定量測定小而密ldl膽固醇的方法和試劑盒的製作方法

2023-10-30 10:55:42 1

專利名稱：定量測定小而密ldl膽固醇的方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及測定小而密LDL中膽固醇的方法和試劑，這對於動脈硬化的診斷是重 要的。
背景技術：
膽固醇是細胞的一種重要組分，也是臨床上重要的組分，因為過高水平的膽固醇 導致在內皮下間隙中的巨噬細胞攝取膽固醇後使巨噬細胞轉化為泡沫細胞(foam cell)並 繼而導致動脈硬化的原發病灶的發展。低密度脂蛋白(LDL)在血液的膽固醇運輸中起主要 作用並且是動脈硬化的危險因素。已知小而密LDL，其在LDL中粒度特別小並且與標準LDL 相比密度更高，具有多於正常LDL數倍水平的致動脈粥樣化的能力。小而密LDL的增加是動 脈硬化的主要危險因素之一。因此在臨床上進行此類小而密LDL的分級測定(fractional measurement)是非常重要的用於測定小而密LDL的常規方法的實例包括超速離心法、電泳法以及使用高效液 相色譜的方法。由於這些方法需要昂貴的設備和大量測量時間，因此並不方便。一種利用自動分析儀測量小而密LDL的方法的實例是以下方法(參見日本專利公 布(Kokai)第2003-28882A號)，該方法涉及利用離子強度差異將小顆粒LDL懸浮或溶解， 然後利用吸光度差異對小顆粒LDL進行測定。然而，吸光度差異依照上述方法是基於濁度 測定的。因此不能測定小而密LDL中膽固醇，因而特異性和準確度不足。此外，已知一種方法(參見國際專利公布W02004/053500)，該方法涉及通過使用 包含聚陰離子和二價陽離子的分離劑與適合於自動分析儀的試劑的組合來測量小而密LDL 中的膽固醇或三醯甘油。該方法能夠比超速離心法或電泳法更方便地測量小而密LDL中的 脂質組分。此外，該方法的特異性和準確度極好。但是該方法需要預處理試樣並需要將LDL 分離成小而密LDL和除這種LDL之外的LDL的步驟。本發明的公開內容本發明要實現的目標本發明的一個目標是提供一種適用於自動分析儀的分級測定小而密LDL的方法 以及用於此類測定的試劑，所述方法和試劑能夠在無需預處理試樣下進行具有良好特異性 的、快速且方便的分析。實現該目標的手段作為集中研究的結果，本發明人完成了一種用於測量小而密LDL的新方法。具體 而言，當利用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶測量含各種脂蛋白的樣品中的膽 固醇時，酶對除小而密LDL之外的LDL的反應速率增加的程度大於酶對小而密LDL的反應 速率增加的程度，這是由於利用了磷脂酶特異性地與特定底物反應。因此，通過利用過氧化 氫酶和4-氨基安替比林可清除除小而密LDL之外的LDL中的膽固醇並將其排除在反應體 系之外。其後，使用用於膽固醇測定的酶進行酶反應，以便可對LDL中、特別是小而密LDL 中的膽固醇進行測定。此外，當在將除小而密LDL之外的LDL排除在反應體系之外的反應前或反應後加入與除LDL之外的脂蛋白(例如HDL和VLDL)反應的特定表面活性劑時，所 述特定表面活性劑與除LDL之外的脂蛋白(例如HDL和VLDL)反應，致使可通過過氧化氫 酶或4-氨基安替比林清除HDL或VLDL中的膽固醇並將其排除在反應體系之外。用於清除 除小而密LDL之外的LDL的此類反應和用於經由脂蛋白(例如HDL和VLDL)與特定表面活 性劑的反應清除HDL或VLDL中的膽固醇的反應可同時進行，以便可將除小而密LDL之外的 脂蛋白清除並將其排除在反應體系之外。由此剩餘的小而密LDL與用於膽固醇測定的酶反 應，致使可成功地分級並單獨測定小而密LDL中的膽固醇。此外，指定表面活性劑的類型和 酶的濃度以便可使以下兩種反應在同一溶液中順利進行用於清除除小而密LDL之外的上 述脂蛋白以將其排除在反應體系之外的反應和用於清除HDL和VLDL中的膽固醇以將其排 除在反應體系之外的反應。因此，本發明得以完成。本發明為如下所述。[1] 一種用於定量測定樣品中的小而密LDL膽固醇的方法，該方法包括以下步驟(1)在磷脂酶存在下清除除小而密LDL之外的LDL中的膽固醇，以及隨後(2)定量測定小而密LDL中的膽固醇。[2]根據[1]的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中步驟⑴中採用的磷 脂酶與至少鞘磷脂和/或磷脂醯肌醇具有高反應性，其為存在於脂蛋白中的磷脂。[3]根據[1]或[2]的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中步驟⑴中使 用的磷脂酶的濃度範圍為0. lU/mL-100U/mL。[4]根據[1]_[3]中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其在中步驟 (2)中在至少作用於小而密LDL的表面活性劑的存在下加入用於膽固醇測定的酶。[5]根據[4]的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步驟⑵中使用的 至少作用於小而密LDL的表面活性劑是作用於所有脂蛋白的表面活性劑。[6]根據[4]或[5]的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步驟⑵中 使用的至少作用於小而密LDL的表面活性劑為聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物、或 HLB為11以上且小於14的聚氧乙烯衍生物。[7]根據[1]_[6]中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，所述方法還 包括在膽固醇酯酶存在下清除樣品中除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的步驟(a)，該步驟 在步驟(2)之前並在步驟(1)之前、之後或同時實施。[8]根據[7]的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中步驟(a)中使用的膽 固醇酯酶的濃度範圍為0. 01U/mL-10U/mL。[9]根據[7]或[8]的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步驟(a)中 還加入作用於除LDL之外的脂蛋白的表面活性劑。[10]根據[9]的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中步驟(a)中使用的 表面活性劑的濃度範圍為0. 05% -1. 0%。[11]根據[7]_[10]中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步 驟(a)中還加入膽固醇氧化酶和過氧化氫酶。[12]根據[7]_[10]中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步 驟(a)中還加入4-氨基安替比林。[13]根據[7]_[12]中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中步驟(a)的反應和步驟(1)的反應在同一溶液中同時進行。[14]根據[7]_[13]中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中步驟 (a)中採用的表面活性劑為選自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚 和聚氧乙烯烷基胺的非離子型表面活性劑；選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基硫酸鹽、醯胺 醚硫酸鹽、烷基牛磺酸鹽和磷酸鹽型表面活性劑的陰離子型表面活性劑；選自烷基甲基銨 鹽、季銨鹽和單直鏈烷基型表面活性劑的陽離子型表面活性劑；或者選自月桂基甜菜鹼、二 甲基烷基甜菜鹼、咪唑啉型表面活性劑以及烷基二氨基乙基甘氨酸鈉的兩性表面活性劑。[15] 一種用於定量測定小而密LDL膽固醇的試劑盒，所述試劑盒包含至少以下兩 類試劑組合物(i)用於清除樣品中除小而密LDL之外的LDL中的膽固醇的試劑組合物，該試劑組 合物含有至少與除小而密LDL之外的LDL反應的磷脂酶；(ii)用於測定小而密LDL的試劑組合物，其包含僅與小而密LDL或其衍生物反應的作為聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚物的表面活性 劑；或作為HLB在11以上且小於14的聚氧乙烯衍生物的表面活性劑；4-氨基安替比林；和過氧化物酶。[16]根據[15]的用於定量測定小而密LDL膽固醇的包含至少3種試劑組合物的 試劑盒，所述試劑盒還包含(iii)用於清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的試劑組合物， 所述試劑組合物包含選自至少聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基胺 的非離子型表面活性劑；選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基硫酸鹽、醯胺醚硫酸鹽、烷基牛 磺酸鹽和磷酸鹽型表面活性劑的陰離子型表面活性劑；選自烷基甲基銨鹽、季銨鹽和單直 鏈烷基型表面活性劑的陽離子型表面活性劑；或者選自月桂基甜菜鹼、二甲基烷基甜菜鹼、 咪唑啉型表面活性劑以及烷基二氨基乙基甘氨酸鈉的兩性表面活性劑。[17]根據[15]的用於定量測定小而密LDL膽固醇的試劑盒，所述試劑組合物⑴ 還包含選自至少聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基胺的非離子型表 面活性劑；選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基硫酸鹽、醯胺醚硫酸鹽、烷基牛磺酸鹽和磷酸 鹽型表面活性劑的陰離子型表面活性劑；選自烷基甲基銨鹽、季銨鹽和單直鏈烷基型表面 活性劑的陽離子型表面活性劑；或者選自月桂基甜菜鹼、二甲基烷基甜菜鹼、咪唑啉型表面 活性劑以及烷基二氨基乙基甘氨酸鈉的兩性表面活性劑，由此通過所述試劑組合物(i)清 除樣品中除小而密LDL之外的脂蛋白中的膽固醇。[18]根據[15]_[17]中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的試劑盒，其中 磷脂酶與脂蛋白中存在的磷脂中的至少鞘磷脂和/或磷脂醯肌醇具有高反應性。本發明的效果通過將含有本發明的特定表面活性劑的試劑(即磷脂酶)加入含有脂蛋白的樣品 中，在無需利用過濾器或離心進行分離的情況下可直接且選擇性地測量脂蛋白中的小而密 LDL。本說明書包括日本專利申請第2007-264908號的說明書和/或附圖所公開的部分 或全部內容，它是本申請的優先權文件。
附圖簡述

圖1顯示了以下兩種方法之間的相關性本發明的方法，其包括3個步驟，其中第一步是清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固 醇以將所述膽固醇排除在反應體系之外並採用磷脂酶A2作為磷脂酶的步驟；和採用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法。圖2顯示了以下兩種方法之間的相關性本發明的方法，其包括3個步驟，其中第一步是清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固 醇以將所述膽固醇排除在反應體系之外並採用磷脂酶C作為磷脂酶的步驟；和採用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法。圖3顯示了以下兩種方法之間的相關性本發明的方法，其包括3個步驟，其中第一步是清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固 醇以將所述膽固醇排除在反應體系之外並採用磷脂酶D作為磷脂酶的步驟；和採用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法。圖4顯示了以下兩種方法之間的相關性本發明的方法，其包括3個步驟，其中第一步是清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固 醇以將所述膽固醇排除在反應體系之外並採用溶血磷脂酶作為磷脂酶的步驟；和採用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法。圖5顯示了以下兩種方法之間的相關性本發明的方法，其包括3個步驟並採用特異性針對甘油磷脂的磷脂酶作為磷脂 酶；和採用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法。圖6顯示了以下兩種方法之間的相關性本發明的方法，其包括3個步驟，其中第一步是清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固 醇以將所述膽固醇排除在反應體系之外並採用鞘磷脂酶作為磷脂酶的步驟；和採用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法。圖7顯示了以下兩種方法之間的相關性本發明的方法，其包括3個步驟，其中第一步是清除LDL中除小而密LDL之外的 LDL(LLDL)中的膽固醇以將所述膽固醇排除在反應體系之外並採用鞘磷脂酶作為磷脂酶的 步驟；和採用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法。圖8顯示了以下兩種方法之間的相關性本發明的方法，其包括2個步驟，該方法採用鞘磷脂酶作為磷脂酶並且採用 EMULGEN B-66和EMULGEN A-90作為表面活性劑；禾口採用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法。圖9顯示了以下兩種方法之間的相關性本發明的方法，其包括3個步驟，該方法採用鞘磷脂酶作為磷脂酶並採用EMULGEN B-66作為表面活性劑；和採用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法。圖10顯示了以下兩種方法之間的相關性
本發明的方法，其包括2個步驟，該方法採用鞘磷脂酶作為磷脂酶並採用EMULGEN A-90作為表面活性劑；和採用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法。圖11顯示了以下兩種方法之間的相關性本發明的方法，其包括2個步驟，該方法採用鞘磷脂酶作為磷脂酶並且沒有使用 表面活性劑；和採用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法。實施本發明的最佳方式將如下詳細解釋本發明。脂蛋白可粗略分級為VLDL、LDL和HDL。進一步將LDL分級為小而密LDL及其它 亞級分。小而密LDL也被稱為小顆粒LDL、SLDL(小LDL)、緻密性LDL或sd LDL0除此之外 的LDL也可被稱為LLDL(大LDL)或輕LDL。這些級分與亞級分可根據粒度或密度區別開 來。VLDL的粒度(或粒徑)範圍為30nm-80nm(30nm-75nm)，LDL的粒度(或粒徑)範圍為 22nm-28nm(19nm-30nm)，而HDL的粒度(或粒徑)範圍為7nm_10nm，然而這些數字可隨研究 人員的變化而變化。VLDL的密度為1. 006 (g/Ι)以下，LDL的密度範圍為1. 019-1. 063 (g/Ι)， 而HDL的密度範圍為1. 063-1. 21 (g/1)。LDL顆粒的直徑可通過梯度凝膠電泳(GGE) (JAMA, 260，第 1917-21 頁，1988)或 NMR(脂蛋白測試手冊(HANDBOOK OF LIP0PR0TEINTESTING), 第二版，編者 Nader Rifai 等人·第 609-623 頁，AACCPRESS The Fats of Life Summer 2002, LVDD 15 YEARANNIVERSARY ISSUE, Volume AVI No. 3，第 15-16 頁)進行測定。密 度可基於通過超速離心的分析進行測定(Atherosclerosis，106，第241-253頁，1994 Atherosclerosis,83,H 59 頁，1990)。由本發明方法測定的小而密LDL通常是LDL級分中直徑範圍為約22. Onm-約 25. 5nm、密度範圍為1. 040-1. 063 (g/Ι)的亞級分。為何要基於粒度對LDL進行亞分級的原 因是LDL中的小LDL需要分級測定，因為這種具有小粒度的LDL具有引發動脈硬化的高傾 向並且惡性程度顯著高於其它LDL。LDL的直徑和密度分布是連續的。因此，不可能清楚 地確定會導致特別高程度的惡性的具有前述水平以上密度的LDL。因此，1. 040-1. 063 (g/ 1)的密度範圍並不構成小而密LDL的確定特徵，而是通過在1.019-1. 063 (g/Ι)之間的 密度範圍在中心點處劃分得到的值，這是已經被廣泛採用且建立完善的方法。例如，在 另一報告中，將小而密LDL在1.044-1. 060 (g/Ι)之間的範圍內分級(Atherosclerosis 106241-253,1994)。關於如何設定小而密LDL的密度範圍在研究人員中有一定差異。在所 有情形中，當利用以上密度範圍進行分級時，小而密LDL的存在與臨床惡性相關。在本發明中，術語「小而密LDL」是指在LDL中具有低密度並且在臨床上具有比其 它LDL更高的引發動脈硬化的傾向的LDL。優選地，小而密LDL具有高於在LDL的整個密度 範圍內中心點處的密度。更優選地，小而密LDL的密度範圍為1.040-1. 063 (g/L)。此外， 術語「除LDL之外的脂蛋白」是指VLDL和HDL。該術語還可指乳糜微粒、IDL (中密度脂蛋 白)和HDL(極高密度脂蛋白)。本發明的方法包括以下步驟清除LDL中除小而密LDL之外的LDL(LLDL)中的膽固醇，以將膽固醇排除在反應 體系之外；
清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇，以將膽固醇排除在反應體系之外；和測定小而密LDL。對於從LDL中清除除小而密LDL之外的LDL(L LDL)中的膽固醇以將膽固醇排除 在反應體系之外的上述步驟和清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇以將所述膽固醇排除 在反應體系之外的上述步驟，本文還可應用合適的技術將這樣的膽固醇排除在反應體系之 外，而非在除小而密LDL之外的LDL(L LDL)中或除LDL之外的脂蛋白中將膽固醇清除。特 別地，使用例如涉及HDL、VLDL、L LDL等中所含的此類膽固醇的聚集反應或抑制其在隨後步 驟中的反應的已知技術可將HDL、VLDL、L LDL等中所含的膽固醇排除在反應體系之外，致使 小而密LDL膽固醇的定量測定不受影響。在將除小而密LDL之外的LDL(L LDL)中的膽固醇從LDL中排除在反應體系之外 的步驟中，認為除所述反應(通過該反應在該步驟中除小而密LDL之外的LDL(L LDL)中的 膽固醇被排除在反應體系之外)之外還發生另一種反應。這樣的「另一種反應」在本發明 的方法是可接受的，只要該反應不會影響本發明的目的(即小而密LDL的分級測定)即可。 這樣的「另一種反應」的實例是將除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇排除在反應體系之外的 反應。該反應是可接受的，因為它一般不會影響小而密LDL的分級測定。本發明的方法通常在自動分析儀內進行。在本發明方法的清除除小而密LDL之外的LDL(大LDL ；LLDL)中的膽固醇以將膽 固醇排除在反應體系之外的步驟中使用磷脂酶。磷脂酶與L LDL的反應速率大於與小而 密LDL的反應速率。因此，當使用L LDL(在LDL中)作為底物時，磷脂酶選擇性地增大了 酶反應速率。磷脂酶是與磷脂反應的酶的總稱。磷脂酶的實例包括磷脂酶A2、磷脂酶C和 磷脂酶D。任何種類的磷脂酶可用於本發明。此外，在磷脂當中，本發明適當地可採用對鞘 磷脂具有高反應性(鞘磷脂酶活性)的磷脂酶(鞘磷脂酶)和對磷脂醯肌醇具有高反應性 的磷脂酶等。對鞘磷脂具有高反應性(鞘磷脂酶活性)的上述磷脂酶、對磷脂醯肌醇具有 高反應性的磷脂酶等也可對磷脂醯膽鹼等(另一種磷酸)具有反應性。上述磷脂酶在試劑 中的濃度優選範圍為0. lU/mL-100U/mL、並更優選範圍為0. 2U/mL_20U/mL。在反應時所述 酶在反應液中的濃度優選範圍為0. 05U/mL-100U/mL、並更優選範圍為0. lU/mL_20U/mL。此 外，除具有高鞘磷脂酶活性的磷脂酶和/或對磷脂醯肌醇具有高反應性的磷脂酶之外，還 可採用其它類型的磷脂酶，例如磷脂酶A2、磷脂酶D和溶血磷脂酶。對於上述磷脂酶，可適 當地採用對鞘磷脂具有高特異性的磷脂酶或對磷脂醯肌醇具有高特異性的磷脂酶。優選可 採用來自細菌、酵母或人胎盤的磷脂酶。磷脂酶的優選具體實例包括但不限於PLA2、PLC、 PLD、LYPL、PLDP、SPC、PI-PLC(Asahi Kasei Corporation)、來源於賭狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)的鞘磷脂酶、來源於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的鞘磷脂酶、磷脂 酶C和來源於蠟狀芽孢桿菌的磷脂醯肌醇特異性的磷脂酶(SIGMA)。在清除L LDL中的膽固醇的步驟中可使用或不使用表面活性劑。使用優選的表面 活性劑能夠加速L LDL中的膽固醇的清除。當使用表面活性劑時，可優選使用與清除除隨 後的LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)中的膽固醇的步驟中所用的表面活性劑的相同 表面活性劑。此外，也可加入與所述實例不同的合適的表面活性劑。當在清除L LDL中膽固醇的步驟前實施清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的步 驟時，在清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的步驟中的各組分在接受清除L LDL中膽固醇的後續步驟時保持完整。因此，用於清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的一種或多種 表面活性劑也可用於清除L LDL中膽固醇的步驟中。在清除L LDL中膽固醇的上述步驟中，膽固醇酯酶在磷脂酶存在下作用於L LDL, 由此得到的膽固醇在與膽固醇反應的酶(例如膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶)的存在下被 反應並清除。在此之後，L LDL中的膽固醇被排除在反應體系之外。當在清除L LDL中膽 固醇的步驟中使用表面活性劑時，膽固醇酯酶和表面活性劑在磷脂酶存在下作用於L LDL, 由此得到的膽固醇在與膽固醇反應的酶(膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶)的存在下被反 應並清除，從而使L LDL中的膽固醇被排除在反應體系之外。這裡，短語「表面活性劑作用 於...(與...反應)」是指其中表面活性劑與脂蛋白結合以改變或降解脂蛋白的情形，例 如致使脂蛋白中的膽固醇釋放。例如當「表面活性劑作用於除LDL之外的脂蛋白(與除LDL 之外的脂蛋白反應)」時，並不要求所述表面活性劑完全不作用於LDL，而是可主要作用於 除LDL外的脂蛋白。例如，作用於除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑對小而密LDL 的作用小於其對除小而密LDL之外的脂蛋白的作用。術語「清除」意指降解樣品中的物質 以防止在後續步驟中檢測到降解產物。這就是說，短語「清除L LDL中脂蛋白的膽固醇」意 指降解樣品中的L LDL並繼而避免降解產物；即防止在後續步驟中檢測到L LDL中的膽固 醇。用於清除的方法的實例包括但不限於涉及用過氧化氫酶將過氧化氫(由使膽固醇酯酶 或膽固醇氧化酶起作用而產生)降解為水和氧的方法以及涉及用過氧化物酶致使氫供體 與過氧化氫反應從而實現轉換為無色醌的方法。在本發明中，短語「排除在反應體系之外」是指以下體系其中HDL、VLDL、L LDL等 中所含的膽固醇被清除、聚集或抑制以避免在後續步驟中所述膽固醇的反應，例如為了防 止HDL、VLDL和L LDL等中所含的此類膽固醇影響小而密LDL膽固醇的定量測定。在本發明中，除了上述在磷脂酶存在下清除L LDL中膽固醇的步驟之外，還可實施 清除除LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)中的膽固醇的步驟。清除除LDL之外的脂蛋 白(例如VLDL和HDL)中的膽固醇的步驟可在清除L LDL中膽固醇的步驟之前、之後或者 同時進行。在清除除LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)中的膽固醇的步驟中，VLDL和HDL 中的膽固醇在表面活性劑存在下被清除，所述表面活性劑作用於除LDL之外的脂蛋白(例 如VLDL和HDL)但不與LDL反應。作用於除LDL之外的VLDL和HDL等並與其反應的此類表 面活性劑的實例為HLB為13-15的聚氧乙烯衍生物。此類表面活性劑在試劑中的濃度優選 範圍為0.3% (重量/體積)_5% (重量/體積)、更優選範圍為0.5% (重量/體積)_3% (重量/體積)。在反應時其在反應液中的濃度優選範圍為0. 15% _5%、並更優選範圍為 0. 25% (重量/體積)_3% (重量/體積)。此類衍生物的實例包括高級醇縮合物、高級脂 肪酸縮合物、高級脂肪醯胺縮合物、高級烷基胺縮合物、高級烷基硫醇縮合物和烷基酚縮合 物。HLB為13-15的聚氧乙烯衍生物的優選具體實例包括但不限於HLB為13-15的化合物， 例如聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油醯基醚、聚氧乙烯高級醇醚和 聚氧乙烯烷基苯基醚。以上表面活性劑的具體實例包括EMULGEN B-66(聚氧乙烯衍生物) 和EMULGEN A-90 (聚氧乙烯聯苯乙烯苯基醚)。當在清除L LDL中膽固醇的步驟中採用不與小而密LDL反應而僅與L LDL反應的 表面活性劑，例如HLB為13-15的表面活性劑時，可加入選自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯烷基胺的非離子型表面活性劑；選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基硫酸鹽、 醯胺醚硫酸鹽、烷基牛磺酸鹽和磷酸鹽型表面活性劑的陰離子型表面活性劑；選自烷基甲 基銨鹽、季銨鹽和單直鏈烷基型表面活性劑的陽離子型表面活性劑；或者選自月桂基甜菜 鹼、二甲基烷基甜菜鹼、咪唑啉型表面活性劑以及烷基二氨基乙基甘氨酸鈉的兩性表面活 性劑。所述非離子型表面活性劑的具體實例包括EMULGEN B-66、EMULGEN A_90、EMULGEN 120 禾口 EMULGEN920 (Kao 公司)、NONION HS-220、NONION HS-215、N0NI0NK-230、NONION NS-220,NONION NS-230,NYMEEN F-215,NYMEEN L-207和 ADEKA TOL LB-1520 (ADEKA公司)。 所述陰離子型表面活性劑的具體實例包括EMAL 20CM、EMAL 20T、EMAL E27C和LEVEN0L WX(Kao 公司)、SUNAMIDE CF-3、SUNAMIDE CF-10、DIAPON K、DIAPON F、DIAPON K-SF, PERSOFT EF、PERSOFT EFT、PERSOFT EL、PERSOFT EP、PERS0FT ΕΚ、PERSOFT SL、POLYSTAR 0MP、ADEKA C0LPS-440E和TRAX K_40 (ADEKA公司)。所述陽離子型表面活性劑的具體實例 包括QUARTAMIN24P (Kao公司)和ADEKA MINEMAC-30 (ADEKA公司)。所述兩性表面活性劑 的具體實例包括 AMPHITOL 24B (Kao 公司)、NISSAN ANON LG、NISSAN ANONBDF-R、NISSAN ANON BF,NISSAN ANON BL,NISSAN ANONBL-SF 和 NISSAN ANON GLM-R-LV0 以上表面活性劑 在試劑中的濃度優選範圍為約0.01% (重量/體積)_1.0% (重量/體積)並更優選範圍 為約0.10% (重量/體積)_0.50% (重量/體積)。在反應時此類表面活性劑在反應液 中的濃度優選範圍為約0.005% (重量/體積)_1.0% (重量/體積)並更優選範圍為約 0. 05% (重量/體積)-0. 50% (重量/體積)。在以上表面活性劑存在下，膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶起作用以從膽固醇產生過 氧化氫，由此產生的過氧化氫隨後被清除。用於清除過氧化氫的方法的實例包括但不限於 涉及使過氧化氫酶起作用以將過氧化氫降解為水和氧氣的方法和涉及用過氧化物酶使苯 酚或苯胺氫供體化合物與過氧化氫反應以實施轉化為無色醌的反應。膽固醇酯酶在反應液 中的濃度的優選範圍為約0. 010U/mL-10U/mL。此外，可採用來自細菌或酵母的膽固醇氧化 酶。所述膽固醇氧化酶在反應液中的濃度的優選範圍為約0. lU/mL-0. 7U/mL。此外，過氧化 氫酶在反應液中的濃度的優選範圍為約40U/mL-500U/mL。此外，當過氧化氫被轉化為無色 奎寧時，過氧化物酶在反應液中的濃度的優選範圍為0. 4U/mL-l. 0U/mL並且這樣的苯酚或 苯胺氫供體化合物在反應液中的濃度的優選範圍為0. 4mmol/L-0. 8mmol/L。在清除L LDL的步驟或清除除LDL之外的HDL、VLDL等的步驟或所述兩個步驟中 可使用與清除有關的上述組分，例如膽固醇氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和苯酚或苯胺 氫供體化合物。在清除L LDL中膽固醇的步驟中所用試劑的量和在清除除LDL之外脂蛋白中膽固 醇的步驟中所用試劑的量可視各組分的濃度範圍而定。例如，假設在清除除LDL之外的脂 蛋白中的膽固醇的步驟中所用表面活性劑的濃度為3g/L，則在清除L LDL中膽固醇的步驟 中不加入表面活性劑，並且在清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的步驟中使用的試劑與 在清除L LDL中膽固醇的步驟中所用試劑的液體體積比為1 1。當樣品量較少時，所述步 驟中表面活性劑的濃度為約1.5g/L。照此，試劑的組成和所加入試劑的量可視反應時所需 試劑的濃度而定。通過清除L LDL中的膽固醇的步驟和清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的步 驟，已作用於上述表面活性劑和膽固醇酯酶並與其反應的脂蛋白中的膽固醇與對膽固醇起
11反應的酶(例如膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶)反應，以使所述膽固醇排除在反應體系之 外。除LDL和L LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)中的膽固醇通過所述反應被排除在 反應體系之外，致使在後續步驟中小而密LDL單獨作為脂蛋白保留在反應液中。在本發明 中，清除除小而密LDL之外的脂蛋白並隨後將其排除在反應體系之外以防止在後續步驟中 檢測到除小而密LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的此類程序也可被稱作「將小而密LDL從除 小而密LDL之外的脂蛋白中區分開」。此外，通過調整在上述表面活性劑存在下膽固醇酯酶的濃度，可改變與膽固醇酯 酶反應的脂蛋白的類型，從而使選擇性地清除除小而密LDL之外的脂蛋白成為可能。隨著 反應時膽固醇酯酶的濃度的增大，首先L LDL，特別是(在LDL之中)與酶的反應性增大，因 此其被排除在反應體系之外。然而，當在濃度不特別高的範圍之內時，小而密LDL與酶的反 應性沒有顯示出增大。此外，當膽固醇酯酶的濃度增大時，小而密LDL與酶的反應性增大。 因此，當將膽固醇酯酶以一定範圍內的濃度(在此範圍內L LDL與酶之間的反應性高而小 而密LDL與酶之間的反應性低)內加入時，小而密LDL可被選擇性地測定。因此，通過將 膽固醇酯酶的濃度調整至特定範圍內時，可更選擇性地測定小而密LDL。在用於清除L LDL 中膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟的反應液中，或在用於清除除LDL之外脂蛋白 中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟的反應液中，膽固醇酯酶的濃度優選範圍為 0. lU/mL-3. OU/mL、更優選範圍為 0. 3U/mL_2. 5U/mL、特別優選範圍為 0. 6U/mL_2. OU/mL。本 發明所使用的膽固醇酯酶不受到特別限制，只要它是水解膽固醇酯的酶即可。可採用來自 動物或微生物的膽固醇酯酶。本文所用的膽固醇脫 氫酶不受到特別限制，只要其是能夠氧化膽固醇以還原被氧 化的輔酶的酶即可。可採用動物或微生物來源的膽固醇脫氫酶。膽固醇脫氫酶在反應液中 的濃度優選範圍為0. 01U/mL-200U/mL，特別優選範圍為0. lU/mL_100U/mL。還可將脂蛋白酶任意加入用於清除L LDL中膽固醇的步驟和/或清除除LDL之 外脂蛋白中膽固醇的步驟的反應液中以調節對各種脂蛋白的作用。作為所述脂蛋白酶，可 使用脂蛋白脂肪酶。本文所用的脂蛋白脂肪酶不受到特別限制，只要其是能夠降解脂蛋白 的酶即可。可使用動物或微生物來源的脂蛋白脂肪酶。此類脂蛋白脂肪酶在反應液中的濃 度優選範圍為0. 01U/mL-10U/mL、更優選範圍為0. 01U/mL_5U/mL、特別優選範圍為0. OlU/ mL-lU/mL0本發明的清除L LDL中膽固醇的步驟和清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的 步驟可在同一試劑中同時實施。在這種情況下，膽固醇酯酶在反應液中的濃度優選範圍為 0. 5U/mL-2. OU/mL。作為本文所用的表面活性劑，清除L LDL中膽固醇的步驟和/或清除除 LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的步驟中所用表面活性劑可照原樣使用。此類表面活性劑在 反應液中的濃度優選範圍為0.05% (重量/體積)_0.3% (重量/體積)。此外，磷脂酶在 反應液中的濃度優選範圍為0. lU/mL-30U/mL。在本發明中，在清除L LDL中的膽固醇和清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇這 兩個步驟中剩餘的未反應的小而密LDL中的膽固醇可在後續步驟中被定量測定。用於定 量測定LDL的常用方法可用於所述定量測定步驟中。此類方法的實例包括涉及加入LDL 絮凝劑並隨後通過比濁測定來定量測定由此形成的LDL特異性聚集物含量的方法、涉及用 LDL特異性抗體進行抗原抗體反應的方法以及涉及利用酶定量測定降解產物的方法。在這些方法中，優選的方法涉及利用酶定量測定降解產物的方法。具體而言，所述方法涉及加入 用於膽固醇測定的酶(例如膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶)並釋放和降解小 而密LDL中的膽固醇，並隨後定量測定反應產物。在定量測定步驟中，將至少作用於小而密 LDL的表面活性劑用於小而密LDL中的膽固醇的定量測定。至少作用於小而密LDL的此類 表面活性劑可為僅作用於小而密LDL的表面活性劑、還作用於除小而密LDL之外的其它脂 蛋白的表面活性劑或作用於所有脂蛋白的表面活性劑。作為僅作用於小而密LDL的表面活性劑，可適當地採用聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚 物或其衍生物。聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚物或其衍生物的實例包括基於Pluronic (商標) 的表面活性劑(例如 BASF 和 ADEKA 公司)例如 Pluronic 17R-4,Pluronic L-64,Pluronic PE3100、Pluronic P_85、Pluronic F_88、Pluronic P-103 禾口 Pluronic F-127。作為作用於所有脂蛋白的表面活性劑，可採用任何市售的表面活性劑，只要其在 用於總膽固醇測定的試劑等中使用即可。此類表面活性劑的優選實例為HLB在11以上且 小於14的聚氧乙烯衍生物、優選HLB在12以上且小於14的聚氧乙烯衍生物。此類表面 活性劑的具體實例包括聚氧乙烯壬基苯基醚(EMULGEN 909 (Kao公司))、聚氧乙烯烷基醚 (EMULGEN 707 (Kao 公司)和 EMULGEN709 (Kao 公司))。在定量測定小而密LDL的步驟中所用的反應液中，表面活性劑的濃度優選範圍為 約0. 01 % (重量/體積)-10% (重量/體積)、更優選範圍為約0. 1 % (重量/體積)-5% (重量/體積)。當採用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作為在定量測定小而密LDL的步驟中用於膽 固醇測定(與膽固醇反應)的酶時，酶反應產生過氧化氫。在過氧化物酶存在下通過與氫 供體和氫受體的偶聯反應使由此產生的過氧化氫形成染料(有色醌)。通過在400-700nm 波長下測定染料可定量測定小而密LDL中的膽固醇。在定量測定步驟中優選使用的氫供體為苯胺衍生物。此類苯胺衍生物的實例包括 N-乙基-N- (2-羥基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N_乙基-N- (2-羥基-3-磺基丙 基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羥 基-3-磺基丙基)_3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-(3-磺基丙基)苯胺(HALPS)和N-(3-磺 基丙基)-3-甲氧基-5-苯胺(HMMPS)。此類氫供體在反應液中所用的終濃度優選範圍為 0.lmmol/L-1. 5mmol/L。作為氫受體，可採用4-氨基安替比林、甲基苯並噻唑酮腙 (methylbenzothiazolonhydrazone)等。當採用膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶作為用於膽固醇測定的酶時，通過酶反應由 NAD(P)產生NAD (P) H。可通過範圍在330nm_400nm處吸光度測定由此產生的NAD (P) H，從而 定量測定小而密LDL中的膽固醇。依照本發明在清除L LDL中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟和清除除 LDL之外的脂蛋白中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟中，單價陽離子和/或二 價陽離子或其鹽可用作離子強度調節劑。加入這樣的離子強度調節劑促進小而密LDL從L LDL中區分開。具體而言，可採用氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、二氯化錳、氯化鈣、氯化鋰、氯化 銨、硫酸鎂、硫酸鉀、硫酸鋰、硫酸銨、醋酸鎂等。在反應時這樣的離子強度調節劑的濃度優 選範圍為 Ommo 1/L-IOOmmol/L。
此外在本發明中，聚陰離子也可被加入至清除L LDL中的膽固醇並將其排除在反 應體系之外的步驟以及清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇並將其排除在反應體系之外 的步驟中，以調節磷脂酶對小而密LDL和L LDL的催化活性。作為被加入的聚陰離子，可 適當地採用肝素、磷鎢酸或葡聚糖硫酸酯等。在肝素的情況下，聚陰離子在試劑中的濃度 優選範圍為10U/mL-250U/mL ；在磷鎢酸的情況下，其濃度優選範圍為0. 02% (重量/體 積)-1.25% (重量/體積)；在葡聚糖硫酸酯的情況下，其濃度優選範圍為0.02% (重量 /體積)-1.25% (重量/體積)。這些聚陰離子在反應液中的濃度優選範圍分別為5U/ mL-250U/mL,0. 01% (重量 / 體積)_1· 25% (重量 / 體積)和 0. 01 % (重量 / 體積)_1· 25% (重量/體積)。本發明的各步驟中的反應優選在2V "450C的溫度下進行，更優選在25°C _40°C的 溫度下進行。各步驟中的反應優選實施1-10分鐘，更優選實施3-7分鐘。血清和血漿可以用作本發明的樣品，但樣品的實例並不限於此。本發明採用的自動分析儀的實例包括TBA-120FR · 200FR (TOSHIBA公司)、 JCA-BMl250 · 1650 · 2250 (JE0L 有限公司)、HITACHI 7180 · 7170 (Hitachi 有限公司)和 AU2700(OLYMPUS)。當實施本發明的測定方法時，本文所採用的試劑可分成多種試劑組合物。本發明 所採用試劑的實例包括與除L LDL和LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)反應的表面活 性劑，用於膽固醇測定的酶(例如膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶)、表面活性劑、降解過氧化 氫的過氧化氫酶、用於經由偶聯反應由過氧化氫形成染料的過氧化物酶、氫供體以及緩衝 劑。考慮到試劑的穩定性等，適當地將這些試劑分成不同的試劑組合物。本文中採用的試 劑組合物的數目可根據本發明方法的步驟數而定。例如，當存在包括以下的3個步驟時清 除L LDL中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟、清除除LDL之外的脂蛋白中的膽 固醇並將其排除在反應體系之外的步驟以及測定小而密LDL的步驟，製備3類試劑組合物 以實施各步驟。此外，清除L LDL中膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟和清除除LDL 之外的脂蛋白中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟同時進行，則製備2類試劑組 合物；即製備一種用於實施所述合併步驟的試劑組合物和一種用於實施測定小而密LDL的 步驟的試劑組合物。在3個步驟的情況下，即在清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇並將其排除在反 應體系之外的步驟、清除L LDL中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟、以及測定小 而密LDL的步驟的情況下，分別採用試劑組合物A (用於清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固 醇的試劑組合物)、試劑組合物B (用於清除L LDL中膽固醇的試劑組合物)和試劑組合物 C(用於測定小而密LDL的試劑組合物)。在清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇並將其排 除在反應體系之外的步驟中採用的試劑組合物A至少包含作用於諸如VLDL和HDL的脂蛋 白的表面活性劑例如聚氧乙烯衍生物。在清除L LDL中膽固醇並將其排除在反應體系之 外的步驟中採用的試劑組合物B至少包含與L LDL反應的磷脂酶。在初始步驟中加入的試 劑組合物A或試劑組合物B還可包含降解膽固醇的酶(例如膽固醇酯酶或膽固醇氧化酶)、 氫供體(例如苯胺衍生物)、清除過氧化氫的過氧化氫酶等。例如，當首先實施清除除LDL 之外的脂蛋白中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟然後再實施清除L LDL中的膽
14固醇並將其排除在反應體系之外的步驟時，試劑組合物A至少包含作用於除LDL之外的脂 蛋白例如VLDL和HDL的表面活性劑(例如聚氧乙烯衍生物)並且還包含例如降解膽固醇的 酶(例如膽固醇酯酶或膽固醇氧化酶)、氫供體(例如苯胺衍生物)以及清除過氧化氫的過 氧化氫酶。試劑組合物B至少包含與L LDL反應的磷脂酶並且若有必要可向其加入表面活 性劑。另一方面，當首先實施清除LLDL中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟然後 再實施清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟時，試劑組 合物B至少包含與L LDL反應的磷脂酶並且還包含例如降解膽固醇的酶(例如膽固醇酯酶 或膽固醇氧化酶)、氫供體(例如苯胺衍生物)以及清除過氧化氫的過氧化氫酶。試劑組合 物A至少包含作用於除LDL之外的脂蛋白例如VLDL和HDL的表面活性劑例如聚氧乙烯衍 生物。測定小而密LDL的試劑組合物的步驟中採用的試劑組合物C可包含僅與小而密LDL 反應的表面活性劑或者作用於所有脂蛋白的表面活性劑、氫供體(例如4-氨基安替比林) 和過氧化物酶等。與此同時，若有必要還可向試劑組合物A和試劑組合物B中加入一價陽 離子、二價陽離子或其鹽或聚陰離子。此外，試劑組合物A和試劑組合物B可含有血清白蛋 白。各試劑組合物的pH可在中性pH附近，例如範圍為pH6-pH8且優選範圍為pH6. 5_pH7. 5。 PH可通過加入緩衝液調節。當按以下順序實施本發明的3步法時清除除LDL之外脂蛋白中的膽固醇並將其 排除在反應體系之外的步驟、清除L LDL中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟和 測定小而密LDL的步驟，將試劑組合物A加入至樣品中反應，加入試劑組合物B反應，加入 試劑組合物C反應並隨後測定吸光度。樣品的量和各試劑組合物的量不受到特別限制，並且可通過考慮各試劑組合物中 試劑的濃度等適當地確定。例如，樣品可採用ι μ L-IO μ L，試劑組合物A、B和C各自可採 用 25μ L-200y L0當按以下順序進行本發明的3步法時清除L LDL中的膽固醇並將其排除在反應 體系之外的步驟、清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟 和測定小而密LDL的步驟，首先將試劑組合物B加入樣品中反應，隨後加入試劑組合物A反 應，加入試劑組合物C反應，最後測定吸光度。在本發明的方法中，在測定小而密LDL的步驟之前將L LDL中的膽固醇和除LDL 之外的脂蛋白中的膽固醇排除在反應體系之外，致使可測定小而密LDL。作為將L LDL中的 膽固醇和除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇排除在反應體系之外的方法，除如上所述的清除 之外，還可採用用於聚集、抑制等的已知技術。此外，當在測定小而密LDL的步驟前實施兩 個或更多個步驟時，可在完成將LLDL中的膽固醇和除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇排除在 反應體系之外的反應後的步驟中立即進行測定小而密LDL的步驟。因此，還可能的是在一 個步驟中使磷脂酶作用於L LDL中的膽固醇，隨後在後續步驟中進行清除。或者，例如可能 的是在一個步驟中降解除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇，隨後在後續步驟中進行清除。各 步的產物也可在同一步驟中清除。可將清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟和 清除L LDL中的膽固醇並將其排除在反應體系之外的步驟合併為單個步驟。當通過包含所 述單個步驟和測定小而密LDL的後續步驟這2步進行反應時，可在第一步中使用試劑組合 物AB(含有包含在以上試劑組合物A和試劑組合物B中的試劑)和試劑組合物C。具體而言，所述試劑組合物AB至少包含作用於除LDL之外的脂蛋白例如VLDL和HDL的表面活性 劑例如聚氧乙烯衍生物和與L LDL反應的磷脂酶。在這種情況下，將試劑組合物AB加入樣 品中，使除L LDL和LDL之外的脂蛋白(例如VLDL和HDL)作用於表面活性劑，將反應產物 與酶反應，隨後加入試劑組合物C使小而密LDL作用於表面活性劑用於酶反應，然後測定小 而密LDL中的膽固醇。
實施例下面將參考以下實施例來更詳細描述本發明，但本發明並不限於此。實施例1依次實施以下三個步驟清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇、清除L LDL中的膽 固醇和測定小而密LDL膽固醇，然後測定小而密LDL。在清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的步驟中使用的試劑組合物A，在清除L LDL中膽固醇的步驟中使用的試劑組合物B和在測定小而密LDL膽固醇的步驟中使用的試 劑組合物C如下製備。
試劑組合物A PIPES 緩衝液(pH 7. 0) 膽固醇酯酶 膽固醇氧化酶 過氧化氫酶 牛血清白蛋白 TOOS
50mmol/L 0. 6U/mL 0.5U/mL 600U/mL 0.5% (重量 20mmol/L
體積)
聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]
0. 27% (重量/體積) 聚氧乙烯聯苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A-90]
0. 03% (重量/體積)
試劑組合物B PIPES 緩衝液(pH 7. 0) 磷脂酶 A2 [Asahi Kasei 公司，PLA2] 氯化鈣 試劑組合物C PIPES 緩衝液(pH 7. 0) 4_氨基安替比林 過氧化物酶
疊氮化鈉0. 05 % (重量/體積)
聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]
1.0% (重量/體積) 將試劑組合物A(75yL)加入2yL血清樣品中，然後在37°C下反應5分鐘。加入 試劑組合物B (75 μ L)，然後反應5分鐘。再加入試劑組合物C(50yL)，然後反應5分鐘。然 後在600nm的主波長和700nm的亞波長處測定吸光度。
50mmol/L 11. OU/mL 1OOmmo1/L
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. O單位/mL 0. 05% (重量
在用於比較的對照方法中使用用於測定小而密LDL膽固醇的sd LDL-C 「SEIKEN「 試劑(DENKA SEIKEN Co. , Ltd.)，並隨後比較小而密LDL膽固醇的濃度。圖1顯示所述結果。
如圖1所示，該實施例的方法表現出與採用sd LDL-C 「SEIKEN」試劑用於測定小 而密LDL膽固醇的方法的良好的相關性。脂酶。

實施例2
由實施例1中採用的試劑組合物B製備試劑組合物，其包含磷脂酶C[PLC]作為磷
50mmol/L 0. 6U/mL 0.5U/mL 600U/mL 2. Ommo 1/L
試劑組合物A PIPES 緩衝液(pH 7. 0) 膽固醇酯酶 膽固醇氧化酶 過氧化氫酶 TOOS
聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]
0. 27% (重量/體積) 聚氧乙烯聯苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A-90]
0. 03% (重量/體積)
試劑組合物B PIPES 緩衝液(pH 7. 0) 磷脂酶 C[Asahi Kasei 公司，PLC] 試劑組合物C PIPES 緩衝液(pH 7. 0) 4_氨基安替比林 過氧化物酶
疊氮化鈉0. 05 % (重量/體積)
聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]
1.0% (重量/體積)
50mmol/L 1. 16U/mL
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. 0單位/mL 0. 05% (重量
測定以與實施例1的方法相似的方式實施。將結果與利用sdLDL-C 「SEIKEN」試 劑得到的結果作比較。圖2顯示所述結果。 如圖2所示，該實施例的方法表現出與採用sd LDL-C 「SEIKEN」試劑用於測定小 而密LDL膽固醇的方法的良好的相關性。脂酶。

實施例3
由實施例1中採用的試劑組合物B製備試劑組合物，其包含磷脂酶D [PLD]作為磷
試劑組合物A PIPES 緩衝液(pH 7. 0) 膽固醇酯酶 膽固醇氧化酶
50mmol/L 0. 6U/mL 0. 5U/mL
1. 36U/mL
作為磷脂酶。
1. 18U/mL
PIPES 緩衝液(pH 7.0)4-氨基安替比林過氧化物酶疊氮化鈉聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. O單位/mL 0. 05% (重量/體積)
1.0% (重量/體積)測定以與實施例1的方法相似的方式實施。將結果與利用sdLDL-C 「SEIKEN」試 劑得到的結果作比較。圖4顯示所述結果。如圖4所示，該實施例的方法表現出與採用sd LDL-C "SEIKEN"試劑用於測定小 而密LDL膽固醇的方法的良好的相關性。實施例5由實施例1中採用的試劑組合物B製備試劑組合物，其包含特異性針對甘油磷脂 的磷脂酶[PLDP]作為磷脂酶。試劑組合物APIPES 緩衝液(pH 7. 0)50mmol/L膽固醇酯酶0.6U/mL膽固醇氧化酶0. 5U/mL過氧化氫酶600U/mLTOOS2. Ommo 1/L聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]0.27% (重量 / 體積)聚氧乙烯聯苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A_90]0. 03% (重量 / 體積)試劑組合物BPIPES 緩衝液(pH 7. 0)50mmol/L磷脂酶[AsahiKasei 公司，PLDP]7. 5U/mL試劑組合物CPIPES 緩衝液(pH 7. 0)50mmol/L4-氨基安替比林4. Ommol/L過氧化物酶4. O單位/mL疊氮化鈉0.05% (重量/體積)聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 體積)測定以與實施例1的方法相似的方式實施。將結果與利用sdLDL-C 「SEIKEN」試 劑得到的結果作比較。圖5顯示所述結果。如圖5所示，該實施例的方法表現出與採用sd LDL-C 「SEIKEN」試劑用於測定小 而密LDL膽固醇的方法的良好的相關性。實施例6由實施例1中採用的試劑組合物B製備試劑組合物，其包含鞘磷脂酶[SPC]作為
1950mmol/L 0. 97U/mL
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. 0單位/mL 0. 05% (重量
磷脂酶。試劑組合物APIPES 緩衝液(pH 7. 0)50mmol/L膽固醇酯酶0. 6U/mL膽固醇氧化酶0. 5U/mL過氧化氫酶600U/mLTOOS2. Ommo 1/L聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]0.27% (重量 / 體積)聚氧乙烯聯苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A-90]0. 03% (重量 / 體積)試劑組合物BPIPES 緩衝液(pH 7. 0)鞘磷脂酶[AsahiKasei 公司，SPC]試劑組合物CPIPES 緩衝液(pH 7. 0)4-氨基安替比林過氧化物酶疊氮化鈉0.05% (重量/體積)聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 體積)測定以與實施例1的方法相似的方式實施。將結果與利用sdLDL-C 「SEIKEN」試 劑得到的結果作比較。圖6顯示所述結果。如圖6所示，該實施例的方法表現出與利用sd LDL-C "SEIKEN"試劑用於測定小 而密LDL膽固醇的方法的良好的相關性。實施例7依次實施以下三個步驟清除L LDL中的膽固醇、清除除LDL之外的脂蛋白中的膽 固醇和測定小而密LDL膽固醇，然後測定小而密LDL。在清除L LDL中膽固醇的步驟中使用的試劑組合物B，在清除除LDL之外的脂蛋白 中的膽固醇的步驟中使用的試劑組合物A，和在測定小而密LDL膽固醇的步驟中使用的試 劑組合物C如下製備。試劑組合物BPIPES 緩衝液(pH 7. 0)50mmol/L 膽固醇酯酶0. 6U/mL 膽固醇氧化酶0.5U/mL 過氧化氫酶600U/mL 牛血清白蛋白0.5% (重量 體積)TOOS2. Ommo 1/L 鞘磷脂酶[AsahiKasei 公司，SPC]0. 485U/mL
試劑組合物APIPES 緩衝液(pH 7. 0)50mmol/L聚氧乙烯聯苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A-90]0.6% (重量 / 體積)試劑組合物CPIPES 緩衝液(pH 7. 0)50mmol/L4-氨基安替比林4. Ommol/L過氧化物酶4. O單位/mL疊氮化鈉0.05% (重量/體積)聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 體積)將試劑組合物B (75 μ L)加入2 μ L血清樣品中，然後在37°C下反應5分鐘。加入 試劑組合物A(75yL)，然後反應5分鐘。再加入試劑組合物C(50yL)，然後反應5分鐘。在 600nm的主波長和700nm的亞波長處測定吸光度。在用於比較的對照方法中採用用於測定小而密LDL膽固醇的sd LDL-C 「SEIKEN「 試劑(DENKA SEIKEN Co.，Ltd.)，並隨後比較小而密LDL膽固醇的濃度。圖7顯示所述結^ ο如圖7所示，該實施例的方法表現出與利用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小 而密LDL膽固醇的方法的良好的相關性。實施例8在該實施例中，清除L LDL中膽固醇的步驟和清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固 醇的步驟(即清除除小而密LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的步驟)同時進行。清除LLDL 的步驟和清除除LDL之外的脂蛋白的步驟(即清除除小而密LDL之外的脂蛋白的步驟)中 採用的試劑組合物AB和測定小而密LDL的步驟中採用的試劑組合物C如下製備。試劑組合物AB
PIPES 緩衝液(pH 7. 0)50mmol/L
膽固醇酯酶0. 6U/mL
膽固醇氧化酶0.5U/mL
過氧化氫酶600U/mL
牛血清白蛋白0. 5% (重量/體積)
TOOS2. Ommol/L
鞘磷脂酶[Asahi Kasei公司，SPC]1. 46U/mL
聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]
0. 135% (1is.1體積)
聚氧乙烯聯苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGENA-90]
0. 015% ( iis. /1體積)
試劑組合物C
PIPES 緩衝液(pH 7. 0)50mmol/L
4_氨基安替比林4. Ommol/L
21
過氧化物酶4. 0單位/mL疊氮化鈉0.05% (重量/體積)聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 體積)將試劑組合物AB(150 μ L)加入2 μ L血清樣品中，然後在37°C下反應5分鐘。加 入試劑組合物C (50 μ L)，然後反應5分鐘。然後在600nm的主波長和700nm的亞波長處測
定吸光度。在用於比較的對照方法中採用用於測定小而密LDL膽固醇的sd LDL-C 「SEIKEN「 試劑(DENKA SEIKEN Co.，Ltd.)，並隨後比較小而密LDL膽固醇的濃度。圖8顯示所述結^ ο如圖8所示，該實施例的方法表現出與利用sd LDL-C 「SEIKEN「試劑用於測定小 而密LDL膽固醇的方法的良好的相關性。實施例9由實施例6中採用的試劑組合物A製備試劑組合物，其包含單一類型的表面活性 劑 EMULGEN B-66。試劑組合物APIPES 緩衝液(pH 7. 0)膽固醇酯酶膽固醇氧化酶過氧化氫酶TOOS聚氧乙烯衍生物[Kao公司，EMULGEN B-66]試劑組合物BPIPES 緩衝液(pH 7. 0)鞘磷脂酶[AsahiKasei 公司，SPC]試劑組合物CPIPES 緩衝液(pH 7. 0)4-氨基安替比林過氧化物酶疊氮化鈉聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 體積)測定以與實施例1的方法相似的方式實施。將結果與利用sdLDL-C 『『SEIKEN」試 劑得到的結果作比較。圖9顯示所述結果。如圖9所示，該實施例的方法表現出與利用sd LDL-C "SEIKEN"試劑用於測定小 而密LDL膽固醇的方法的良好的相關性。實施例10由試劑組合物AB製備含單一類型的表面活性劑EMULGENA-90的試劑組合物。
50mmol/L 0. 6U/mL 0.5U/mL 600U/mL 2. Ommo 1/L
0. 27% (重量/體積)
50mmol/L 0. 97U/mL
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. 0單位/mL 0. 05% (重量/體積)試劑組合物AB PIPES 緩衝液(pH 7. 0) 膽固醇酯酶 膽固醇氧化酶 過氧化氫酶 牛血清白蛋白 TOOS
鞘磷脂酶[Asahi Kasei公司，SPC]
50mmol/L 1. 2U/mL
0. 3U/mL 1200U/mL 1.0% (重量
2.Ommo 1/L
3.OU/mL
體積)
聚氧乙烯聯苯乙烯苯基醚[Kao公司，EMULGEN A-90]
試劑組合物C PIPES 緩衝液(pH 7. 0)
4_氨基安替比林
0. 18% (重量/體積)
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. O單位/mL 0. 05% (重量/體積)過氧化物酶疊氮化鈉聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 709]1.0% (重量 / 體積)將試劑組合物ΑΒ(150 μ L)力口入2 μ L血清樣品中，然後在37°C下反應5分鐘。再 加入試劑組合物C (50 μ L)，然後反應5分鐘。在600nm的主波長和700nm的亞波長處測定
吸光度。採用超速離心法作為對照。圖10顯示所述結果。如圖10所示，該實施例的方法表現出與利用sd LDL-C 「SEIKEN」試劑用於測定小 而密LDL膽固醇的方法的良好的相關性。實施例11由不包含其中所用的表面活性劑的試劑組合物AB製備試劑組合物。試劑組合物ABPIPES 緩衝液(pH 7. 0)膽固醇酯酶膽固醇氧化酶過氧化氫酶牛血清白蛋白TOOS鞘磷脂酶[AsahiKasei 公司，SPC]試劑組合物CPIPES 緩衝液(pH 7. 0)4-氨基安替比林過氧化物酶疊氮化鈉0.05% (重量/體積)聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 709]
50mmol/L 0. 6U/mL
0.3U/mL 1200U/mL 1.0% (重量 2. Ommo 1/L
1.6U/mL
50mmol/L 4. Ommo 1/L 4. O單位/mL 0. 05% (重量
體積)
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1.0% (重量 / 體積)將試劑組合物ΑΒ(150 μ L)力口入2 μ L血清樣品中，然後在37°C下反應5分鐘。再 加入試劑組合物C (50 μ L)，然後反應5分鐘。在600nm的主波長和700nm的亞波長處測定
吸光度。採用超速離心法作為對照。圖11顯示所述結果。如圖11所示，該實施例的方法表現出與利用sd LDL-C 「SEIKEN」試劑用於測定小 而密LDL膽固醇的方法的良好的相關性。實施例12通過加入各種的表面活性劑由實施例1中採用的試劑組合物A製備試劑。此處加 入的表面活性劑為 NONION HS215,EMULGEN920,NONION NS220,NONION HS220,NONION NS230 或 PERSOFT EP0 NONION HS215,EMULGEN 920 和 NONION NS220 按 0.03% (重量 / 體積)加 入。NONION HS220、NONION NS230 和 PERSOFT EP 按 0. 06% (重量 / 體積)加入。0. 97U/mL
試劑組合物C
PIPES 緩衝液(pH 7. 0)
4_氨基安替比林
50mmol/L 4. Ommo 1/L
4. 0單位/mL 0. 05% (重量
體積)過氧化物酶疊氮化鈉聚氧乙烯壬基苯基醚[Kao公司，EMULGEN 909]1.0% (重量 / 體積)測定以與實施例1的方法相似的方式實施。將結果與利用sdLDL-C 「SEIKEN」試 劑得到的結果作比較。表1顯示所述結果。如表1所示，該實施例的方法表現出與利用sd LDL-C 「SEIKEN」試劑用於測定小 而密LDL膽固醇的方法的良好的相關性。
如表1所示，使用以組合的方式包含作為表面活性劑的EMULGEN B-66和NONION HS215, EMULGEN 920、N0NI0NNS220、NONION HS220、NONION NS230 或 PERSOFT EP 的試劑組 合物A的方法表現出與利用sd LDL-C 「SEIKEN」試劑用於測定小而密LDL膽固醇的方法的 良好的相關性。表 1 本文列舉的所有出版物、專利及專利申請以其全部內容在此引作參考。
權利要求
一種定量測定樣品中的小而密LDL膽固醇的方法，所述方法包括以下步驟(1)在磷脂酶存在下清除除小而密LDL之外的LDL中的膽固醇，以及隨後(2)定量測定剩餘的小而密LDL中的膽固醇。
2.權利要求1的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中步驟(1)中使用的磷脂 酶與至少鞘磷脂和/或磷脂醯肌醇具有高反應性，其為存在於脂蛋白中的磷脂。
3.權利要求1或2的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中步驟(1)中使用的 磷脂酶的濃度範圍為0. lU/mL-100U/mL。
4.權利要求1-3中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步驟(2) 中在至少作用於小而密LDL的表面活性劑的存在下加入用於膽固醇測定的酶。 >
5.權利要求4的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步驟(2)中使用的至 少作用於小而密LDL的表面活性劑是作用於所有脂蛋白的表面活性劑。
6.權利要求4或5的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步驟(2)中使用 的至少作用於小而密LDL的表面活性劑為聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物、或HLB 為11以上且少於14的聚氧乙烯衍生物。
7.權利要求1-6中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，所述方法還包括 在膽固醇酯酶存在下清除樣品中的除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的步驟(a)，該步驟在 步驟(2)之前並在步驟(1)之前、之後或者同時實施。
8.權利要求7的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中步驟(a)中使用的膽固 醇酯酶的濃度範圍為0. 01U/mL-10U/mL。
9.權利要求7或8的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步驟(a)中還加 入作用於除LDL之外脂蛋白的表面活性劑。
10.權利要求9的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步驟(a)中使用的表 面活性劑的濃度範圍為0. 05% -1. 0%。
11.權利要求7-10中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步驟 (a)中還加入膽固醇氧化酶和過氧化氫酶。
12.權利要求7-10中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中在步驟 (a)中還加入膽固醇氧化酶和4-氨基安替比林。
13.權利要求7-12中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中步驟(a) 的反應和步驟(1)的反應在同一溶液中同時進行。
14.權利要求7-13中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的方法，其中步驟(a) 中使用的表面活性劑為選自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚 氧乙烯烷基胺的非離子型表面活性劑；選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基硫酸鹽、醯胺醚硫 酸鹽、烷基牛磺酸鹽和磷酸鹽型表面活性劑的陰離子型表面活性劑；選自烷基甲基銨鹽、季 銨鹽和單直鏈烷基型表面活性劑的陽離子型表面活性劑；或者選自月桂基甜菜鹼、二甲基 烷基甜菜鹼、咪唑啉型表面活性劑以及烷基二氨基乙基甘氨酸鈉的兩性表面活性劑。
15.一種用於定量測定小而密LDL膽固醇的試劑盒，所述試劑盒包含至少以下兩類試 劑組合物⑴用於清除樣品中的除小而密LDL之外LDL中的膽固醇的試劑組合物，該試劑組合物 至少包含與除小而密LDL之外的LDL反應的磷脂酶；( )用於測定小而密LDL的試劑組合物，其包含僅與小而密LDL或其衍生物反應的作為聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的表面活性劑；或 作為HLB在11以上且小於14的聚氧乙烯衍生物的表面活性劑；4_氨基安替比林；和過氧化物酶。
16.權利要求15的用於定量測定小而密LDL膽固醇的包含至少3種試劑組合物的試劑 盒，所述試劑盒還包含(iii)用於清除除LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的試劑組合物，所述 試劑組合物包含選自至少聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基胺的非 離子型表面活性劑；選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基硫酸鹽、醯胺醚硫酸鹽、烷基牛磺酸 鹽和磷酸鹽型表面活性劑的陰離子型表面活性劑；選自烷基甲基銨鹽、季銨鹽和單直鏈烷 基型表面活性劑的陽離子型表面活性劑；或者選自月桂基甜菜鹼、二甲基烷基甜菜鹼、咪唑 啉型表面活性劑以及烷基二氨基乙基甘氨酸鈉的兩性表面活性劑。
17.權利要求15的用於定量測定小而密LDL膽固醇的試劑盒，其中所述試劑組合物 ⑴還包含選自至少聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基胺的非離子型表面活 性劑；選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基硫酸鹽、醯胺醚硫酸鹽、烷基牛磺酸鹽和磷酸鹽型 表面活性劑的陰離子型表面活性劑；選自烷基甲基銨鹽、季銨鹽和單直鏈烷基型表面活性 劑的陽離子型表面活性劑；或者選自月桂基甜菜鹼、二甲基烷基甜菜鹼、咪唑啉型表面活性 劑以及烷基二氨基乙基甘氨酸鈉的兩性表面活性劑，由此通過所述試劑組合物⑴清除樣品中的除小而密LDL之外的脂蛋白中的膽固醇。
18.權利要求15-17中任一項的用於定量測定小而密LDL膽固醇的試劑盒，其中磷脂酶 與脂蛋白中存在的磷脂中的至少鞘磷脂和/或磷脂醯肌醇具有高反應性。
全文摘要
本發明公開了一種分級測定小而密LDL的方法以及試劑，其使得能夠在無需任何預處理樣品的情況下進行快速、簡便和高特異性的分析。本發明具體公開了用於定量測定樣品中小而密LDL膽固醇的方法，所述方法包括以下步驟(1)和(2)(1)在磷脂酶存在下清除除小而密LDL之外的LDL中的膽固醇，和(2)測定經過步驟(1)後剩餘的脂蛋白中的膽固醇的量。
文檔編號C12Q1/30GK101896620SQ20088012108
公開日2010年11月24日 申請日期2008年10月10日 優先權日2007年10月10日
發明者伊藤康樹, 藤村美樹 申請人:電化生研株式會社