一種規模化培養細胞增殖的方法及其用於生產病毒的方法
2023-10-30 13:13:07
專利名稱：一種規模化培養細胞增殖的方法及其用於生產病毒的方法
一種規模化培養細胞增殖的方法及其用於生產病毒的方法技術領域
本發明屬於生物製品製造領域，尤其涉及一種規模化培養細胞增殖的方法及其將增殖細胞用於生產病毒的方法。
背景技術：
疫苗免疫是預防和控制病毒類疾病的有效措施，疫苗生產過程中需要依賴培養基質或大量動物細胞，如禽流感疫苗的生產，傳統方法是以雞胚為培養基質，但用雞胚尿囊液分離或傳代禽流感病毒易引起抗原性變異；大規模生產時還存在雞胚數量不足和潛在外源病毒汙染等生物安全問題；應用動物細胞生產疫苗，可完全避免雞胚中的蛋白質引起的不良反應，可克服雞胚要求嚴格、來源少的問題，但用犬腎細胞(Mardin Darby canine kidneycells, MDCK)生產疫苗時，由於MDCK細胞培養過程中存在很嚴重的「失巢凋亡」現象，即細胞一旦不黏附其它基質就會發生凋亡，存在細胞培養體積較小的問題，通常培養體積在100L左右，且培養的細胞族細胞密度較小，在5X IO5 I X IO6ceIls/ml，要實現大規模生產病毒疫苗，需要先生產多組細胞系，工藝複雜，不能滿足要求。因此應用動物細胞大規模生產病毒疫苗，關鍵在於細胞的大規模培養。發明內容
本發明的目的是提供一種規模化培養細胞增殖的方法及其用於生產病毒的方法，以解決上述生產病毒時細胞系體積小，細胞密度也小，不能滿足大規模生產病毒疫苗的要求的問題。
技術方案如下:
一種規模化培養 細胞增殖的方法，包括:
將細胞經過逐級放大懸浮培養，得到體積為100 200L的細胞系；
在微載體中加入DMEM培養基預培養；
將預培養後的微載體和所述體積為100 200L的細胞系打入體積為650L以上的細胞培養反應器中，懸浮培養後，得到目標細胞系。
進一步，所述體積為100 200L的細胞系的培養過程中，先將細胞經常規培養後，得到初級細胞；再將初級細胞經逐級放大懸浮培養，加入微載體和培養液，待微載體上的細胞長滿單層後，對微載體進行消化，收穫細胞，得到所述體積為100 200L的細胞系。
進一步，所述微載體的預培養過程中，先用PBS液對所述微載體洗滌三次，浸泡4h，去掉上清後進行預培養，所述預培養至少三次；加入至少8000ml DMEM培養基進行第一次預培養至少12h，去掉上清；再加入至少8000ml DMEM培養基進行第二次預培養至少12h，去掉上清，再加入含5 20%胎牛血清的至少8000ml DMEM培養基進行第三次預培養，預培養至少6h後打入體積為650L以上的細胞培養反應器中。
進一步，所述第一次預培養加入8500ml DMEM培養基培養13h ;所述第二次預培養加入8500ml DMEM培養基培養13h ;所述第三次預培養加入含10%胎牛血清的8500ml DMEM培養基培養7h。
進一步，所述目標細胞系的培養過程包括:
I)將預培養後的微載體和所述體積為100 200L的細胞系打入體積為650L以上的細胞培養反應器中進行懸浮培養，加入含5 20%胎牛血清的DMEM培養基，攪拌速度為35 55 轉 /min ；
2)懸浮培養的前5 IOh中，每隔半小時停止攪拌10分鐘；
3)培養20 30h後，去掉100 200L上清，加入200 300L含5 20%胎牛血清DMEM培養基，繼續培養；
4)培養至40 50h時，加入含5 20%胎牛血清DMEM培養基至500 600L，繼續培養至70 80h。
進一步，所述步驟I)中，細胞培養反應器內的初始培養體積為150 250L。
進一步，所述步驟I)中，所述DMEM培養基中胎牛血清的含量為10%，所述初始培養體積為200L，所述攪拌速度為40轉/min ；
所述步驟2)中，懸浮培養的前6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘；
所述步驟3)中，24h後去掉150L上清，所述DMEM培養基含有10%胎牛血清，加入量為250L ；
所述步驟4)中，培養至48h時，所述DMEM培養基含有10%胎牛血清，加入所述DMEM培養基至反應器內培養體積為550L，繼續培養至72h。
進一步，所述細胞為犬腎細胞MDCK細胞。
—種以上述規模化培養的細胞係為基質生產病毒的方法，包括:根據MOI值,在所述目標細胞系中接種病毒增殖培養，培養過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養溫度為32 38°C、PH值7.2 7.8,DO值為30%_50%，增殖48_72h後，取其上清液，收穫病毒液。
進一步，所述病毒為H5N1亞型禽流感病毒。
本發明的有益效果:
1、本發明培養的細胞系細胞密度>4X106Cells/ml，是滾瓶細胞培養密度的10倍以上，且細胞系的形態好，質量高，培養體積為650L以上。
2、本發明實施例以MDCK細胞為基質，增殖重組H5N1亞型禽流感病毒，具有無外源因子汙染、易於規模化生產、生產線佔用空間小、生產效率高、成本低、能較好的維持病毒抗原穩定等優點。
3、本發明生產的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價不低於1:2048。
圖1實施例中重組病毒增殖生產工藝流程圖。
具體實施方式
下面參考附圖並結合實施例，進一步詳細說明本發明。
實施例中優選，MDCK細胞為普通MDCK細胞，H5N1亞型禽流感病毒為中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供的 重組H5N1亞型禽流感病毒(Re-4、Re-5, Re-6株)，細胞培養反應器為Applikon公司生產，微載體為GE公司的Cytodexl球狀微載體。本發明規模化培養細胞增殖的方法，其包括如下步驟:S1:種細胞培養:將細胞經常規培養後，得到初級細胞；本實施例優選，將MDCK細胞經滾瓶培養，長滿單層後，得到初級MDCK細胞。S2:細胞的逐級放大:將初級細胞接種於細胞培養反應器中進行懸浮培養，加入微載體和培養液，待微載體上的細胞長滿單層後，加入消化細胞胰酶，對細胞和微載體消化分離，經細胞收穫、細胞液濃縮，得到濃縮細胞；將濃縮細胞接種於較大細胞培養反應器中，重複上述細胞培養過程，逐級放大培養，最後得到目標細胞系。優選地，如圖1中S21所示，S21:長滿單層的4個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養反應器的 種子細胞進行懸浮培養，攪拌速度為40 60轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養40 50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.0 2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。如圖1中S22所示，S22:將7升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到30升細胞培養反應器中，攪拌速度為40 60轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養40 50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.0 2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。如圖1中S23所示，S23:將30升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到130升細胞培養反應器中，攪拌速度為35 55轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養40 50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.0 2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮，得到第一細胞系。上述S21 S23步驟中，細胞培養條件為溫度35-38 °C、PH值7.2-7.4、溶解氧(dissolved oxygen, DO)為30%_50%，微載體用量為3_5g/L，增殖48_72h，消化細胞胰酶為乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, EDTA)-胰酶,鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養液主要包括含各種胺基酸和葡萄糖的培養基(Dulbecco’s modified eaglemedium, DMEM)和胎牛血清。在130L-650L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:①用磷酸鹽緩衝液(Phosphate Buffered Saline,PBS)洗漆微載體三次,浸泡4h,然後去掉上清,加入至少8000ml DMEM培養基進行第一次預培養至少12h，去掉上清，再加入至少8000ml DMEM培養基進行第二次培養，同樣至少12h，去掉上清，再加入含5 20%胎牛血清的至少8000ml DMEM培養基進行第三次預培養，培養至少6h後，打入650L細胞培養反應器中，上述操作均無菌操作。預培養指微載體在培養基中浸泡的過程。②如圖1中S24所示，S24包括:I)將130L細胞培養反應器中收穫的第一細胞系打入650L細胞培養反應器中懸浮
培養；2)加入鹼和糖，添加含5 20%胎牛血清的DMEM培養基，控制初始培養體積在150 250L，攪拌速度為35 55轉/min ；3)最初培養的5 IOh,每隔半小時停止攪拌10分鐘；4)20 30h後去掉100 200L上清，加入200 300L含5 20%胎牛血清DMEM培養基，繼續培養；
5)培養至40 50h時，補加含5 20%胎牛血清DMEM培養基至500 600L，繼續培養至70 80h，最後得到細胞密度彡4X106cells/ml的第二細胞系。
上述步驟中，細胞培養條件為溫度35-38 °C、PH值7.2-7.4、DO值為30%_50%，微載體用量為3-5g/L，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。
本發明還涉及通過大規模培養基質細胞以生產病毒的方法。可在本發明實施例中的MDCK細胞中生長的病毒包括所有對MDCK細胞敏感的病毒，其包括但不限於:流感病毒，呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV),副流感病毒,乳多空病毒,水泡性口膜炎病毒，痘苗病毒，柯薩奇病毒，呼腸弧病毒，細小病毒，腺病毒，骨髓灰質炎病毒，麻疫病毒，狂犬病病毒皰疹病毒。優選為H5N1亞型禽流感病毒。
一種通過規模化培養細胞增殖以生產病毒的方法，包括:
如圖1中S25所示，S25:根據H5N1亞型禽流感病毒的病毒感染複數(multiplicity of infection, MOI),在上述實施例中得到的MDCK第二細胞系中接種病毒增殖培養，培養過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養溫度為32 38°C、PH值7.2 7.8、DO值為30%-50%，增殖48_72h後，取其上清液，收穫病毒液，微載體回收重複利用。
參照《中國獸藥典》(2010版)描述的病毒血凝效價的測定方法，測得本發明所得重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價不低於1:2048。
其中，MOI =有感染力的病毒量/細胞總量。
上述的方法實施例中，改變細胞的培養工藝，會得到不同細胞密度的細胞系，不同質量的病毒，下面通過以下的各個實施例詳細說明。
實施例1
將MDCK細胞經滾瓶培養，長滿單層後，得到初級MDCK細胞。
長滿單層的4個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為5升細胞培養反應器的種子細胞進行懸浮培養，攪拌速度為40轉/min,加入微載體、培養液以及鹼和糖,培養40h,待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。
將5升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到25升細胞培養反應器中，攪拌速度為40轉/min,加入微載體、 培養液以及鹼和糖,培養40h,待微載體上的細胞長滿單層,去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。
將25升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到100升細胞培養反應器中，攪拌速度為35轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養40h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮，得到第一細胞系。
上述第一細胞系培養過程中，細胞培養條件為溫度35°C、PH值7.2、DO值為30%，微載體用量為3g/L，增殖48h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養液主要包括DMEM培養基和胎牛血清。
在100L-650L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:
①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然後去掉上清，加入8000ml DMEM培養基進行第一次預培養12h，去掉上清，再加入8000ml DMEM培養基進行第二次培養，同樣12h，去掉上清，再加入含5%胎牛血清的8000ml DMEM培養基進行第三次預培養，培養6h後，打入650L細胞培養反應器中，上述操作均無菌操作。②100L細胞培養反應器中收穫的第一細胞系打入650L細胞培養反應器中懸浮培養，加入鹼和糖，添加含5%胎牛血清的DMEM培養基，控制初始培養體積在150L，攪拌速度為35轉/min，最初培養的5h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。20h後去掉100L上清，加入200L含5%胎牛血清DMEM培養基，繼續培養，培養至40h時，補加含5%胎牛血清DMEM培養基至500L，繼續培養至70h，得到目標細胞系。上述步驟中，細胞培養條件為溫度35°C、PH值7.2、D0值為30%，微載體用量為3g/L，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。根據H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述實施例中得到的MDCK目標細胞系中接種H5N1亞型禽流感病毒增殖培養，培養過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養溫度為32°C、PH值7.2、DO值為30%，增殖48h後，取其上清液，收穫病毒液，微載體回收重複利用。本實施例得到的目標細胞系細胞密度為4X106cells/ml，細胞的形態好，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:2048。實施例2將MDCK細胞經滾瓶培養，長滿單層後，得到初級MDCK細胞。長滿單層的6個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為10升細胞培養反應器的種子細胞進行懸浮培養，攪拌速度為60`轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。將10升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到35升細胞培養反應器中，攪拌速度為60轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。將35升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到200升細胞培養反應器中，攪拌速度為55轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮，得到第一細胞系。上述第一細胞系培養過程中，細胞培養條件為溫度38°C、PH值7.4、DO值為50%，微載體用量為4g/L，增殖72h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養液主要包括DMEM培養基和胎牛血清。在200L-800L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然後去掉上清，加入9000ml DMEM培養基進行第一次預培養14h，去掉上清，再加入9000ml DMEM培養基進行第二次培養，同樣14h，去掉上清，再加入含20%胎牛血清的9000ml DMEM培養基進行第三次預培養，培養8h後，打入800L細胞培養反應器中，上述操作均無菌操作。
②200L細胞培養反應器中收穫的第一細胞系打入800L細胞培養反應器中懸浮培養，加入鹼和糖，添加含20%胎牛血清的DMEM培養基，控制初始培養體積在250L，攪拌速度為55轉/min，最初培養的10h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。30h後去掉200L上清，加入300L含20%胎牛血清DMEM培養基，繼續培養，培養至50h時，補加含20%胎牛血清DMEM培養基至600L，繼續培養至80h，得到目標細胞系。
上述步驟中，細胞培養條件為溫度38°C、PH值7.4,DO值為50%，微載體用量為4g/L，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。
根據H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述實施例中得到的MDCK目標細胞系中接種H5N1亞型禽流感病毒增殖培養，培養過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養溫度為38 °C、PH值7.8、DO值為50%，增殖60後，取其上清液，收穫病毒液，微載體回收重複利用。
本實施例得到的目標細胞系細胞密度為4.5X106cells/ml，細胞的形態好，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:2048。
實施例3
將MDCK細胞經滾瓶培養，長滿單層後，得到初級MDCK細胞。
長滿單層的5個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養反應器的種子細胞進行懸浮培養，攪拌速度為50轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養48h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。
將7升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到30升細胞培養反應器中，攪拌速度為50轉/min,加入微載體、培養液以及鹼和糖,培養48h,待微載體上的細胞長滿單層,去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。
將30升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到130升細胞培養反應器中，攪拌速度為40轉/min，加入微載體、 培養液以及鹼和糖，培養48h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮，得到第一細胞系。
上述第一細胞系培養過程中，細胞培養條件為溫度37°C、PH值7.3、DO值為40%，微載體用量為5g/L，增殖60h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養液主要包括DMEM培養基和胎牛血清。
在130L-700L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:
①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然後去掉上清，加入8500ml DMEM培養基進行第一次預培養13h，去掉上清，再加入8500ml DMEM培養基進行第二次培養，同樣13h，去掉上清，再加入含10%胎牛血清的8500ml DMEM培養基進行第三次預培養，培養7h後，打入700L細胞培養反應器中，上述操作均無菌操作。
②130L細胞培養反應器中收穫的第一細胞系打入700L細胞培養反應器中懸浮培養，加入鹼和糖，添加含10%胎牛血清的DMEM培養基，控制初始培養體積在200L，攪拌速度為40轉/min，最初培養的6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。24h後去掉150L上清，加入250L含10%胎牛血清DMEM培養基，繼續培養，培養至48h時，補加含10%胎牛血清DMEM培養基至550L，繼續培養至72h，得到目標細胞系。上述步驟中，細胞培養條件為溫度37°C、PH值7.3,DO值為40%，微載體用量為5g/L，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。根據H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述實施例中得到的MDCK目標細胞系中接種H5N1亞型禽流感病毒增殖培養，培養過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養溫度為35°C、PH值7.5、DO值為40%，增殖72後，取其上清液，收穫病毒液，微載體回收重複利用。本實施例得到的目標細胞系細胞密度為4.7X106cells/ml，細胞的形態好，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:2048。實施例4將MDCK細胞經滾瓶培養，長滿單層後，得到初級MDCK細胞。長滿單層的4個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養反應器的種子細胞進行懸浮培養，攪拌速度為70轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養45h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積3.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。將7升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到30升細胞培養反應器中，攪拌速度為70轉/min,加入微載體、培養液以及鹼和糖,培養45h,待微載體上的細胞長滿單層,去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積3.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。將30升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到130升細胞培養反應器中，攪拌速度為30轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養45h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積3.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮，得到第一細胞系。上述第一細胞系培養過程中，細胞培養條件為溫度36°C、PH值7.3、DO值為35%，微載體用量為6g/L，增殖55h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養液主要包括DMEM培養基和胎牛血清。在130L-650L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然後去掉上清，加入6000ml DMEM培養基進行第一次預培養10h，去掉上清，再加入6000ml DMEM培養基進行第二次培養，同樣10h，去掉上清，再加入含10%胎牛血清的6000ml DMEM培養基進行第三次預培養，培養4h後，打入650L細胞培養反應器中，上述操作均無菌操作。②130L細胞培養反應器中收穫的第一細胞系打入650L細胞培養反應器中懸浮培養，加入鹼和糖，添加含10%胎牛血清的DMEM培養基，控制初始培養體積在200L，攪拌速度為30轉/min，最初培養的6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。15h後去掉50L上清，加入100L含10%胎牛血清DMEM培養基，繼續培養，培養至40h時，補加含10%胎牛血清DMEM培養基至600L，繼續培養至60h，得到目標細胞系。上述步驟中，細胞培養條件為溫度36°C、PH值7.3,DO值為35%，微載體用量為6g/L，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。根據H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述實施例中得到的MDCK目標細胞系中接種H5N1亞型禽流感病毒增殖培養，培養過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養溫度為35 °C、PH值7.5、DO值為50%，增殖72後，取其上清液，收穫病毒液，微載體回收重複利用。本實施例得到的目標細胞系細胞密度為3.2X106cells/ml，細胞的形態較差，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:1024。實施例5將MDCK細胞經滾瓶培養，長滿單層後，得到初級MDCK細胞。長滿單層的4個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養反應器的種子細胞進行懸浮培養，攪拌速度為60轉/min,加入微載體、培養液以及鹼和糖,培養48h,待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮；收穫到的細胞放大到30升細胞培養反應器中，重複上述步驟，收穫到的細胞放大到130升細胞培養反應器中進行放大懸浮培養，攪拌速度為40轉/min，其他步驟同上，得到第一細胞系。上述第一細胞系培養過程中，細胞培養條件為溫度37°C、PH值7.2-7.4、DO值為50%，微載體用量為5g/L，增殖48h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養液主要包括DMEM培養基和胎牛血清。在130L-650L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然後去掉上清，加入5000ml DMEM培養基進行第一次預培養10h，去掉上清，再加入含10%胎牛血清的5000ml DMEM培養基進行第二次預培養，培養4h後，打入650L細胞培養反應器中，上述操作均無菌操作。②130L細胞培養 反應器中收穫的第一細胞系打入650L細胞培養反應器中懸浮培養，加入鹼和糖，添加含10%胎牛血清的DMEM培養基，控制初始培養體積在200L，攪拌速度為40轉/min，最初培養的6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。24h後去掉150L上清，加入250L含10%胎牛血清DMEM培養基，繼續培養，培養至48h時，補加含10%胎牛血清DMEM培養基至500L，繼續培養至72h。上述步驟中，細胞培養條件為溫度37°C、PH值7.2,DO值為50%，微載體用量為5g/
L，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。根據H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述方法得到的MDCK第二細胞系中接種病毒增殖培養，培養過程中加入濃度為 ο μ g/mL的TPCK-胰酶，培養溫度為35°C、PH值
7.5、DO值為50%，增殖72h後，取其上清液，收穫病毒液，微載體回收重複利用。本實施例得到的目標細胞系細胞密度為3.lX106cells/ml，細胞的形態較差，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:1024。實施例6將MDCK細胞經滾瓶培養，長滿單層後，得到初級MDCK細胞。長滿單層的4個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養反應器的種子細胞進行懸浮培養，攪拌速度為60轉/min,加入微載體、培養液以及鹼和糖,培養48h,待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮；收穫到的細胞放大到30升細胞培養反應器中，重複上述步驟，收穫到的細胞放大到130升細胞培養反應器中進行放大懸浮培養，攪拌速度為40轉/min，其他步驟同上，得到第一細胞系。
上述第一細胞系培養過程中，細胞培養條件為溫度38°C、PH值7.2、DO值為50%，微載體用量為5g/L，增殖48h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養液主要包括DMEM培養基和胎牛血清。
在130L-650L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:
①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然後去掉上清，加入8000ml DMEM培養基進行第一次預培養12h，去掉上清，再加入8000ml DMEM培養基進行第二次培養，同樣12h，去掉上清，再加入含10%胎牛血清的8000ml DMEM培養基進行第三次預培養，培養6h後，打入650L細胞培養反應器中，上述操作均無菌操作。
②130L細胞培養反應器中收穫的第一細胞系打入650L細胞培養反應器中懸浮培養，加入鹼和糖，添加含10%胎牛血清的DMEM培養基，控制初始培養體積在200L，攪拌速度為40轉/min。24h後補加含10%胎牛血清DMEM培養基至500L，繼續培養至72h。
上述步驟中，細胞培養條件為溫度38°C、PH值7.4、D0值為50%，微載體用量為5g/L，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。
根據H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述方法得到的MDCK第二細胞系中接種病毒增殖培養，培養過程中加入濃度為 ο μ g/mL的TPCK-胰酶，培養溫度為35°C、PH值7.5、DO值為50%，增殖72h後，取其上清液，收穫病毒液，微載體回收重複利用。
本實施例得到的目標細胞系細胞密度為4.0X 106cells/ml，細胞的形態較差，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:1024。
實施例7
將MDCK細胞經滾瓶培養，長滿單層後，得到初級MDCK細胞。
長滿單層的5個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養反應器的種子細胞進行懸浮培養，攪拌速度為50轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養48h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。
將7升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到30升細胞培養反應器中，攪拌速度為50轉/min,加入微載體、培養液以及鹼和糖,培養48h,待微載體上的細胞長滿單層,去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮。
將30升細胞培養反應器中收穫到的細胞放大到130升細胞培養反應器中，攪拌速度為40轉/min，加入微載體、培養液以及鹼和糖，培養48h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應器內剩餘液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收穫、細胞液濃縮，得到第一細胞系。
上述第一細胞系培養過程中，細胞培養條件為溫度37°C、PH值7.3、DO值為40%，微載體用量為5g/L，增殖60h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養液主要包括DMEM培養基和胎牛血清。
在130L-700L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:
①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然後去掉上清，打入700L細胞培養反應器中，上述操作均無菌操作。
②130L細胞培養反應器中收穫的第一細胞系打入700L細胞培養反應器中懸浮培養，加入鹼和糖，添加含10%胎牛血清的DMEM培養基，控制初始培養體積在200L，攪拌速度為40轉/min，最初培養的6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。24h後去掉150L上清，加入250L含10%胎牛血清DMEM培養基，繼續培養，培養至48h時，補加含10%胎牛血清DMEM培養基至550L，繼續培養至72h，得到目標細胞系。上述步驟中，細胞培養條件為溫度37°C、PH值7.3,DO值為40%，微載體用量為5g/L，鹼為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。根據H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述實施例中得到的MDCK目標細胞系中接種H5N1亞型禽流感病毒增殖培養，培養過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養溫度為35 °C、PH值7.5、DO值為40%，增殖72後，取其上清液，收穫病毒液，微載體回收重複利用。本實施例得到的目標細胞系細胞密度為2.0X 106cells/ml，細胞的形態較差，得到的重組H5N1亞型禽 流感病毒的血凝效價為1:512。
權利要求
1.一種規模化培養細胞增殖的方法，包括: 將細胞經過逐級放大懸浮培養，得到體積為100 200L的細胞系； 在微載體中加入DMEM培養基預培養； 將預培養後的微載體和所述體積為100 200L的細胞系打入體積為650L以上的細胞培養反應器中，懸浮培養後，得到目標細胞系。
2.如權利要求1所述的規模化培養細胞增殖的方法，其特徵在於:所述體積為100 200L的細胞系的培養過程中，先將細胞經常規培養後，得到初級細胞；再將初級細胞經逐級放大懸浮培養，加入微載體和培養液，待微載體上的細胞長滿單層後，對微載體進行消化，收穫細胞，得到所述體積為100 200L的細胞系。
3.如權利要求1所述的規模化培養細胞增殖的方法，其特徵在於:所述微載體的預培養過程中，先用PBS液對所述微載體洗滌三次，浸泡4h，去掉上清後進行預培養，所述預培養至少三次；加入至少8000ml DMEM培養基進行第一次預培養至少12h，去掉上清；再加入至少8000ml DMEM培養基進行第二次預培養至少12h，去掉上清，再加入含5 20%胎牛血清的至少8000ml DMEM培養基進行第三次預培養，預培養至少6h後打入體積為650L以上的細胞培養反應器中。
4.如權利要求3所述的規模化培養細胞增殖的方法，其特徵在於:所述第一次預培養加入8500ml DMEM培養基培養13h ;所述第二次預培養加入8500ml DMEM培養基培養13h ；所述第三次預培養加入含10%胎牛血清的8500ml DMEM培養基培養7h。
5.如權利要求1所述的規模化培養細胞增殖的方法，其特徵在於:所述目標細胞系的培養過程包括: 1)將預培養後的微 載體和所述體積為100 200L的細胞系打入體積為650L以上的細胞培養反應器中進行懸浮培養，加入含5 20%胎牛血清的DMEM培養基，攪拌速度為35 55 轉 /min ； 2)懸浮培養的前5 IOh中，每隔半小時停止攪拌10分鐘； 3)培養20 30h後，去掉100 200L上清，加入200 300L含5 20%胎牛血清DMEM培養基，繼續培養； 4)培養至40 50h時，加入含5 20%胎牛血清DMEM培養基至500 600L，繼續培養至70 80h。
6.如權利要求5所述的規模化培養細胞增殖的方法，其特徵在於:所述步驟I)中，細胞培養反應器內的初始培養體積為150 250L。
7.如權利要求6所述的規模化培養細胞增殖的方法，其特徵在於: 所述步驟I)中，所述DMEM培養基中胎牛血清的含量為10%，所述初始培養體積為200L，所述攪拌速度為40轉/min ； 所述步驟2)中，懸浮培養的前6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘； 所述步驟3)中，24h後去掉150L上清，所述DMEM培養基含有10%胎牛血清，加入量為250L ； 所述步驟4)中，培養至48h時，所述DMEM培養基含有10%胎牛血清，加入所述DMEM培養基至反應器內培養體積為550L，繼續培養至72h。
8.如權利要求1 7任一項權利要求所述的規模化培養細胞增殖的方法，其特徵在於:所述細胞為犬腎細胞MDCK細胞。
9.一種以如權利要求1所述的規模化培養細胞增殖的方法培養的細胞係為基質生產病毒的方法，其特徵在於:根據MOI值，在所述目標細胞系中接種病毒增殖培養，培養過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養溫度為32 38°C、PH值7.2 7.8、DO值為30%-50%，增殖48-72h後，取其上清液，收穫病毒液。
10.如權利要求9所 述的方法，其特徵在於:所述病毒為H5N1亞型禽流感病毒。
全文摘要
本發明涉及一種規模化培養細胞增殖的方法及其將增殖細胞用於生產病毒的方法，規模化培養細胞增殖的方法，包括將細胞經過逐級放大懸浮培養，得到體積為100～200L的細胞系；在微載體中加入DMEM培養基預培養；將預培養後的微載體和所述體積為100～200L的細胞系打入體積為650L以上的細胞培養反應器中，懸浮培養後，得到目標細胞系。在所述目標細胞系中接種病毒增殖培養，得到病毒液。本發明培養的細胞系細胞密度≥4×106cells/ml，培養體積為650L以上，且細胞系的形態好，質量高。
文檔編號C12N7/00GK103160457SQ201310127308
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月11日 優先權日2013年4月11日
發明者李朝陽, 劉延麟, 李明義, 喬彥良 申請人:山東信得動物疫苗有限公司