顯示了EBOVLP/Fluc可作為感染模型在體外(A)和體內(B-C)對伊波拉病毒中和抗體進行評價。(A)分別用基於慢病毒的HIV/EBOVpv和EBOVLP/Fluc對兩種伊波拉病毒中和抗體13C6和6D8進行中和實驗。(B)EBOVLP/Fluc與不同劑量的抗體孵育後，將VLP-抗體混合物通過尾靜脈注射感染BALB/c小鼠，感染後12h，將小鼠置於活體成像儀中測定體內生物發光讀數。(C)肝臟區域生物發光讀數的統計。柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus Group A Type16,CVA16)中和抗體9B5在體外和體內實驗中作為陰性對照。
具體實施方式
本發明人通過廣泛而深入的研究，獲得一種基於EBOV病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)的、以螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase,Fluc)為報告蛋白的新型感染模型。該模型依賴EBOV包膜蛋白GP進入細胞，並在進入細胞後能夠將Fluc導入細胞中，因此可根據細胞中Fluc的信號強度，對細胞感染進行定量；也可通過生物成像，根據小鼠體內的生物發光的信號強度，對小鼠感染進行定量。本發明還提供了根據本發明的VLP的用途。本發明人意外地發現，根據本發明的VLP具有感染細胞的能力，且能夠將報告蛋白導入細胞中，在此基礎上，完成了本發明。
具體的，本發明人發現，EBOVLP能將報告蛋白包裹其中並通過感染，將報告蛋白傳遞到細胞中。基於該發現，在此次研究中，本發明人建立了一個安全可靠的，以螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase,Fluc)為報告蛋白，易於生產的體外、體內感染系統。該系統在形態上最大限度地模仿了真實EBOV的絲狀形態，同時在功能上，其進入細胞的過程也與EBOV感染過程相似，因此可作為在體外和體外進行藥物、中和抗體高通量篩選的高效工具。
在描述本發明之前，應當理解本發明不限於所述的具體方法和實驗條件， 因為這類方法和條件可以變動。還應當理解本文所用的術語其目的僅在於描述具體實施方案，並且不意圖是限制性的，本發明的範圍將僅由所附的權利要求書限制。
除非另外定義，否則本文中所用的全部技術與科學術語均具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數值中使用時，術語「約」意指該值可以從列舉的值變動不多於1％。例如，如本文所用，表述「約100」包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
雖然在本發明的實施或測試中可以使用與本發明中所述相似或等價的任何方法和材料，本文在此處例舉優選的方法和材料。
伊波拉病毒
伊波拉病毒(Ebola virus disease,EVD)屬於纖維病毒科程長絲狀體。在病毒粒子中心結構的核殼蛋白由螺旋狀纏繞之基因體RNA與核殼蛋白質以及蛋白質病毒蛋白VP35、VP30、L組成，病毒包含的糖蛋白從表面深入病毒粒子10納米長，另外10納米則向外突出在套膜表面，而這層套膜來自宿主的細胞膜，在套膜與核殼蛋白之間的區域，稱為基質空間，由病毒蛋白VP40和VP24組成。
每個病原體是由鏈狀的負鏈核糖核酸病毒粒子構成。伊波拉病毒的基因組中具有18595個鹼基，3'端沒有多聚腺苷酸化，5'端也沒有加帽(capping)。基因組編碼七個結構蛋白和一個非結構蛋白。基因順序是：3'端-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5'端，兩端的非編碼區含有重要的信號以調節病毒的轉錄、複製和新病毒顆粒的包裝。
報告蛋白
本文中術語「報告蛋白」指由報告基因(reporter gene)編碼的蛋白。報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，也就是說，是一個其表達產物非常容易被鑑定的基因。報告蛋白包括但不限於：抗生素抗性蛋白、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、β半乳糖苷酶、螢光素酶、螢光蛋白等。
病毒樣顆粒
病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是含有某種病毒的一個或多個結構蛋白的空心顆粒，沒有病毒核酸，不能自主複製，在形態上與真正病毒粒子相同或相似，也稱為偽病毒。
本發明中的VLP由伊波拉病毒VP40多肽或其活性片段以及任選的其它多肽組成結構蛋白，構成VLP的顆粒。
根據本發明的VLP還包括Fluc(firefly luciferase,螢火蟲螢光素酶)多肽或其活性片段，優選地，所述Fluc被包裹在所述VLP的內部。
在本發明優選地實施方式中，所述VLP的結構蛋白中還可以包括：伊波拉病毒GP多肽和/或伊波拉病毒NP多肽。
在本發明優選地實施方式中，組成所述VLP的結構蛋白中還包含GP多肽。
在本發明優選地實施方式中，所述VLP內部包裹有NP多肽。
在本發明的優選地實施方式中，伊波拉病毒VP40多肽的序列如下：
MRRVILPTAPPEYMEAIYPARSNSTIARGGNSNTGFLTPESVNGDTPSNPLRPIADDTIDHASHTPGSVSSAFILEAMVNVISGPKVLMKQIPIWLPLGVADQKTYSFDSTTAAIMLASYTITHFGKATNPLVRVNRLGPGIPDHPLRLLRIGNQAFLQEFVLPPVQLPQYFTFDLTALKLITQPLPAATWTDDTPTGSNGALRPGISFHPKLRPILLPNKSGKKGNSADLTSPEKIQAIMTSLQDFKIVPIDPTKNIMGIEVPETLVHKLTGKKVTSKNGQPIIPVLLPKYIGLDPVAPGDLTMVITQDCDTCHSPASLPAVVEK(SEQ ID NO.:2)；
其編碼核苷酸序列如下：
ATGCGCCGCGTGATTCTGCCGACAGCCCCACCCGAGTACATGGAGGCCATCTATCCAGCCCGCTCGAACAGTACGATTGCCCGCGGCGGAAACAGCAATACAGGCTTCCTGACCCCGGAGTCGGTGAACGGAGATACCCCCAGTAATCCGCTGCGCCCAATCGCCGATGACACAATTGATCACGCCTCCCATACCCCGGGCAGCGTGAGCAGCGCCTTTATCCTGGAGGCTATGGTGAATGTGATTTCCGGCCCGAAGGTGCTGATGAAGCAGATCCCCATTTGGCTGCCGCTGGGAGTGGCCGATCAGAAGACCTACAGCTTCGACTCCACCACGGCCGCCATCATGCTGGCCTCGTATACAATTACCCACTTTGGCAAGGCCACCAATCCCCTGGTGCGCGTGAATCGCCTGGGACCGGGAATCCCGGATCATCCACTGCGCCTGCTGCGCATTGGAAACCAGGCCTTCCTGCAGGAGTTTGTGCTGCCACCCGTGCAGCTGCCCCAGTACTTCACGTTTGACCTGACAGCCCTGAAGCTGATTACCCAGCCCCTGCCAGCCGCCACCTGGACAGATGACACCCCAACCGGCAGCAATGGAGCCCTGCGCCCGGGAATCTCCTTCCACCCAAAGCTGCGCCCCATTCTGCTGCCGAACAAGTCGGGCAAGAAGGGAAATAGCGCCGATCTGACGTCCCCCGAGAAGATCCAGGCCATTATGACAAGTCTGCAGGATTTCAAGATCGTGCCCATTGACCCGACCAAGAACATCATGGGCATTGAGGTGCCAGAGACGCTGGTGCATAAGCTGACCGGCAAGAAGGTGACGTCCAAGAATGGACAGCCAATCATTCCCGTGCTGCTGCCCAAGTATATTGGCCTGGACCCCGTGGCCCCAGGAGACCTGACGATGGTGATCACACAGGATTGCGATACATGCCATTCCCCAGCCAGTCTGCCAGCCGTGGTGGAGAAGTAA(SEQ ID NO.:1)。
在本發明的優選地實施方式中，伊波拉病毒GP多肽的序列如下：
MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNGPKNISGQSPARTSSDPETNTTNEDHKIMASENSSAMVQVHSQGRKAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVGQHHRRADNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLDLATTTSPQNYSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYTEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQWIPAGIGVTGVIIAVIALFCICKFVF(SEQ ID NO.:4)；
其編碼核苷酸序列如下：
ATGGGAGTGACCGGCATCCTGCAGCTGCCCCGCGACCGCTTCAAGCGCACGAGTTTCTTTCTGTGGGTGATTATTCTGTTCCAGCGCACGTTCAGCATCCCCCTAGGCGTGATTCACAATAGCACGCTGCAGGTGTCCGATGTGGACAAGCTGGTGTGCCGCGATAAGCTGTCGTCGACCAACCAGCTGCGCTCGGTGGGACTGAATCTGGAGGGAAATGGAGTGGCCACCGATGTGCCCTCCGCCACCAAGCGCTGGGGATTTCGCAGTGGAGTGCCACCGAAGGTGGTGAACTACGAGGCCGGCGAGTGGGCCGAGAATTGCTATAACCTGGAGATCAAGAAGCCGGATGGCAGCGAGTGCCTGCCGGCCGCCCCCGACGGCATTCGCGGATTCCCACGCTGCCGCTACGTGCACAAGGTGTCGGGAACCGGACCCTGCGCCGGAGATTTCGCCTTTCATAAGGAGGGCGCCTTCTTTCTGTACGACCGCCTGGCCAGCACCGTGATCTATCGCGGAACCACCTTTGCCGAGGGAGTGGTGGCCTTTCTGATTCTGCCCCAGGCCAAGAAGGATTTCTTTTCGAGTCACCCCCTGCGCGAGCCGGTGAATGCCACCGAGGACCCGAGCTCCGGCTACTATTCGACAACCATCCGCTACCAGGCCACCGGCTTCGGAACAAATGAGACCGAGTACCTGTTTGAGGTGGATAACCTGACGTATGTGCAGCTGGAGAGCCGCTTCACCCCGCAGTTTCTGCTGCAGCTGAATGAGACCATCTATGCCAGCGGAAAGCGCTCCAATACGACAGGCAAGCTGATTTGGAAGGTGAACCCAGAGATCGACACCACGATTGGCGAGTGGGCCTTTTGGGAGACCAAGAAGAACCTGACGCGCAAGATCCGCTCGGAGGAGCTGAGTTTCACCGCCGTGTCCAATGGACCGAAGAACATTTCGGGACAGTCCCCCGCCCGCACATCCAGTGATCCAGAGACCAATACAACCAACGAGGACCACAAGATCATGGCCTCGGAGAACAGCTCCGCTATGGTGCAGGTGCACAGCCAGGGACGCAAGGCCGCCGTGTCCCATCTGACGACACTGGCCACGATCAGCACATCGCCCCAGTCCCTGACCACCAAGCCCGGACCAGATAATAGCACCCATAACACGCCCGTGTACAAGCTGGACATTTCGGAGGCCACCCAAGTGGGACAGCACCATCGCCGCGCCGATAATGACTCGACAGCCAGTGATACCCCCCCGGCCACAACCGCCGCCGGACCACTGAAGGCCGAGAATACGAACACATCGAAGAGTGCCGATAGCCTGGACCTGGCCACCACAACCTCCCCACAGAACTACAGTGAGACCGCCGGCAACAATAACACACACCATCAGGACACCGGAGAGGAGTCCGCGTCGAGTGGCAAGCTGGGACTGATCACCAATACGATTGCCGGCGTGGCCGGACTGATTACCGGAGGACGCCGCACACGCCGCGAGGTCATCGTGAATGCCCAGCCCAAGTGCAATCCAAACCTGCACTACTGGACGACACAGGATGAGGGAGCCGCCATTGGACTGGCCTGGATTCCCTACTTCGGACCCGCCGCCGAGGGAATCTATACCGAGGGCCTGATGCATAATCAGGACGGCCTGATTTGCGGACTGCGCCAGCTGGCCAATGAGACCACCCAGGCCCTGCAGCTGTTCCTGCGCGCCACAACCGAG CTGCGCACGTTTTCCATCCTGAATCGCAAGGCCATTGATTTCCTGCTGCAGCGCTGGGGAGGAACCTGCCACATCCTGGGACCAGATTGCTGCATTGAGCCCCATGACTGGACGAAGAACATCACAGATAAGATTGACCAGATCATTCACGATTTCGTGGACAAGACGCTGCCGGACCAGGGAGATAATGACAACTGGTGGACCGGATGGCGCCAGTGGATTCCCGCCGGAATTGGAGTGACCGGAGTGATTATCGCCGTGATTGCCCTGTTCTGCATCTGCAAGTTTGTGTTTTGA(SEQ ID NO.:3)。
在本發明的優選地實施方式中，伊波拉病毒NP多肽的序列如下：
MGSATMDSRPQKIWMAPSLTESDMDYHKILTAGLSVQQGIVRQRVIPVYQVNNLEEICQLIIQAFEAGVDFQESADSFLLMLCLHHAYQGDYKLFLESGAVKYLEGHGFRFEVKKRDGVKRLEELLPAVSSGKNIKRTLAAMPEEETTEANAGQFLSFASLFLPKLVVGEKACLEKVQRQIQVHAEQGLIQYPTAWQSVGHMMVIFRLMRTNFLIKFLLIHQGMHMVAGHDANDAVISNSVAQARFSGLLIVKTVLDHILQKTERGVRLHPLARTAKVKNEVNSFKAALSSLAKHGEYAPFARLLNLSGVNNLEHGLFPQLSAIALGVATAHGSTLAGVNVGEQYQQLREAATEAEKQLQQYAESRELDHLGLDDQEKKILMNFHQKKNEISFQQTNAMVTLRKERLAKLTEAITAASLPKTSGHYDDDDDIPFPGPINDDDNPGHQDDDPTDSQDTTIPDVVVDPDDGSYGEYQSYSENGMNAPDDLVLFDLDEDDEDTKPVPNRSTKGGQQKNSQKGQHIEGRQTQSRPIQNVPGPHRTIHHASAPLTDNDRRNEPSGSTSPRMLTPINEEADPLDDADDETSSLPPLESDDEEQDRDGTSNRTPTVAPPAPVYRDHSEKKELPQDEQQDQDHTQEARNQDSDNTQSEHSFEEMYRHILRSQGPFDAVLYYHMMKDEPVVFSTSDGKEYTYPDSLEEEYPPWLTEKEAMNEENRFVTLDGQQFYWPVMNHKNKFMAILQHHQ(SEQ ID NO.:6)；
其編碼核苷酸序列如下：
ATGGGATCCGCCACCATGGACTCAAGACCTCAGAAGATTTGGATGGCACCCTCCCTCACAGAATCAGACATGGACTATCATAAGATCCTCACCGCTGGGCTGTCTGTGCAGCAGGGAATCGTCCGGCAGCGCGTCATTCCCGTGTATCAGGTCAACAACCTGGAGGAAATTTGCCAGCTGATCATTCAGGCCTTCGAGGCTGGCGTGGATTTTCAGGAAAGCGCCGACTCCTTCCTGCTCATGCTGTGCCTCCACCATGCTTATCAGGGCGATTACAAGCTGTTCCTGGAGAGCGGAGCCGTGAAATACCTGGAGGGGCACGGTTTCCGATTTGAAGTGAAGAAACGGGACGGGGTCAAGCGCCTGGAGGAACTGCTCCCAGCTGTGAGCTCCGGCAAGAACATCAAAAGAACCCTGGCCGCTATGCCCGAGGAAGAGACCACAGAGGCAAATGCCGGCCAGTTCCTGTCTTTTGCAAGTCTGTTCCTCCCCAAGCTCGTGGTCGGAGAGAAGGCTTGCCTGGAAAAAGTGCAGAGACAGATCCAGGTCCACGCTGAGCAGGGCCTGATTCAGTATCCTACTGCATGGCAGAGCGTGGGACACATGATGGTCATTTTCCGACTCATGAGGACCAACTTCCTGATCAAGTTTCTGCTCATTCACCAGGGGATGCACATGGTGGCCGGTCACGATGCAAACGACGCCGTGATCTCCAATTCTGTCGCTCAGGCACGGTTTTCCGGGCTGCTCATCGTGAAGACCGTCCTGGACCACATTCTCCAGAAAACAGAGAGAGGTGTGCGGCTGCATCCTCTCGCTCGCACTGCAAAGGTGAAAAACGAGGTCAATAGTTTCAAGGCAGCCCTGTCTAGTCTCGCCAAACACGGCGAGTACGCCCCTTTTGCTAGGCTGCTCAACCTGAGCGGGGTGAACAATCTGGAGCACGGTCTCTTCCCACAGCTGTCTGCCATCGCTCTCGGAGTGGCAACTGCCCACGGCAGCACCCTGGCTGGAGTCAATGTGGGCGAGCAGTATCAGCAGCTGCGCGAAGCTGCAACAGAGGCAGAAAAGCAGCTCCAGCAGTACGCCGAGTCCCGAGAACTGGACCACCTGGGACTCGACGATCAGGAGAAGAAAATTCTGATGAACTTCCATCAGAAGAAAAATGAAATCTCTTTTCAGCAGACAAACGCTATGGTGACCCTGCGCAAGGAGCGACTGGCTAAACTCACCGAAGCAATTACAGCCGCTTCCCTGCCTAAGACCTCTGGGCACTATGACGATGACGATGACATCCCCTTCCCTGGGCCAATTAACGATGACGATAATCCAGGTCATCAGGACGATGACCCCACAGATTCACAGGACACTACCATCCCCGATGTGGTCGTGGACCCTGATGACGGCAGCTACGGAGAGTATCAGAGTTACTCAGAAAACGGCATGAATGCCCCAGATGACCTGGTGCTCTTTGATCTGGACGAGGATGACGAAGACACAAAGCCCGTCCCTAACAGAAGTACTAAAGGCGGACAGCAGAAGAACAGCCAGAAAGGCCAGCACATCGAGGGACGACAGACCCAGTCCAGGCCAATTCAGAACGTGCCAGGCCCCCATCGGACTATCCACCATGCTTCTGCACCCCTGACCGATAACGACAGGAGAAATGAGCCTAGCGGCAGCACCAGCCCTCGCATGCTGACACCAATCAACGAAGAGGCCGACCCCCTGGATGACGCTGATGACGAGACATCAAGCCTGCCCCCTCTCGAAAGCGATGACGAAGAGCAGGATAGAGACGGAACTTCCAATCGGACACCTACTGTGGCACCACCCGCCCCAGTCTATAGGGATCACTCCGAGAAGAAAGAACTGCCACAGGACGAGCAGCAGGATCAGGACCATACACAGGAAGCCAGAAACCAGGATAGTGACAATACTCAGTCAGAGCACAGCTTCGAAGAGATGTACAGGCATATCCTGAGATCACAGGGGCCATTTGATGCTGTGCTGTACTATCACATGATGAAGGACGAGCCCGTCGTGTTCAGTACTTCAGATGGTAAAGAATACACCTATCCTGACTCTCTCGAAGAGGAATACCCTCCCTGGCTGACCGAGAAGGAAGCCATGAACGAGGAAAATCGGTTTGTGACACTGGACGGACAGCAGTTCTATTGGCCCGTGATGAACCACAAAAACAAGTTTATGGCTATTCTCCAGCACCACCAGTGA(SEQ ID NO.:5)。
在本發明的優選地實施方式中，所述Fluc多肽的序列如下：
MLYEVMISEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQKCAAGANPILLLRQKHSD(SEQ ID NO.:8)；
其編碼核苷酸序列如下：
ATGCTATACGAAGTTATGATATCGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGGA ACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATTGCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGA(SEQ ID NO.:7)。
在本發明較佳地實施方式中，組成本發明的VLP的結構蛋白包含伊波拉病毒VP40多肽和伊波拉病毒GP多肽，並且在所述VLP內部包含有報告蛋白(優選為Fluc)；較佳地，為0.1～1：1～0.1，優選地摩爾比為0.15～0.5：1～0.1；更優選地摩爾比為0.15～0.3：1。本發明人發現，報告蛋白(如Fulc)和VP40的摩爾比只有在合適的範圍內，才能在感染細胞中檢測到報告蛋白的活性。
本發明還包括根據本發明VLP的衍生物和類似物。如本文所用，術語「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的VLP功能或活性的病毒樣顆粒。其可以是在構成本發明的VLP的多肽基礎上，(i)有一個或幾個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團，或(iii)與另一個化合物融合，或(iv)附加的胺基酸序列融合(與前導序列、分泌序列或6His等標籤序列融合)。根據本文的教導，這些衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
一類優選的活性衍生物指與構成VLP的各個多肽的胺基酸序列相比，有至多3個，較佳地至多2個，更佳地至多1個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。
表A
本發明還提供本發明VLP的類似物。這些類似物與本發明的VLP的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明涉及的多肽有相同的胺基酸序列的蛋白質片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼多肽的功能。
如本文所用，術語「引物」指的是在與模板配對，在DNA聚合酶的作用下能以其為起點進行合成與模板互補的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物「大致上」(或「基本上」)與模板上一條鏈上的一個特殊的序列互補。引物必須與模板上的一條鏈充分互補才能開始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補。比如，在一個3'端與模板互補的引物的5'端加上一段與模板不互補的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補。只要有足夠長的引物能與模板充分的結合，非完全互補的引物也可以與模板形成引物-模板複合物，從而進行擴增。
構成本發明VLP的各個多肽的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據已公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法被優選用於獲得本發明的基因。用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及多核苷酸的載體，這些多核苷酸的載體包含構成本發明VLP的多肽的多核苷酸，以及用本發明的載體經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述VLP的方法。
通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的載體可用來表達或生產本發明的VLP。一般來說有以下步驟：
(1).用編碼構成本發明VLP的各個蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體共轉染合適的宿主細胞(優選為293T細胞)；
(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；
(3).從培養基或細胞中分離、純化根據本發明的VLP。
在優選地實施方式中，在轉染過程中，編碼報告蛋白或其活性片段的質粒濃度≥0.1ug/(2×105個細胞)；優選地，≥0.5ug/(2×105個細胞)；更優選的，≥2.5ug/(2×105個細胞)；最優選地≥5ug/(2×105個細胞)。
在另一優選例中，在轉染過程中，編碼報告蛋白或其活性片段的質粒濃度≤50ug/(2×105個細胞)。
在另一優選例中，在轉染過程中，編碼VP40多肽或其活性片段的質粒濃度≥0.1ug/(2×105個細胞)；優選地，≥0.2ug/(2×105個細胞)；更優選的，≥0.5ug/(2×105個細胞)；最優選地≥1ug/(2×105個細胞)。
在另一優選例中，在轉染過程中，編碼VP40多肽或其活性片段的質粒濃度≤10ug/(2×105個細胞)。
經過研究，本發明人發現，在轉染過程中編碼報告蛋白的質粒濃度過低，會導致VLP感染細胞後無法檢測到報告蛋白的活性。而濃度過高，會降低感染效率，且顯著影響宿主細胞的VLP產量。而編碼VP40多肽的質粒濃度過低或過高均會影響宿主細胞的VLP產量，在一個優選地實施方式中，在轉染過程中，編碼報告蛋白或其活性片段的質粒濃度為約5ug/(2×105個細胞)、編碼VP40多肽的質粒濃度為約1ug/(2×105個細胞)、編碼GP多肽的質粒濃度為約1ug/(2×105個細胞)、編碼NP多肽的質粒濃度為約1ug/(2×105個細胞)。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含本發明蛋白(構成本發明VLP的各個多肽或其活性片段)的編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈黴菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、NS0、COS7、或293細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿 主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法：磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的獲得VLP可在細胞內或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化VLP。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於：常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
本發明的主要優點在於：
(1)首次構建了一種能夠感染細胞的基於EBOV以螢火蟲螢光素酶為報告基因的VLP，可以用作伊波拉病毒感染模型；
(2)本發明的VLP能夠通過感染進入細胞，並能夠將報告蛋白(如Fluc)導入細胞中，因此可根據細胞中Fluc的信號強度，對細胞感染進行定量。
(3)本發明的VLP具有與天然的伊波拉病毒類似的形態，更適宜用作伊波拉病毒的體內或體外研究。
(4)使用本發明的VLP的伊波拉病毒感染模型，同時適用於體外和體內感染實驗，容易操作，且成本較低，易於推廣應用。
(5)通過本發明的模型可以在BSL-4實驗室外進行EBOV疫苗和藥物的預評估，因此對於研發成本的節約和研究效率提高具有重大意義。
下面結合具體實施例，進一步詳陳本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明詳細條件的實驗方法，通常按照常規條件如美國Sambrook.J等著《分子克隆實驗室指南》(黃培堂等譯，北京：科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。
材料與方法
重組質粒的構建
根據之前公布的2014年從西非病人體內分離出來的毒株Zaire ebolavirus isolate H.sapiens-wt/GIN/2014/Gueckedou-C07(GenBank ID:KJ660347.2)序列，編碼EBOV VP40和GP蛋白的基因經密碼子優化併合成(南京金斯瑞公司)，VP40的基因序列如SEQ ID NO.:1所示，GP蛋白的基因序列如SEQ ID NO.:3所示；根據毒株Zaire ebolavirus isolate H.sapiens-tc/COD/1976/Yambuku-Mayinga(GenBank ID:NC_002549.1)的序列，合成編碼NP的基因(南京金斯瑞公司)，序列如SEQ ID NO.:5所示。上述基因分別插入哺乳動物表達載體pcDNA3.1(購自Thermo Fisher公司)上，構建質粒pcDNA-EBOV GP,pcDNA-EBOV VP40和pcDNA-EBOV NP。
利用PCR以pVSVG[5]為模版擴增VSVG的跨膜區(trans-membrane domain,TMD)和胞質尾區基因片段(cytoplasmic tail,CT)，所用引物如下:正向5』CGGATATCAAAAGCTCTATT 3』(SEQ ID NO.:9)；反向5』GCCTCGAGTCACTTTCCAAG3』(SEQ ID NO.:10)，利用EcoRV和XhoI對PCR片段進行雙酶切，將其插入載體pcDNA3.1-中，構建質粒pcDNA-VSVGTMD。利用PCR擴增EBOV GP片段，所用引物如下：正向5』GTGGAATTCGCCACCATGGGAGTGACCGGCATCCT GCAGCTG 3』(SEQ ID NO.:11)；反向5』GAGGATATCCTGGCGCCATCCGGTCCACCAGTTGTC 3』(SEQ ID NO.:12)，利用EcoRI和EcoRV對PCR片段和pcDNA-VSVGTMD分別雙酶切，回收後連接，構建質粒pcDNA-EBOV GP/VSVGTMD。
利用重疊PCR(overlap PCR)，構建GP點突變質粒pcDNA3.1-GP F88A,所用引物如下：片段1:正向5』CTGGCTAGCATGGGAGTGACCGGCATCCTGCAGC 3』(SEQ ID NO.:13),反向5』GCACTCCACTGCGAGCTCCCCAGCGCTTGGTGGCGG 3』(SEQ ID NO.:14)；片段2:正向5』CCAAGCGCTGGGGAGCTCGCAGTGGAGTGCCACCG3』(SEQ ID NO.:15)；反向5』GGGGGATCCT CAAAACACAAACTTG CAGATGC 3』(SEQ ID NO.:16)。對PCR片段進行NheI和BamHI雙酶切，裝入載體pcDNA3.1中，構建質粒pcDNA-GP F88A。
利用引物以Huh7.5.1細胞(購自中國科學院細胞庫)cDNA為模版擴增人NPC1基因片段(正向引物：5』cccgctagcATGACCGCTCGCGGCCTGGCCCTTGGC 3』(SEQ ID NO.:17)；反向引物：5』ggcggatccCTAGAAATTTAGAAGCCGTTCGCGCTCTG3』(SEQ ID NO.:18))，插入到表達質粒載體pcDNA3.1中，構建質粒pcDNA3.1-NPC1。
細胞系和抗體
293T,Huh-7.5.1，Vero，Hepa1-6,NIH3T3和L929等細胞系購自於中國科學院細胞庫或Thermo Fisher公司，培養於完全含有10％滅活胎牛血清(FBS,Gibco)和1％青黴素/鏈黴素(Gibco)的Dulbecco’s Modified Eagle’s培養基(DMEM,Gibco)中。
針對EBOV NP並偶聯辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)的單克隆抗體(該抗體的製備參考文獻：王曉杜,劉陽,王皓婷,等.伊波拉病毒NP蛋白的單克隆抗體製備及抗原肽的定位.生物工程學報,2012,28(11):1317-1327.)
針對EBOV VP40的多克隆血清由製備方法概述如下：用PCR方法擴增EBOV VP40基因，構建原核表達質粒並轉化大腸桿菌，誘導表達並純化VP40重組蛋白，免疫BALB/c小鼠，獲得多克隆抗體。
針對EBOV GP的單克隆抗體13C6和6D8利用已公布的相應抗體的序列[6]優化併合成(南京金斯瑞)13C6和6D8可變區基因，構建表達質粒，利用支化聚乙烯亞胺(branched Polyethylenimine,PEI；408727,Sigma-Aldrich)，將編碼重鏈和輕鏈的質粒共轉293T細胞，37℃培養4小時後，將培養基換為含有10μM丁酸鈉(Sodium butyrate)的DMEM,繼續培養8小時後，將培養基換 為FreeStyle 293(FS293,Gibco)，72小時後收穫上清，使用HiTrap rProtein A FF column(GE Healthcare)純化，獲得抗體。
EBOVLP的製備和感染實驗
為製備EBOVLP/Fluc，利用PEI將pcDNA-EBOV GP,pcDNA-EBOV VP40和pcDNA-EBOV NP以及pcDNA-Fluc共轉293T細胞(購自中國科學院細胞庫)，37℃培養4h後，將培養基換為含有10μM丁酸鈉的完全DMEM,繼續培養8h後，將培養基換為FS293，48小時後收穫上清並高速離心去除細胞碎片。利用同樣的方法製備EBOVLP/Fluc/GP-，即不含GP蛋白的VLP作為陰性對照。
EBOVLP感染實驗24h前，在96孔板中，每孔加入1×104個Vero或Huh7.5.1細胞。利用Western blot對上清VLP中所含VP40定量後，每孔加入含VP40150ng的VLP，孵育一定時間後，丟棄上清，用無菌PBS將孔中的細胞洗三遍，然後每孔加入50μl裂解液Cell culture lysis reagent(Promega,Madison,WI)裂解細胞，之後每孔加入30μl底物Luciferase substrate(Promega)，並利用VarioskanTMflash multimode reader測定Fluc的活性。
HIV/EBOVpv的製備和感染實驗
製備HIV/EBOVpv的方法如之前報導所述[1]。簡言之，利用PEI將pNL4-3.Luc.R-.E-[7]和pcDNA-EBOV GP共轉293T細胞，37℃培養4小時後，將培養基換為含有丁酸鈉的DMEM,繼續培養8小時後，將培養基換為FS293，48h後收穫上清並離心去除細胞碎片。在HIV/EBOVpv的感染實驗中，首先，利用ELISA測定上清的HIV p24水平，對HIV/EBOVpv進行定量，隨後感染預先鋪在96孔板中的細胞。於感染後72h利用上述方法測定Fluc的活性。
中和實驗
將一定量的HIV/EBOVpv或EBOVLP/Fluc與純化後的中和抗體混合，37℃孵育1h，隨後將抗原抗體混合物加入預先鋪在96孔板中的Vero細胞上，於感染後48-72h測定Fluc的活性。
蔗糖密度梯度純化
將EBOVLP表達質粒共轉293T細胞，收集轉染後24h，48h以及72h的上清，將上清置於25％的蔗糖墊上，27,000rpm超速離心3h。PBS重懸沉澱後用20％，30％，40％，50％，60％的蔗糖做不連續密度梯度離心，39,000rpm離心2h，收穫樣品，並利用ELISA和Western blot檢測樣品。最後收集EBOVLP富集的層數，置於25％的蔗糖墊上，27,000rpm離心3小時，PBS重懸沉澱。
SDS-PAGE和Western blot
將含有EBOVLP的蛋白樣品與SDS-PAGE上樣緩衝液混合，煮沸冷卻後加入已經配置好的10％聚丙烯醯胺膠上，進行電泳。電泳結束後，將凝膠放入考馬斯亮藍染液(R-250)中染色，染色結束後將凝膠放入脫色液中，脫色後分析結果。或者電泳結束後，將凝膠上的蛋白轉印到PVDF膜上，轉印完成後，用上述相應的VP40，NP和GP一抗進行孵育2h，隨後用1:5000稀釋的HRP標記的 山羊抗人IgG二抗(goat anti-human IgG-HRP,Sigma)室溫作用1h。最後加入適量ECL化學發光試劑為底物，LAS4000掃描分析儀(Fujifilm)獲取Western blot結果。
ELISA
將含有EBOVLP的蛋白樣品用PBS稀釋，加入ELISA板中，4℃包被過夜。PBST(含有0.05％Tween-2的PBS)洗板三次，隨後每孔加入100μl 5％脫脂牛奶37℃封閉1小時，PBST洗板三次；每孔加入稀釋後的13C6抗體50μl，37℃孵育2小時，PBST洗板三次；每孔加入1:5000稀釋的HRP標記的山羊抗人IgG二抗(goat anti-human IgG-HRP,Sigma)50μl，37℃孵育2小時，PBST洗板三次。之後每孔加入50μl的TMB顯色液，室溫放置5到10分鐘，最後每孔加入50μl的終止液(1M H3PO4)，終止顯色反應，將96孔板置於酶標儀中，讀取450nm的OD值。
電鏡檢測
將經過純化的EBOVLP和HIV/EBOVpv蛋白樣品置於碳包覆銅網上，用0.2％磷鎢酸負染後，置於Tecnai G2Spirit 120kV透射電鏡下觀察檢測。
小鼠感染和體內生物發光成像實驗
雌性6周齡BALB/c小鼠購於上海靈暢生物科技有限公司。通過尾靜脈注射，以2μg VP40的VLP(EBOVLP/Fluc或EBOVLP/Fluc/GP-)每隻小鼠的劑量進行感染。12小時後，對小鼠進行異氟醚吸入麻醉，並對每隻小鼠腹腔注射1.5mg的螢光素(Caliper Life Sciences)，將處理後的小鼠置於IVIS Lumina II platform(Caliper Life Sciences)上，測定體內生物發光強度。
小鼠中和抗體體內保護實驗
將純化後的中和抗體與2μg VP40的EBOVLP/Fluc混合，室溫孵育1h，隨後將抗原-抗體混合物通過尾靜脈注射感染小鼠。於感染後12h利用上述方法對小鼠體內生物發光進行檢測。
統計學分析
本研究中所有數據利用GraphPad Prism 5.0c(GraphPad Software,CA)軟體中student t test或one-way ANOVA進行顯著性差異分析。顯著性分析表示方法如下：ns P≥0.05,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.
實施例1 EBOVLP對報告基因蛋白的包裝
為了表達包含Fluc的EBOVLP(EBOVLP/Fluc)，本發明人構建了編碼Fluc，VP40，NP和GP的質粒(圖1A)，並以不同的組合方式將這些質粒共轉染293T細胞，通過Western blot檢測上清中VLP的表達。如圖1B所示，將編碼VP40，NP，GP和Fluc質粒的共同轉染細胞(lane 1)，三種病毒蛋白都在細胞中表達並且釋放到細胞上清中，並且在上清中檢測到了Fluc的活性；而單獨 表達Fluc時，Fluc無法分泌到上清中(lane 8)，這表明Fluc蛋白被成功的包裝到VLP中，並隨著VLP釋放到細胞外。由於VP40能夠單獨組裝成病毒樣顆粒，因此只要同時表達VP40和Fluc(lane 5)，無論是否與NP(lane 2)或GP(lane 3)共表達，Fluc都能被包裹到NP40的VLP中，使得上清中呈現很高的Fluc信號。相比之下，NP無法單獨組裝成VLP，因此當NP與Fluc共表達時，上清液中無Fluc信號(lane 6)。雖然在表達NP+GP(lane 4)和GP(lane 7)的上清中也檢測到了Fluc信號，但GP卻不能形成單獨VLP，因此這可能是由於GP具有細胞毒性，增加了細胞膜通透性而將部分Fluc釋放到上清中的緣故。
實施例2 EBOVLP通過感染將包裹在內的報告基因蛋白導入細胞
儘管單獨的VP40也可以將Flu包裹在VLP中，但是當本發明人用含有完整的顆粒EBOVLP/Fluc(lane 1)和缺少GP蛋白的顆粒EBOVLP/Fluc/GP-(lane 2)的上清感染細胞時，EBOVLP/Fluc能夠感染細胞並釋放Fluc進入細胞，導致細胞內Fluc信號在感染6h後達到高峰，而EBOVLP/Fluc/GP-由於缺少GP蛋白而不具備感染性(圖1C)。雖然釋放到細胞中的Fluc在6h後被迅速降解，但在感染48h和72h後，EBOVLP/Fluc感染的細胞內仍然可檢測到明顯的Fluc信號，與EBOVLP/Fluc/GP-感染的細胞呈現顯著差異。
隨後本發明人檢測了轉染後293T細胞內Fluc的活性，希望以此判定包裝細胞中表達Fluc的量與感染靶細胞後產生的Fluc信號的關係。圖1D-E實驗結果表明，隨著包裝EBOVLP/Fluc時轉染的Fluc質粒的減少，包裝細胞中Fluc的產量也隨之減少，從而造成感染靶細胞時的信號也減少；當包裝細胞中Fluc的活性小於106時(0.05μg Fluc質粒/(2×105個細胞))(圖1D)，此時產生的EBOVLP/Fluc用來感染靶細胞就已經無法產生可見的信號(圖1E)。該結果表明可用於感染靶細胞的EBOVLP/Fluc需要在包裝過程中有大量報告基因蛋白Fluc的表達。
本發明人也將其他胞內蛋白，如報告基因Renilla luciferase(Rluc)(圖1F)或人幹擾素調節因子-3(Interferon regulatory Factor 3,IRF-3)(圖1G-H)與VP40、GP和NP共同表達，這些蛋白都能隨著VP40一同組裝成顆粒，並具有進一步感染其他細胞的能力。EBOVLP/Rluc對子代細胞的感染與EBOVLP/Fluc基本一致(圖1F)；儘管無論有沒有GP存在的情況下，IRF-3都可以釋放到上清中(圖1G)，然而用收集的上清感染Vero細胞之後，只有完整的含有所有GP,VP40,NP和IRF-3蛋白的顆粒EBOVLP/IRF3才能將包含在其中的IRF-3傳遞到靶細胞中(圖1H)。本發明人推測這是由於EBOVLP本身顆粒較大，能夠包裹較多其他胞內蛋白的原因。這一高載量的特性，使得EBOVLP將來可能能夠作為一種載體，在細胞水平上傳遞蛋白。
Fluc的活性的檢測方法如下：細胞在被感染相應時間後，丟棄上清，用無菌PBS將孔中的細胞洗三遍，然後每孔加入50μl裂解液Cell culture lysis reagent(Promega,Madison,WI)裂解細胞，之後每孔加入30μl底物Luciferase substrate(Promega)，並利用VarioskanTMflash multimode reader測定Fluc的活性的讀值。
實施例3 EBOVLP依賴具有完整功能的GP進入細胞
為了確定EBOVLP進入細胞是否依賴於GP，本發明人構建了編碼不同包膜 糖蛋白的質粒(圖2A)：一個是野生型EBOV GP基因，一個是之前報導的進入細胞能力減弱的GP F88A突變基因[3]，一個是作為陽性對照的水皰口炎病毒G蛋白(vesicular stomatitis virus glycoprotein G,VSVG)基因，以及EBOV GP與VSVG的嵌合基因，其中GP的跨膜結構域(transmembrane domain,TMD)被VSVG的TMD取代，使GP定位在細胞膜上，本發明人給該基因命名為GP/VSVGTMD。同時，本發明人根據先前的報導，構建了HIV為骨架的EBOV慢病毒(HIV/EBOVpv)作為參考，即通過將慢病毒載體pNL4-3.Luc.E-R-與編碼EBOV GP的質粒共轉細胞，表達得到帶有EBOV GP的重組慢病毒。
首先，由於EBOVGP定位於細胞內質網(ER)，本發明人推測，定位於細胞膜的GP可能將更多的與VP40/NP顆粒結合，從而更具傳染性。為了驗證這個假設，本發明人表達了承載著以上四種不同的糖蛋白的EBOVLP/Fluc或HIV/EBOVpv，並用其感染天然細胞。如圖2B所示，野生型GP可以使EBOVLP/Fluc和HIV/EBOVpv獲得感染細胞的能力，從而分別通過蛋白傳遞和基因組整合的形式，使得被感染細胞中檢測到Fluc活性，而不帶GP的對照組EBOVLP/Fluc/GP-感染的細胞中則無信號或信號極弱。該結果表明EBOVLP/Fluc和HIV/EBOVpv EBOV的感染性都是GP依賴的。令本發明人吃驚的是，雖然以VSVG為包膜蛋白的VLP和假病毒都更具感染性，但以嵌合蛋白GP/VSVGTMD為包膜蛋白時，無論VLP還是假病毒都無法感染細胞(圖2B)，這提示本發明人，EBOV GP的TMD對於GP介導的細胞進入功能十分重要，而當本發明人將GP的TMD替換為VSVG的TMD後，破壞了其原有的功能或影響到了GP蛋白膜外區的構象。
其次，為了進一步探討EBOVLP/Fluc進入細胞是否是通過GP與受體結合介導的，本發明人在GP上引入了一個以前報導過的導致進入細胞功能減弱的突變F88A，這個突變會破壞GP與受體人Niemann-Pick C1(NPC1)的結合，而病毒主要是通過GP與NCP1的結合而進入細胞的。雖然野生型GP與GP F88A都在293T細胞中表達，但帶有GP F88A的VLP感染細胞後，幾乎檢測不到Fluc活性，顯著低於帶有野生型GP的VLP(圖2C)，這說明破壞GP與受體的結合能力能夠破壞VLP進入細胞。此外，在人NPC1過表達的293T細胞上，EBOVLP/Fluc的感染性顯著增強，而不帶GP的對照組EBOVLP/Fluc/GP-不論是在NPC1還是GFP過度表達的細胞上，都沒有感染性(圖2D)。這些結果表明，EBOVLP進入細胞依賴於GP-NCP1之間的結合，這與天然環境中EBOV進入細胞的過程一致。
實施例4 EBOVLP/Fluc的鑑定與定量
為了驗證EBOVLP/Fluc是否形成正確的形態，本發明人通過25％的蔗糖墊濃縮上清，並通過20％-60％的蔗糖密度梯度離心進行分析鑑定。純化後的EBOVLP/Fluc，其GP,NP和VP40都集中於特定的幾層，主要是4-9層(圖3A)，表明EBOVLP/Fluc組裝成了病毒樣顆粒。本發明人驚奇地發現，不僅螢光素酶Fluc，有少量編碼Fluc的質粒同樣與GP，NP和VP40降到了相同的層中，說明EBOVLP/Fluc裝配過程中，不僅將Fluc蛋白，而且將Fluc的質粒也包裝在了顆粒中。接下來，為了檢測EBOVLP/Fluc的組分，本發明人收穫了GP、NP、VP40較多，且Fluc酶活性高峰值處的層數(4-9層)進行SDS-PAGE分析；通過考馬斯亮藍染色可以清晰地看出GP，NP，VP40和Fluc的條帶(圖3B)，並通過 ImageJ軟體定量，得出Fluc與VP40的質量比例為0.257，摩爾數比例為0.171。最後，為了確定EBOVLP/Fluc的形態特徵，本發明人將EBOVLP/Fluc樣品進行負染，通過電子顯微鏡觀察，並與HIVpv/GP進行比較。如圖3C所示，EBOVLP/Fluc呈現直徑100nm左右、長度超過1μm典型的絲狀顆粒，而HIVpv/GP要小得多，是直徑～100nm的球形顆粒。這些結果證實了EBOVLP/Fluc與天然EBOV的形態相似。
為了建立體外和體內的感染系統，本發明人開發了針對EBOVLP/Fluc的Western blot定量方法，這個方法利用在大腸桿菌中表達的重組VP40為參考標準，抗VP40小鼠血清作為檢測抗體。如圖4所示，這個方法，VP40的最低檢測限為2ng；標準曲線的線性範圍在2–8ng VP40時的相關係數(R2)為0.993。利用這個方法，本發明人檢測出EBOVLP/Fluc表達質粒轉染293T細胞48小時後，上清中VP40的表達量為0.13ng/μl。並且重複實驗三次，所得到的結果相似。通過這個量化標準，可以確定感染實驗中EBOVLP的量。該定量方法類似於在HIV的臨床檢測或實驗中，通過測量p24Gag的量來定量HIV或HIVpv的經典方法[4]。
實施例5 EBOVLP/Fluc的小鼠感染實驗
EBOV動物感染實驗被嚴格限制在BSL-4實驗室，因此本發明人希望利用EBOVLP/Fluc感染小鼠，從而將Fluc運輸到小鼠細胞中，通過活體成像的方法對感染進行定量，以此作為一個非複製型、單輪感染的EBOV感染模型。由於之前的實驗一直是在猴或人細胞上進行，因此本發明人首先探究了EBOVLP/Fluc在體外對小鼠細胞的感染能力。如圖5A所示，EBOVLP/Fluc顯示出了廣泛的細胞嗜性，三種小鼠細胞系Hepa1-6,NIH3T3和L929(細胞均購自購自中國科學院細胞庫)都能被其感染。接下來，本發明人通過尾靜脈注射，用含有2μg VP40的EBOVLP/Fluc(或EBOVLP/Fluc/GP-)感染BALB/c小鼠。感染12h後，本發明人將小鼠肝細胞分離並檢測細胞中Fluc活性。與體外感染一致，EBOVLP/Fluc成功地將Fluc導入肝細胞，而EBOVLP/Fluc/GP-則因缺乏包膜蛋白未能感染小鼠肝細胞(圖5B)。更重要的是，EBOVLP/Fluc感染的小鼠產生很強的生物發光信號，比EBOVLP/Fluc/GP-感染的小鼠高2-log，這表明在小鼠體內EBOVLP/Fluc的感染也是依賴於GP的。以上數據表明這種非複製型的EBOV感染動物模型的成功建立。
實施例6 EBOVLP/Fluc作為體外和體內感染模型對中和抗體進行評價
為了驗證EBOVLP/Fluc可作為感染模型在體外和體內對伊波拉病毒中和抗體進行評價，本發明人表達並純化了13C6和6D8兩種之前報導過的EBOV中和抗體，通過體外中和實驗和體內螢光成像實驗對該模型進行了驗證。從圖6A可以看出，與假病毒系統HIV/EBOVpv一樣，EBOVLP/Fluc也能在體外被13C6和6D8兩種抗體中和，並呈現抗體劑量依賴性，而無法被對照抗體柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus Group A Type16,CVA16)中和抗體9B5所中和。本發明人進一步在小鼠模型中進行驗證，將EBOVLP/Fluc與不同劑量(200μg，20μg)的13C6抗體孵育後，將VLP-抗體混合物通過尾靜脈注射感染BALB/c小鼠，感染後12h，將小鼠置於活體成像儀中測定體內生物發光讀數。如圖6B所 示，與對照抗體9B5相比，抗體13C6在體內中和了EBOVLP/Fluc對肝臟細胞的侵入，顯示出了顯著減少(p＝0.0155)的肝臟區域螢光強度(圖6C)。
討論
儘管2013年到2015年西非伊波拉出血熱的大爆發已經得到了控制，但此次疫情引起了全世界對EBOV高度的重視和警覺，使得EBOV疫苗/藥物的開發刻不容緩。但是必要的評估工具的缺乏，即體外和體內的EBOV感染模型，已經大大阻礙了疫苗和藥物的研究進展。一方面，EBOV感染實驗，無論是細胞培養還是動物實驗都需要在BSL-4設施中進行，而絕大部分的科研機構都無法滿足這一硬體要求。另一方面，體外感染模型的替代品，如以慢病毒為基礎的假病毒，rVSV，或β內醯胺酶融合的VLP，要麼形態與真實病毒相差甚遠，要麼過於昂貴難以被廣泛推廣應用。而據本發明人所知，目前尚沒有可以在BSL-4之外操作的EBOV動物感染模型。因此在本研究中，本發明人開發了一種基於VLP的、適用於體外和體內的新型EBOV感染模型。
本發明人也曾將Fluc與VP40融合表達，期望能夠產生衣殼表面帶有報告基因的VLP，試驗結果表明，雖然Fluc-VP40形成了VLP,但是Fluc卻沒有活性。因此本發明人轉變策略，將Fluc與VP40共表達，Fluc會隨VP40在細胞中組裝成顆粒(被包裹在VLP內部)並且釋放到胞外(圖1B)，而將Fluc與GP共表達，也會導致Fluc釋放到胞外，這是由於GP具有的毒性會導致細胞通透性改變而使Fluc釋放。但是，只有攜帶GP的VLP才能夠通過感染的方式將Fluc呈遞入Vero細胞中(圖1C)，這表明該EBOVLP的感染具有GP依賴性。圖2能夠進一步的證明這個觀點，突變體F88A GP進入細胞功能的減弱，在很大程度上減弱了VLP的感染性，而EBOV受體NPC1過表達的細胞更容易被EBOVLP感染(圖2C和2D)。EBOVLP/Fluc依賴GP進入細胞的特點，使其十分適合作為篩選針對GP的中和抗體和進入抑制劑的工具。
目前，已經建立了基於生物發光成像的HIV、登革熱病毒和C型肝炎病毒的動物感染模型。在本研究中，本發明人證明EBOVLP可用作一種安全、有效和經濟的模仿EBOV感染動物的工具。當本發明人用EBOVLP/Fluc從尾靜脈感染小鼠時，它通過尾靜脈經後腔靜脈到達肝臟，從而造成了肝臟中的生物發光(圖5C)，這可能是由於EBOVLP進入了肝內皮細胞，因為EBOV主要感染內皮細胞。經過體外中和實驗(圖6A)以及體內保護實驗(圖6B-C)的驗證，該模型能夠有效地對伊波拉病毒中和抗體進行評價。這是首次在BSL-4實驗室外建立的EBOV動物感染模型。
綜上所述，本發明人開發出的新型EBOV感染模型基於EBOVLP的兩個特性：第一，進入細胞的過程依賴與GP蛋白介導，第二，在進入細胞後能夠將Fluc導入細胞中。該模型同時適用於體外和體內感染實驗，容易操作，且成本較低，易於推廣應用。通過該系統可以在BSL-4實驗室外進行EBOV疫苗和藥物的預評估，因此對於研發成本的節約和研究效率提高具有重大意義。並且EBOV所屬的絲狀病毒科中僅有兩個成員，即伊波拉病毒屬和馬爾堡病毒屬，這些病毒的結構相似。因此，本發明人的研究能夠為絲狀病毒科其他病毒感染模型的建立提供一定的指導。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
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