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癌症檢測試劑以及在病理學和診斷學及癌細胞死亡中的用途的製作方法

2023-10-29 11:48:22 4


專利名稱：：癌症檢測試劑以及在病理學和診斷學及癌細胞死亡中的用途的製作方法
技術領域：
：本發明的實施方案涉及癌症病理學和治療，具體地，涉及基於病理學的診斷學和治療學，它們利用個體化的遺傳i普分析(geneticprofiling)。背景當體內細胞功能障礙並且開始不受控制地生長時產生癌症。這些功能障礙由細胞DNA藍圖(blueprint)中的突變引起。因此，儘管早年間癌症診斷關注可疑癌細胞的生長性質和物理外觀，但更現代的技術已開始檢查細胞的內部運轉。不是所有的癌症都由相同的突變引起。對引起癌症的特定突變有作用的一些治療對具有其它類型突變的癌症不起作用，並且如果不適當地開處方實際上可能產生更多損害。因此，至關重要的是區別不同類型癌症的癌症診斷能力與治療不同類型癌症的能力適當同步。當前的診斷方法正努力配合新療法發展的速度。當前癌症診斷方法的另一個問題為需要組織樣品進行分析。所有目前成功的癌症診斷方法(除了純粹的成像)，需要從患者身體取出癌細胞。這些細胞最通常獲自組織活檢。雖然組織活檢有效，但其昂貴、耗時，並且對患者是痛苦的。另外，安排和獲得組織活檢物，隨後分析而需要的時間造成治療耽誤，並且活檢過程本身可能將癌細胞釋放進入血流中，引起增加的轉移。雖然這些手術後檢驗對於指導患者進一步的治療仍然有效，但如可預先確定胂瘤的性質，可能更加可行的是在患者經受手術的嚴酷之前嘗試非侵入性治療，如化療。即使需要手術，患者仍然可能受益於更詳細的手術前診斷。所述診斷可能例如允許手術前用所設計藥物治療以將手術期間從腫瘤移出的癌細胞轉移性播散的機率減到最低程度。其還可能提供對於手術技術更大的指導，如腫瘤周圍多少組織要除去。目前，基於細胞的最成功的診斷方法中的一些利用非活檢樣品。例如，PAP塗片尋找細胞的不規則性，但其利用由身體正常脫落的細胞。PAP塗片允許在變為宮頸癌的過程中容易地且非常早期地進行細胞檢測，從而每年持續挽救數以千計的生命。由於與活檢有關的問題以及更簡單方法(如PAP塗片)的成功，醫學界已花費數年利用另外的容易獲得的樣品，即血液，尤其是外周血尋找癌症的診斷法。他們的努力已獲得一定的成功。例如，利用血液檢驗容易地監測前列腺癌的進展或復發。然而，當前的基於血液的癌症診斷法，如前列腺癌檢驗，仍維持關注特定類型的癌症。仍需要對能利用血液i貪斷多種癌症或一^:性癌症的癌症i貪斷法。除基於組織的癌症診斷法之外，大多數診斷方法依賴成像技術，從簡單的X線至MRI以及核成像，常常利用耙向癌症或耙向組織的造影劑以產生更好的圖像。然而，即使最有效的成像技術也無法檢測小於大約2-5mm直徑的肺瘤。等到肺瘤已達到該大小時，其包含數以千計的細胞。此外，這些精密的成像技術太昂貴，而不能在癌症早期應用，即不能在當患者除了可很容易除去的小腫瘤外沒有其它症狀時應用。事實上，複雜的成像診斷法最常見用於已具有大原發腫瘤並且疑似具有發展的轉移性癌症的患者。檢測的小腫瘤實際上是由於癌症已播散而轉移產生的。因此，不同於常常包含許多良性細胞的原發腫瘤，檢測的小腫瘤包含數以千計的惡性、轉移性細胞，每個能在體內別處種植另一個肺瘤。明顯地，通過當前成像技術的小轉移性腫瘤檢測確實是挽救垂危患者的最後的努力。如果這些轉移性細胞可更早檢測，如當它們首先開始經過血液傳遞時，則患者可針對其可能患有的所有轉移性肺瘤開始接受治療，儘管那些腫瘤仍然太小而不能通過診斷顯象或任何其它的當前技術檢測。因此存在對轉移性胂瘤的更早診斷或對轉移性肺瘤很大增加可能性進行檢測的需求。然而現代癌症診斷中的另一個缺點涉及其與治療聯合的能力。雖然可通過組織樣品診斷一些常見的突變，並用其指導對患者癌症類型的一定程度上特異性的治療，但該方法只適用少數癌症類型。目前沒有診斷方法能檢測各種各樣類型的癌症或提供用於治療許多類型癌症的詳細靶。最後，當前的癌症診斷法，尤其那些依賴組織活檢的那些，在監測進展或治療有效性方面非常差。如果治療醫師能知道什麼時候所有或相當大數目癌細胞或特定類型的癌細胞已經根除，則可挽回數千美元並且可能甚至是患者的生命。另外，通過其性質，癌細胞能夠非常迅速地變化。因此，其甚至可以進一步在治療期間突變，造成一度有用的藥物變成無效的或有害的。基本上，癌細胞可變得對藥物耐受，就像細菌變得對抗生素耐受一樣。癌症治療將從能檢測顯示治療有效性或患者癌細胞更進一步突變的這些和其它變化的診斷方法大大受益。癌症治療最通常依賴於單個突變、基因和蛋白。隨著一種治療的有效性逐漸消退，給予另一種治療。該方法的兩個缺點是沒有一種治療能夠足夠耙向癌細胞從而根除疾病，並且每個癌症受試者具有獨特的一組突變或其它異常，這使得任何一種治療都不能針對癌症患者的整個群體。理想的是強效癌症治療，其單獨針對每個癌症受試者，然後表現出殺死個體的全部或大多數癌細胞，而不影響他們的健康細胞的足夠效能。為了實現此目標，必須能夠對癌症受試者的遺傳、突變個體性進行譜分析，然後迅速與個體化的藥物反應，從而攻擊適合鑑定的譜的那些細胞。概述本發明的實施方案涉及具有特定序列的短的分離的核酸，其長度是至少17個鹼基，稱作癌症檢測試劑。癌症4企測試劑也包括分離的核酸，其具有與本說明書中公開的任何序列互補的序列。本發明的實施方案也涉及在癌症診斷學，特別是基於病理學的診斷學中使用這些核酸的方法。其它方法涉及癌症^r測試劑的抗癌用途，例如殺死癌細力包、i秀導身體殺死癌細胞，或阻礙癌細胞生長，特別是通過誘導癌細胞的耙向的死亡。儘管在很多實施方案中將使用一種以上的癌症檢測試劑，在某些實6施方案中，使用的"癌症檢測試劑"可能實際上僅僅是單個分離的核酸。此外，本說明書中使用的"受試者"可以包括整個動物，如人、器官、組織、肺瘤、血液、一組細胞，或甚至單個細月包。癌症一全測試劑可以單獨或組合用於確定受試者的癌症i普(cancerprofile)。這些癌症^f全測試劑可以用在多種來自受試者的樣品上，包括傳統胂瘤活4企物以及外周血或其它血液。癌症才企測試劑可以用於才全測癌症、確定癌症分期，或監測癌症或其治療的過程。此外，採用癌症檢測試劑進行的測試可以用於提供癌症譜，其顯示存在於受試者內的一個或多個轉移性癌細胞中的一些突變或異常。受試者中特定癌症檢測試劑或癌症檢測試劑的組合的存在或缺乏，可以表明應該或不應該給受試者施用各種療法，包括含有或基於癌症治療試劑的療法。可以基於例如上文描述的診斷結果，選擇癌症檢測試劑的抗癌用途。但是，也可以基於完全或部分不依賴於採用癌症檢測試劑的檢測的其它臨床指標採用抗癌用途。抗癌用途可以包括基於由癌症檢測試劑編碼的肽的抗體治療或基於核酸的治療。抗癌用途可以與診斷性監測結合，所述診斷性監測用於檢測受試者中新癌症檢測試劑的出現，或受試者中舊癌症才全測試劑的消失。所述出現和消失可保證癌症一全測試劑的相應改變或給受試者施用其它療法。抗癌用途可以包括誘導受試者中靶向的癌症細胞死亡。靶向的細胞死亡的誘導可以體外或體內發生。耙向的細胞死亡的體外誘導可以是診斷方法或組合的i貪斷和治療方法的一部分。在整個動物受試者中，抗癌方法可以導致一個或多個胂瘤大小的減少，增加其它抗癌試劑起作用的時間，或破壞癌細胞，特別是少量細胞，如可能在手術後保留或形成用常規技術不能檢測到的d、轉移灶的那些細胞。即使通過一些治療不能到達肺瘤，血液中的轉移細胞可以一皮破壞，阻礙癌症未來的播散。因此，本發明的某些實施方案可以滿足以下目的，並且提供以下優點僅僅採用受試者的血樣構建受試者癌症的個體的、遺傳性癌症語；利用個體的、遺傳性癌症譜作為用於規定存在的癌症治療的先驅；利用個體的、遺傳性癌症譜來促進新的、個體化的、癌症細胞耙向治療的發展。附圖簡述參照以下詳述，結合附圖，可以更好地理解本發明，所述附圖舉例說明了本發明的多種實施方案。圖1舉例說明了片全測癌症片全測試劑的方法。圖2舉例說明了各個癌症檢測試劑和癌症類型之間的關聯。圖3舉例說明了採用癌症檢測試劑進行PCR縮減(PCRReduction)的方法。圖4舉例i兌明了血液測試和癌症i普分析的方法。詳述本發明的實施方案涉及由具有相應於癌症相關突變的序列的短的分離核酸組成的癌症才全測試劑。癌症才企測試劑可以包括具有與突變mRNA的序列相同的序列和互補序列的核酸。但是，兩條互補核酸鏈都不是本發明的所有方面所必須的。在一些方面，將僅僅使用互補核酸中的一個或另一個。用作每種應用的特異性癌症檢測試劑的合適核酸鏈是本領域技術人員可以明確的。這些癌症檢測試劑可以用於診斷轉移性癌症，特別是基於病理學的診斷，包括最初的i貪斷以及治療和疾病進展監測，並且也包括監測革巴向的癌細力包死亡。採用私有軟體和來自公共資料庫的信息分離癌症檢測試劑序列，所述資料庫記錄關於癌症和健康細胞和組織的遺傳信息。具體地，採用私有軟體和超級計算機，將來自癌細胞系的mRNA數據的隨機部分與可以從所有健康細胞系獲得的所有mRNA數據進行比較，如圖l所圖示。得到的資料庫稱作癌症檢測試劑序列超集合(hyperset),其含有數十萬種癌症檢測試劑(長度是17聚體或更長)的序列，根據每種癌症類型分組為超集合。超集合中每種癌症檢測試劑在相應於超集合的癌症類型的癌細胞系中至少發現一次。在超集合中存在冗餘，因為癌症檢測試劑序列出現在很多不同癌症類型的超集合中。總癌症超集合中的癌症檢測試劑序列的總數可以增加。隨著新癌症出現，可以產生新的癌症檢測試劑。基於目前可以獲得的數據，已知單個類型的癌症的超集合可以含有數萬種癌症檢測試劑。用於分離含有癌症4企測試劑的mRNA分子的細胞系來源於患有癌症的人受試者。因此，可以將這些細胞系計數為癌症檢測試劑在人類中的過去的出現。這產生了用於將每種癌症檢測試劑出現的可能性排序的簡單方法，該方法基於其在癌細胞系中過去的出現率。癌症檢測試劑通常是小的，因此，不適合基因組作圖。但是，可以對含有未分離的癌症才全測試劑的mRNA分子作圖。以此方式，可以確定哪些基因與每種癌症檢測試劑相關。很多基因可以與每種癌症試劑相關-基因的數目通常與含有每種癌症檢測試劑的獨特mRNA分子的數目成正比。有時，數百種mRNA分子含有癌症檢測試劑，產生4艮多作圖的基因。這在表l中是明顯的。表l列出了癌症才企測試劑和一些相關的癌症，以及一些其它相關信息，如PCR退火溫度和基因/染色體定位信息。這些癌症檢測試劑可能包括SNPs,-f旦也包括適於診斷和耙向的癌症細胞死亡用途的更長突變。儘管艮多癌症檢測試劑序列位於沒有目前已知的與癌症的相關性的基因中，一些檢測試劑位於已知在癌症中重要的基因中。這些基因通常代表SNPs、隱匿剪接和其它遺傳缺陷。癌症檢測試劑可能對於很多基因和很多癌症是共有的。這並不表示每種癌症4全測試劑將存在於每種癌症細月包系或癌症受試者中。考慮到產生公共數據的方式，將預期癌症檢測試劑和癌細胞系之間共有性的較多機會和一致性，或缺乏所述機會和一致性。預期每個癌症受試者具有含一個子集的癌症檢測試劑的mRNA,其構成個體癌症譜，並且鑑定哪些基因可以在該個體中突變。但是，可能的是，採用足夠大的受試者庫，在不同受試者之間可能觀察到相同的癌症譜，然而不能預期所述庫中的每個受試者都具有相同的癌症傳。癌症中的個體化程度不是明確理解的。但是，個體性似乎與癌症類型相關，如圖2所示。癌症檢測試劑超集合可能構成癌症細胞專有的長度為17聚體或更長的所有mRNA分子。然後，每種癌症類型具有相應的癌症檢測試劑超集合，並且每個癌症受試者具有癌症檢測試劑子集，所述子集對於他們的個體癌症譜是同義的。由於表1顯示了癌症檢測試劑的超集合，人們不應該預期在單個癌症受試者發現所有這些癌症檢測試劑，儘管這並不是不可能的。相反，表l的檢測試劑或其組合可以用於產生特定受試者的癌症的癌症譜。通過引入大量癌症檢測試劑，可以建立更完整的癌症譜。此外，關於受試者的mRNA中不存在哪些檢測試劑序列的了解，對於診斷，包括預後，以及癌症進展和治療監測是非常有用的。例如，它可以用於選擇受試者的治療。在各種實施方案中，可以用l種或更多、5種或更多、IO種或更多、20種或更多、50種或更多、IOO種或更多、500種或更多，或1000種或更多不同的癌症片企測試劑產生癌症i普。用於建立癌症i普的癌症衝全測試劑可以基於特定標準選擇，例如癌症中出現的總體頻率，或以前在特定癌症類型中的出現。癌症4全測試劑可以用於測試實際患者的腫瘤或血液組織。例如，可以用PCR、^微陣列或晶片4支術進^t測試。一旦發現癌症片全測試劑存在於患者中，可以選擇那些試劑，用於治療患者或指導治療。基於PCR的樣品分析提供了檢測受試者癌症中癌症檢測試劑存在的有力的和迅速的手段。採用基於癌症檢測試劑的擴增引物的PCR分析使得能夠用小量起始材料進行分析，並且使得能夠同時檢測多種癌症檢測試劑。採用基於癌症檢測試劑序列的單個PCR引物的線性PCR擴增使得能夠進行基因表達水平的定量。傳統PCR擴增位於5'和3，引物之間的一組核酸區域。由於採用5，和3，引物這兩者，新建立的核酸鏈可以在下一輪中作為模板。所有引物和PCR條件在擴增時不是相同有效的，因此，一些引物相對於其它引物，以更高速度產生新模板。該效果與新鏈作為模板的能力組合，導致當使用不同的引物時，具有擴增序列的各個核酸鏈的數目具有顯著差異。該差異與引物和PCR-條件效率而不是最初樣品中可獲得的模板鏈的實際數目相關。採用改進類型的PCR,在本文中稱作"PCR縮減"，可以獲得給定樣品中含有不同癌症檢測試劑序列的mRNA分子數目的更準確比4支。採用該方法，僅僅提供5，引物。這些引物能夠與最初的模板核酸雜交，但不與作為PCR過程的一部分而產生的任何鏈雜交，因為所述鏈含有與5，引物相同而不是互補的序列。由於僅有最初的模板核酸可以作為PCR反應的模板，因此引物或PCR效率導致的不同癌症檢測試劑序列拷貝數目的差異不是那麼明顯。拷貝數目與最初模板的實際數目具有緊密得多的關聯。在PCR縮減中，直到聚合酶從模板鏈掉下時才發生聚合。這容易在5，引物後留下拖尾端(trailingend)。這些拖尾端某種程度上長度不同，但通常所有都在引物的幾百個鹼基對內終止。因此，通過在凝膠上電泳為單個、但略^^糊的條帶，可以分辨所有PCR反應產物。PCR縮減方法的一個實例示於圖3。儘管單獨擴增癌症檢測試劑可能在本發明的一些實施方案中是有用的，但在上文描述的PCR縮減技術中，拖尾端使得能夠進行容易的基於凝膠的檢測，而用單獨的小的癌症檢測試劑不能容易地實現所述檢測。如果樣品中不存在癌症檢測試劑序列，則引物不具有沖莫板，並且在電泳後在預期的位置不出現條帶。另一方面，如果存在癌症^f企測試劑序列，則存在模糊的條帶。可以用常規技術分析該條帶的強度，從而估計含有每種檢測試劑序列的樣品中的相對模板豐度。癌症組織樣品和活檢物通常來自單個肺瘤，即使當存在多個肺瘤時也是如此。在癌症的早期階段，大多數癌細胞都是親本胂瘤的子代，並且通常與腫瘤中的細胞具有相同的突變。但是，轉移性癌細胞通常具有不同的突變。此外，轉移性腫瘤即使最初是相似的，也遵循不同的發育途徑，並且可能隨時間積累不同的額外突變。最終，公知的是^f艮多癌症治療導致癌細胞的進一步突變。因此，癌症較晚階段中的癌細胞通常與早期階段的那些不具有相同的突變。突變的變異在同一個體的轉移性腫瘤中也是常見的。由於腫瘤傾向於具有個體突變，認為從單個腫瘤採集的受試者組織樣品不太可能含有受試者癌症的所有癌症突變。因此，採用常規方法獲得的受試者身體中所有或大多數突變的譜通常需要來自多個腫瘤的樣品。相反，在本發明的實施方案中，採用血液作為樣品，在單個樣品中可以檢測所有或大多數突變，因為血液含有來自多個胂瘤的細胞。此外，血樣可能甚至含有來自用常規技術檢測不到的小的轉移性腫瘤的細胞。通常可以設計本發明的癌症4企測試劑，用於檢測癌細月包而不是特定腫瘤所專有的突變。已經顯示，癌症4企測試劑可以;險測在血液中循環的細胞中的癌症突變。因此，可以預期腫瘤組織樣品和來自同一受試者的血樣之間的PCR縮減測試可以顯示血液中數目增加的突變。實際上，來自單獨的組織樣品的任何癌症譜都可能比不上血樣，因為組織癌症語實ii際上是來自單個活檢腫瘤，而不是受試者總體癌症的譜。癌症;f企測試劑代表了一類特殊的癌症突變_即具有癌細胞專有的核酸內容的突變。如果不存在所述專有性，則突變將不認為是癌症檢測試劑，如圖1所示。選擇癌症檢測試劑的該條件產生了在檢測癌細胞遺傳學差異中有用的試劑。沒有所述差異，則很難或不可能耙向癌細胞同時避免健康細胞。這是用於診斷和治療癌症的重要標準。可以用血樣和本文描述的方法建立其它受試者的癌症譜。圖4說明了一種所述示例性方法的步驟。在大多數情況下，可以在從受試者獲得血樣後幾小時到幾天內獲得癌症譜。由於大多數癌症檢測試劑與一組基因相關，人們可以迅速確定哪組基因在受試者的癌症中以癌細胞專有的方式突變。任何隨後的治療都可以利用該遺傳信息進行特異性癌細胞靶向。遺憾的是，大多數現有療法不具有該類輩巴向能力。因此，本發明的血液測試也可以是新療法的先驅測試，所述療法可以利用癌症4企測試劑進行特異性癌細胞靶向。在本發明的非限制性實施方案中，癌症檢測試劑可以是反義寡核苷酸序列。該反義序列可以與癌細胞的轉錄組中一個或幾個基因的5，非翻譯序列、3，非翻譯序列或編碼序列的至少一部分互補。相應於癌症檢測試劑的寡核苷酸序列可以有足夠的長度，以便與靶細胞特異性相互作用(雜交)，但不是長到寡核苷酸不能區分單鹼基差異。例如，為了得到特異性，寡核苷酸的長度可以是至少6個核苷酸。也可以使用更長的序列。在特定實施方案中，癌症才企測試劑的長度可以是17個核苷酸。序列的最大長度將依賴於其雜交特異性的保持，這又依賴於試劑的G-C含量、解鏈溫度(Tm)和其它因素，並且可以通過計算或實驗，例如，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",VolumeI,Ausubeletal.,eds.JohnWiley:NewYorkNY,pp.2.10.1-2.10.16，首先在1989出版，但每年更新)中所述的用於檢測核酸分子雜交的嚴格條件，或通過利用免費軟體如Osprey(NucleicAcidsResearch32(17):el33)或EMBOSS(http:〃www.uk.embnet.org/Software/EMBOSS)而容易地確定。本發明的實施方案提供了在受試者中診斷癌症，所述受試者包括但不限於人、家養寵物，包括但不限於貓、狗、倉鼠等、運動和畜牧動物，包括但不限於馬、牛、羊等。本發明的實施方案進一步提供了將癌症檢測試劑用於來源於分離的細胞或分離自需要進行疾病狀態診斷分析的受試者的樣品的材料中。本發明的其它實施方案包括將癌症檢測試劑用於完整細胞或組織，以進行原位4全測和診斷。採用寡核苷酸探針在原位條件下進行特定基因表達的檢測是本領域公知的。經典地，寡核苷酸探針用修飾的核香酸進行了5，或3，末端標記，或3，加尾，所述修飾的核苦酸連接了"標記"，所述標記可以在探針與其靶雜交後被檢測到。採用末端標記，將單個修飾ddNTP(其摻入了標記)酶促添加到分子的5，或3，末端，或在探針合成過程中添加。3，加尾涉及用酶，即末端轉移酶(TdT)添加尾(依賴於使用的方法，平均長度為5-50個核苷酸的修飾的dNTPs)。另一方面，已經將一些非放射性標記成功用於原位雜交，所述標記包括生物素、地高辛和地高辛配基(DIG)、鹼性磷酸酶和螢光標記、螢光素(FITC)、德克薩斯紅和羅丹明。本發明包括所有上述探針標記和通過原位雜交進行檢測的方法。癌症檢測試劑可以是DNA或RNA分子，或其任何修飾或組合。癌症檢測試劑可以包含除了磷酸二酯鍵之外的核苷酸間鍵，例如硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸二曱酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯或磷酸酯鍵，導致穩定性增加。也可以通過在合成過程中將3，-脫氧胸苷或2，-取代的核苷酸(用例如烷基取代)摻入寡核苷酸，或通過提供作為苯基異脲衍生物的寡核苷酸，或通過將其它分子，如氨基吖啶或聚賴氨酸連接於寡核苷酸的3，末端，而增加寡核苷酸穩定性。包含本發明的癌症檢測試劑的RNA和/或DNA核苦酸的修飾也可以存在於整個寡核苦酸中或存在於寡核苦酸的選定區域中，例如5，和/或3'末端。可以通過本領域已知的任何方法，包括標準化學合成、組成寡核苷酸的連接和編碼寡核苷酸的DNA的轉錄，來製備癌症糹企測試劑。本發明在一個實施方案中提供了生物組織的篩選，所述生物組織將要從一個動物物種的成員轉移到另一個成員，包括但不限於從一個人受試者到另一個人受試者。所述生物組織的非限制性實例包括血液、血漿、皮膚、骨髓和主要器官，如心臟、肝、肺、腎等。一些實施方案提供了在轉移到另一個體前，測試血液或組織樣品中惡性細胞的存在。目前，在輸血或移植前在生物材料上進行了;f艮多測試。進行這些測試以確保不含病原體的材料和/或組織相容性。目前還沒有充分關注供體組織是否含有具有惡性潛能的細胞，或來自未檢測的癌症的明顯惡性的細胞。普遍意見是來自患有癌症的供體的惡性細胞由於移植物排斥而不會導致疾病轉移到受體。最近對該概念進行了質疑，並且越來越多的證據表明惡性肺瘤在個體間轉移(DingliandNowak,2006Nature433:35-36和其中引用的參考文獻)。通過使用免疫抑制藥物與器官移植的組合，也增強了轉移的可能性。因此，需要測試生物材料的惡性潛能。惡性細胞存在的測試受到缺乏迅速和可靠的篩選的限制，所述篩選同時測試多個標記物的存在，並且可以用小量測試材料進行。本發明的實施方案提供了在血液或其它組織或器官樣品中測試小量惡性細胞存在的途徑。候選供體材料的測試可以通過本領域已知的一些方法中的任意一種方法進行，其非限制性實例描述於上文的章節中。利用本發明的癌症檢測試劑來確定供體材料是否含有惡性細胞的方法包括但不限於諸如PCR、微陣列分析、原位雜交等方法。在特定實施方案中，可以用測試來篩選血庫中的血液。本發明的癌症檢測試劑可以用於多種抗癌用途，其中它們殺死癌細胞，謙導身體殺死癌細胞，或抑制癌細胞生長。通過癌症檢測試劑、彼此的組合，或與其它療法的組合，可以實現這些效果。例如，可以用癌症4企測試劑以多種方式i秀導癌細l包的革巴向的細月包死亡。首先，如果它們與已知的或後來開發的關於存在的癌症治療或新癌症治療，如化療或放療的信息相關，則它們可以用於指導這些治療中的哪一些可以用於受試者。但是，本發明的檢測試劑也可以用於開發靶向檢測試劑核酸序列或它們編碼的肽的新試劑。這些新試劑可以用於誘導把向的癌細胞死亡。由於本發明的癌症檢測試劑不存在於健康細胞轉錄組中，它們代表用於誘導癌細胞死亡的癌症特異性靶。例如，儘管一些癌症片企測試劑可以翻譯為主要位於細月包內的肽，一些包埋在通常編碼細胞外或膜蛋白的序列中。所述序列是本領域公知的，並且認為預測蛋白及其部分的可能的細胞定位。因此，特別對於具有細胞外區域的蛋白，預期施用癌症檢測試劑編碼的肽的特異性抗體會謙導細胞死亡。由於僅僅癌細胞具有這些肽，僅僅癌細胞一皮抗體把向和殺死。與本發明結合使用的抗體可以包括單克隆抗體和多克隆抗體，非人、人和人源化抗體，及其任何功能性片段。除了基於蛋白的治療，本發明的癌症檢測試劑序列提供了基於mRNA或基於其它核酸的幹預的特別有前景的耙。由於癌症檢測試劑是14通過與健康細胞的轉錄組比較而分離的，基於mRNA的治療應該對健康細胞沒有影響，因為它們將缺乏任何受到治療影響的mRNA。具體地，可以用核酸，包括癌症檢測試劑序列實現基於mRNA的治療。公知的是，當mRNA被細胞內的互補核酸結合時，隨後各種細胞機制可以防止該mRNA轉錄為蛋白。這些機制中的一些，如基於反義的機制，似乎依賴於互補鏈與mRNA的重複結合。其它機制，如siRNA或RNAi,似乎誘導多得多的長期持續改變，這些改變將防止甚至從未改變的、單鏈形式翻譯為被耙向的mRNA。在本發明的特定實施方案中，通過癌細胞中質粒DNA的轉錄而產生siRNA。採用選定的癌症4全測試劑，可以建立質粒，以允許該轉錄活性。存在於受試者的癌症譜中的針對一些癌症檢測試劑的質粒集合也可以建立。建立質粒後，它們可以放置在適於送遞到癌細胞的轉染培養基中。已知一些細胞將攝取並表達棵質粒。但是，也可以採用送遞載體，如脂質體或缺失的病毒載體。由於預期質粒對正常健康細胞沒有影響，不需要靶向的送遞。在本發明的一些實施方案中，可能包括增加送遞載體的有效性，例如，通過增加其擴散到組織中而增加所述有效性的額外試劑。配製用於送遞的質粒隨後可以在來自癌症受試者的血液中測試。適當地起作用的質粒應該以輩巴向的方式殺死血液中的癌細胞。通過分析血液中的mRNA,可以容易地-險證該活性(在足夠的時間段後，以允許在死亡之前，降解已經在癌細月包中產生的mRNA，通常l小時內)。可以通過肉眼和其它分析-瞼證對正常細胞破壞的缺乏。在動物^t型，如靈長類動物中測試，也可以證實健康細胞不受質粒影響。質粒標記物或癌症檢測試劑本身可能有助於證實體內細胞攝取和/或轉錄。然後，可以通過藥學可接受的方式配製選擇用於送遞給受試者中的癌細胞的質粒，並且施用於受試者。所述施用可以包括注射到肺瘤中或注射到血流中。送遞方法可以受到癌症類型和位置，以及受試者的其它需要和質粒試劑的製劑的影響。儘管單個癌症檢測試劑可以用於在本發明的誘導癌細胞死亡的方法中耙向多種基因或基因產物，在一些實施方案中，可以靶向多種癌症檢測試劑，以產生強效。如果給具有多個肺瘤的受試者施用，耙向一種以上癌症檢測試劑的組合試劑也可以是特別有用的。受試者的肺瘤可能已經分化，使得每個腫瘤不包含任何一種癌症檢測試劑序列。摻入耙向多種癌症檢測試劑序列的試劑可以使得這些分化的癌細胞能夠被更有效殺死。所述組合的方法對於用常規方法可能不能檢測的新或小胂瘤可能是特別有用的，但當本發明的診斷方法用於建立癌症譜時含有可檢測的癌症4企測試劑。因此，根據三步法，可以用本發明的選定的方法實現靶向的癌細胞死亡。首先，可以給受試者建立癌症譜。其次，可以建立靶向的癌細胞死亡試劑，並且在受試者血液或其它組織樣品上測試。第三，可以給受試者施用該試劑，導致該受試者中癌細胞的耙向的死亡。該方法可以在少至3周中實現。持續監測可以允許檢測受試者中任何癌症檢測試劑的消失，以及任何新癌症檢測試劑的出現。因此，可以隨後改變給受試者施用的藥劑或藥劑組合。表l包括癌症4企測試劑序列。癌症4企測試劑也可以具有與表1中的序列互補的序列。表1中列出的癌症檢測序列代表反向互補鏈。基於癌症中的總體出現或基因中的出現率選擇表1中列出的序列。出現率("In.")表明序列位於各個癌症中的次數。每個序列與一個標識符相關，所述標識符相應於發現所述序列的至少一種癌症類型。對於一些序列，也指出了其它癌症類型、基因或染色體，以及分離出所述癌症檢測試劑的文庫。對於一些序列，也包括了預測的解鏈溫度(Tm)。表1-癌症檢測序列SEQ.ID.NO.序列TACGGGTGACTGTGCCAT19AAATGCATCAAAGTTGC17GCAGGTCAGTTCCACCA17TGTGATGAGCTGTCTCA17In.標識符和U癌症][基因(染色體)][文庫]}Tm卯巢—68295_4635{[乳^][未^][+NIH_MGC—87}([卵巢][未知][+NIH_MGC—66]}{[卩巢][未知][+NIH_MGC—9]}{[結腸/直腸][未知][+NIH_MGC—65]}{[肺][未知][+NIH—MGC—68]}{[肺][未知][+NIH—MGC_18]}{[^][未5口〗[+NIH—MGC—69]}{[宮頸][未知][+NIH_MGC_12}{[腦][未知][+NIH—MGC—19}{[腦][未知][+NIH一MGC一47]){[腦][未;][+56NIH_MGC_96]}{[皮膚][未知][+NIH_MGC_20]}{[淋巴][未知][+NIH—MGC_85]}{[睪丸][未知][+NIH—MGC—92]}{[眼][未知][+NIH—MGC—67]}{[神經膠^瘤][泉知][+NCI—CGAP—Brn67]}{[細胞瘤][未知][+NIH_MGC—98]}([肉瘤][l知][+NIH_MGC_71}{[月f瘤][未知][+NIH_MGC_88]}肺」40950一11879乳腺—128252—11961{pl^"[NSPCl(2)~][+NIH_MGC_87]}{[卵巢][GAPD(12)][+NIH_MGC—66]}{[卯巢][GAPD(12)LOC389849(X)][NIH_MGC—66]}{[卵巢][GAPD(12)LOC389849(X)~][+NIH_MGC_109]}{[結腸/直腸][GAPD(12)LOC389849(X)〗[十NIH_MGC—15]}{[前歹'J腺][GAPD(12)][+NIH_MGC_40]}{[月畝][GAPD(12)LOC389849(X)[十NCI—CGAP_Brn64]}{[月運〗[GAPD(12)LOC389849(X)][+NIH—MGC—19]}{[月畝][GAPD(12)][+NIH=MGC=47]}54U月滷][GAPD(12)LOC389849(X)][NIH—MGC—47]}{[腎上腺][GAPD(12)~][+NIH—MGC—84]}{[皮膚]〖GAPD(12)LOC389849(X)][十NIH—MGC_72]}{[皮膚][GAPD(12)LOC389849(X)~][+NIH_MGC_20〗}{[肌肉][未知][+NIH—MGC—17]}{[月臺盤][GAPD(12)][+NIH—MGC_21]}{[肝][GAPD(12)LOC389849(X)][十NIH_MGC—卯〗}{[肝][GAPD(12)][+NIH_MGC—100}{[肉瘤[GAPD(12)][+NCI—CGAP_Alvl]}{[肉瘤][GAPD(12)LOC389849(X)~][+NIH_MGC—46]}肺_97380一1525{結S/直腸][K-ALPHA-1(12)][+NIH_MGC_15]}{[前列腺I[未知][+50NIH—MGC_60]}"][未知][+NIH_MGC_7]}{[宮頸][^"知〗[+NIH—MGC_12]}([皮膚][lGTTGTTAGGATCCAGTC16TGTTAGATCAGTCCAGA16ACTCCTATAGGAACTTG15知][+NIH_MGC—62]}{皮膚[未知][+NIH—MGC_20]}{[皮膚][l知][+NIH_MGC—49]}{[腎][未知][+NIH_MGC_14]}{[胰腺][K-ALPHA-1(12)]+NIH一MGC一l10]}{[胰腺][未知][+NIH—MGC_39〗}{[胰^][瓜知][+NIH—MGC—70]}{[肌肉[未知][+NIH—MGC_17]}{[淋巴][知][+NIH_MGC_8]}{[眼][未知][+NIH—MGC—67]}{[神經膠^瘤][未知][+NCI_CGAP—Brn67]}{[肉瘤][未知][+NIH_MGC_46]}([i上腺樣瘤][未知][十NIH_MGC_89I}乳腺_128723_13168{[乳森][未知][+NIH—MGC_87I}([卵巢][未知[+NIH_MGC_66〗}{卩巢][未知][+NIH_MGC_9]}{[前列腺][未知][+NIH_MGC_60]}{[肺][未知][+NIH—MGC—18]}{[腎111腺]["^知][+NIH_MGC—84]}{[月幾^][^知][+NIH—MGC—17]}{[巴][未知][+NIH_MGC_85]}{[骨/骨髓][未知][+NIH_MGC_86]}{[睪丸][未知][+NIH_MGC_92}{[月臺盤][未知][+NIH_MGC_21]}{[肝][未知][+NIH_MGC_%]}{[目艮][未知][+NIH_MGC_67}([神經l交質瘤][未知][十NCI_c5AP_Brn67]}([肉瘤][未知〗[+NIH—MGC—71]}{[乳頭狀瘤][未知][+NIH—MGC一93D肺—114200—11255{[乳腺][未知][+NIH—MGC—87]}{[卵巢]^1^32363(5)][+NIH—MGC—9]}U肺][未知][+NIH_MGC_68}{[$][A知][+NIH_MGC_7]}{[^"][;4知][+NIH_MGC_18]}{[宮頸][^^知][+NIH—MGC—12]}([皮i][未知][+NIH—MGC—72]}{[胰威][未知][+NIH—MGC—39]}{[肌肉][l知][+NIH—MGC_17]}{[淋巴][未知][+NIH—MGC_85]}{[睪丸][未知][+NIH—MGC—92]}{[胎盤][未知〗[+NIH_MGC—21]}{[肝][未知][+NIH—MGC—90]}{[眼][未知][+NIH—MGC—67]}{[眼]未^〗[+NIH_MGC—16]}{[乳f狀瘤][▲知][+NIH_MGC_93]}肺—116399_15887{[乳腺][未_知][+NIH—MGC_87]}{[卵巢[未知1[+NIH—MGC—9]}{[結^/直腸][未知][+NIH—MGC—15]}{[結腸/直腸][未知][+NIH—MGC_65]}{[肺1[未知][+NIH—MGC—68〗}{[肺][未知][+NIH—MGC—7]}{[腦][未^][+Nffl—MGC—19]}{[腎][未知]〖+NIH—MGC—14]}{[胰腺[;^知][+MH_MGC_39]}{[肌1^1[&知][+NIH—MGC—17]}U^巴][未知]+NIH_MGC_85]}{[骨/骨髓][未知][+NIH—MGC_86〗}{[肉瘤〗[未知][+NIH—MGC_46]}{[腎上腺樣瘤][未知][+NIH—MGC—89}{[腫瘤][未知〗[+NIH—MGC—88]}ATCACGCCAACAGTTTC15CAGGTCTCCCGTTTCTGCTCCCCAAAGGAACATCCAGGAGATAACCGGTGGCATACGGATGTCCCTGCTGGGTACCAGTCGCAGGTTCAGC1515151414AACACCCAGCCTCGTAC13ACCCAGCCTCGTACCTA13淋巴—50077—1076{[l〖腺][GAPD(12)~][+NIH—MGC_87]}{[肺][GAPD(12)LOC389849(X)][十NIH_MGC_7]}U宮頸][GAPD(12)LOC389849(X)~][+NIH—MGC—12]}{[月運][GAPD(12)LOC38^849(X~〗[+NIH_MGC_19]}{[月畝][GAPD(12)~][+NIH_MGC-47]}{[月畝][未知][+NCI—CGAP—Brn64]}{[子宮][GAPD(12)LOC389849(X)][+NIH—MGC—44]}{[皮膚][未知][+NIH—MGC_20]}{[A膚][GAPD(12)50LOC389849(X)~][+NIH—MGC_49]}{[淋巴][未知][十NIH_MGC—8]}([淋"^][GAPD(12)LOC389849(X)~][+NIH_MGC_85]}{[月臺盤〗[GAPD(12)LOC389849(X)][+NIH—MGC—21]}{[細胞瘤][未知][+NIH—MGC_98]}{[肉瘤][GAPD(12)][+NIH_MGC_71〗}{[肉瘤][GAPD(12)LOC389849(X)~][NIH_MGC—71]}{[肉瘤][GAPD(12)LOC389849(XH[+NIH—MGC—46]}淋巴一69924—10602肺_151195一32065卵巢_83345—32595{[乳腺][RPL8(8)][+NIH_MGC_87]}{[卵巢][未知][+NIH_MGC_66]}{[肺][111^8(8)][+NIH—MGC_7]}{[肺][^知][+NIH_MGC_68]}U威][RPL8(8)~][+NIH_MGC_18]}{[宮頸][RPL8(8)~][+NIH—MGC—12]}{[皮膚][111^(8)~][+NIH—MGC—20]}([胰腺][未知][+NIH_MGC_39]}{[肌肉][RPL8(8)~][+54NIH_MGC_17]}{[淋巴][RPL8(8)~][+NI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C_62]}{[皮反][未知][+NCI_CGAP_Skn4]}{[胰腺][未知][+NIH—MGC—39]}{[月幾肉][A知〗[+NIH_MGC—17]}U淋巴][未知][+NIH_MGC_85]}([秦丸][TPK1(7)TPKl(7b)][十NIH—MGC—92]}{[胎盤][未知][+NIH_MGC_21]}{[眼][未知][+NIH_MGC—67]}{[神經膠^瘤][;4知][+NCI—CGAP_Brn67]}{[腎上腺樣瘤][未知][+NIH_MGC_89〗}腦_152238—50202{[乳腺][呆知][+NIH—MGC_87〗}([腦][未知]+NIH—MGC—19]}{[][瓜知][+NIH—MGC_57]}{[NIH_MGC_62]}{NIH_MGC—85]}{[NIH_MGC_8]}U骨一一NIH_MGC_86]}{[眼][未知][+NIH—MGC_67]}{[神經膠質瘤][未知][+NCI—CGAP_Brn67]}545652儘管已經描寫、描述並且參照公開內容的具體示例性實施方案定義了本公開內容的實施方案，所述參照不暗示對公開內容的限制，並且不能推斷所述限制。公開的主題的形式和功能能夠進行相當多的修飾、改變和等同方案，並且所屬
技術領域：
的普通技術人員可以理解，並且具有本公開內容的優點。本公開內容描寫和描述的實施方案僅僅是舉例，並且不是公開內容範圍的窮舉。權利要求1.給患有癌症或懷疑患有癌症的受試者建立癌症譜的方法，包括從來自所述受試者的組織樣品分離mRNA；在mRNA中篩選至少一種癌症檢測試劑，以確定mRNA中存在或缺乏所述癌症檢測試劑，所述癌症檢測試劑選自表1的任何寡核苷酸及其任意組合；和將篩選結果整理在癌症譜中，所述癌症譜表明mRNA中存在或缺乏每種測試的癌症檢測試劑。2.權利要求l的方法，其中所述組織樣品包括外周血。3.權利要求1的方法，進一步包括在mRNA中篩選至少兩種癌症檢測試劑，所述癌症檢測試劑選自表1的任何寡核苷酸及其任意組合。4.權利要求1的方法，進一步包括在mRNA中篩選至少IO種癌症檢測試劑核酸序列，所述癌症檢測試劑核酸序列選自表1的任何寡核普酸及其任意組合。5.權利要求l的方法，進一步包括在mRNA中篩選至少20種癌症檢測試劑核酸序列，所述癌症檢測試劑核酸序列選自表1的任何寡核苷酸及其任意組合。6.權利要求1的方法，進一步包括在mRNA中篩選至少50種癌症檢測試劑核酸序列，所述癌症檢測試劑核酸序列選自表1的任何寡核苷酸及其任意組合。7.權利要求1的方法，進一步包括在mRNA中篩選至少100種癌症檢測試劑核酸序列，所述癌症檢測試劑核酸序列選自表1的任何寡核苷酸及其任意組合。8.誘導癌細胞中靶向的癌細胞死亡的方法，包括給癌細胞施用至少一種革巴向於癌症4企測試劑核酸序列編碼的肽的抗體，所述癌症一企測試劑核酸序列選自表1的任何寡核苷酸及其任意組合。9.權利要求8的方法，進一步包括給位於人受試者中的癌細胞施用抗體。10.權利要求8的方法，進一步包括施用至少兩種抗體。11.權利要求8的方法，其中該抗體包括單克隆抗體。12.權利要求8的方法，其中該抗體包括多克隆抗體。13.誘導癌細胞中耙向的癌細胞死亡的方法，包括給癌細胞施用至少一種包括癌症4企測試劑的siRNA分子，所述癌症檢測試劑選自表1的任何寡核苷酸及其任意組合，其中施用所述siRNA分子導致含有癌症檢測試劑的細胞mRNA的破壞。14.權利要求13的方法，進一步包括給人受試者中的癌細胞施用siRNA分子。15.權利要求13的方法，進一步包括給癌細胞施用質粒，所述質粒編碼siRNA分子並且可操作從而在癌細胞中產生siRNA分子。16.權利要求15的方法，進一步包括在送遞載體中施用質粒。17.權利要求16的方法，其中所述送遞載體包括脂質體。18.癌症檢測試劑集合，包含至少兩種表1的任何寡核香酸。19.癌症檢測試劑集合，包含至少5種表1的任何寡核苷酸。20.癌症檢測試劑集合，包含至少10種表1的任何寡核苷酸。21.癌症檢測試劑集合，包含至少20種表1的任何寡核香酸。22.癌症檢測試劑集合，包含至少50種表1的任何寡核苷酸。23.癌症檢測試劑集合，包含至少IOO種表1的任何寡核苷酸。24.;險測樣品中的癌症片企測試劑的方法，包4舌使樣品與癌症檢測試劑接觸；並且確定樣品中是否存在含有癌症檢測試劑的核酸。25.權利要求24的方法，其中用癌症檢測試劑的單個引物在樣品上進行PCR，以產生PCR產物；並且分析PCR產物，以確定樣品中是否存在PCR擴增的、含有癌症檢測試劑的核酸。26.權利要求25的方法，其中所述引物包括5，引物。27.權利要求24的方法，其中所述樣品包括cDNA。28.權利要求27的方法，進一步包括來源於血液或組織樣品的cDNA。29.權利要求25的方法，其中所述分析進一步包括PCR產物的基於大小的電泳分離。30.權利要求25的方法，其中PCR產物包括具有多種長度的多個擴增的DNA分子，每個所述分子都含有引物。全文摘要通過比較癌症mRNAs與健康細胞的轉錄組，鑑定了癌症檢測試劑。這些癌症檢測試劑可以用於多種目的，包括癌細胞的診斷和靶向破壞。在診斷應用中，可以分析受試者的外周血或其它組織樣品，以建立該受試者的癌症譜。隨後可以用該譜指導用已知藥劑進行治療。它也可以用於產生能夠以靶向方式殺死受試者的癌細胞的藥劑。這些藥劑可以包括抗體和siRNA、RNAi或反義RNA。文檔編號C12Q1/68GK101448959SQ200780018777公開日2009年6月3日申請日期2007年3月23日優先權日2006年3月23日發明者D·A·諾爾思申請人:天空遺傳學公司

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