增加纖連蛋白的方法
2023-10-30 10:14:52
專利名稱：增加纖連蛋白的方法
技術領域：
本發明通常涉及皮膚修復和維護的領域。
背景技術：
改善、維護和修復皮膚的狀況由於醫學和化裝的原因而是重要的。例如，象溼度、紫外線、化裝品、疾病、緊張狀態、創傷和飲食習慣這些因素可以影響皮膚並且會導致各種皮膚問題。隨著年齡增長皮膚彈性也會減小，如皺紋的形成可說明這點。因而，幫助促進、維護和修復皮膚狀況的試劑是需要的。
皮膚含有負責維持皮膚彈性特徵的彈性蛋白纖維的精細網絡結構。然而，響應於各種因素例如過度暴露於太陽光，彈性纖維系統會開始增生、瓦解和最終破壞。這個過程稱為光化性彈性纖維病，並且它是皮膚產生皺紋、退色和鬆弛的主要原因。然而，如同新的成纖維細胞、內皮細胞和角質細胞形式，皮膚能自我修復。不幸的是，隨著皮膚衰老其這方面能力開始減弱。因而，需要能促進皮膚例如過早衰老的皮膚生長和修復的試劑。
纖連蛋白(一種糖蛋白)參與包括組織修復、胚胎發生、血液凝固、細胞遷移、傷口修復和細胞粘著的許多細胞過程。有2種主要的纖連蛋白形式(1)用作細胞外基質(ECM)連接體的不溶性糖蛋白二聚體；(2)在血漿中發現的可溶性二硫化物連接的二聚體。ECM形式的纖連蛋白由成纖維細胞、軟骨細胞、內皮細胞、巨噬細胞和某些上皮細胞產生。血漿形式的ECM由肝細胞產生。通過將細胞錨定在膠原蛋白或蛋白聚糖底物上，纖連蛋白可作為普通細胞粘著分子。纖連蛋白也可以通過結合到ECM成分和細胞表面的膜結合纖連蛋白受體上來組織細胞間相互作用。纖連蛋白在胚胎發生期間對細胞的遷移也很重要並且已被認為是在介導各種處理的抗皺和緊膚(skim-firming)效果中起重要作用的蛋白(Chi等人，(2002))。
因而，需要能增加組織中纖連蛋白量的試劑和組合物來維護、促進和修復皮膚狀況。這類試劑和組合物將用來治療、更新和恢復衰老皮膚的狀況。
發明概述本發明提供肽和含有這些肽的組合物，所述肽和組合物用作維護健康皮膚和改善皮膚狀況的試劑。這些肽和組合物也用作防止和治療皮膚相關狀況例如皺紋的試劑。在本發明的各方面，這些肽和組合物用於加強皮膚、收緊皮膚、更新或恢復皮膚的狀況。這些肽和組合物也用作抗衰老治療和用作治療光損害(photodamage)皮膚的試劑。預期含有所述肽和組合物的局部洗劑和敷料(dressings)，同樣預期使用所述肽和組合物的方法。所述肽和組合物增加了組織中纖連蛋白的量。
本發明的組合物包括具有與橫跨基質金屬蛋白酶兩個球形結構域的連接區域相同或相關的胺基酸序列的肽。已知幾種類型的基質金屬蛋白酶和其序列，包括基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-3、基質金屬蛋白酶-4、基質金屬蛋白酶-5、基質金屬蛋白酶-6、基質金屬蛋白酶-7、基質金屬蛋白酶-8、基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶-10、基質金屬蛋白酶-11、基質金屬蛋白酶-12和基質金屬蛋白酶-13。本發明預期包括具有來自任何基質金屬蛋白酶連接區域胺基酸序列的肽的組合物。例如，組合物可包括具有來自基質金屬蛋白酶-2序列(SEQ ID NO14)的從大約胺基酸70到大約胺基酸120的任何區域和所有其它基質金屬蛋白酶的類似區域的胺基酸序列的肽。
本發明提供了的肽和含有這些肽的組合物，所述肽具有式(I)、(II)、(III)中的任意一個式Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1、Xaa4和Xaa6各自分別是非極性胺基酸；
Xaa2是鹼性胺基酸；Xaa3是半胱氨酸樣胺基酸；Xaa5是極性或脂族胺基酸；Xaa7是酸性胺基酸；Xaa8是脂族或極性胺基酸；Xaa9是脂族、非極性或鹼性胺基酸；和Xaa10是極性、酸性、鹼性或非極性胺基酸；Xaa11是極性或芳族胺基酸；Xaa12是極性、鹼性、脂族或非極性胺基酸；Xaa13是芳族、脂族、極性或酸性胺基酸；Xaa14是芳族、非極性或極性胺基酸；Xaa15是非極性或酸性胺基酸；Xaa16是鹼性、極性或非極性胺基酸；Xaa17是鹼性、極性、脂族、非極性或酸性胺基酸；Xaa18是非極性或脂族胺基酸；Xaa19是鹼性或脂族胺基酸；且其中所述肽能增加組織中纖連蛋白的量。
所述肽也能抑制下列基質金屬蛋白酶的活性基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-3、基質金屬蛋白酶-4、基質金屬蛋白酶-5、基質金屬蛋白酶-6、基質金屬蛋白酶-7、基質金屬蛋白酶-8、基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶-10、基質金屬蛋白酶-11、基質金屬蛋白酶-12和基質金屬蛋白酶-13。在某些實施方案中，所述肽能抑制基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-3、基質金屬蛋白酶-7、基質金屬蛋白酶-8或基質金屬蛋白酶-9的活性。
肽中的非極性胺基酸以是，例如，甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。鹼性胺基酸可以是，例如，組氨酸、賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鳥氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸。半胱氨酸樣胺基酸可以是，例如，半胱氨酸、高米胱氨酸、青黴胺或β-甲基半胱氨酸。脂族胺基酸可以是，例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸。酸性胺基酸可以是，例如，天冬氨酸或穀氨酸。極性胺基酸可以是天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸，或非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。芳族胺基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯並噻吩丙氨酸(benzothienyl alanine)。
本發明也提供含有式(IV)的肽(SEQ ID NO18)的組合物Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaam-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)其中Xaaa是脯氨酸；Xaa1是脯氨酸；Xaab是穀氨醯胺或穀氨酸； Xaa2是精氨酸；Xaac是蘇氨酸；Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸；Xaa4是甘氨酸；Xaae是天冬氨酸或穀氨酸； Xaa5是纈氨酸或天冬醯胺；Xaaf是亮氨酸；Xaa6是脯氨酸；Xaag是天冬氨酸； Xaa7是天冬氨酸；Xaah是穀氨醯胺或絲氨酸； Xaa8是纈氨酸或亮氨酸；Xaai是天冬醯胺或丙氨酸； Xaa9是丙氨酸或甘氨酸；Xaaj是蘇氨酸；Xaa10是天冬醯胺或精氨酸；Xaak是異亮氨酸或亮氨酸； Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸；XaaL是穀氨酸或賴氨酸；Xaa12是天冬醯胺或穀氨醯胺；Xaam是蘇氨酸或丙氨酸；Xaa13是苯丙氨酸或蘇氨酸；Xaan是甲硫氨酸； Xaa14是苯丙氨酸；Xaao是精氨酸；Xaa15是脯氨酸或穀氨酸；Xaap是賴氨酸或蘇氨酸；Xaa16是精氨酸或甘氨酸；Xaa17是賴氨酸或天冬氨酸； Xaa18是脯氨酸或亮氨酸；Xaa19是賴氨酸；和其中所述肽能增加組織中纖連蛋白的量。所述肽也能抑制基質金屬蛋白酶的活性。所述基質金屬蛋白酶可以是基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-3、基質金屬蛋白酶-4、基質金屬蛋白酶-5、基質金屬蛋白酶-6、基質金屬蛋白酶-7、基質金屬蛋白酶-8、基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶-10、基質金屬蛋白酶-11、基質金屬蛋白酶-12或基質金屬蛋白酶-13。在某此實施方案中，除了增加組織中纖連蛋白的量外，所述肽還抑制基質金屬蛋白酶-2或基質金屬蛋白酶-9。
肽所來源的連接區域具有，例如，在SEQ ID NO14的從大約位置70到大約位置120間的胺基酸序列，和其它基質金屬蛋白酶的類似區域。在本發明的某些實施方案中，所述肽具有在SEQ ID NO14的從大約位置77到大約位置110間的胺基酸序列，和其它基質金屬蛋白酶的類似區域。一些所述肽的例子包括那些含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12或SEQ ID NO13所列胺基酸序列的肽。這些肽中的任何一個可用於本發明的實踐。
肽對不同的基質金屬蛋白酶具有不同的親和力。例如，在本發明的一個實施方案中，所述肽可以以大約1.0μM到大約500.0μM的Ki抑制基質金屬蛋白酶-2。在另一個實施方案中，所述肽可以以大約1.0μM到大約400.0μM的Ki抑制基質金屬蛋白酶-2。而在另一個實施方案中，所述肽可以以大約1.0μM到大約50.0μM的Ki抑制基質金屬蛋白酶-2。
本發明進一步提供了包含治療有效量的肽和藥物學可接受載體的組合物。也預期傷口治療和皮膚洗劑。
本發明進一步提供了用於治療傷口或逆轉衰老效應的方法，所述方法包括施用治療有效劑量的式I、II、III或IV的肽
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO21)其中Xaa1、Xaa4和Xaa6各自分別是非極性胺基酸；Xaa2是鹼性胺基酸；Xaa3是半胱氨酸樣胺基酸；Xaa5是極性或脂族胺基酸；Xaa7是酸性胺基酸；Xaa8是脂族或極性胺基酸；Xaa9是脂族、非極性或鹼性胺基酸；和Xaa10是極性、酸性、鹼性或非極性胺基酸；Xaa11是極性或芳族胺基酸；Xaa12是極性、鹼性、脂族或非極性或酸性胺基酸；Xaa13是芳族、脂族、極性或酸性胺基酸；Xaa14是芳族、非極性或極性胺基酸；Xaa15是非極性或酸性胺基酸；Xaa16是鹼性、極性或非極性胺基酸；Xaa17是鹼性、極性、脂族、非極性或酸性胺基酸；Xaa18是非極性或脂族胺基酸；Xaa19是鹼性或脂族胺基酸；Xaaa是脯氨酸；Xaab是穀氨醯胺或穀氨酸；Xaac是蘇氨酸；
Xaad是甘氨酸；Xaae是天冬氨酸或穀氨酸；Xaaf是亮氨酸；Xaag是天冬氨酸；Xaah是穀氨醯胺或絲氨酸；Xaai是天冬醯胺或丙氨酸；Xaaj是蘇氨酸；Xaak是異亮氨酸或亮氨酸；XaaL是穀氨酸或賴氨酸；Xaam是蘇氨酸或丙氨酸；Xaan是甲硫氨酸；Xaao是精氨酸；和Xaap是賴氨酸或蘇氨酸；其中所述肽能增加組織中纖連蛋白的量。
在另一個實施方案中，本發明提供了用於在哺乳動物皮膚中增加纖連蛋白量的方法，所述方法包括給皮膚施用治療有效量的肽，所述肽為SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12或SEQ ID NO13所列的肽。
附圖描述
圖1提供了選擇的MMP酶原的橫跨切割區域的CLUSTALXTM(版本1.8)多序列比對。圖1A提供了突出保守殘基的比對。『*』表示序列之間的完全相同，『:』表示7/9保守的位置，和『.』表示具有最保守取代的大於80％相同的位置。圖1B表示粗體標記的異質位置。
圖2提供了MMP-1原(蛋白資料庫文件1FBL.ENT)的結構。顯示於表1中的SEQ ID NOS2-10的區域橫跨兩個大結構域之間的短區域。在活化期間這個區域被切割。
圖3提供MMP-9的三維模型。產生活性蛋白酶N末端的切割區域用雙向影線顯示。兩個鋅原子用球體表示。切割結構域肽可在其在酶原中正常位置的附近連接到MMP上。該結合(也鄰近起催化作用的鋅)在空間上封閉了活性位點部分。該封閉防止底物結合。
圖4表示用19-聚體(SEQ ID NO11)抑制MMP-9的活性。將MMP-9與19-聚體在FRET測定前混合。19-聚體的濃度如下0mM(實心圓圈)、0.01mM(空心圓圈)、0.03mM(實心正方形)、0.06mM(空心正方形)、0.125mM(實心三角形)、0.25mM(空心三角形)、0.5mM(x’s)、1mM(實心倒三角形)、2mM(空心倒三角形)。
圖5表示用10-聚體抑制MMP-9的活性。將MMP-9與10-聚體在FRET測定前混合。10-聚體的濃度如下0mM(實心三角形)、0.25mM(空心三角形)、0.5mM(空心倒三角形)、1.0mM(實心倒三角形)、2.0mM(x’s)。
圖6表示用9-聚體抑制MMP-9的活性。將MMP-9與9-聚體在FRET測定前混合。9-聚體的濃度如下0mM(實心三角形)、0.25mM(空心三角形)、0.5mM(空心倒三角形)、1.0mM(實心倒三角形)、2.0mM(x’s)。
圖7表示用19-聚體(SEQ ID NO11)抑制MMP-9的活性。將MMP-9與19-聚體在螢光膠原蛋白測定前混合。19-聚體的濃度如下0mM(實心圓圈)、0.06mM(空心菱形)、0.1mM(空心正方形)、0.25mM(空心圓圈)、0.5mM(x’s)。
圖8表示用19-聚體(SEQ ID NO11)對MMP-9活性的更長時程的抑制。將MMP-9與19-聚體在螢光膠原蛋白測定前混合。19-聚體的濃度如下0mM(實心圓圈)、0.06mM(空心菱形)、0.1mM(空心正方形)、0.25mM(空心圓圈)、0.5mM(x’s)。
圖9表示用10-聚體(SEQ ID NO11)對MMP-9活性的更長時程的抑制。將MMP-9與10-聚體在螢光膠原蛋白測定前混合。10-聚體的濃度如下0mM(空心圓圈)、0.1mM(空心菱形)、0.2mM(空心正方形)、0.4mM(x’s)。
圖10表示用9-聚體對MMP-9活性的更長時程的抑制。將MMP-9與9-聚體在螢光膠原蛋白測定前混合。9-聚體的濃度如下0mM(實心圓圈)、0.06mM(空心菱形)、0.1mM(空心正方形)、0.25mM(空心圓圈)、0.5mM(x’s)。
圖11提供了一般剪接反應的HPLC洗脫圖。箭標表示第一個峰在所述反應過程中面積下降(MMP-9原(pro-MMP-9)峰)，而第二部分兩個峰(分別為成熟MMP-9和N末端切割產物)的面積增加。
圖12表示通過stromilysin將MMP-9原轉化成N末端和C末端結構域。MMP-9原在0(實心圓圈)、0.5μM(空心正方形)或1.0μM(實心正方形)19-聚體(SEQ ID NO11)存在的情況下與stromilysin反應。在指定的時間點，取出等分試樣並進行HPLC。將MMP原峰面積積分並且對0時間點的樣品設定為100％。空心圓圈表示溫育在不含stromilysin或19-聚體(SEQ ID NO11)的緩衝液中的MMP原。
圖13A提供19-聚體(SEQ ID NO11)和MMP-9相互作用的等溫滴定量熱分析。各峰顯示通過注射和隨後的結合反應產生的熱。圖13B提供了通過對時間積分來自圖13A中的各注射峰值產生的結合等溫線。
圖14提供了19-聚體(SEQ ID NO11)和MMP-2相互作用的等溫滴定量熱分析。圖14A提供了在25℃時將19-聚體(1mM)滴定到二甲基胂酸鹽(pH6.8)、10mM NaCl中的MMP-2(20μM)的原始等溫量熱數據。各峰表示通過注射和隨後的結合反應產生的熱量。圖14B提供了通過對時間積分來自圖14A中的各注射峰值產生的結合等溫線。
圖15提供了當19-聚體(SEQ ID NO11)流過固定的MMP-9表面時產生的表面等離子體共振結合等溫線。
圖16提供的條形圖表示相對於正對照，用兩種濃度的肽處理後的皮膚模型中活細胞的百分比。第一個用磷酸緩衝鹽溶液(PBS)處理的樣品是用於建立表示100％生存力的細胞計數的正對照。第二個樣品是顯示所述測定可檢驗細胞死亡的負對照，其中細胞暴露於1％Triton-X100。接下來的三個樣品是以500μM濃度使用的19-聚體(SEQID NO11)、10-聚體(SEQ ID NO13)和9-聚體(SEQ ID NO12)。最後三個樣品是以2mM濃度使用的19-聚體、10-聚體和9-聚體。顯示的數據表示三個檢驗的平均值。
圖17圖示了在db/db糖尿病小鼠中傷口癒合的時程。圖表顯示用正常鹽水(空心圓圈)或20μg/mL 19-聚體(實心圓圈)處理的小鼠相對於受傷後天數的相對平均傷口面積。提供的數據表示來自10個受試動物的平均相對傷口直徑。
圖18圖示了在19-聚體(SEQ ID NO11)存在和不存在時正常人皮膚成纖維細胞(Clonetics，CC-2509)的增殖。通過在三種不同濃度下490nm的光密度(OD)測量值檢測細胞生長。標記「19聚體6」的條形反映19-聚體以1×10-6M濃度存在的情況下細胞的生長。標記「19聚體5」的條形反映19-聚體以1×10-5M濃度存在的情況下細胞的生長。標記「19聚體4」的條形反映19-聚體以1×10-4M濃度存在的情況下細胞的生長。「對照」細胞在不添加肽的情況下生長。
圖19圖示了正常人角質細胞在19-聚體(SEQ ID NO11)存在和不存在情況下的增殖。如所描述的，19-聚體導致角質細胞以劑量依賴性方式加速生長。不加19-聚體的對照細胞具有最低的細胞密度。接受低至1×10-5M 19-聚體(19聚體5)的細胞展現出顯著大於(P＜0.01)不接受19-聚體細胞的細胞密度。接受1×10-4M 19-聚體(「19聚體4」)的細胞展現出甚至更快的細胞生長(P＜0.001)。然而，接受1×10-6M 19-聚體(「19聚體6」)的細胞只展現出在統計學上不顯著的少量細胞增殖(P＞0.05)。
圖20描述了用於正常人皮膚成纖維細胞(NHDF)遷移測定的48孔趨化性室(Neuroprobe，Inc.)。
圖21A和21B表示正常人皮膚成纖維細胞(NHDF)的遷移。圖21A顯示無NHDF存在時用於遷移測定的具有8μm孔(顯示為圓圈)的膜(300X放大率)。圖21B的圖顯示在NHDF遷移後的膜，所述NHDF的遷移是由於加入正對照化合物(1.25μg/mL血漿纖連蛋白)引起的。這張照片是用300X放大率拍攝的。將NHDF的核染成紫色。一些NHDF已經遷移穿過所述膜，而其它的似乎陷在8μm孔中。
圖22提供的條形圖表示相對於暴露於正對照(血漿纖連蛋白)或各種濃度19-聚體下的NHDF遷移，正常人皮膚成纖維細胞(NHDF)遷移的百分比。因為某些趨化性物質具有非常窄範圍的活性濃度，所以將稀釋10倍的19-聚體(SEQ ID NO11)用於初始實驗。顯示了三個獨立實驗的平均值(100μg/mL的數據是六個實驗的平均值)。1000和100μg/mL濃度的19-聚體對成纖維細胞具有趨化性(分別是正對照的55±3％和46±3％)。使用小於100μg/mL濃度19-聚體的成纖維細胞遷移實驗大約地比負對照高2倍並且不被認為是顯著的。
圖23提供的條形圖表示在各種濃度19-聚體(SEQ ID NO11)和其衍生物時相對於暴露於正對照(纖連蛋白)的NHDF遷移的正常人皮膚成纖維細胞(NHDF)遷移的百分比。在100μg/mL時，乙醯化的19-聚體(Ac-19-聚體)觸發NHDF遷移的程度與19-聚體大致相同，但在更高濃度，Ac-19-聚體並不同樣有效。9-聚體和10-聚體只在1000μg/mL時觸發NHDF遷移。有趣的是，在任何濃度下14-聚體TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17-聚體TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)肽對NHDF均沒有趨化性(數據沒有顯示)。14-聚體TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17-聚體TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)的肽序列來源於MMP酶，只是起點上稍微更靠近N末端。因而，所述肽的胺基酸序列對NHDP遷移誘導很重要。
圖24提供的條形圖表示加入19-聚體(SEQ ID NO11)導致在人皮膚成纖維細胞中增加膠原蛋白的生產。不加入19-聚體的對照人皮膚成纖維細胞只產生較低量的膠原蛋白。相反地，接受少至1×10-6M的19-聚體(19聚體6)或1×10-5M的19-聚體(19聚體5)的細胞表現出比沒有接受19-聚體的細胞顯著更高的密度(p＜0.001)。
圖25提供的條形圖表示加入19-聚體(SEQ ID NO11)導致在人皮膚成纖維細胞中增加的膠原蛋白。與沒有接受19-聚體(對照)的細胞相比，接受1×10-6M的19-聚體(19聚體6)的細胞表現顯著更大的密度(p＜0.05)，接受1×10-5M 19-聚體(19聚體5；P＜0.001)和接受1×10-4M19-聚體(19聚體4，P＜0.001)的細胞也表現同樣的效果。
發明詳述本發明提供肽和含有這些肽的組合物，所述肽和組合物用作維護健康皮膚和促進皮膚狀況的試劑。這些肽和組合物用作防止和治療皮膚相關狀況例如皺紋的試劑。所述肽和組合物增加組織中纖連蛋白的量。在本發明的一些實施方案中，所述肽和組合物也抑制基質金屬蛋白酶的活性基質金屬蛋白酶在體內作為無活性的酶原產生。酶原的蛋白水解切割導致成熟基質金屬蛋白酶的活化和形成。切除的肽序列是長度大約100到110個胺基酸的酶原前導序列，發現該序列最靠近所述蛋白的氨基末端。這些酶原的前導肽可封閉基質金屬蛋白酶的活性位點並且抑制所述基質金屬蛋白酶的活性。基質金屬蛋白酶酶原的前導肽的施用減小了細胞外基質的破壞速率並提供更快的傷口癒合速率。
絕大多數抑制策略涉及阻止帶有有機小分子的基質金屬蛋白酶的酶促活性。這些化合物通常對身體有毒性並且不是天然存在的分子。使用天然的肽抑制活化的基質金屬蛋白酶可在沒有毒性副作用的情況下提供高度的蛋白酶控制。與小分子抑制策略不同，在本發明的某些實施方案中，所述肽可用來同時抑制單個或所有基質金屬蛋白酶類的活化。
所述肽可以很自由地導到皮膚、進入傷口環境或可通過皮膚覆蓋物(covering)或創傷敷料限制或遞送。
某些實施方案中，本發明提供了對癒合慢性傷口和改善衰老效應的蛋白酶活性水平的高度控制。例如，如在慢性傷口癒合過程中要求一定量的蛋白酶水平(Agren等人，1999)，本領域技術人員可選擇只是部分地抑制蛋白酶活性。通過調節所用抑制劑肽的種類和量，就可控制基質金屬蛋白酶被抑制的程度。
肽根據本發明，含有在切割位點區域具有與基質金屬蛋白酶酶原前導序列相關序列的肽的組合物用於維護健康皮膚和促進皮膚狀況。這些肽和組合物也用作防止和治療皮膚相關狀況例如皺紋的試劑。這些肽增加了組織中纖連蛋白的量。所述肽也可抑制許多種類基質金屬蛋白酶的活性，並提高成纖維細胞和角質細胞的生長和遷移。
所述基質金屬蛋白酶酶原前導序列被切割的位置大致是在所述酶原胺基酸序列的胺基酸位置110。所述肽具有與在酶原胺基酸位置70到大致胺基酸位置120以內的任何區域相關的序列。這些肽可抑制多種基質金屬蛋白酶的活性。所述肽也可以阻止基質金屬蛋白酶酶原的活化以及抑制成熟基質金屬蛋白酶的酶促活性。含有在各種基質金屬蛋白酶中更保守序列(例如朝向切割區域N末端一側的序列)的肽可用於提供通常有效對抗各種基質金屬蛋白酶的抑制劑。然而，含有較不保守序列(例如朝向所述切割區域C末端一側的序列)的肽可用來提供對單個基質金屬蛋白酶特異的抑制劑。
因此，本發明預期包含來自基質金屬蛋白酶的任何酶原前導區域序列的肽以及包含一個或更多個取代基質金屬蛋白酶中天然存在胺基酸的胺基酸的變體肽。具有不同序列的肽的混合物也是預期的。
總之，所述肽、肽的變體和肽的混合物以最優化傷口癒合、皮膚再生、防止結疤或逆轉和防止形成皺紋的方式來配製和使用。因而，可改變本發明肽的組合物和製劑，以便獲得更低或更高的纖連蛋白水平，只要提高癒合和抗衰老即可。
肽的大小可以變化。總之，只有大約5個胺基酸的肽可能太小而不能提供纖連蛋白的最佳增長。然而，多於大約8到9個胺基酸的肽，其長度足以提供纖連蛋白的增加。因而，儘管總體長度不是關鍵的，但在本發明中通常使用比8個胺基酸更長的的肽。其它應用於本發明的肽長度超過9個胺基酸。其它應用於本發明的肽長度超過10個胺基酸。更有甚者，長度超過大約15個胺基酸的肽也用於本發明。肽大小上沒有特定的上限。然而，通常製備較短肽要比製備較長肽便宜。因而，所述肽通常短於大約100個胺基酸。許多用於本發明的肽短於大約50個胺基酸。其它用於本發明的肽短於大約30個胺基酸。短於大約25個胺基酸的肽也可以使用。類似地，短於大約23個胺基酸的肽也可用於本發明。用於實踐本發明的肽的例子有SEQ ID NO11，其具有19個胺基酸。
表1提供了幾個來自酶原的從大致胺基酸位置70到大致胺基酸位置120的代表性基質金屬蛋白酶的序列。
表1基質金屬蛋白酶切割區域的序列
表1中所列的各肽，以及具有SEQ ID NO1、11、12和13的肽，預期作為應用於本發明實踐的肽。此外，具有SEQ ID NO1-13任一項的肽的變體和衍生物也是有用的。只要所述肽的變體或衍生物能增加組織中的纖連蛋白，這類肽的變體和衍生物可具有一個或更多個胺基酸取代、缺失、插入或其它修飾。
所述分離的肽的胺基酸殘基可以是遺傳編碼的L胺基酸、天然存在的非遺傳編碼的L胺基酸、合成的L胺基酸或上述任何胺基酸的D型對映異構體。此處用於20種遺傳編碼的L胺基酸和常見非編碼胺基酸的胺基酸符號是常規的並且於表2中顯示。
表2
在本發明範圍內的肽可具有一個或更多個用具有類似化學和/或物理性質的胺基酸取代的胺基酸，只要這些變體或衍生肽保持增加組織中纖連蛋白的能力即可。這些肽也可以抑制基質金屬蛋白酶的活性，刺激成纖維細胞或角質細胞的細胞生長或刺激成纖維細胞的細胞遷移。
可相互取代的胺基酸通常位於相似的類或亞類。正如本領域技術人員所知道的，胺基酸可分為三個主要的類親水性胺基酸、疏水性胺基酸和半胱氨酸樣胺基酸，這主要依賴於所述胺基酸側鏈的特徵。這些主要的類可進一步分成亞類。親水性胺基酸包括具有酸性、鹼性或極性側鏈的胺基酸而疏水性胺基酸包括具有芳族或非極性側鏈的胺基酸。其中非極性胺基酸可進一步分成包括脂族胺基酸。此處使用的胺基酸類的定義如下「疏水性胺基酸」是指具有在生理pH下不帶電荷並且被水溶液排斥的側鏈的胺基酸。遺傳編碼的疏水性胺基酸的例子包括Ile、Leu和Val。非遺傳編碼的疏水性胺基酸的例子包括t-BuA。
「芳族胺基酸」是指具有含有至少一個具有共軛π電子系統的環(芳基)的側鏈的疏水性胺基酸。芳基可進一步用基團例如烷基、鏈烯基、炔基、羥基、磺醯基、硝基和氨基基團以及其它基團取代。遺傳編碼的芳族胺基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。通常遇到的非遺傳編碼的芳族胺基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
「非極性胺基酸」是指具有在生理pH下通常不帶電荷和沒有極性的側鏈的疏水性胺基酸。遺傳編碼的非極性胺基酸的例子包括甘氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。非遺傳編碼的非極性胺基酸的例子包括Cha。
「脂族胺基酸」是指具有飽和或不飽和的直鏈、分支或環狀烴側鏈的非極性胺基酸。遺傳編碼的脂族胺基酸的例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非編碼的脂族胺基酸的例子包括Nle。
「親水性胺基酸」是指具有被水溶液所吸引的側鏈的胺基酸。遺傳編碼的親水性胺基酸的例子包括Ser和Lys。非編碼的親水性胺基酸的例子包括Cit和hCys。
「酸性胺基酸」是指具有pK值小於7的側鏈的親水性胺基酸。由於氫離子的丟失，酸性胺基酸在生理pH下通常具有帶負電荷的側鏈。遺傳編碼的酸性胺基酸的例子包括天冬氨酸(天冬氨酸鹽)和穀氨酸(穀氨酸鹽)。
「鹼性胺基酸」是指具有pK值大於7的側鏈的親水性胺基酸。由於締合有水合氫離子，鹼性胺基酸在生理pH下通常具有帶正電荷的側鏈。遺傳編碼的鹼性胺基酸的例子包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。非遺傳編碼的鹼性胺基酸的例子包括非環狀胺基酸鳥氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
「極性胺基酸」是指具有在生理pH下不帶電荷的側鏈的親水性胺基酸，但所述側鏈中所含的某一鍵中通常由兩個原子共有的電子對被其中一個原子結合得更緊密一些。遺傳編碼的極性胺基酸的例子包括天冬醯胺和穀氨醯胺。非遺傳編碼的極性胺基酸的例子包括瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸和甲硫氨酸亞碸。
「半胱氨酸樣胺基酸」是指具有能與另一個胺基酸殘基的側鏈形成共價連接例如二硫鍵的側鏈的胺基酸。一般地，半胱氨酸樣蛋白通常具有含有至少一個硫羥(SH)基團的側鏈。遺傳編碼的半胱氨酸樣胺基酸的例子包括半胱氨酸。非遺傳編碼的半胱氨酸樣胺基酸的例子包括高半胱氨酸和青黴胺。
如本領域技術人員所意識到的，上述分類不是絕對的。幾種胺基酸展現出超過一種特徵性質，因而可以歸入超過一種類別。例如，酪氨酸同時具有芳環和極性羥基基團。因此，酪氨酸具有雙重性質並且可歸入芳族類和極性類。類似地，除了能形成二硫鍵外，半胱氨酸也具有非極性特徵。因此，儘管不很嚴格地分類為疏水性或非極性胺基酸，但在許多情況下半胱氨酸可用於將疏水性賦予肽。
某些通常遇到的非遺傳編碼的和可在肽和肽類似物中存在或取代胺基酸的胺基酸包括，但不限於β-丙氨酸(b-Ala)和其它ω-胺基酸例如3-氨基丙氨酸(Dap)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等；α-氨基異丁酸(Aib)、ε-氨基己酸(Aha)、δ-氨基戊酸(Ava)、甲基甘氨酸(MeGly)、鳥氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)、叔丁基丙氨酸(t-BuA)、叔丁基甘氨酸(t-BuG)、N-甲基異亮氨酸(MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)、環己基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl)、2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))、3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、青黴胺(Pem)、1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸(Tic)、β-2-噻吩丙氨酸(Thi)、甲硫氨酸亞碸(MSO)、高精氨酸(hArg)、N-乙醯賴氨酸(AcLys)、2，3-二氨基丁酸(Dab)、2，4-二氨基丁酸(Dbu)、ρ-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))、N-甲基纈氨酸(MeVal)、高半胱氨酸(hCys)和高絲氨酸(hSer)。這些胺基酸也落在上面定義的類別中。
表3概述了上述遺傳編碼和非編碼的胺基酸的分類。應當理解表3隻是用於說明目的，而並不意味著是可包括在此處描述的肽和肽類似物的胺基酸的完全列表。其它用於製備此處描述的肽和肽類似物的胺基酸殘基可見於，例如在Fasman，1989，CRC Practical Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology，CRC Press，Inc.和其中引用的文獻。在這裡沒有特別提到的胺基酸可以根據與明確鑑定的胺基酸相比已知的行為和/或它們的特徵性化學和/或物理特性方便地分成上述類型。
表3
肽可以通過用任何相似類型的胺基酸取代任意胺基酸以產生變體或衍生肽，只要所述肽變體和衍生物保持增加組織中纖連蛋白的能力。
在一個實施方案中，所述組合物包含含有式I、II或III中任意一個式的肽。
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1、Xaa4和Xaa6各自分別是非極性胺基酸，例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸；Xaa2鹼性胺基酸，例如，組氨酸、賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鳥氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸；Xaa3是半胱氨酸樣胺基酸，例如，半胱氨酸、高半胱氨酸、青黴胺或β甲基半胱氨酸；Xaa5是極性或脂族胺基酸，例如，極性胺基酸例如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高半胱氨酸，或脂族胺基酸例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸；Xaa7是酸性胺基酸，例如，天冬氨酸或穀氨酸；Xaa8是脂族或極性胺基酸，例如脂族胺基酸例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸，或極性胺基酸例如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸；Xaa9是脂族、非極性或鹼性胺基酸，例如，脂族胺基酸例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸，非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸，或鹼性胺基酸例如組氨酸、賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鳥氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸；Xaa10是極性、酸性、鹼性或非極性胺基酸，例如，極性胺基酸例如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸，酸性胺基酸例如天冬氨酸或穀氨酸，鹼性胺基酸例如組氨酸、賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鳥氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸，或非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸；Xaa11是極性胺基酸或芳族胺基酸，例如，極性胺基酸例如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸，或芳族胺基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯並噻吩丙氨酸；Xaa12是極性、鹼性、脂族或非極性胺基酸，例如，極性胺基酸例如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸，或鹼性胺基酸例如組氨酸、賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鳥氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸，或脂族胺基酸例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸，或非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸；Xaa13是芳族、脂族、極性或酸性胺基酸，例如，芳族胺基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯並噻吩丙氨酸，或脂族胺基酸例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸，或極性胺基酸例如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸，或酸性胺基酸例如天冬氨酸或穀氨酸；Xaa14是芳族、非極性或極性胺基酸，例如，芳族胺基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯並噻吩丙氨酸，或非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸，或極性胺基酸例如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸；Xaa15是非極性或酸性胺基酸，例如，非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸，或酸性胺基酸例如天冬氨酸或穀氨酸；Xaa16是鹼性、極性或非極性胺基酸，例如，鹼性胺基酸例如組氨酸、賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鳥氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸；或極性胺基酸例如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸，或非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸；Xaa17是鹼性、極性、脂族、非極性或酸性胺基酸，例如，鹼性胺基酸例如組氨酸、賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、瓜氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸，或極性胺基酸例如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸，或脂族胺基酸例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸，或非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸，酸性胺基酸例如天冬氨酸或穀氨酸；Xaa18是非極性或脂族胺基酸，例如，非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸，或脂族胺基酸例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸；和Xaa19是鹼性或脂族胺基酸，例如，鹼性胺基酸如組氨酸、賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鳥氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸，或脂族胺基酸例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸。
在某些實施方案中Xaa1是脯氨酸，Xaa2是精氨酸，Xaa3是半胱氨酸，
Xaa4是甘氨酸，Xaa5是纈氨酸或天冬醯胺，Xaa6是脯氨酸，Xaa7是天冬氨酸，Xaa8是纈氨酸、亮氨酸或絲氨酸，Xaa9是丙氨酸、甘氨酸或組氨酸，Xaa10是天冬醯胺、天冬氨酸、組氨酸、精氨酸、穀氨醯胺或甘氨酸，Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸，Xaa12是天冬醯胺、絲氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、纈氨酸或甲硫氨酸，Xaa13是苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸或穀氨酸，Xaa14是苯丙氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸，Xaa15是脯氨酸或穀氨酸，Xaa16是精氨酸、天冬醯胺或甘氨酸，Xaa17是賴氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、天冬氨酸或天冬醯胺，Xaa18是脯氨酸或亮氨酸，和Xaa19是賴氨酸、纈氨酸或精氨酸。
在本發明的某些實施方案中，組合物可包含含有SEQ ID NOs 1-13中任意一個序列的肽。例如，本發明的一些組合物包含具有SEQ IDNO11(PRCGNPDVANYNFFPRKPK)的19個胺基酸的肽。該肽橫跨MMP-2的切割位點。表示SEQ ID NO11肽兩個一半的兩個更小的肽(PRCGNPDVA(SEQ ID NO12))NYNFFPRKPK(SEQ IDNO13))也可以包含於組合物中。組合物也可以包括多於一個肽的組合。
具有與基質金屬蛋白酶切割區域相關的序列單個肽可用於增加組織中的纖連蛋白，並且也可以抑制單個或只是少數基質金屬蛋白酶的活性。這種單個肽的製劑可抑制一個或更多個但通常不是全部基質金屬蛋白酶。基質金屬蛋白酶活性的這種部分抑制可有助於癒合。可選擇地，可將兩個或更多個肽組合以靶向兩個或更多個基質金屬蛋白酶，這樣可提供更完全的對基質金屬蛋白酶活性的抑制。
通過使用可獲得的教導並結合此處提供的教導，本領域技術人員可設計包含合適肽或肽的組合的組合物以獲得大量想要的纖連蛋白。
通過使用可獲得的指導並結合此處提供的指導，本領域技術人員可設計包含合適的肽或肽的組合的組合物來獲得想要的基質金屬蛋白酶被抑制的質和量。抑制的「質」是指受抑制的基質金屬蛋白酶的類型。不同的基質金屬蛋白酶可具有略微不同的底物和活性位點。抑制的「量」是指對所有基質金屬蛋白酶抑制的總量。可通過調節所使用的肽抑制劑的類型和量來調節抑制的質和量。本領域技術人員可容易地修飾由本發明提供的肽並且觀察給定的基質金屬蛋白酶受抑制的類型和程度。
例如，本領域技術人員可比較和比對圖1中顯示的肽序列並且設計肽抑制劑以獲得想要的抑制的質和量。在一個實施方案中，以舉例的方式提供，比較三個傷口位點基質金屬蛋白酶mmp2、mmp9和mmp1的比對的胺基酸序列以鑑定序列上的同源區域和趨異區域。
MMP序列SEQ ID NOmmp2MUKFFGLFQTGDLDQNTIETMRKPRCGNPDVANYNFFPRKPKW NO15mmp9LQKQLSLPETGELDBATLKAMRTPRCGVPDLGRFQTFEGDLKW NO16mmp1MQEFFGLKVTGKPDAETLKVMKQPRCGVPDVAQFVLTEGNPRW NO17在這個序列比對中，粗體表示在MMP-1中發現的而在MMP-2或MMP-9中未發現的胺基酸，並且下劃線表示在MMP-1中並且僅在MMP-2或MMP-9中發現的胺基酸。
在本發明的一個實施方案中，除了增加組織中纖連蛋白，也需要抑制MMP2和MMP9，但要保持MMP-1的水平相對不受調節以癒合慢性傷口。基於上述的序列比對，本領域技術人員可設計具有在MMP2和MMP9酶原序列中發現的但在MMP1酶原序列中沒有的胺基酸的肽，以產生可抑制MMP2和MMP9同時使MMP1不受抑制的肽。由式IV提供這樣的肽。
Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO18)
其中Xaaa是脯氨酸；Xaa1是脯氨酸；Xaab是穀氨醯胺或穀氨酸； Xaa2是精氨酸；Xaac是蘇氨酸；Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸；Xaa4是甘氨酸；Xaae是天冬氨酸或穀氨酸； Xaa5是纈氨酸或天冬醯胺，理想地是天冬醯胺；Xaaf是亮氨酸；Xaa6是脯氨酸；Xaag是天冬氨酸； Xaa7是天冬氨酸；Xaah是穀氨醯胺或絲氨酸； Xaa8是纈氨酸或亮氨酸，理想地是亮氨酸；Xaai是天冬醯胺或丙氨酸； Xaa9是丙氨酸或甘氨酸，理想地是甘氨酸；Xaaj是蘇氨酸；Xaa10是天冬醯胺或精氨酸；Xaak是異亮氨酸或亮氨酸， Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸，理想地是異亮氨酸； 理想地是酪氨酸；XaaL是穀氨酸或賴氨酸，Xaa12是天冬醯胺或穀氨醯胺；理想地是穀氨酸； Xaa13是苯丙氨酸或蘇氨酸；Xaam是蘇氨酸或丙氨酸；Xaa14是苯丙氨酸；Xaan是甲硫氨酸； Xaa15是脯氨酸或穀氨酸，理想地是脯氨酸；Xaao是精氨酸；Xaa16是精氨酸或甘氨酸，理想地是精氨酸；Xaap是賴氨酸或蘇氨酸；Xaa18是脯氨酸或亮氨酸，Xaa17是賴氨酸或天冬氨酸； 理想地是亮氨酸；和Xaa19是賴氨酸。
肽的修飾本發明也預期對所述肽進行修飾以穩定它們、促進它們的攝取和吸收、並改善本領域技術人員所知的所述肽的任何其它特徵或性質。例如，可環化所述肽，中和所述肽上的電荷和將所述肽與其它化學部分連接。
可通過任何本領域技術人員可獲得的方法環化肽。例如，通過已知的方法可將N末端和C末端縮合以形成肽鍵。也可連接存在於肽中胺基酸側鏈上的官能團以環化所述肽。例如，可形成共價鍵的官能團包括--COOH和--OH、--COOH和--NH2以及--COOH和--SH。可用於環化肽的胺基酸對包括Asp和Lys、Glu和Lys、Asp和Arg、Glu和Arg、Asp和Ser、Glu和Ser、Asp和Thr、Glu和Thr、Asp和Cys以及Glu和Cys。其它能與另一個胺基酸形成共價鍵的胺基酸殘基的例子包括半胱氨酸樣胺基酸例如Cys、hCys、β-甲基-Cys和Pen，所述胺基酸相互可形成二硫鍵。想要的半胱氨酸樣胺基酸殘基包括Cys和Pen。其它可用於肽環化作用的胺基酸對對本領域技術人員而言是顯而易見的。
用於環化肽的基團不必是胺基酸。能夠與肽的氨基末端形成共價鍵的官能團的例子包括羧酸和酯。能夠與肽的羧基末端形成共價鍵的官能團的例子包括--OH、--SH、--NH2和--NHR，其中R是(C1-C6)烷基、(C1-C6)鏈烯基和(C1-C6)炔基。
兩個具有適合於形成這種互連的官能團的側鏈之間的各種反應以及適合於形成這種互連的反應條件對於本領域技術人員而言是顯而易見的。用於環化肽的想要的反應條件要足夠溫和以免降解或破壞所述肽。用於必要時保護各種功能性的合適的基團在本領域是熟知的(參見，例如GreeneWuts，1991，第2版，John WileySons，NY)，同時各種用於製備這類保護分子的反應方案在本領域也是熟知的。
在一個實施方案中，N末端和C末端的電荷被有效去除。可通過本領域技術人員可獲得的任何方法例如，通過乙醯化N末端和醯胺化C末端可實現之。
用於通過其它方式製備環肽和修飾肽的方法在本領內是熟知的(綜述參見，例如，Spatola，1983，Vega Data 1(3))；Spatola，1983，「PeptideBackbone Modifications」InChemistry and Biochemistry of AminoAcids Peptides and Proteins(Weinstein，ed.)，Marcel Dekker，NewYork，p.267(綜述)；Morley，1980，Trends Pharm.Sci.1463-468；Hudson等人，1979，Int.J.Prot.Res.14177-185(--CH2NH--、--CH2CH2--)；Spatola等人，1986，Life Sci.381243-1249(--CH2--S)；Hann，1982，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.1307-314(--CH＝CH--，順式和反式)；Almquist等人，1980，J.Med.Chem.231392-1398(--COCH2--)；Jennings-White等人，Tetrahedron.Lett.232533(--COCH2--)；European Patent Application EP 45665(1982)CA9739405(--CH(OH)CH2--)；Holladay等，1983，Tetrahedron Lett.244401-4404(--C(OH)CH2--)；和Hruby，1982，Life Sci.31189-199(--CH2--S--)。
維護和治療皮膚本發明提供肽和含有這類肽的組合物，所述肽和組合物可用作維護健康皮膚和促進皮膚狀況的試劑。這些肽和組合物也可用作防止和治療皮膚相關的狀況例如皺紋的試劑。在本發明的各方面，這些肽和組合物用於加強皮膚、收緊皮膚、更新或恢復皮膚狀況。這些肽和組合物也可用作抗衰老治療和用作治療光損害皮膚的試劑。本發明組合物可用於癒合傷口，例如，癒合慢性傷口。可在製劑中組合單個肽、肽變體、肽衍生物和其混合物(例如具有不同序列的)。含有肽和組合物的局部洗劑和敷料以及使用所述肽和組合物的方法也是預期的。
最佳的癒合和皮膚再生可能需要某些基質金屬蛋白酶活性。因而，當本發明的組合物和製劑抑制基質金屬蛋白酶時，它們不必提高對基質金屬蛋白酶的最大抑制。相反，所述製劑的活性是根據最優化癒合和改善健康皮膚發育的需要變化的。可通過改變肽的類型、內容物和量來獲得更小或更大的抑制水平以促進癒合和健康皮膚發育。
為了促進健康皮膚發育和/或治療傷口，將含有肽的組合物以領域技術人員選擇的任意方式引到皮膚上或引入傷口。例如，可將肽配製到含有治療有效劑量的一種或更多種肽和藥物學載體的治療組合物中。這種組合物可被施到皮膚上或施入傷口，例如以乳膏、噴霧劑、泡沫、凝膠或任何其它的製劑形式。在某些實施方案中，所述組合物是局部軟膏。在另外的實施方案中，可將肽配製成含有治療有效劑量的一種或多種肽的皮膚覆蓋物或敷料，所述肽被浸滲到、共價附著到或以其它方式結合到覆蓋物或敷料材料上。在本發明的一個實施方案中，皮膚覆蓋物或敷料允許所述肽的釋放。所述肽的釋放可以是以不可控或是可控的方式進行。因而，本發明的皮膚覆蓋物或傷口敷料可以慢速或定時地將所述肽釋放入傷口或到皮膚上。皮膚覆蓋物和敷料材料可以是任何用於本領域的材料，例如，繃帶、紗布、滅菌的包裹物、水凝膠、水膠體和類似材料。
肽的治療有效劑量是能將組織中纖連蛋白增加到維護健康皮膚和/或促進皮膚狀況所需程度的肽量。肽的治療有效劑量也是將組織中纖連蛋白增加到防止和/或治療皮膚相關狀況例如皺紋所需程度的肽量。此外，肽的治療有效劑量也是將組織中纖連蛋白增加到加強或收緊皮膚、更新和/或恢復皮膚狀況例如恢復受傷的或光損害的皮膚所需程度的肽量。例如，當提供到治療或藥物學組合物中時，所述肽的量可以是組合物重量的大約0.001％到大約35％的範圍。所述肽可構成組合物重量的大約0.5％到大約20％。可選擇地，所述肽可構成組合物重量的大約1.0％到大約10％。肽抑制劑的治療有效劑量可隨施用途徑而變化。例如，在每Kg體重30到112,000μg之間的治療量對靜脈內施用可以是有效的。然而，健康皮膚發育或傷口治療所需要的所述肽抑制劑的量不僅隨施用途徑而變化，而且也隨受治療狀況的特性和病人的年齡和狀況而變化，且最終由主治醫師或臨床醫生判斷。
施用的劑量和方法可依賴於受治療的皮膚或組織的位置和/或傷口的嚴重性而變化。所述肽和肽綴合物的有用劑量可通過使其體外活性和此處描述的動物模型的體內活性相關聯來確定。所述化合物可用單位劑量形式施用；例如，每單位劑量形式含有大約0.001μg到大約10mg、大約0.01μg到大約5mg、大約0.10μg到大約1mg，大約1.0μg到大約500μg的肽。想要的劑量可以以單一劑量、以分開劑量或以連續輸注的方式提供。想要的劑量也可以按合適間隔施用，例如，每天二次、三次、四次或更多次亞劑量施用。通過使用此處提供的教導，本領域技術人員可以容易地利用可獲得的信息製備和施用有效製劑。
所述肽可配製成藥物學組合物並且以各種適合於所選擇的施用途徑的劑量形式施用於哺乳動物宿主，例如人類患者，所選擇的施用途徑即，經口或腸胃外、通過靜脈內、肌內、局部或皮下途徑。
因此，可全身性地施用含有肽的所述組合物，例如，通過輸注或注射靜脈內或腹膜內施用。可在水中製備肽溶液，任選地與無毒表面活性劑混合。可在甘油、液體聚乙二醇、三醋精和其混合物和油中製備分散體。在普通貯存和使用的條件下，這些製劑含有防腐劑以防止微生物生長。
適合於注射或輸注或局部應用的藥物學劑量形式包括無菌水溶液或分散體或無菌粉末(其包含的活性成分適合用於臨時製備無菌可注射的或可輸注的溶液或分散體任選地被囊化在脂質體中)。最終的劑量形式在生產和貯存條件下應該是無菌的、流動的和穩定的。液體載體或運載體可以是溶劑或液體分散介質，包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、植物油、無毒甘油酯和其合適混合物。合適的流動性可通過，例如，通過脂質體的形成、在分散體的情況下通過維持所需顆粒的大小或通過使用表面活性劑得以保持。可通過各種抗細菌和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等產生對微生物作用的防護。在某些情況下，本領域技術人員可選擇包括等滲劑，例如，糖、緩衝液或氯化鈉。通過在組合物中使用延長吸收的試劑例如一硬脂酸鋁和明膠來產生可注射組合物的延長的吸收。
通過將所需要量的所述肽或肽綴合物按需要整合到具有各種其它上述成分的合適溶劑中，接著通過過濾滅菌可製備無菌可注射溶液。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，製備的方法包括真空乾燥和冷凍乾燥技術，所述方法產生具有活性成分加上任意額外的存在於前述無菌過濾的溶液中的想要成分。
在某些情況下，所述肽也可結合藥物學可接受的運載體例如惰性稀釋劑或可同化的可食的載體經口施用。它們也可包裹在硬的或軟的殼狀明膠膠囊內，也可壓縮成片劑或可直接整合入到病人飲食的食物中。對於口服治療施用，所述肽可與一個或更多個賦形劑組合，並以可消化的片劑、口腔片、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、薄片(wafer)等使用。這類組合物和製劑可含有至少0.1％的活性化合物。當然，所述組合物和製劑的百分比可以是變化的並且變動範圍可以是按給定單位劑量形式重量計算從大約2％到大約60％。在這種治療性有用組合物中的活性化合物的量就是將要獲得的有效劑量水平。
所述片劑、錠劑、藥丸、膠囊等也可含有下列成分粘合劑例如黃蓍樹膠、阿拉伯樹膠、玉米澱粉或明膠；賦形劑例如磷酸二鈣；崩解劑例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、褐藻酸等；潤滑劑例如硬脂酸鎂；和增甜劑例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜或調味劑例如胡椒薄荷、冬綠油或可加入櫻桃調味劑。當單位劑量形式是膠囊時，除了上述類型材料，其可包含液體載體，例如植物油或聚乙二醇。各種其它材料可以以塗層形式提供或用以修飾固體單位劑量形式的物理形式。例如，片劑、藥丸或膠囊可用明膠、蠟、紫膠或糖等塗覆。糖漿或酏劑可含有活性化合物，作為增甜劑的蔗糖或果糖，作為防腐劑的羥苯甲酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯、染料和調味劑例如櫻桃或柑桔調料。當然，任何用於製備任何單位劑量形式的材料應該是藥物學可接受的並且基本上在使用的量內是無毒的材料。此外，可將所述肽整合到持續釋放的製劑和裝置中。
有用的固體載體包括精細粉碎的固體例如滑石粉、粘土、微晶纖維素、矽石和礬土等。有用的液體載體包括水、醇或1，2-乙二醇或水-醇/1，2-乙二醇摻合物，通過任選地無毒表面活性劑的幫助，本發明化合物可以以有效水平在所述摻合物中溶解或分散。可加入佐劑例如香料和額外的抗微生物劑以最優化給定使用的性質。
為了直接應用於使用者的皮膚，也可將增稠劑例如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、修飾的纖維素或修飾的礦物質材料與液體載體一起使用來形成可塗開的糊劑、凝膠、軟膏、肥皂等。
一般地，本發明的組合物是用於局部施用的。可通過任何方式直接地或間接地將活性肽局部施用於選擇的組織，所述方式例如噴霧劑、泡沫、粉末、乳膏、膠凍、糊劑、栓劑或溶液。本文中所使用的術語糊劑應當被理解為包括乳膏和其它粘滯性的可被塗開的組合物，例如那些通常直接用於皮膚或塗抹在繃帶或敷料上的組合物。肽可以共價地附著到、穩定地吸附在或應用到皮膚覆蓋物或傷口敷料材料中。為了幫助手術後的癒合，所述活性肽可直接應用於靶組織或假器官裝置或可植入的持續釋放裝置中。所述組合物可作為泡沫或霧與或不與其它試劑一起通過氣溶膠直接在皮膚或傷口上施用。
所述肽可以以製劑形式施用，所述製劑包括所述肽在蠟、油、乳化劑、水和/或基本上不溶於水且能在水存在的情況下形成凝膠的材料中形成的乳劑。所述製劑提供了想要的乳劑性質，因為其是可塗開且具有乳劑的奶油狀稠度，但是當進行正常的滅菌過程，例如蒸汽滅菌時不會解體，因為凝膠穩定了所述乳劑。同時該乳劑也表現出比常規凝膠更好的保水性，因為水既被保留在乳劑中又被保留在凝膠中。
所述製劑也可包含減少乳膏或洗劑中水的蒸氣分壓的溼潤劑以降低乳膏或洗劑乾燥的速率。合適的溼潤劑相當容易於與水混溶並通常適合應用於皮膚。多元醇特別適合於所述目的，且合適的多元醇可包括丙二醇(monopropylene glycol)或甘油(丙三醇)。所述多元醇可佔總製劑比例的20％到50％(按重量計算)；可選擇地所述範圍是30-40％。這個相對較高比例的多元醇比例也保證如果糊劑乾燥到任何程度，所得的糊劑仍保持柔軟和具有柔性，因為甘油為可作為所述聚合物的增塑劑。當將所述糊劑用於繃帶時，例如，在所述糊劑失去水時其仍然能容易地從皮膚上揭離而不需要將繃帶剪除。當所述多元醇與皮膚或傷口特別是感染的傷口接觸時也具有防止細菌在糊劑中增殖的功能優勢。
所述製劑可包括其它成分。可使用的成分包括氧化鋅、魚石脂、爐甘石(calamine)、磺胺嘧啶銀、醋酸氯己定、煤焦油、葡萄糖酸洗必太、水楊酸、甲硝噠唑或其它抗細菌劑或其組合。其它成分發現也可適合於整合到所述乳膏中。
可以有益量包含這些成分，例如，可加入最多大約15wt％的氧化鋅；一般地使用6-10％的氧化鋅，可能和另外的成分例如魚石脂(0-3wt％)和/或爐甘石(0-15％wt)組合。魚石脂或爐甘石也可以單獨使用。醋酸氯己定可以以最高按重量計算1％濃度使用；通常是0.5wt％。
用於乳劑的蠟的例子是硬脂酸苷油酯，或以CITHROLGMS/AS/NA形式從Croda Universal Ltd.商業購得的硬脂酸甘油酯和PEG100硬脂酸酯的組合。該組合提供了蠟和特別容易與蠟相容的乳化劑(PEG100硬脂酸酯)以在水中形成乳劑。第二個乳化劑可以包括在製劑中以增加乳劑的穩定性，例如PEG20硬脂酸酯，例如由Croda Universal Ltd.提供的CITHROL 1OMS。乳膏中乳化劑的總濃度正常地應該為3到15％。其中使用了兩種乳化劑，一種可以以大於另一種的濃度存在。
不溶於水的材料與製劑中的水形成凝膠。因而所述材料是親水性的但不會以任何程度溶於水。所述材料可以是聚合材料，例如吸水性非水溶性聚合物。然而，也可使用與水形成凝膠的非聚合材料和在升高溫度時穩定的非聚合材料，例如粘土例如高嶺土或膨潤土。某些用於本發明的聚合物是高吸水性聚合物例如那些公開於WO92/16245的聚合物並且包括部分交聯形成三維結構的親水性纖維素衍水物。合適的交聯型纖維素衍生物包括那些羥基低碳烷基化纖維素，其中烷基基團含有1到6個碳原子，例如羥乙基纖維素或羥丙基纖維素，或羧基纖維素例如羧甲基羥乙基纖維素或羧甲基纖維素。可用於本發明的聚合物的例子是由Akzo Chemicals B.V.以AKUCELL X181形式提供的部分交聯的羧甲基纖維素鈉聚合物。該聚合物是高吸水性聚合物，因為其可吸收至少10倍於其自身重量的水。所述聚合物的交聯結構防止其溶解於水中但水可很容易地吸收到並且保持在所述聚合物的三維結構中以形成凝膠。水從這樣的凝膠中丟失要比從溶液中慢並且在減慢或防止乳膏製劑乾燥方面是有利的。所述製劑的聚合物含量正常情況下低於10％，例如，所述聚合物含量按重量計算可為大約0.5％到大約5.0％或為大約1.0％到大約2％。
所述製劑可進行滅菌並且應當選擇所述製劑的組分(通過改變所述聚合物的含量)以提供終產物想要的流動性質。即，如果產物要進行滅菌，那麼應當選擇製劑以在滅菌前給產物以相對高的粘性/彈性。如果某些製劑組分不能進行滅菌，那麼可在加入那些成分前先對所述製劑進行滅菌，或可對各組分分別進行滅菌。接著通過在無菌條件下混合各滅菌成分可製備所述製劑。當組分分開滅菌然後混合在一起時，可調整所述聚合物含量以產生具有終產物想要的流動性質的產物。所述乳劑含量決定所述製劑的操作性質和感覺，更高乳劑含量導致增加的可塗開性和乳脂狀。
所述製劑可包裝到管中、盆中或其它合適形式的容器中進行貯存或塗到基底上然後進行包裝。合適的襯底包括敷料，包括膜敷料，以及繃帶。
牙科上的應用本發明也預期組合物和製劑和使用這些組合物和製劑在牙齦組織中增加纖連蛋白的方法，所述組合物和製劑包含能增加組織中纖連蛋白的肽。這些組合物和製劑用於治療或防止各種牙齒或口腔狀況，包括牙齦退縮、齦炎和牙齦疾病。除了所述肽以外，這些組合物可包含有效量的羥酸化合物、茉莉酮酸化合物、赤黴酸化合物或玉米素化合物以及口可接受的載體和其它成分。這些組合物可配製成漱口劑、配製成用於戴在牙齒上的牙齒託盤(dental tray)的凝膠、或配製成能粘在牙齒或牙齦表面的粘合劑。
在某些實施方案中，所述載體可包括混合在一起會產生粘性基質材料的膠粘劑和溶劑。所述基質材料粘性足以使牙齒託盤保持並且留靠在人的牙齒上。合適的粘性基質材料優選地是具有粘滯性的並且不容易溶解在唾液中。各種膠粘劑是可購得的並且本領域技術人員可以容易地選擇膠粘劑。可用於形成粘性和粘滯性的基質材料的膠粘劑包括羧基聚亞甲基(carboxypolymethylene)，例如，CARBOPOL 934P。羧基聚亞甲基可用於形成膠狀牙齒組合物，所述組合物自身可充當將舒適的、非自保持的牙齒託盤留靠在人牙齒上的粘合劑。羧基聚亞甲基的使用消除了對使用自保持牙齒託盤(即，堅硬的和機械地將人的牙齒或牙齦互鎖並且傾向於使用較少的粘性組合物的一般牙齒託盤)的需要。參見美國專利6,309,625。
一般地，本發明的牙齒組合物可包括按所述牙齒組合物重量計算濃度為大約0.5％到大約25％的羧基聚亞甲基，或為大約2％到大約12％和/或為大約3％到大約10％。在想要增加粘性、粘滯性和抵抗唾液稀釋的時候，人們可以調節羧基聚亞甲基的濃度以達到任何一個或所有這些性質的想要水平。增加粘性有助於將優選的牙齒託盤留靠在人的牙齒上。可選擇地，如果需要特別是不用牙齒託盤直接應用時，可以使組合物的粘合性和粘性減小。
為了獲得羧基聚亞甲基樹脂在牙齒組合物中良好擴散，推薦在試圖加入其它組分前將羧基聚亞甲基與合適的溶劑混合，所述組分與羧基聚亞甲基相容性較低，例如水。與羧基聚亞甲基一起使用的合適溶劑的例子包括甘油、其它多元醇、聚(亞烷基)二醇和其它多元醇等。甘油似乎能使大量的羧基聚亞甲基分散到水中。在本發明的某些實施方案中，作為牙齒增白組合物溶劑的甘油、多元醇等物質加入的濃度按牙齒增白組合物重量計算為大約15％到大約85％；在本發明的某些實施方案中，按重量計算為大約25％到75％；和在本發明的某些實施方案中，按重量計算為大約30％到65％。然而，應當理解的是羧基聚亞甲基的實際量對獲得粘性的、粘滯性的牙齒組合物不是至關重要的。
粘性基質材料可包括其它膠粘組分，所述膠粘組分與羧基聚亞甲基組合或代替部分或全部羧基聚亞甲基可產生牙齦刺激性組合物，所述組合物具有將優選的、舒適適配的牙齒託盤置於人牙齒的位置時所需要的想要的粘性水平。可使用其它合成聚合物和/或天然樹膠、蛋白或其它形成凝膠的混合物，只要其產生粘性牙齦刺激組合物即可。
除了羧基聚亞甲基外，其它合適的膠粘劑和增稠劑的例子包括樹膠例如黃原酸膠、塔爾哈膠(talha gum)、黃蓍膠、刺槐豆膠、瓜耳膠、愛爾蘭蘚膠(Irish moss gum)、茄替膠、紅藻膠、角叉菜聚糖膠、阿拉伯樹膠、褐藻酸樹膠、瓊脂樹膠、藻酸鹽樹膠。另外合適的膠粘劑以PEMULENTM(B.F.Goodrich所有的化合物)或其組合物的或化學等同物的形式銷售。PEMULENTM包含大量的具有輕度疏水性末端和強親水性末端的聚丙烯酸共聚物。合適膠粘劑的另外的例子包括聚環氧乙烷例如由Union Carbide銷售的POLYOXTM。這些膠粘劑可以以如上所述的關於羧基聚亞甲基的相同範圍存在。
本領域技術人員可包括其它活性牙科試劑來治療或防止其它類型的牙齒和/或牙齦問題。例如，結合本發明的牙齦刺激組分，這些技術人員可提供抗生齲劑的和抗脫礦質劑例如氟化物鹽，更特別的是單氟磷酸鈉、氟化鈉和氟化亞錫。依賴於想要的氟化物治療水平，和依賴於組合物是否是「非處方的」或「通過處方的」，可包含按牙齒增白組合物重量計算大約0％到大約1％的氟化物，更優選的是按重量計算大約0.1％到大約0.5％。可包括與本發明的牙齦刺激組分結合的抗微生物劑(例如用於抗牙齦疾病)。有用的抗微生物劑的例子包括氯己定、四環素、西吡氯銨、苯扎氯銨、溴化十六烷基吡啶、苯甲酸甲酯和苯甲酸丙酯。按重量計算，優選地包含0％到大約15％或大約1％到大約5％的與牙齦刺激組分結合的抗微生物劑。
在本發明範圍內分配粘性的和粘滯性牙齦刺激組合物的一個方法是使用注射器。可擠壓的管子和其它類似分配裝置也可用來分配所述組合物。分配後，牙齦刺激組合物要有足夠粘滯性這樣一旦被分配它們就不容易沉積或擴展，而是牙齦刺激組合物一般保持為單一擠壓出的鏈或珠狀物，例如，沿著牙齦線。此外，可使用瓶子、管或其它本領域已知的分配裝置，特別是當所述牙齦刺激組合物具有更低的粘滯性、低粘性並且不含增稠劑時。
在某些實施方案中，本發明在注射器或類似的分配裝置中提供了單位劑量的牙齦組合物。通過這個方式，人們可以在每個治療期內將精確量的牙齦刺激組合物裝入牙齒託盤。通過使用這種分配裝置，能夠監控人已經接受和使用了多少劑量。然而，在其他實施方案中可將牙齦組合物在不使用牙齒託盤的情況下直接用於人的牙齒，或根據本發明的粘滯性和粘性較低的刺激組合物可用與本領域已知的自保持牙齒託盤配合使用。
當給定牙齦刺激組合物能將牙齒託盤留靠在人的牙齒上持續例如10小時或更長時，所述組合物一定能在本發明範圍內任何想要的時間段使用，例如15分鐘、1小時或任何想要的持續時間。為了最大化治療時間和減少將牙齒託盤置於人口內的不便，可在晚上人睡覺期間使用牙齒託盤。
下面的例子用來說明但不限制本發明。
實施例1肽抑制劑一般材料所有的肽由Sigma-Genosys，Inc合成。由該公司用RP-HPLC純化所述釋放的肽至＞95％的均一性。對所匯集的洗脫的峰材料進行脫鹽和凍幹。質譜分析確定所述肽的分子量和純度。除非另外指出，所有化學試劑購自Sigma Chemical Corp，或Fluka Chemical Co。活性MMP-9酶購自Calbiochem。
分子建模分子建模使用兩個可視化程序，Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch，1997)和Rasmol(Sayle和Milner-White，1995)。建模工作在運行Windows 95的Compaq PC上和Silicon Graphics，Inc.Octane UNIX工作站上進行。另外，來自Molecular Simulations，Inc.的Cerius2分子包在Octane上使用。三維結構文件從如下Protein Databank下載而來(文件名，參考文獻)MMP-1(1FBL，Li等人，1995)、MMP-2(1GEN，Libson等人，1995)、MMP-8(1JAO，1JAN，Grams等人，1995；Reinemer等人，1994)、MMP-9(1MMQ，Browner等人，1995)、TIMP-2/MT-1MMP複合物(1BUV，Fernandez-Catalan等人，1988)、TIMP-2(1BR9，Tuuttila等人，1998)和TIMP-1/MMP複合物(1UEA，Gomis-Ruth等人，1997；Huang等人，1996；Becker等人，1995)。這些文件用於分析所述蛋白的三維結構，並做為原始序列數據來源。
抑制測定進行兩個酶促測定。第一個測定測量作為時間函數的MMP-9對螢光素化膠原蛋白的酶促水解作用。將螢光素化膠原蛋白(MolecularProbes，Inc.)以5μM的濃度加入到反應緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.6)，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1mM NaN3)中，放入Speetrosil石英螢光計比色杯中。將MMP以0.1μM的濃度與各種量的肽混合併在25℃下溫育10分鐘以實現結合。將該蛋白混合物加入到膠原蛋白底物中，並快速混合。在Shumadzu RF5301螢光計(Lakowicz，1983)測量作為時間函數的520nm處的螢光發射強度(激發波長為495nm)。根據Segel(1993)，運用Dixon圖(1/v對[I])，由螢光素釋放測定來確定肽抑制劑([I])的抑制常數(Ki)，從而斜率＝Km/(Vmax Ki[S]) (1)其中，Km為米氏常數，Vmax為反應最大速率，[S]為底物濃度。
第二個測定利用螢光共振能量傳遞技術(FRET)。7個胺基酸的底物肽(Calbiochem)被偶聯到一個羧基末端的二硝基苯基受體和一個氨基末端的2-氨基苯並氨茴醯(Abz)部分供體。由MMP-9對該底物的切割導致一個螢光產物(365nm激發，450nm發射)的釋放。濃度為5μM的肽被加入到反應緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.6)，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1mM NaN3)中，然後放置在一個黑色的96孔微量滴定板孔中，該板孔事先用1％BSA進行封閉。將濃度為0.1μM的MMP與各種量的9-聚體、10-聚體或19-聚體相混合併在25℃下溫育10分鐘以實現結合。該蛋白混合物被加入到螢光肽底物中並快速混合。作為時間函數的螢光強度用Dynex MFX螢光微量滴定板讀數器來檢測。通過用一個帶有非FRET肽的Abz製作標準曲線，將螢光強度與被切割肽的摩爾數聯繫起來。抑制常數由上述的曲線推導出來。其他的基質金屬蛋白酶類通過使用特異的底物FRET肽(均購自Calbiochem)採取相似的方式進行測試。
抗激活測定本測定檢測有多少酶原被轉化為成熟的基質金屬蛋白酶。酶原MMP-9原(100μg)與在PBS中配製的0.5μg的Stromilysin相混合。該反應在35℃下溫育。在80分鐘的時間過程中從反應物中獲取等分試樣。每一份等分試樣與EDTA相混合至最終濃度為1mM，然後注射到BioSelect 125 HPLC柱，在PBS中進行色譜分析。零時間點(注射)為一單峰，其在大約750秒從柱上洗脫下來。該峰大小作為時間的函數減小，隨後出現兩個新峰。第一個峰在大約800秒處洗脫，代表MMP-9的成熟形式。第二個峰在大約1100秒處洗脫，對應於N末端的前結構域片段。通過在全部洗脫曲線上積分確定峰的面積，並且標出面積變化的百分比。
等溫滴定量熱法用來自MicroCal，Inc.的VP-ITC儀器進行等溫滴定量熱法(ITC)。通過向1.4mL攪拌的反應測定池中注射入5μL的抑制劑肽溶液(濃度變化範圍從0.5mM到2.0mM)進行滴定。測定池中MMP-9的濃度變化範圍是從50到80μM。所述抑制劑和酶都存在於20mM二甲基胂酸鈉(pH5.5-7.0)、40mM NaCl或20mM Tris-HCl(pH7.0-7.5)，40mM NaCl中。滴定在20℃和40℃之間進行。進行滴定的一般實驗條件是10秒注射時間段，接著在注射之間延遲240秒，總共進行40次注射。為了校正因稀釋和混合而產生的熱，進行將抑制劑肽滴定入緩衝液中的空白滴定。
多結合位點的獨立集是用於結合實驗估量的最常見模型。對總熱的分析解決方案由(Freire等人，1990)確定Q=VH[[L]+1+[M]nK-(1+[M]nK-[L]K)2+4K[L]2K](2)]]>其中Q是總熱，V是測定池體積，ΔH是焓，M是大分子濃度(測定池中的結合配偶體)，n是結合化學計量，L是配體濃度(注射器中的結合配偶體)且K是締合常數(association constant)。用第5版的Origin(MicroCal，Inc.)將數據擬合該模型。
表面等離子體共振使用BiaCore-X表面等離子體共振(SPR)儀(BiaCore，Inc.)測量19-聚體(P)與MMP-9之間的相互作用。為進行這些實驗，用50mMN-羥基琥珀醯亞胺、0.2M N-乙基-N』-(二甲基氨丙基)-碳二亞胺以每分鐘10μL的流速激活羧甲基葡聚糖傳感器晶片(CM-5，Lofas等人，1993)10分鐘。將75ng/μL濃度的MMP-9以每分種10μL的流速偶聯到所述活性表面10分鐘。通過將1M乙醇胺-HCl以每分鐘10μL的速度流過傳感器表面5分鐘來進行終表面的滅活。所述19-聚體以每分鐘20μL的速度流經傳感器表面，並且濃度為10到50nM。通過在構建速度常數前使用自動化FFT程序使結合等溫線的締合相和離解相平滑。通過同時擬合正向(Ka)和反向(Kd)速度常數到d[P～MMP-9]/dt＝(Ka[p][MMP-9])-(Kd[P～MMP-9]) (3)來估計結合等溫線(Karlsson and Falt，1997)，其中[P]、[MMP-9]和[P～MMP-9]分別是游離肽、游離MMP-9和所述複合物的濃度。因而平衡親和常數(KA)定義為KA＝ka/kd(4)根據SPR信號(Morton等人，1995)，式3正確地表達為dR/dt＝kaC Rmax-(kaC+kd)R (5)其中R是在時間t的SPR信號(響應單位，RU)，Rmax是以RU為單位的最大MMP-9結合能力，且C是螯合肽濃度。使用來自Microcal，Inc.的Origin進行動力學分析(O』Shannessy等人，1993)。
生存力測定使用來自MatTek Corp.的皮膚模型Epiderm測定9-聚體、10-聚體和19-聚體的相對毒性。在加入所述肽之前將單個皮膚樣品容器在培養基中於37℃下、5％CO2中預溫育2小時。將樣品容器轉移到含有新鮮培養基的6孔平板上。將所有的肽以終濃度10mM溶解在PBS中，並且用移液器將100μL各肽溶液加到Epiderm樣品容器的表面。在37℃下、5％CO2中繼續溫育12小時。溫育期過後，將樣品容品用PBS洗滌3次，並且將樣品容器轉移到24孔平板中，所述平板中每個孔含有300μL的MTT測定培養基(MTT濃度為1mg/mL)。允許比色測定進行3小時顯色(溫育在37℃下、5％CO2中)。然後將樣品容器轉移到24孔培養板中，每個孔中含有2mL的異丙醇。在室溫下4個小時期間內，提取有色沉澱。採集各樣品在570nm和650nm的吸收度讀數。各樣品相對於PBS對照的百分比生存力計算為100×(OD570sam-OD650sam)/(OD570con-OD650con) (6)通常地，所述肽樣品重複三次測定。
結果以下提供基質金屬蛋白酶-2(SEQ ID NO14)的序列以幫助定義基質金屬蛋白酶中各種結構域和區域。
1 MEALMARGAL TGPLRALCLL GCLLSHAAAA PSPIIKFPGD41 VAPKTDKELA VQYLNTFYGC PKESCNLFVL KDTLKKMQKF81 FGLPQTGDLD QNTIETMRKP RCGNPDVANY NFFPRKPKWD121 KNQITYRIIG YTPDLDPETV DDAFARAFQV WSDVTPLRFS161 RIHDGEADIM INFGRWEHGD GYPFDGKDGL LAHAFAPGTG201 VGGDSHFDDD ELWTLGEGQV VRVKYGNADG EYCKFPFLFN241 GKEYNSCTDT GRSDGFLWCS TTYNFEKDGK YGFCPHEALF281 TMGGNAEGQP CKFPFRFQGT SYDSCTTEGR TDGYRWCGTT321 EDYDRDKKYG FCPETAMSTV GGNSEGAPCV FPFTFLGNKY361 ESCTSAGRSD GKMWCATTAN YDDDRKWGFC PDQGYSLFLV401 AAHEFGHAMG LEHSQDPGAL MAPIYTYTKN FRLSQDDIKG441 IQELYGASPD IDLGTGPTPT LGPVTPEICK QDIVFDGIAQ481 IRGEIFFFKD RFIWRTVTPR DKPMGPLLVA TFWPELPEKI521 DAVYEAPQEE KAVFFAGNEY WIYSASTLER GYPKPLTSLG541 LPPDVQRVDA AFNWSKNKKT YIFAGDKFWR YNEVKKKMDP601 GFPKLIADAW NAIPDNLDAV VDLQGGGHSY FFKGAYYLKL641 ENQSLKSVKF GSIKSDWLGC使用CLUSTALTM程序可計算9個MMP胺基酸序列切割區域的穩健的成對比對(Higgins等人，1992)。該比對確定了活性蛋白酶切割位點兩側的保守和非保守胺基酸的位置。選擇活性切割位點的任意數目的N末端胺基酸以及C末端胺基酸數目來進行比對。顯示於圖1的MMP序列(表1)的比對表明所有MMP活性區域可以以統計學顯著方式進行比對。選擇用來比對的區域大致對應於胺基酸70-120，假定平均MMP信號序列結構是胺基酸1-20，所述前肽結構域是胺基酸21-100，並且成熟活性酶是從胺基酸101到末端。選擇用以研究的19-聚體序列包含在比對區域裡。特別地，在MMP-2中，所述19-聚體對應於胺基酸100-118。
MMP序列的比對表明活性結構域的中心區域PRCGVPDV(SEQID NO1)高度保守，並且在該區域兩側有更大程度的序列變化。序列的不均一性可簡單地通過胺基酸(基於該比對)的選擇用於設計抑制特定MMP酶或MMPs組合的肽序列。此外為了調節能力，特定肽的長度可以變化。
圖2提供了MMP-1原的三維結構，表明顯示於表1和圖1中的活性區域各構建了使兩個大球狀結構域互相連接的橋。所述切割區域定義為一段短的連接前肽結構域和活性酶結構域的無結構結構域。作為活化步驟的一部分，該序列被切割成兩部分。這也是在體外對HgCl2介導的活化敏感的區域。
活化過程消除了空間區段(其是前肽結構域)暴露了成熟酶的活性位點。所述N末端靠近催化性的鋅離子，所述鋅離子通常是酶促活性所必需的。圖3顯示了活性MMP-9結構，鋅離子描述為實心球體。第二個鋅離子是結構離子，即，其對蛋白的穩定性有貢獻，但不對催化有貢獻。現在19-聚體的C端半段是酶的最遠氨基末端，如圖3左側所顯示的作為最後的環的上升部分(雙向影線)。構造激活結構域肽到活化的MMPs表面的模型表明所述肽(特別當如果更長的N端區域被包括進來時)可與活性位點區域相互作用，從而有效地阻斷底物接近所述活性位點。通過這種方式其可充當小的前結構域或酶的「帽子」。
酶可被蛋白酶解成片段並且這些片段可以重建以再生活性的酶。各種肽結構域重新裝配並且通過分子間非共價作用力維持在一起。這種肽-蛋白相互作用的經典例子包括核糖核酸酶S肽/核糖核酸酶S蛋白相互作用(Levit和Berger，1976)。核糖核酸酶S肽在其正確的位置結合到S蛋白上並且得到的複合物恢復RNASE-S的酶促活性。
根據本發明，所述激活結構域肽可重新結合到激活的MMP的區域上形成無活性複合體，所述區域是在MMP原上發生這種結合的區域。可測量這種結合(參見下面)。此外，所述19-聚體可通過其半胱氨酸殘基連接鋅，重新阻止催化作用。
MMP酶促活性的抑制使用19個胺基酸的肽(SEQ ID NO11)進行抑制研究，所述肽來源於MMP-2切割結構域區域。該肽選自CLUSTAL比對的區域，所述區域顯示最高程度的保守性。選擇的19-聚體在N末端嚴格保守，但在C末端區域顯示高度可變性。對兩個代表該肽的N末端和C末端半部分的更小的肽也進行檢驗。所述兩個半部分將該肽大致分成了保守的N末端部分(9-聚體)和非保守的C末端(10-聚體)。這不僅允許檢驗整體的抑制功效，也允許檢驗選擇性。
19-聚體PRCGNPDVANYNFFPRKPK (SEQ ID NO11)9-聚體PRCGNPDVA (SEQ ID NO12)10-聚體NYNFFPRKPK (SEQ ID NO13)所有這三個肽都能在兩個基於螢光的測定中抑制MMP-9。在所有研究的情況中，所述19-聚體是比兩個半肽更好的酶促抑制劑。9-聚體是比C末端的10-聚體更有效的抑制劑。這些結果表示半胱氨酸可能是必需的因為其充當鋅的配體，或N末端區域需要用來影響酶活性位點的空間阻斷。可通過生產含有更靠N末端序列(指在殘基100之前的胺基酸)的抑制劑肽來檢驗該假說。圖4顯示用19-聚體滴定MMP-9的一般抑制曲線。
圖5和6分別顯示了用10-聚體和9-聚體進行的類似抑制分析。在基於FRET的測定中，各肽能抑制MMP-9，抑制劑常數(Ki’s)的變化範圍是從45.2到327.7μM(參見表4)。底物的選擇(FRET肽或螢光素化的膠原蛋白)在對三種肽的相對抑制作用上產生很小的不同，具有如下一致的趨勢19-聚體＞9-聚體＞10-聚體。圖7-9表示用肽滴定MMP-9的一般反應曲線。
對於膠原蛋白底物的抑制劑常數總體上稍微偏低，對於膠原蛋白的變化範圍是從30.3到221.3μM而對於FRET-肽為45.2到327.7μM。這些數據表明當使用膠原蛋白底物時所述肽是稍微更有效的抑制劑，暗示著抑制劑肽封閉了活性位點並且因為膠原蛋白明顯比FRET肽底物更大，所以更容易阻止其與酶活性位點接近。甚至在抑制劑肽存在的情況下，更小的FRET-肽底物可以更容易地接近活性位點。
一般的酶測定(圖4-7顯示)通常進行30-40分鐘。更長時間的測定顯示19-聚體有效地抑制MMP-9催化膠原蛋白水解的時間超過1000分鐘(圖8)。在長時間點(圖9)上10-聚體防止膠原蛋白破壞不如9-聚體(圖10)有效。19-聚體再次顯示最大程度的抑制作用。
對其它MMP酶進行類似的酶研究以檢驗19-聚體的有效性。這些測定使用了FRET肽，所述FRET肽在其序列中整合了特定MMP切割位點。所述19-聚體能夠潛在地抑制多個MMPs。19-聚體對抗各種MMPs的有效性如下MMP-2＞MMP-3＞MMP-8＞MMP-7＞MMP-9＞MMP-1，抑制常數變化範圍從3.1μM(MMP-2)到41.1μM(MMP-1)。這些數據總結於表4。
表4.抑制劑數據總結
19-聚體的抗剪接活性MMPs是以無活性酶原形式生物合成產生的。酶原的蛋白酶解切割導致MMP活化，所述蛋白酶解切割通常是通過不同種類的膜結合的MMPs進行的。所述酶原的前導序列長度約100個胺基酸(從MMP到MMP之間稍微有點變化)並且發現位於蛋白的最遠氨基端。抑制酶原活性可能是在慢性傷口中降低MMP酶活性的有用方法。如果這些酶不能行使功能，那麼ECM降解的速度就會下降，這樣依次可導致慢性傷口更快速地癒合。
明顯地，激活結構域肽(19-聚體、9-聚體和10-聚體)抑制各種MMPs的酶活性。除了該活性外，19-聚體還阻止MMP-9原(無活性)形式的活化。因而，通過抑制已經活化的MMPs或阻止新合成的MMP原的激活，19-聚體可在皮膚和慢性傷口滲出液中降低總體MMP活性水平。
圖11表示一般的剪接測定。在大約700秒處洗脫的第一個峰是MMP-9原。隨著剪接反應進行，該峰強度下降(如使用向下箭標標記的)，並且出現兩個新的峰。在大約800秒處洗脫出來的第一個新峰是成熟和活性MMP-9。在大約1050秒處洗脫的第二個新峰是前結構域。隨著剪接反應進行，這兩個峰的強度增加(如用向上的箭標標記的)。當所述反應完成時，沒有可檢測的MMP-9原剩下。用19-聚體滴定標準剪接反應物阻止了MMP-9原轉化成前結構域和活性酶。圖12顯示該滴定的結果。剪接反應可用大分子19-聚體以劑量依賴方式進行抑制。
等溫滴定量熱法將量熱法用來確定19-聚體是否與活性MMP-9形成穩定的非共價複合物。這些數據提供了對19-聚體的酶抑制作用機制和抗激活性質的理解。圖13表示確定19-聚體MMP抑制劑與MMP-9相互作用的等溫量熱實驗。將所述肽1mM的最終濃度溶解在20mM二甲基胂酸鹽(pH6.8)，20mM NaCl中。將MMP-9以20μM的終濃度透析到相同的緩衝液中。如上所述進行一系列標準注射。有關MMP-9和19-聚體之間相互作用的結果如下化學計量0.975±0.02ΔH(kcal/mol) -26.1±1.45ΔS(cal mol-1K-1) -11.6±2.2KA(M-1) 1.65×106±4.5×104這些結果表明19-聚體和MMP-9之間的相互作用是焓驅動的，就是說，ΔH是負值。正如ΔS的負值所證明的，熵不利於所述反應。但是，焓項在量級上大於TΔS項，因而總體自由能(ΔG)是負的。
19-聚體與MMP-2的反應經觀察和發現是焓驅動的而是熵不利的。通過用MMP-2滴定19-聚體產生顯示於圖14的等溫量熱分析。從這些實驗獲得下列值。
化學計量 0.99±0.03ΔH(kcal/mol) -15.4±2.05ΔS(cal mol-1K-1) -21.1±1.8KA(M-1)2.40×106±3.7×104因而，熵不利於所述結合反應的進行。這大概是因為結合引起的構象熵損失造成的。要知道完全柔性的肽含有大量的自由能。在所有結合的情況中，肽對MMP的化學計量是1∶1，表明單個19-聚體與單個MMP分子相互作用。
表面等離子體共振使用表面等離子體共振(SPR)技術對19-聚體與MM-9的結合進行動力學研究。通過按照廠商推薦的標準化學反應將活性MMP-9連接到BIACore，Inc.CM-5晶片的表面上來構建傳感器晶片。使19-聚體流過BIACore-XTM設備中的MMP-9表面並且實時監控結合與離解。圖15表示一般的結合等溫線。締合相(30-430秒)與單結合位點模型擬合最好並且產生2.2×104M-1s-1的締合速度常數(ka)。離解相(440-700秒)顯示類似的擬合併且產生4.1×10-3s-1的離解速度常數(kd)。計算的平衡締合常數(Ka＝ka/kd)5.3×106與熱力學數據接近一致。在沒有被模擬的離解相的初期，觀察到一個大約100個反應單位的整批運輸效應。因此，19-聚體結合到MMP-9上既是動力學有利的也是熱力學有利的。
生存力測定與許多小分子MMP抑制劑不同，本研究中的三個肽當被施用在EpiDermTM皮膚模型上時對細胞是無毒的。圖16表示與PBS對照相比，兩種濃度(500μM和2mM)的肽僅導致生存力稍微下降。對於所述肽總的平均生存力是97.6％(對於19-聚體)、89.6％(對於10-聚體)和95.8％(對於9-聚體)。這些結果表明在治療慢性傷口癒合的方法中使用這些肽對哺乳動物細胞是無毒的。標繪在圖16中的數據是三次重複樣品的平均值。在本研究中生存力的標準差變化範圍是從2.2到3.7並且顯示與劑量或肽的同一性無關。生存力在更高肽濃度時稍微降低。
這些數據表明在EpiDermTM皮膚模型中所述肽是無毒的，其在動力學和熵上有利於與MMPs形成結合複合物，並且其抑制酶促活性和阻止基質金屬蛋白酶的激活。
實施例2傷口癒合方法從The Jackson Laboratories獲得小鼠並且在開始創傷方案前讓其長到3-7個月大小。在創傷前，對所有的小鼠進行麻醉。用4mm活組織檢查打孔器在C57BL6/KsJ db/db小鼠身上製造傷口。通過將皮膚從下面的結構中拉出並將打孔器推過分離的皮膚在每隻動物的上背部引入兩個傷口。一般地，產生的傷口平均深1.7mm，具有1.3到2.2mm的變化範圍。在創傷過程中沒有涉及肌肉。受傷後立即用生理鹽水(用作未處理對照組)處理傷口或用5μL 20μg/mL的19-聚體處理傷口。
每天都對傷口進行數碼拍照並且通過計算機積分照片以確定傷口面積。所有傷口處理和隨後的數據分析都以盲式方式進行(參見例如，Brown等人，1994)。對所有傷口，在創傷時刻(第0天)的傷口面積被任意地設為相對值1；這樣隨後的傷口面積通過將第n天的傷口面積除以第0天的傷口面積而轉換成為相對傷口面積。
結論如圖17所示，單劑19-聚體的應用(在創傷時刻，第0天)在糖尿病小鼠模型中極大地加速傷口的完全閉合的時間。平均地，與鹽水處理對照所需14天相比，用19-聚體處理的傷口在受傷後第9天閉合。此外，用19-聚體處理的傷口顯示在受傷後第一天傷口的炎症減輕。還要指出的是觀察到19-聚體處理的傷口開始收縮的過程比鹽水處理對照的快(第5天對第8天)。
實施例3成纖維細胞生長的刺激本實施例提供表示刺激成纖維細胞增殖的肽的數據。
材料與方法對人皮膚成纖維細胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常人皮膚成纖維細胞，新生兒的(neonatal)，商品目錄號CC-2509)進行檢驗以確定暴露於肽是否能刺激細胞增殖。使用無血清培養基作對照，在96孔測定系統中測量人皮膚成纖維細胞系對19-聚體的增殖反應。在水中製備含有0.5g/L 19-聚體的母液，然後用無血清Dulbecco氏修飾的Eagle氏培養基(DMEM，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)進行稀釋以形成含有1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M的肽的溶液。將細胞以在100μl DMEM中含有1×103個細胞的濃度接種到96孔平板中，所述DMEM含有10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。將平板在37℃下於潮溼的5％CO2氣氛中溫育24小時。溫育後，將培養基吸出並且將孔用100μl無血清DMEM漂洗二次。將最終的漂洗液吸出並將100μl 1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M的19-聚體溶液加入到20個孔中。此外，將100μl的運載體(無血清DMEM)加入10個孔中作對照。所有的孔都在37℃下於潮溼的、5％CO2氣氛中溫育28小時。溫育後，將20μl的Cell Titer 96 Aqueous One Solution加入到所有孔中。將平板輕輕地旋轉並放回到培養箱中進行45分鐘，並且在490nm讀取分光光度吸收度。用one-way ANOVA對結果進行統計分析。
結果如圖18所示，19-聚體的加入導致成纖維細胞以劑量依賴性方式加速生長。沒有加入19-聚體的對照具有最低的細胞密度。接受低至1×10-5M的19-聚體(圖18中標記為19聚體5)的細胞表現出比沒有接受19-聚體的細胞顯著更高的細胞密度(P＜0.01)。接受1×10-4M的19-聚體(圖18中標記為「19聚體4」)的細胞表現出甚至更多的細胞生長(p＜0.001)。然而，接受1×10-6M 19-聚體(圖18中標記為「19聚體6」)的細胞表現出在統計學上發現不是非常顯著的少量細胞增殖(p＜0.05)。
因此在細胞生長方面，在對照細胞和用19-聚體處理的細胞之間觀察到統計學上顯著的差異。基於這些統計學顯著差異，對於成纖維細胞來說19-聚體似乎是良好的細胞增殖劑。
實施例4角質細胞生長的刺激本實施例提供了表示刺激角質細胞增殖的肽的數據。
材料與方法將來自Clonetics(Walkersville，MD，正常人表皮角質細胞、新生兒的(neonatal)、商品目錄號cc-2503)的人皮膚角質細胞系暴露於19-聚體中以確定該肽是否能刺激角質細胞增殖。使用角質細胞基本培養基(KBM，Clonetics，商品目錄號CC-3103)作對照，在96孔測定系統中測量這些人皮膚角質細胞系對19-聚體肽的增殖反應。在水中製備含有0.5g/L 19-聚體的母液然後用KBM進行稀釋以形成含有1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M的肽的溶液。將細胞以在100μl KBM中含有2.5×103個細胞的濃度接種到96孔平板中。將平板在37℃下於潮溼的5％CO2氣氛中溫育24小時。溫育後，將100μl 1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M 19-聚體溶液各加入到10個孔中。此外，將100μl的運載體KBM加入10個孔中作對照。將平板在37℃下於潮溼的、5％CO2氣氛中溫育48小時。溫育後，將20μl的Cell Titer 96 Aqueous OneSolution加入到所有孔中。將平板輕輕地旋轉並放回到培養箱中進行3小時。在490nm讀取各孔的分光光度吸收度。用one-way ANOVA對結果進行統計分析。
結果如圖19中所見，19-聚體的加入導致角質細胞以劑量依賴性方式加速生長。沒有加入19-聚體的對照細胞具有最低的細胞密度。接受低至1×10-5M的19-聚體(圖19中標記為19聚體5)的細胞表現出比沒有接受19-聚體的細胞顯著更高的細胞密度(P＜0.01)。接受1×10-4M的19-聚體(圖19中標記為「19聚體4」)的細胞表現出甚至更高的細胞生長(p＜0.001)。然而，接受1×10-6M 19-聚體(圖19中標記為「19聚體6」)的細胞表現出在統計學非顯著的少量細胞增殖(p＞0.05)。
因此，在對照細胞和用19-聚體處理的角質細胞之間觀察到統計學上顯著的差異。因此，對角質細胞來說19-聚體似乎是良好的增殖劑。
實施例5肽刺激成纖維細胞遷移本實施例提供說明能刺激成纖維細胞遷移的肽的數據。
材料與方法正常的人皮膚成纖維細胞(NHDF)從Biowhittaker(Walkersville，MD)商業購得並且在T75瓶中的FBM培養基(500mL，Biowhittaker)中繁殖最多12代，所述培養基含有胰島素、hFGF-b、GA-1000和胎牛血清(10mL)。為進行遷移測定，用10mL Hank氏緩衝鹽溶液(HBSS)洗滌NHDF一次。將3毫升溶於EDTA中的胰蛋白酶(0.25％)加入到T75瓶中不超過5分鐘以從瓶中取出NHDF。將胰蛋白酶溶液中的NHDF加入到7mL的不加補料的FBM中。將NHDF離心5分鐘並移去上清液。將NHDF重新懸浮於10mL的FBM中用以計數。將NHDF再離心5分鐘並將上清液移去。將NHDF在無補料的FBM中以每mL 1×106個細胞重新懸浮。在遷移測定中只使用FBM培養基是很重要的，因為完全培養基含有成纖維細胞生長因子和血清，兩者都將觸發成纖維細胞的遷移。
通過Emory University的Microchemical Facility或通過SigmaGenesis合成和純化肽。在進行HPLC後通過質譜法對所有的肽進行分析以估量純度。對於各遷移測定，大約使用0.5-2.0毫克的肽來製備新鮮母液(5mg/mL於PBS中)。將所述肽在PBS中的母液用於在FBM(無補料)中製備更加稀釋的溶液(1mg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL)以用於遷移測定。
用90％的乙醇洗滌8mm孔的無聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(Neuroprobe，Inc.，Gaithersburg，MD)15分鐘並且用去離子水漂洗4次。然後將膜放入含有5μg/mL明膠水溶液的玻璃皿中。將所述玻璃皿放在約90℃下進行水浴1小時。將膜從明膠溶液中取出並且充許在37℃培養箱中乾燥1小時。
將48孔趨化性的小室(Neuroprobe，Inc.，Gaithersburg，MD)(參見圖20)用於遷移測定。將28μL的各檢驗溶液按4份重複加入到小室底部的孔中。將明膠處理的膜小心地放在底部孔的上部。然後將小室的墊圈和上部小心地放在膜的上方。用6個指旋螺絲將儀器擰緊。通過將320μl的每mL中1×106個細胞的溶液加入到1.28mL FBM(無補料)中製備含有估計的細胞密度(2×105個細胞/mL)的NHDF溶液。將50微升2×105個細胞/mL的NHDF溶液加入到小室各孔的上部。將小室於37℃/5％CO2下放入培養箱中溫育3小時。將小室取出，去除指旋螺絲並將小室翻轉過來放在紙巾上。將小室的底部移走，展現出具有遷移通過朝上膜面的NHDF的膜。將膜小心地取出。用PBS溼潤膜的一面並且用細胞刮棒(Neuroprobe，Inc.)將沒有遷移通過膜的細胞從膜上刮去。用甲醇將膜固定並且用Diff-Quik StainingSolution I和II染色。NHDF的細胞核被染成紫色。用香柏浸鏡用油和蓋玻片將膜封固於玻璃載玻片上。用Zeiss光學顯微鏡(25X物鏡x10X目鏡x1.25X)對位於對應於不同小室的三個區域的每一區域上三個分開的視野中的細胞進行計數。從實驗(肽)數據和正對照數據中減去負對照中遷移的NHDF平均數目。然後將所述數據按照與血漿纖連蛋白正對照(1.25μg/mL)比較的遷移的NHDF百分比來表示，定義如下。
結果如圖21A(上部)所示用於成纖維細胞(NHDF)遷移的膜具有8μm的孔。所述化學引誘物溶液發出使成纖維細胞穿膜遷移的信號。一旦成纖維細胞通過膜，其將附著在朝向化學引誘物面的膜上。如圖21B(底部)所示，成纖維細胞的細胞核被染成紫色以便可視計數。陷在孔中的細胞(孔顯示出具有暗紫色顏色)包括在總細胞計數中。正對照引起的NHDF遷移產生變化範圍為每個視野從27到60個NHDF的細胞計數。用於NHDF遷移測定的正對照是血漿纖連蛋白(1.25μg/mL溶解於FBM培養基中)。纖連蛋白是在損傷修復中幫助補充ECM的分子。結合到成纖維細胞的α4β1整聯蛋白受體上的纖連蛋白在非常窄的濃度範圍(0.8-1.6μg/mL)內具有趨化性。Postlethwaite，A.E.；Kang，A.H.「Fibroblast Chemoattractants」in Methods ofEnzymology，163卷，Academic PressNew York，1988，pp.694-707。負對照(無補料的FBM)細胞計數是每個視野中1到7個NHDF(＜10％的正對照)(參見圖22)。
幾種濃度的19-聚體用於NHDF遷移測定中。因為血漿纖連蛋白對NHDF具有趨化性的狹窄濃度範圍，所以使用10倍稀釋的肽以使能檢查大範圍的濃度。如圖23所示，在高於0.1mg/mL的19-聚體濃度下，顯著數量的NHDF已經遷移穿過膜(55％±3％和46％±3％分別對應1000μg/mL和100μg/mL)。19-聚體濃度低於100μg/mL時只有輕微的趨化性。因為這些濃度的19-聚體誘導大約20％NHDF遷移，只是負對照中NHDF遷移的大約2倍，所以這些數據被認為不顯著。通過從兩個不同商業來源製備的19-聚體母液誘導的遷移沒有差別(數據未顯示)。
合成和純化19-聚體序列的不同變體以確定胺基酸序列的改變是否會影響成纖維細胞的遷移。對下列肽進行檢驗9-聚體PRCGNPDVA(SEQ ID NO12)、10-聚體NYNFFPRKPK(SEQ IDNO13)、14-聚體TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17-聚體TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)。14-聚體和17-聚體序列分別基於近一步靠近MMP-2和MMP-9的N末端的序列。9-聚體和10-聚體抑制MMP活性。也合成在N末端和C末端分別具有保護性乙醯和醯胺基團的19-聚體(Ac-19-聚體)以確定這些基團的加入是否會改變對成纖維細胞遷移的影響。如圖23所示Ac-19-聚體在100(44±3％)和1000(40±6％)μg/mL時對成纖維細胞都具趨化性。10-聚體在1000μg/mL(30±2％)時具有趨化作用，但在100μg/mL(11±0％，如圖22所示與負對照相似)時沒有。9-聚體在1000μg/mL(32±2％)時具有趨化作用，而在100μg/mL(16±0％)時沒有。有趣地是，在9-聚體的N末端加入胺基酸導致不存在NHDF遷移。14-聚體TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17-聚體TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)在濃度範圍從1000μg/mL到10ng/mL內都不會誘導NHDF遷移(數據未顯示)。因為在不同肽之間NHDF遷移變化很大，所以胺基酸序列對激活NHDF遷移是很重要的。
成纖維細胞遷移到傷口位點是正確癒合的關鍵。使用NHDF遷移測定已證明了19-聚體(≥100μg/mL)和Ac-19-聚體、9-聚體和10-聚體衍生物的趨化性性質。因為9-聚體和10-聚體都誘導大約相同程度的NHDF遷移，所以很難估計是否特定的胺基酸對激活是至關重要的。有趣地是，14-聚體TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17-聚體TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)對成纖維細胞遷移性無影響。儘管還不清楚19-聚體的趨化性作用的確切機制，但所述肽的胺基酸序列對成纖維細胞的激活是很重要的。
實施例6肽不會刺激嗜中性粒細胞遷移本實施例提供說明不刺激嗜中性粒細胞遷移的肽的數據。
材料與方法通過使用Emory University的Microchemical Facility 或通過SigmaGenesis合成和純化肽。經過HPLC後對所有肽進行質譜分析以估量純度。將大約0.5-2.0毫克肽用於製備新鮮母液(5mg/mL於HBSS/HSA中)以用於各遷移測定。用於測定時，將所述肽的母液用於在HBSS/HSA中製備成更多的稀釋溶液(1mg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL和10ng/mL)。
通過在50mL Falcon管中將血液/EDTA混合物(約20mL)鋪在HistopaqueTM1119(底層，18mL)和1077(上層，7mL)組成的雙層之上，可將嗜中性粒細胞從人血液(採集在含有EDTA的VacutainerTM管中)中分離。將管子在1800rpm離心30分鐘(無制動)。離心後在管中顯現4層(從上到下層)血漿、1077、1119和紅細胞。血漿和1077層之間的棕黃層含淋巴細胞、單核細胞和一些血小板。將血漿層、棕黃層和大部分1077層取出並遺棄。將含有嗜中性粒細胞的1119層取出並放入乾淨的50mL管中。加入Dulbecco氏磷酸緩衝鹽溶液(DPBS)將體積增至50mL。以2100rpm將細胞離心15分鐘。將細胞重新懸浮於10mL DPBS中，轉移到15mL管中，並且再以2000rpm離心10分鐘。再次重複該過程以對所述細胞進行第二次洗滌。在取出上清液後，通過加入6mL冷的無菌水到各15mL的上清液中來裂解紅細胞。將細胞在水中僅混合30秒。然後再加入6mL 2％的冷的無菌鹽水。再次以2000rpm離心細胞10分鐘。移走紅色上清液(含有來自紅細胞的血紅蛋白)。超過兩次重複裂解紅細胞的過程以去除所有的紅細胞。在絕大部分紅細胞去除後，將嗜中性粒細胞重新懸浮於10mL HBSS/HSA以用錐蟲藍進行計數。將細胞離心並且以1.25×106細胞/mL的濃度重新懸浮於HBSS/HSA中。
使用24孔跨孔(transwell)平板(3μm孔徑大小的膜)重複兩次進行嗜中性粒細胞遷移測定。用20-40μl的HBSS/HSA(0.04-0.4％)預溼潤跨孔膜。將趨化性溶液(500μl)加入各孔底部。將嗜中性粒細胞(200μl 1.25×106細胞/mL的溶液)加在跨孔的膜上。然後將跨孔放入趨化性溶液中。將平板放入培養箱(37℃，5％CO2)溫育1小時。使用錐蟲藍對遷移通過膜的細胞進行計數。
結果在嗜中性粒細胞遷移實驗中，分離的嗜中性粒細胞有大約95％的生活力。為進行本實驗將嗜中性粒細胞重新懸浮於HBSS/0.4％HSA中。用IL-8(10nM於HBSS/0.4％HSA緩衝液中)作為嗜中性粒細胞遷移的正對照。所使用的19-聚體濃度是1mg/mL、100、10和1μg/mL。
表5中第二欄描述了來自第一個實驗的結果。負對照和正對照分別是HBSS/HSA和IL-8。
表5.各趨化性底物的嗜中性粒細胞遷移百分率
*實驗1和實驗2中HSA的濃度分別是0.4％和0.04％。
19-聚體誘導的嗜中性粒細胞遷移與負對照的相似。IL-8的加入導致81％加入的嗜中性粒細胞遷移穿過膜。儘管正對照似乎表現良好，但負對照(29％)似乎相當高。因此在第二個實驗中，HSA的量減少10倍達到0.04％。如表5第三欄所示，負對照的嗜中性粒細胞遷移已急劇下降到0％。IL-8正對照也下降了但仍顯示大量的嗜中性粒細胞遷移(51％)。如在第一個實驗中一樣，19-聚體對嗜中性粒細胞遷移沒有影響。
成纖維細胞遷移到傷口位點對正確的癒合至關重要。通過使用NHDF遷移測定已證明了19-聚體的趨化性性質。然而，19-聚體顯示對嗜中性粒細胞遷移沒有影響。也許在成纖維細胞中存在固有的參與19-聚體識別、結合和趨化性信號傳導的受體，而在嗜中性粒細胞在不存在這種受體。
實施例7刺激膠原蛋白產生通過使用由Panvera(Madison，WI)出售的Takara BiomedicalsEIA測定試劑盒(TAK MK101)測量人皮膚成纖維細胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常人皮膚成纖維細胞，新生兒的，商品目錄號CC-2509)中19-聚體肽對膠原蛋白產生的刺激反應。首先使用具有10％胎牛血清(FBS)的DMEM使細胞生長在96孔測定系統中，所述胎牛血清和DMEM都購自Sigma Chemical Co，St.Louis，MO。無血清DMEM用作對照。在水中製備含有0.5g/L的19-聚體的母液，然後用無血清DMEM稀釋形成含有1×10-5M和1×10-6M的肽的溶液。將細胞以在100μl DMEM中含有5×103個細胞的濃度接種到96孔平板中，所述DMEM含有10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。將平板在37℃下、潮溼的5％CO2氣氛中溫育24小時。溫育後，將培養基吸出並且用100μl無血清DMEM將孔漂洗兩次。將最終漂洗液吸出並且將100μl 1×10-5M或1×10-6M的19-聚體溶液加入到孔中(對於每個濃度n＝2)。此外，將100μl運載體(無血清DMEM)加入到4個孔中作為對照。將所有的孔置於37℃下、潮溼的5％CO2氣氛中溫育48小時。
使用推薦的來自96孔平板各孔20μl的上清液進行測定。在進行測定前現配標準緩衝液和終止溶液。將100μl抗體-POD綴合物溶液(由試劑盒提供)加入到用前抗體(pre antibody)塗覆的96孔平板(由試劑盒提供)的孔中。將20μl標準和檢驗溶液(來自其它含有成纖維細胞的96孔平板)加入到合適的孔中。將平板輕柔地混合、密封並在37℃下溫育3小時。
溫育後，用PBS緩衝液(400μl)仔細洗滌各孔4次。洗滌結束時將所有孔中的任何液體倒空。將100μl的底物溶液(存在於緩衝液中的過氧化氫和四甲聯苯胺，由試劑盒提供)加入到各孔並且將平板溫育15分鐘。這時，以與加入底物同樣的順序向各孔中加入100μl終止溶液(現配的1N H2SO4)。將平板輕柔混合併在450nm讀取吸收度。使用one-way ANOVA對結果進行統計分析。
結果從圖24和表6中可見，在兩個所使用的濃度上，19-聚體的加入導致膠原蛋白生產增加。不加19-聚體的對照細胞具有最低量的膠原蛋白。在濃度為10-5和10-6M時，19-聚體肽產生統計學顯著的膠原蛋白量(p＜0.001)。這些結果表明19-聚體刺激膠原蛋白的產生。
表6數據總結
實施例8增加纖連蛋白通過使用由Panvera(Madison，WI)出售的Takara BiomedicalsEIA測定試劑盒(TAK MK115)測量19-聚體的應用對人皮膚成纖維細胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常人皮膚成纖維細胞，新生兒的，商品目錄號CC-2509)的影響。19-聚體的應用導致顯著的纖連蛋白水平增加。
材料和方法首先使用具有10％胎牛血清(FBS)的DMEM使細胞生長在96孔測定系統中，所述胎牛血清和DMEM都購自Sigma Chemical Co，St.Louis，MO。以三種濃度(1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M)應用19-聚體，重複二次。無血清DMEM用作對照。將細胞以在100μl DMEM中含有9×103個細胞的濃度接種到96孔平板中，所述DMEM含有10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。將平板在37℃下、潮溼的5％CO2氣氛中溫育48小時。溫育後，將培養基吸出並且用100μl無血清DMEM將孔漂洗兩次。將最終漂洗液吸出並且將100μl 1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M的19-聚體溶液連同100μl無血清DMEM加入到孔中(對於每個濃度n＝2)。此外，將100μl運載體(無血清DMEM)加入到2個孔中作為對照。將平板置於37℃下、潮溼的5％CO2氣氛中溫育48小時。
使用推薦的來自96孔平板各孔100μl的上清液進行測定。在進行測定前現配標準緩衝液和終止溶液。將前抗體塗覆的96孔平板(由試劑盒提供)用來轉移檢驗樣品和對照。將平板混合、密封並在37℃下溫育1小時。在取出樣品溶液後，用洗滌緩衝液將所有孔洗滌三次(300μl)。將100μl的抗體-過氧化物酶綴合物溶液加入孔中。將平板混合、密封並在37℃下溫育1小時。將溶液取出並且用洗滌緩衝液將孔洗滌3次。洗滌結束時將所有孔中的所有液體完全倒空。將100μl的底物溶液(存在於緩衝液中的過氧化氫和四甲聯苯胺)加入到各孔，並且將平板在室溫下溫育15分鐘。以與底物同樣的順序向各孔中加入100μl終止溶液(現配的1N H2SO4)。將平板輕柔混合併在450nm讀取吸收度。使用one-way ANOVA對結果進行統計分析。
結果從表7和圖25中可見，在所有使用的濃度上，檢驗的19-聚體都增加纖連蛋白存在量。所述「19聚體6」組構成了暴露於濃度為1×10-6M的19-聚體的細胞。「19聚體5」組構成了暴露於濃度為1×10-5M的19-聚體的細胞。「19聚體4」組構成了暴露於濃度為1×10-4M的19-聚體的細胞。「對照」細胞暴露於不加肽的溶液中。
結果表明所有濃度的檢驗的19-聚體都在統計學上刺激纖連蛋白產生。該效應在10-4M時更加顯著，與對照和10-6M濃度相比，在10-4M時19聚體肽對纖連蛋白的刺激效果超過兩倍。
表7纖連蛋白數據總結
參考文獻下列參考文獻和本文中引用的任何其他參考文獻均在此處引入作為參考。
Agren，M.S.(1999).Matrix metalloproteinases(MMMPs)are required for re-epithelialization of cutaneous wounds.Arch.Dermatol.Res.291，583-590.
Becker，J.W.，Marcy，A.I.，Rokosz，L.L.，Axel，M.G.，Burbaum，J.J.，Fitzgerald，P.M.，Cameron，P.M.，Esser，C.K.，Hagmann，W.K.，Hermes，J.D.，and Springer，J.P.(1995).Stromelysin-1Three dimensional structure of the inhibited catalyticdomain and of the C-truncated proenzyme.Protein Sci.4，1966-76.
Brown，RL，Breeden，MP.，and Greenhalgh，MD.，(1994).PDGF and TGF-a actsynergistically to improve wound healing in the genetically diabetic mouse.J.Surg.Res.56，562-570.
Browner，M.F.，Smith，W.W.，Castelhano，A.L.(1995).Matrilysin-inhibitor complexesCommon themes among 18 metalloproteinases.Biochemistry 34，6602-10.
Calabrese，E.J.「Cell Migration/ChemotaxisBiphasic Dose Responses，」Critical Reviewsin Toxicology 2001，31(45)，615-624.
Calvin，M.「Cutaneous Wound Repair」Wounds 1998，10(1)，12-32.
Chi YS，Heo MY，Chung JH，Jo BK，Kim HP.(2002).Effects of the chestnut inner shellextract on the expression of adhesion molecules，fibronectin and vitronectin，of skinfibroblasts in culture.Arch Pharm Res，25(4)469-74.
Clark，R.A.F.「Wound Repair.Overview and General Considerations，」in The Molecularand Cellular Biology of Wound Repair，2ndedition，Plenum PressNew York，1996，pp.3-50.
Di Colandrea，T.，Wang，L，Wille，J.，D』Armiento，J.，and Chada，K.K.(1998).Epidermalexpression of collagenase delays wound healing in transgenic mice.J.Invest.Dermatol.111，1029-1033.
Duivenvoorden，W.C.M.，Hirte，H.W.，and Singh，G.(1997).Use of tetracycline as aninhibitor of matrix metalloproteinase activity secreted by human bonemetastasizing cancer cells.Invasion and Metas.17，312-322.
Fernandez-Catalan，C.，Bode，W.，Huber，R.，Turk，D.，Calvete，J.J.，Lichte，A.，Tschesche，H.，and Maskos，K.(1998).Crystal structure of the complex formed bymembrane type-1 matrix metalloproteinase with the tissue inhibitor ofmetalloproteinases-2，the soluble progelatinase A receptor.EMBO J.17，5238-48.
Freire，E.，van Osdol，WW.，Mayorga，OL，and Sanchez-Ruiz，JM.(1990).
Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins.
Annu Rev Biophys Biophys Chem.19，159-88.
Gomis-Ruth，F.X.，Maskos，K.，Betz，M.，Bergner，A.，Huber，R.，Suzuki，K.，Yoshida，N.，Nagase，H.，Brew，K.，Bourenkov，G.P.，Bartunik，H.，and Bode，W.(1997).
Mechanism of inhibition ofthe human matrix metalloproteinase stromelysin-1 byTIMP-1.Nature 389，77-81.
Grams，F.，Reinemer，P.，Powers，J.C.，Kleine，T.，Pieper，M.，Tschesche，H.，Huber，R.，Bode，W.(1995).X-ray structures of human neutrophil collagenase complexed withpeptide hydroxamate and peptide thiol inhibitorsImplications for substrate bindingand rational drug design.Eur.J.Biochem.228，830-834.
Guex，N.and Peitsch，M.C.(1997).Swiss Model and the Swiss-Pdb ViewerAnenvironment for comparative protein modeling.Electrophoresis 18，2714-2723.
Higgins，DG.，Bleasby，AJ.，and Fuchs，R.(1992).CLUSTAL Vimproved software formultiple sequence alignment.Comput Appl Biosci.，8(2)，189-91.
Howard，E.W.，Bullen，E.C.，and Banda，M.J.(1991).Preferential inhibition of 72 and 92kDa gelatinase by tissue inhibitor of metalloproteinase-2.J.Biol.Chem.266，13070-13075.
Huang，W.，Suzuki，K.，Nagase，H.，Arumugam，S.，Van Doren，S.R.，and Brew，K.(1996).
Folding and characterization of the amino terminal domain of human tissueinhibitor of metalloproteinases-1(TIMP-1)expressed at high yield in E.coli.FEBSLett.384，155-161.
Karlsson，R.，and Falt，A.(1997).Experimental design for kinetic analysis of protein-protein interactions with surface plasmon resonance biosensors.J.Immunol.Meths.200，121-33.
Lakowicz，J.R.(1983).Principles of Fluorescence Spectroscopy，Chapter 10，PlenumPress，New York，London.
Levit，S.，and Berger，A.(1976).Ribonuclease S-peptide.A model for molecularrecognition.J.Biol.Chem.251，1333-9.
Levy，D.E.，Lapierre，F.，Liang，W.，Ye，W.，Lange，C.W.，Li，X.，Grobelny，D.，Casabonne，M.，Tyrrell，D.，Holme，K.，Nadzan，A.，and Galardy，R.E.(1998).
Matrix metalloproteinase inhibitorsA structure activity study.J.Med.Chem.41，199-223.
Li，J.，Brick，P.，O′Hare，M.C.，Skarzynski，T.，Lloyd，L.F.，Curry，V.A.，Clark，I.M.，Bigg，H.F.，Hazleman，B.L.，Cawston，T.E.et al.(1995).Structure of full-lengthporcine synovial collagenase reveals a C-terminal domain containing a calcium-linked，four-bladed beta-propeller.Structure 3，pp.541-49.
Libson，A.M.，Gittis，A.G.，Collier，I.E.，Marmer，B.L.，Goldberg，G.I.，and Lattman，E.E.(1995).Crystal structure of the haemopexin-like C terminal domain of gelatinase A.Nat.Struct.Biol.2，938-42.
Lofas，S.，Johnsson，B.，Tegendahl，K.，and Ronnberg，I.(1993).Dextran modified goldsurfaces for surface plasmon resonance biosensors；immunoreactivity ofimmobilized antibodies and antibody-surface interaction studies.J.ColloidInterface Sci.65，423-431.
Morton，T.A.，Myska，D.G.，and Chaiken，I.M.(1995).Interpreting complex bindingkinetics from optical biosensorsA comparison of analysis by linearization，theintegrated rate equation，and numerical integration.Anal.Biochem.227，176-185.
Moses，M.A.，Marikovsky，M.，Harper，J.W.，Vogt，P.，Eriksson，E.，Klagsbrun，M.andLanger，R.(1996).Temporal study of the activity of matrix metalloproteinases andtheir endogenous inhibitors during wound healing.J.Cell.Biochem.60，379-386.
Odake，S.，Morita，Y.，and Morikawa，T.(1994).Inhibition of matrix metalloproteinases bypeptidyl hydroxamic acids.Biochem.Biophys.Res.Comm.199，1442-1446.
Ohtsuka，Y.；Lee，J.；Stamm，D.S.；Sanderson，I.R.「MIP-2Secreted by Epithelial CellsIncreases Neutrophil and Lymphocyte Recruitment in the Mouse Intestine，」Gut2001，49，526-533.
Olson，M.W.，Gervasi，D.C.，Mobashery，S.，and Fridman，R.(1997).Kinetic analysis ofthe binding of human matrix metalloproteinase 2 and 9 to tissue inhibitor ofmetalloproteinase(TIMP)-1 and TIMP-2.J.Biol.Chem.272，29975-29983.
O』Meara，S.M.；Cullum，N.A.；Majid，J.；Sheldon，T.A.「Systemic Review ofAntimicrobial Agents Used for Chronic Wounds，」Brit.J.Surg.2001，88，4-21.
O』Shannessy，D.J.，Brigham-Burke，M.，Soneson，K.K，Hensley，P.，and Brooks，I.(1993).Determination of rate and equilibrium binding constants formacromolecular interactions using surface plasmon resonanceuse of non linearleast squares analysis methods.Anal.Biochem.212，457-468.
Postlethwaite，A.E.；Kang，A.H.「Fibroblast Chemoattractants」in Methods ofEnzymology，vol.163，Academic PressNew York，1988，pp.694-707.
Reinemer，P.，Grams，F.，Huber，R.，Kleine，T.，Schnierer，S.，Pieper，M.，Tschesche，H.，Bode，W.(1994).Structural implications for the role of the N terminus in thesuperactivation of collagenasesA crystallographic study.FEBBS Lett.338，227-33.
Saarialho-Kere，U.K.(1998).Patterns of matrix metalloproteinase and TIMP expression inchronic ulcers.Arch.Dermatol.Res.290(suppl)，47-54.
Sayle，R.A.and Milner-White，E.J.(1995).RasMolBiomolecular graphics for all.Trendsin Biochemical Sciences 20，374-376.
Segel，IH.(1993)Enzyme KineticsBehavior and analysis of rapid equilibrium andsteady-state enzyme systems.Wiley Classics Library，John Wiley and Sons，Inc.New York.
Staiano-Coico，L.；Higgins，P.J.；Schwartz，S.B.；Zimm，A.J.；Gonclaves，J.「WoundFluidsA Reflection of the State of Healing，」Ostomy/Wound Management 2000，46(S1A)，83S-93S.
Su，J-L.，Becherer，D.，Edwards，C.，Bukhart，W.，McMgeehan，G.M.，and Champion，B.R.(1995).Monoclonal antibodies against human collagenase and stromelysin.Hybridoma.14，383-390.
Taylor，K.B.，Windsor，J.L.，Caterina，N.C.M.，Bodden，M.K.，and Engler，J.A.(1996).The mechanism of inhibition of collagenase byTIMP-1.J.Biol.Chem.271，23938-23945.
Tuuttila，A.，Morgunov，E.，Bergmann，U.，Lindqvist，Y.，Maskos，K.，Fernandez-Catalan，C.，Bode，W.，Tryggvason，K.，and Schneider，G.(1998).Three dimensionalstructure of human tissue inhibitor of metalloproteinases-2 at 2.1resolution.J.Mol.Biol.284，1133-1140.
Vaalamo，M.，Weckroth，M.，Puolakkainen，P.，Kere，J.，Saarinen，P.，Lauharanta，J.，andSaarialho-Kere，U.K.(1996).Patterns of matrix metalloproteinase and TIMP-1expression in chronic and normally healing human cutaueous wounds.Brit.J.Dermatol.135，52-59.
Vaalamo，M.，Mattila，L.，Johansson，N.，Kariniemi，A-L.，Karjalainen-Lindsberg，L.，Kahari，V-M.，and Saarialho-Kere，U.K.(1997).Distinct populations of stromalcells express collagenase-3(MMP-13)and collagenase-1(MMP-1)in chroniculcers，but not in normally healing wounds.J.Investig.Dermatol.109，96-101.
Weckroth，M.，Vaheri，A.，Lauharanta，J.，Sorsa，T.，and Konttinen，Y.T.(1996).Matrixmetalloproteinases，gelatinases，and collagenases in chronic leg ulcers.J.Investig.Dermatol.108，1119-1124.
Wojtowicz-Praga，S.M.，Dickson，R.B.，and Hawkins，M.J.(1997).Matrixmetalloproteinase inhibitors.Investigational new Drugs.15，61-75.
Wysocki，A.；Staiano-Cioco，L.；Grinnell，F.「Wound fluid from chronic leg ulcerscontains elevated levels of metalloproteinases MMP-2 and MMP-9，」J.Invest.Dermatol.1993，101，64-68.
Wysocki，A.B.「Wound Fluids and the Pathogenesis of Chronic Wounds，」J.WoundOstomy Continence Nurs.1996，23(6)，283-290.
序列表110Kimberly-Clark Worldwide，Inc.
Malik，SohailQuirk，Stephen120增加纖連蛋白的方法13018,80516021170FastSEQ for Windows Version 4.021012118212PRT213智人(Homo sapiens)4001Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val1 5210221144212PRT213智人(Homo sapiens)4002Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn1 5 10 15Thr Ile Glu Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala20 25 30Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Asp35 40210321150212PRT213智人(Homo sapiens)
4003Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Asp Asn1 5 10 15Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Lys Met Asn Leu35 40 45Thr Tyr50210421156212PRT213智人(Homo sapiens)4004Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Glu Thr Gly Lys Leu Ser Pro Arg1 5 10 15Val Met Glu Ile Met Gln Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala20 25 30Glu Phe Ser Leu Met Pro Asn Ser Pro Lys Trp His Ser Arg Thr Val35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Ser Tyr Thr50 55210521154212PRT213智人(Homo sapiens)4005Met Gln Lys Phe Leu Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Ser Asp1 5 10 15Thr Leu Glu Val Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30His Phe Arg Thr Phe Pro Gly Ile Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Asn50210621155
212PRT213智人(Homo sapiens)4006Met Gln Lys Phe Leu Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Thr Asp1 5 10 15Thr Leu Glu Val Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30His Phe Ser Ser Phe Pro Gly Met Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr50 55210721154212PRT213智人(Homo sapiens)4007Met Gln His Phe Leu Gly Leu Lys Val Thr Gly Gln Leu Asp Thr Ser1 5 10 15Thr Leu Glu Met Met His Ala Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val His20 25 30His Phe Arg Glu Met Pro Gly Gly Pro Val Trp Arg Lys His Tyr Ile35 40 45Thr Tyr Arg Ile Asn Asn50210821147212PRT213智人(Homo sapiens)4008Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala1 5 10 15Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly20 25 30Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys Trp His His His Asn35 40 45210921154212PRT
213智人(Homo sapiens)4009Met Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu1 5 10 15Thr Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala20 25 30Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp Glu Gln Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Glu Asn502101021155212PRT213智人(Homo sapiens)40010Met Gln Arg Phe Phe Gly Leu Asn Val Thr Gly Lys Pro Asn Glu Glu1 5 10 15Thr Leu Asp Met Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Ser Gly20 25 30Gly Phe Met Leu Thr Pro Gly Asn Pro Lys Trp Glu Arg Thr Asn Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Arg Asn Tyr50 552101121119212PRT213智人(Homo sapiens)40011Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg1 5 10 15Lys Pro Lys210122119212PRT213智人(Homo sapiens)
40012Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala1 52101321110212PRT213智人(Homo sapiens)40013Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys1 5 1021014211660212PRT213智人(Homo sapiens)40014Met Glu Ala Leu Met Ala Arg Gly Ala Leu Thr Gly Pro Leu Arg Ala1 5 10 15Leu Cys Leu Leu Gly Cys Leu Leu Ser His Ala Ala Ala Ala Pro Ser20 25 30Pro Ile Ile Lys Phe Pro Gly Asp Val Ala Pro Lys Thr Asp Lys Glu35 40 45Leu Ala Val Gln Tyr Leu Asn Thr Phe Tyr Gly Cys Pro Lys Glu Ser50 55 60Cys Asn Leu Phe Val Leu Lys Asp Thr Leu Lys Lys Met Gln Lys Phe65 70 75 80Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn Thr lle Glu Thr85 90 95Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Ash Tyr Asn Phe100 105 110Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Asp Lys Asn Gln Ile Thr Tyr Arg Ile115 120 125Ile Gly Tyr Thr Pro Asp Leu Asp Pro Glu Thr Val Asp Asp Ala Phe130 135 140Ala Arg Ala Phe Gln Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Arg Phe Ser145 150 155 160Arg lle His Asp Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Asn Phe Gly Arg Trp165 170 175Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala180 185 190His Ala Phe Ala Pro Gly Thr Gly Val Gly Gly Asp Ser His Phe Asp
195 200 205Asp Asp Glu Leu Trp Thr Leu Gly Glu Gly Gln Val Val Arg Val Lys210 215 220Tyr Gly Asn Ala Asp Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Leu Phe Asn225 230 235 240Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys Thr Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly Phe245 250 255Leu Trp Cys Ser Thr Thr Tyr Asn Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr Gly260 265 270Phe Cys Pro His Glu Ala Leu Phe Thr Met Gly Gly Asn Ala Glu Gly275 280 285Gln Pro Cys Lys Phe Pro Phe Arg Phe Gln Gly Thr Ser Tyr Asp Ser290 295 300Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr305 310 315 320Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala325 330 335Met Ser Thr Val Gly Gly Asn Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe Pro340 345 350Phe Thr Phe Leu Gly Asn Lys Tyr Glu Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg355 360 365Ser Asp Gly Lys Met Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Asp Asp370 375 380Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val385 390 395 400Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Met Gly Leu Glu His Ser Gln Asp405 410 415Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg420 425 430Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Glu Leu Tyr Gly Ala Ser435 440 445Pro Asp Ile Asp Leu Gly Thr Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Val450 455 460Thr Pro Glu Ile Cys Lys Gln Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gln465 470 475 480Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr485 490 495Val Thr Pro Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe500 505 510Trp Pro Glu Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln515 520 525Glu Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser530 535 540Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly
545 550 555 560Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys565 570 575Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn580 585 590Glu Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp595 600 605Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln610 615 620Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu625 630 635 640Glu Asn Gln Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp645 650 655Trp Leu Gly Cys6602101521143212PRT213智人(Homo sapiens)40015Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn1 5 10 15Thr Ile Glu Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala20 25 30Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp35 402101621143212PRT213智人(Homo sapiens)40016Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala1 5 10 15Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly20 25 30Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys Trp35 402101721143
212PRT213智人(Homo sapiens)40017Met Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu1 5 10 15Thr Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala20 25 30Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp35 402101821135212PRT213人工序列220
223能夠抑制金屬蛋白酶活性的合成的肽220
221SITE2222223Xaa＝穀氨醯胺或穀氨酸220
221SITE2225223Xaa＝天冬氨酸或穀氨酸220
221SITE2228223Xaa＝穀氨醯胺或絲氨酸220
221SITE2229223Xaa＝天冬醯胺或丙氨酸220
221SITE22211
223Xaa＝異亮氨酸或亮氨酸220
221SITE222(12)...(12)223Xaa＝穀氨酸或賴氨酸220
221SITE222(13)...(13)223Xaa＝蘇氨酸或丙氨酸220
221SITE222(16)...(16)223Xaa＝賴氨酸或蘇氨酸220
221SITE222(21)...(21)223Xaa＝纈氨酸或天冬醯胺220
221SITE222(24)...(24)223Xaa＝纈氨酸或亮氨酸220
221SITE222(25)...(25)223Xaa＝丙氨酸或甘氨酸220
221SITE222(26)...(26)223Xaa＝天冬醯胺或精氨酸220
221SITE222(27)...(27)223Xaa＝酪氨酸或苯丙氨酸
220
221SITE222(28)...(28)223Xaa＝天冬醯胺或穀氨醯胺220
221SITE222(29)...(29)223Xaa＝苯丙氨酸或蘇氨酸220
221SITE222(31)...(31)223Xaa＝脯氨酸或穀氨酸220
221SITE222(32)...(32)223Xaa＝精氨酸或甘氨酸220
221SITE222(33)...(33)223Xaa＝賴氨酸或天冬氨酸220
221SITE222(34)...(34)223Xaa＝脯氨酸或亮氨酸40018Pro Xaa Thr Gly Xaa Leu Asp Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Met Arg Xaa1 5 10 15Pro Arg Cys Gly Xaa Pro Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Lys352101921114212PRT213智人(Homo sapiens)
40019Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn1 5 102102021117212PRT213智人(Homo sapiens)40020Thr Leu Lys Ala Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala1 5 10 15Asn2102121135212PRT213人工序列220
223能夠抑制金屬蛋白酶活性的合成的肽220
221SITE2222223Xaa＝穀氨醯胺或穀氨酸220
221SITE2225223Xaa＝天冬氨酸或穀氨酸220
221SITE2228223Xaa＝穀氨酸或絲氨酸220
221SITE2229223Xaa＝天冬醯胺或丙氨酸
220
221SITE22211223Xaa＝異亮氨酸或亮氨酸220
221SITE222(12)...(12)223Xaa＝穀氨酸或賴氨酸220
221SITE222(13)...(13)223Xaa＝蘇氨酸或丙氨酸220
221SITE222(16)...(16)223Xaa＝賴氨酸或蘇氨酸220
221SITE222(17)...(17)223Xaa＝任何非極性胺基酸220
221SITE222(18)...(18)223Xaa＝任何鹼性胺基酸220
221SITE222(19)...(19)223Xaa＝任何半胱氨酸樣胺基酸220
221SITE222(20)...(20)223Xaa＝任何非極性胺基酸220
221STTE
222(21)...(21)223Xaa＝任何極性或脂族胺基酸220
221SITE222(22)...(22)223Xaa＝任何非極性胺基酸220
221SITE222(23)...(23)223Xaa＝任何酸性胺基酸220
221SITE222(24)...(24)223Xaa＝任何脂族或極性胺基酸220
221SITE222(25)...(25)223Xaa＝任何脂族、非極性或鹼性胺基酸220
221SITE222(26)...(26)223Xaa＝任何極性、酸性、鹼性或非極性胺基酸220
221SITE222(27)...(27)223Xaa＝任何極性或芳族胺基酸220
221SITE222(28)...(28)223Xaa＝任何極性、鹼性、脂族或非極性胺基酸220
221SITE222(29)...(29)223Xaa＝任何芳族、脂族、極性或酸性胺基酸
220
221SITE222(30)...(30)223Xaa＝任何芳族、非極性或極性胺基酸220
221SITE222(31)...(31)223Xaa＝任何非極性或酸性胺基酸220
221SITE222(32)...(32)223Xaa＝任何鹼性、極性或非極性胺基酸220
221SITE222(33)...(33)223Xaa＝任何鹼性、極性、脂族、非極性或酸性胺基酸220
221SITE222(34)...(34)223Xaa＝任何非極性或脂族胺基酸220
221SITE222(35)...(35)223Xaa＝任何鹼性或脂族胺基酸40021Pro Xaa Thr Gly Xaa Leu Asp Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Met Arg Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa3權利要求
1.包含治療有效量的肽和藥物學可接受的載體的組合物，所述肽包含式III的肽，其中式III的肽為Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1、Xaa4和Xaa6各自分別是非極性胺基酸；Xaa2是鹼性胺基酸；Xaa3是半胱氨酸樣胺基酸；Xaa5是極性或脂族胺基酸；Xaa7是酸性胺基酸；Xaa8是脂族或極性胺基酸；Xaa9是脂族、非極性或鹼性胺基酸；Xaa10是極性、酸性、鹼性或非極性胺基酸；Xaa11是極性或芳族胺基酸；Xaa12是極性、鹼性、脂族或非極性胺基酸；Xaa13是芳族、脂族、極性或酸性胺基酸；Xaa14是芳族、非極性或極性胺基酸；Xaa15是非極性或酸性胺基酸；Xaa16是鹼性、極性或非極性胺基酸；Xaa17是鹼性、極性、脂族、非極性或酸性胺基酸；Xaa18是非極性或脂族胺基酸；Xaa19是鹼性或脂族胺基酸；且其中所述肽能增加組織中纖連蛋白的量。
2.權利要求1的組合物，其中非極性胺基酸是甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。
3.權利要求1的組合物，其中鹼性胺基酸是組氨酸、賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鳥氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸。
4.權利要求1的組合物，其中半胱氨酸樣胺基酸是半胱氨酸、高半胱氨酸、青黴胺或β-甲基半胱氨酸。
5.權利要求1的組合物，其中脂族胺基酸是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸。
6.權利要求1的組合物，其中酸性胺基酸是天冬氨酸或穀氨酸。
7.權利要求1的組合物，其中極性胺基酸是天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸，或非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。
8.權利要求1的組合物，其中芳族胺基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯並噻吩丙氨酸。
9.權利要求1的組合物，其中所述肽抑制基質金屬蛋白酶-2。
10.權利要求1的組合物，其中所述肽抑下列任何一種基質金屬蛋白酶的蛋白酶活性基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶-3、基質金屬蛋白酶-4、基質金屬蛋白酶-5、基質金屬蛋白酶-6、基質金屬蛋白酶-7、基質金屬蛋白酶-8、基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶-10、基質金屬蛋白酶-11、基質金屬蛋白酶-12或基質金屬蛋白酶-13。
11.權利要求1的組合物，其中所述肽是成纖維細胞或角質細胞的化學引誘物。
12.權利要求1的組合物，其中所述肽包含SEQ ID NO11。
13.權利要求1的組合物，其中所述肽是SEQ ID NO11。
14.權利要求1的組合物，其中所述組合物是洗劑。
15.權利要求1的組合物，其中所述組合物是敷料。
16.用於防止皺紋的方法，所述方法包括向哺乳動物皮膚施用安全和有效量的權利要求1的組合物，其中藥物學可接受的載體是皮膚病學可接受的載體。
17.權利要求16的方法，其中非極性胺基酸是甲硫氨酸、甘氨酸或哺氨酸。
18.權利要求16的方法，其中鹼性胺基酸是組氨酸、賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鳥氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸。
19.權利要求16的方法，其中半胱氨酸樣胺基酸是半胱氨酸、高半胱氨酸、青黴胺或β-甲基半胱氨酸。
20.權利要求16的方法，其中脂族胺基酸是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸。
21.權利要求16的方法，其中酸性胺基酸是天冬氨酸或穀氨酸。
22.權利要求16的方法，其中極性胺基酸是天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸，或非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。
23.權利要求16的方法，其中芳族胺基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯並噻吩丙氨酸。
24.權利要求16的方法，其中所述肽抑制基質金屬蛋白酶-2。
25.權利要求16的方法，其中所述肽抑下列任何一種基質金屬蛋白酶的蛋白酶活性基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶-3、基質金屬蛋白酶-4、基質金屬蛋白酶-5、基質金屬蛋白酶-6、基質金屬蛋白酶-7、基質金屬蛋白酶-8、基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶-10、基質金屬蛋白酶-11、基質金屬蛋白酶-12或基質金屬蛋白酶-13。
26.權利要求16的方法，其中所述肽是成纖維細胞或角質細胞的化學引誘物。
27.權利要求16的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO11。
28.權利要求16的方法，其中所述肽是SEQ ID NO11。
29.權利要求16的方法，其中所述組合物是洗劑。
30.權利要求16的方法，其中所述組合物是敷料。
31.增加哺乳動物組織中纖連蛋白的方法，所述方法包括對組織施用安全和有效量的權利要求1的組合物，其中所述藥物學可接受的載體是皮膚病學可接受的載體。
32.權利要求31的方法，其中非極性胺基酸是甲硫氨酸、甘氨酸或哺氨酸。
33.權利要求31的方法，其中鹼性胺基酸是組氨酸、賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鳥氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸。
34.權利要求31的方法，其中半胱氨酸樣胺基酸是半胱氨酸、高半胱氨酸、青黴胺或β-甲基半胱氨酸。
35.權利要求31的方法，其中脂族胺基酸是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基異亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基纈氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基異丁酸。
36.權利要求31的方法，其中酸性胺基酸是天冬氨酸或穀氨酸。
37.權利要求31的方法，其中極性胺基酸是天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙醯賴氨酸、甲硫氨酸亞碸或高絲氨酸，或非極性胺基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。
38.權利要求31的方法，其中芳族胺基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯並噻吩丙氨酸。
39.權利要求31的方法，其中所述肽抑制基質金屬蛋白酶-2。
40.權利要求31的方法，其中所述肽抑下列任何一種基質金屬蛋白酶的蛋白酶活性基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶-3、基質金屬蛋白酶-4、基質金屬蛋白酶-5、基質金屬蛋白酶-6、基質金屬蛋白酶-7、基質金屬蛋白酶-8、基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶-10、基質金屬蛋白酶-11、基質金屬蛋白酶-12或基質金屬蛋白酶-13。
41.權利要求31的方法，其中所述肽是成纖維細胞或角質細胞的化學引誘物。
42.權利要求31的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO11。
43.權利要求31的方法，其中所述肽是SEQ ID NO11。
44.權利要求31的方法，其中所述組合物是洗劑。
45.權利要求31的方法，其中所述組合物是敷料。
46.權利要求31的方法，其中所述組織是皮膚。
47.權利要求31的方法，其中所述組織是牙齦組織。
48.局部軟膏，所述軟膏包含了治療有效量的包含SEQ ID NO11的肽和藥物學可接受的載體，其中所述肽增加了組織中纖連蛋白的量。
49.權利要求48的軟膏，其中軟膏中的肽量為按軟膏重量計算大約0.001％到大約35％。
50.權利要求49的軟膏，其中軟膏中的肽量為按軟膏重量計算大約0.5％到大約20％。
51.權利要求50的軟膏，其中軟膏中的肽量為按軟膏重量計算大約1.0％到大約10％。
全文摘要
本發明提供了肽和含有這些肽的組合物，所述肽和組合物增加了組織中纖連蛋白的量。這些組合物用於促進健康皮膚的維護和發育、用於預防和治療皺紋以及治療傷口。所述肽可配製成促進癒合和健康皮膚發育、防止結疤和形成皺紋以及改善癒合效果的治療性組合物、洗劑、乳膏、皮膚覆蓋物和傷口敷料。
文檔編號A61K38/00GK1756839SQ200380110036
公開日2006年4月5日 申請日期2003年11月18日 優先權日2002年12月30日
發明者S·馬利克, S·奎爾克 申請人:金伯利-克拉克環球有限公司