一株耐酸長雙歧桿菌JDY1017dpH及其應用的製作方法

2023-10-17 06:36:19 1

一株耐酸長雙歧桿菌JDY1017dpH及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一株耐酸長雙歧桿菌JDY1017dpH及其應用。長雙歧桿菌JDY1017dpH的16S?rRNA基因部分核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，保藏號為CGMCC?No.8371。本發明的長雙歧桿菌JDY1017dpH的獲得，是從健康青年人糞便中分離並在pH3.5酸性條件下進一步篩選得到的菌種。發酵培養過程是，於BL液體培養基(含0.05％半胱氨酸鹽酸鹽)中37℃厭氧培養24h。本發明的長雙歧桿菌JDY1017dpH對酸的耐受性能顯著優於普通菌株，且耐酸性能具有遺傳穩定性，具有與普通菌株不同的細胞膜脂肪酸含量百分比，平均碳鏈長度顯著長於普通菌株，細胞膜流動性顯著低於普通菌株。可用於日常發酵食品、保健食品和藥品的生產領域中。
【專利說明】—株耐酸長雙歧桿菌JDY101 7dpH及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物，具體涉及一株耐酸長雙歧桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002]人體胃腸道定植著各種對人體有益生作用的益生細菌。其中雙歧桿菌和乳桿菌是定植於人體胃腸道的最具代表性的益生菌。益生菌是指服用一定數量後對人體健康有益的活的微生物。當益生菌佔人體胃腸道優勢數量時常常有利於人體健康。
[0003]雙歧桿菌屬於革蘭氏陽性菌，是一種專性厭氧菌，無運動屬性，生長周期中不產生芽孢，無莢膜和鞭毛。
[0004]雙歧桿菌對環境pH的變化非常敏感。其最適生長pH為6.7~7.0，一旦高於8.0或低於5.0，雙歧桿菌將停止生長。當處於低pH條件下，會導致細菌細胞大量的死亡，特別是人源性雙歧桿菌酸耐受力非常差。
[0005]雙歧桿菌對環境溫度的變化也很敏感。當溫度介於37~41°C時，生長最為迅速，當溫度高於43°C或低於28°C時，其生長極其緩慢或停止生長。在生產應用中，雙歧桿菌的最適溫度為35~40°C。
[0006]許多研究表明，雙歧桿菌是重要的益生菌，對人體具有多種潛在的生理功能，如調節腸道茵群平衡、預防由抗生素引起的腹瀉、降低膽固醇、緩解乳糖不耐症及增強機體免疫力等。
[0007]目前，隨著雙歧桿菌功能研究的深入，其在日常發酵食品、保健食品和藥品等新產品開發中的應用越來越多。而雙歧桿菌作為重要的益生菌，許多國家法規要求益生菌食品中的活菌數在保質期內必須達到106~108CFU / ml(g)。為了使其在人體胃腸道有效發揮益生功能，雙歧桿菌必須具有良好的貯存穩定性和對胃腸道的耐受(如耐酸性等)性能。因此，對不利環境(如胃腸道環境)適應性更強的人源性雙歧桿菌株是可應用的重要潛在菌株。

【發明內容】

[0008]本發明的目的，就是為了提供一株長雙歧桿菌JDY1017dpH及其應用，長雙歧桿菌JDY1017dpH具有優勢的耐酸性能，且耐酸性具有遺傳穩定性，以及具有不同的細胞膜脂肪酸含量百分比和低的細胞膜流動性，可作為潛在的益生菌菌株。
[0009]本發明的長雙歧桿菌JDY1017dpH已於2013年10月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏登記號為CGMCC N0.8371。其分類命名為:長雙歧桿菌，拉丁名:Bifidobacterium longum。
[0010]為了實現上述目的，本 發明的技術方案是:一株耐酸長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum) JDYlO 17dpH，其保藏登記號為 CGMCC 唚.8371，其165 rRNA基因部分核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。[0011]所述長雙歧桿菌JDY1017dpH具有以下特性:
[0012](1)優勢的耐酸性能
[0013]經pH3.5處理4h後，每毫升菌液活菌數的對數值log CFU / ml =為7.53 ±0.41，其耐酸性能明顯優於普通菌株；
[0014](2)耐酸性能具有遺傳穩定性
[0015]新篩選到的菌株JDY1017dpH經pH3.5處理4h後，其每毫升菌液活菌數的對數值log CFU / ml = 7.12±0.10，連續傳代20次並經pH3.5處理4h後，其每毫升菌液活菌數的對數值 log CFU / ml = 7.57 ±0.15 ；
[0016](3)不同的細胞膜脂肪酸含量百分比
[0017]新篩選到的菌株JDY1017dpH的C16: O和C16: I脂肪酸含量百分比分別為24.786±1.162 和 5.460±0.908，顯著低於普通菌株；而 C18: O、C18: I 和 cycC19: O脂肪酸含量百分比分別為4.281 ±0.521,44.066±1.844和11.342±0.996，顯著高於普通菌株；平均碳鏈長度為17.085±0.049，顯著長於普通菌株；
[0018](4)具有更低的細胞膜流動性 [0019]新篩選到的菌株JDY1017dpH細胞膜的微粘度r = 0.135 + 0.006，明顯高於普通菌
株，即細胞膜流動性明顯低於普通菌株。
[0020]上述長雙歧桿菌JDY1017dpH的獲取方法包括以下步驟:
[0021]A、將新鮮的健康青年人糞便5克用50ml糞便稀釋液振蕩成糞便勻漿液，將Iml糞便勻漿液接入9ml新鮮的pH7.4BL液體培養基中，37°C厭氧培養24h，用接種環挑取菌液在PH6.5的TPY固體培養基平板上劃線，37 °C厭氧培養24h後，挑取單菌落接種於50ml新鮮的pH7.4BL液體培養基中，37°C厭氧過夜培養至平臺期後，7600g離心10min獲得菌體，再將菌體轉移至PH3.5新鮮的BL液體培養基中，37°C厭氧過夜培養後，7600g離心10min獲得菌體；
[0022]B、再用pH7.4的磷酸緩衝液洗滌兩次後，重懸於500 μ I ρΗ7.4的磷酸緩衝液中，然後塗布於ΡΗ6.5的TPY固體培養基中，37°C厭氧培養3~4天至生長出單菌落，挑取單菌落進行鏡檢，確認達到菌株純種分離，並分子鑑定該菌株為長雙歧桿菌，命名為長雙歧桿菌JDY1017dpH ；
[0023]C、將長雙歧桿菌JDY1017dpH以I %接種量接種於新鮮的pH7.4BL液體培養基中，37°C厭氧培養24h，即得長雙歧桿菌JDY1017dpH菌株的發酵液。
[0024]上述長雙歧桿菌JDY1017dpH的獲取方法，其中，所述BL液體培養基、TPY固體培養基和磷酸緩衝液中均含有重量百分含量為0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽。
[0025]上述長雙歧桿菌JDYlO17dpH用於日常發酵食品、保健食品和藥品的生產領域中。
[0026]本發明的長雙歧桿菌JDY1017dpH的酸耐受性能顯著優於普通菌株，且耐酸性能具有遺傳穩定性，具有不同的細胞膜脂肪酸含量百分比和更低的細胞膜流動性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為長雙歧桿菌JDY1017dpH優勢的耐酸性能的遺傳穩定性分析圖表。
【具體實施方式】[0028]本發明的長雙歧桿菌JDY1017dpH的獲得:從健康青年人新鮮糞便中分離並在PH3.5酸性條件下進一步篩選得到的菌種。革蘭氏染色呈陽性，專性厭氧，無運動屬性，生長周期中不產生芽孢，無莢膜和鞭毛。
[0029]該長雙歧桿菌已於2013年10月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC(地址:中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)保藏，保藏登記號為CGMCC N0.8371。其分類命名為:長雙歧桿菌，拉丁名:Bifidobacterium longum。
[0030]下面結合實施例和附圖1進一步說明本發明:
[0031]實施例1:菌株的篩選及獲得
[0032]將新鮮的健康青年人糞便5克用50ml糞便稀釋液振蕩成勻漿，將Iml糞便勻漿液接入9ml新鮮的pH7.4BL液體培養基(含0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽)試管中，37°C厭氧培養24h，用接種環挑取菌液在pH6.5的TPY (含0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽)固體培養基平板上劃線，37°C厭氧培養24h後，挑取單菌落接種於50ml新鮮的pH7.4BL液體培養基(含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)中，37°C厭氧過夜培養至平臺期後，7600g離心10min獲得菌體，再將菌體轉移至PH3.5新鮮的BL液體培養基(含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)中，37 °C厭氧過夜培養後，7600g離心10min獲得菌體，再用含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽的磷酸緩衝液(pH7.4)洗滌兩次後，重懸於500μ I含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽的磷酸緩衝液(ρΗ7.4)中，然後塗布於ρΗ6.5的TPY (含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)固體培養基中，37°C厭氧培養3~4天至生長出單菌落，挑取單菌落進行鏡檢，確認達到菌株純種分離，並分子鑑定該菌株為長雙歧桿菌，命名為長雙歧桿菌JDY1017dpH。
[0033]實施例2:菌株的鏡檢
[0034]無菌條件下接種環挑取長雙歧`桿菌JDY1017dpH，塗於載玻片上，製片並革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態。
[0035]實施例3:菌株發酵
[0036]將長雙歧桿菌JDY1017dpH以I %接種量接種於新鮮的pH7.4BL液體培養基(含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)中，37°C厭氧培養24h，即得長雙歧桿菌JDY1017dpH菌株的發酵液。
[0037]實施例4:長雙歧桿菌JDY1017dpH優勢的耐酸性能
[0038]將待進行耐酸性評價的菌株以I %的接種量接種於新鮮的pH7.4BL液體培養基(含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)中，並傳代2次，第3代發酵液在37°C厭氧培養18h至平臺期，取Iml菌液轉移至1.5ml離心管中，7600g離心10min獲得菌體，將菌體轉移至IOml pH值3.5新鮮的BL液體培養基(含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)中，分別於Oh和3h，37°C厭氧培養後，取100 μ I菌液用含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽的磷酸緩衝液(ρΗ7.4)梯度稀釋後取100 μ I的稀釋菌液塗布於TPY(含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)固體培養基中，37°C厭氧培養3~4天後菌落計數，並統計在pH3.5BL液體培養基(含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)中培養Oh和3h後的菌體濃度。本實施例採用實驗室保存的分離自商業化產品的長雙歧桿菌BLS作為對照菌株。長雙歧桿菌的JDY1017dpH優勢的耐酸性能如表1所示。
[0039]表1長雙歧桿菌JDY1017dpH優勢的耐酸性能(pH = 3.5處理4h)
【權利要求】
1.一株耐酸長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum) JDY1017dpH,其保藏登記號為CGMCC N0.8371，其16S rRNA基因部分核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.如權利要求1所述的長雙歧桿菌JDY1017dpH，其特徵在於，所述長雙歧桿菌JDY1017dpH具有以下特性: (1)優勢的耐酸性能 經pH3.5處理4h後，每毫升菌液活菌數的對數值log CFU / ml =為7.53 ±0.41，其耐酸性能明顯優於普通菌株； (2)耐酸性能具有遺傳穩定性 新篩選到的菌株JDY1017dpH經pH3.5處理4h後，其每毫升菌液活菌數的對數值logCFU / ml = 7.12±0.10，連續傳代20次並經pH3.5處理4h後，其每毫升菌液活菌數的對數值 log CFU / ml = 7.57±0.15 ； (3)不同的細胞膜脂肪酸含量百分比 新篩選到的菌株JDY1017dpH的C16: O和C16: I脂肪酸含量百分比分別為24.786±1.162 和 5.460±0.908，顯著低於普通菌株；而 C18: O、C18:1 和 cycC19: O 脂肪酸含量百分比分別為4.281 ±0.521,44.066±1.844和11.342±0.996，顯著高於普通菌株；平均碳鏈長度為17.085±0.049，顯著長於普通菌株； (4)具有更低的細胞膜流動性 新篩選到的菌株JDY1017dpH細胞膜的微粘度r = 0.135±0.006，明顯高於普通菌株，即細胞膜流動性明顯 低於普通菌株。
3.權利要求1所述長雙歧桿菌JDY1017dpH的獲取方法，其特徵在於，包括以下步驟: A、將新鮮的健康青年人糞便5克用50ml糞便稀釋液振蕩成糞便勻漿液，將Iml糞便勻漿液接入9ml新鮮的pH7.4BL液體培養基中，37°C厭氧培養24h，用接種環挑取菌液在PH6.5的TPY固體培養基平板上劃線，37 °C厭氧培養24h後，挑取單菌落接種於50ml新鮮的pH7.4BL液體培養基中，37°C厭氧過夜培養至平臺期後，7600g離心10min獲得菌體，再將菌體轉移至PH3.5新鮮的BL液體培養基中，37°C厭氧過夜培養後，7600g離心10min獲得菌體； B、再用pH7.4的磷酸緩衝液洗滌兩次後，重懸於500 μ I ρΗ7.4的磷酸緩衝液中，然後塗布於ΡΗ6.5的TPY固體培養基中，37°C厭氧培養3~4天至生長出單菌落，挑取單菌落進行鏡檢，確認達到菌株純種分離，並分子鑑定該菌株為長雙歧桿菌，命名為長雙歧桿菌JDY1017dpH ； C、將長雙歧桿菌JDY1017dpH以I%接種量接種於新鮮的pH7.4BL液體培養基中，37°C厭氧培養24h，即得長雙歧桿菌JDY1017dpH菌株的發酵液。
4.如權利要求3所述的長雙歧桿菌JDY1017dpH的獲取方法，其特徵在於，所述BL液體培養基、TPY固體培養基和磷酸緩衝液中均含有重量百分含量為0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽。
5.如權利要求1所述的長雙歧桿菌JDY1017dpH的應用，其特徵在於:所述的長雙歧桿菌JDY1017dpH菌株用於日常發酵食品、保健食品和藥品的生產領域中。
【文檔編號】C12R1/01GK103865856SQ201410114641
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2014年3月25日
【發明者】楊虹, 楊旭, 杭曉敏, 張旻, 柳向龍 申請人:上海交通大學