早孕因子中具有免疫抑制作用的關鍵活性肽段的製作方法
2023-10-27 16:35:22
專利名稱：早孕因子中具有免疫抑制作用的關鍵活性肽段的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物繁殖免疫學領域，特別是涉及哺乳動物早孕因子的部分肽段。
二背景技術：
早孕因子(early pregnancy factor, EPF)是雌性哺乳動物受精後，所發現的 一種最早能在血清中檢測到的具有免疫抑制和生長調節作用的妊娠相關蛋白。 1974年，澳大利亞學者Morton在進行玫瑰花環抑制試驗(RIT)時，首次在妊 娠小鼠血清中檢測到了 EPF活性，由於EPF在小鼠受精後4 6h即可檢測到， 便將其命名為"早孕因子"。該發現引起了世界各國專家學者的關注，隨後在妊
娠婦女、羊、豬、牛等妊娠哺乳動物母體血清中均檢測到了 EPF活性，發現EPF 對妊娠母體具有很高的特異性。小鼠受精後4h，兔受精後16h，大鼠、綿羊、 牛、豬受精後24h，人受精後48h，均可在血清中檢測到EPF活性；EPF活性在 小鼠血清中可持續至分娩前4d，在綿羊、豬血清中幾乎持續整個孕期，在人可 持續至妊娠第6個月， 一旦妊娠終止，血清中EPF立即消失。
EPF能抑制T淋巴細胞介導的細胞免疫，抑制玫瑰花環的形成，防止母體 對胚胎乃至胎兒發生免疫排斥反應，也是惡性腫瘤細胞分泌的一種免疫抑制劑， 在燒傷、潰瘍及類風溼等傷口癒合中，有著生長因子的作用特點。
EPF對溫度和酸鹼度的耐受性較強，低於56。C時很穩定，超過72X:時容易 失活，EPF由102個胺基酸殘基的糖蛋白分子組成，人、豬和牛的EPF胺基酸 序列完全相同，分子量均為10.93kD，等電點約為6.5;小鼠EPF胺基酸序列和 人的純合度為97%，分子量為10.96kD，等電點約為6.8。 EPF與熱休克蛋白家 族成員伴侶蛋白10(cpnl0)高度同源，但與cpn10在細胞定位和功能上又不同， EPF是cpn10在細胞外發揮的效應。cpnl0在細胞內與cpn60特異性結合，輔助
蛋白質的正確摺疊，但在細胞外則表現EPF的活性。
EPF的生物學特性主要體現在抑制免疫和生長調節兩方面。首先，具有抑 制母體的免疫反應而使精子、胚胎免受免疫排斥的作用，也是目前最早確認妊 娠的生化標誌之一；其次是EPF能促進腫瘤細胞的生長，也能促進燒傷、潰瘍 等傷口的癒合。由於EPF能增強抗淋巴細胞血清(ALS)抑制T細胞花環的形成， 因此，玫瑰花環抑制試驗(RIT)為檢測EPF活性的經典方法。EPF在動物繁殖領 域可用於動物的早期、超早期妊娠診斷，在妊娠中斷的檢測、胚胎生物技術在 胚胎移植後的成活情況，以及評價雄性繁殖力和繁殖免疫疾病的治療等方面有 著重要價值。
發明內容
本發明要解決的技術問題提供一種哺乳動物早孕因子的部分合成肽段，
該肽段在免疫抑制上具有EPF的生物學活性。
本發明的技術方案是
本發明是根據人的EPF / HsplO (H-Met-Ala-Gly-Gln-Ala-Phe-Arg-Lys-Phe-Leu-Pro-Leu-Phe-Asp-Arg-Val-Leu-V al-Glu-Arg-Ser-Ala-Ala畫Glu-Thr匪Val國Thr-Lys-Gly-Gly-Ile-Met-Leu-Pro畫Glu-Lys-Se r-Gln-Gly國Lys-Val-Leu-Gln-Ala-Thr-Val-Val-Ala-Val-Gly國Ser-Gly-Ser-Lys-Gly-Ly s-Gly-Gly畫Glu-Ile-Gln-Pro-Val-Ser-Val-Lys-Val-Gly-Asp-Lys-Val-Leu-Leu-Pro-Glu -Tyr-Gly-Gly-Thr-Lys-Val-Val-Leu畫Asp-Asp-Lys國Asp-Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Asp-G ly-Asp-Ile-Leu-Gly-Lys-Tyr-Val-Asp-OH)，採用多肽合成的方法，分段合成不
同長度的肽段，再對各個肽段進行免疫抑制活性檢測，發現
H-Phe-Arg-Asp-Gly-Asp-Ile-Leu-Gly-Lys-Tyr-Val-OH和含有該段肽的肽段具有
抑制玫瑰花環的形成，在免疫抑制上，具有EPF的生物學活性。
本發明的哺乳動物的具有免疫抑制作用的關鍵活性肽段的胺基酸序列為 Phe Arg Asp Gly Asp lie Leu Gly Lys Tyr Val 。
該肽段為早孕因子的部分合成多肽。 編碼所述的活性肽段的核苷酸序列。
本發明的積極有益效果
(1) 本發明首次合成了哺乳動物早孕因子EPF的部分肽段，通過玫瑰花環 抑制試驗進行檢測，結果發現該肽段能抑制玫瑰花環的形成，通過家兔皮膚移 植檢測，也表明EPF在免疫抑制上具有生物學活性。
(2) 本發明的EPF部分肽段為免疫抑制作用的關鍵肽段，為進一步研究早 孕因子EPF及其臨床應用奠定了基礎。
具體實施例方式
實施例一採用多肽合成儀合成EPF/Hsp10 (H畫Met-Ala-Gly-Gln國Ala-Phe-Arg國Lys-Phe-Leu誦Pro-Leu隱Phe-Asp-Arg-Val國Leu-Val -Glu畫Arg-Ser-Ala-Ala-Glu-Thr-Val-Thr國Lys國Gly-Gly畫Ile-Met-Leu-Pro-Glu-Lys-Ser-Gln-Gly-Lys-Val-Leu-Gln國Ala-Thr-Val-Val國Ala-Val-Gly-Ser畫Gly-Ser-Lys-Gly-Lys-Gly-Gly-Glu-Ile-Gln-Pro-Val-Ser-Val-Lys-Val國Gly-Asp-Lys國Val國Leu-Leu-Pro-Glu-Tyr-Gly-Gly-Thr-Lys-Val誦Val-Leu-Asp-Asp-Lys-Asp-Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Asp誦Gl y-Asp-Ile-Leu-Gly-Lys-Tyr-Val-Asp-OH)的肽段如下
H-Cys-Met-Ala-Gly-Gln-Ala-Phe-Arg畫Lys國Phe-Leu-Pro-Leu-Phe-Asp-Arg-Val-Leu-Val-Glu-Arg-OH
-Pro扁Glu-OH
H-Cys-Ile-Met-Leu-Pro-Glu-Lys-Ser-Gln-Gly-Lys-Val-Leu-Gln-Ala-Thr-Val-Val-Ala -Val-Gly-OH
H畫Cys-Val-Val-Ala-Val-Gly-Ser-Gly畫Ser-Lys-Gly-Lys-Gly-Gly佳-Ile-Gln-Pro國Val-Ser國Val-OH
H國Cys-Gln-Pro-Val-Ser-Val-Lys-Val國Gly-Asp-Lys畫Val-Leu-Leu-Pro-Glu-Tyr-Gly-Gl y-Thr-Lys-OH
H-Cys-Tyr畫Gly畫Gly-Thr-Lys畫Val-Val-Leu-Asp-Asp-Lys-Asp-Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Asp-Gly-Asp-OH
H國Cys-Phe-Arg-Asp誦Gly-Asp-Ile-Leu國Gly-Lys-Tyr-Val-Asp-OH H-Asp-Lys-Asp-Tyr畫Phe誦Leu-Phe-Arg國Asp-Ser-Asp-Ile-Leu-Gly國Lys-Tyr-Val-Asp-O H
H-Lys畫Asp-Tyr-Phe畫Leu-Phe-Arg-Asp-Ser隱Asp-Ile-Leu-Gly-Lys-Tyr-Val-Asp-OH
H-Asp-Tyr扁Phe+eu-Phe-Arg-Asp-Ser-Asp國Ile-Leu-Gly-Lys-Tyr畫Val-Asp-OH
H-Phe-Leu-Phe-Arg-Asp-Gly-Asp-Ile-Leu隱Gly國Lys-Tyr-Val畫Asp-OH
H-Leu-Phe國Arg-Asp-Gly-Asp畫Ile國Leu-Gly-Lys誦Tyr-Val-Asp-OH
H-Phe-Arg-Asp-Gly-Asp-Ile-Leu國Gly-Lys-Tyr-Val-Asp-OH
H-Arg-Asp-Gly畫Asp-Ile-Leu-Gly誦Lys-Tyr-Val-Asp-OH
H-Asp-Gly-Asp畫Ile畫Leu-Gly-Lys-Tyr-Val-Asp-OH
H-Phe-Arg-Asp-Gly-Asp-Ile-Leu-Gly-Lys畫Tyr-Val-OH
H-Phe-Arg-Asp-Gly陽Asp國Ile-Leu-Gly陽Lys-Tyr-OH。
根據EPF的胺基酸序列，應用peptide程序分析合成難度特性，設計多肽合 成程序，採用多肽合成儀進行自動合成和手工合成相結合的方法合成多肽序列。 具體流程如下
設計合成多肽序列—peptide程序分析—設計合成程序—按樹脂的取代值計 算並稱取Fmoc-AA-Wang-resin或Rink resin—DMF溶漲樹脂—*加20% piperidine/DMF脫Fmoc保護，攪動6min—*加下一位胺基酸和HBTU進行醯化 反應，N2攪動反應30min—*用Kaiser法或TNBS法測試反應的完成情況—*DMF 洗5次，每次lmin—重複帶有*的步驟，在樹脂上連接下一位胺基酸，直到該多 肽序列合成完成—根據組成肽鏈胺基酸的不同，選取適當的試劑用TFA法裂解 肽鏈與樹脂的連接—冷乙醚沉澱TFA多肽—Sephadex G-25脫鹽純化—LC一MS 和HPLC分析鑑定和純化多肽。
在合成多肽時可以在多肽序列的N末端添加一個半胱氨酸。 以胺基酸序列FRDGDILGKY為例，合成5pmo1多肽所需試劑和操作流程 如下
主要試劑N， N—二甲基甲醯胺(DMF);脫保護試劑I : 20% Piperidine/DMF;脫保護劑II: 二氯甲烷(DCM);縮合、活化試劑2—(1H
一苯並三唑)一N,N，N，，N，—四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)溶於NMM (氮甲基 嗎啡啉)/DMF;切割試劑94%三氟乙酸(TFA) ; 20種Fmoc保護胺基酸
(每種胺基酸的濃度均為25pmol/L) ; Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Cys (Trt) -OH; Fmoc-Asp (OtBu) -OH; Fmoc誦Glu (OtBu)國OH; Fmoc國Phe誦OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His (Trt)國OH; Fmoc-Ile畫OH; Fmoc-Lys (Boc) -OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc隱Met-OH; Fmoc-Asn (tBu) -OH; Fmoc畫Pro誦OH; Fmoc-Gln (Trt) -OH; Fmoc國Arg(Pbf)-OH; Fmoc畫Ser (tBu)國OH; Fmoc-Thr (tBu)-OH; Fmoc-Val-OH; Fmoc-Trp (Boc) -OH; Fmoc國Tyr (tBu) -OH。
主要樹脂FmooLeu-Wang-Resin; Symphony多肽合成儀，由美國Protein Technology公司生產。
多肽合成中胺基酸偶聯步驟根據目的肽鏈產量，稱取10mg Fmoc-Leu-Wang-Resin放入反應瓶；(1)加入1.25ml DMF，混合10min，用 N2吹掉DMF，重複3次；(2)加入1.25ml 20%piperidine/DMF，混合5min， 用N2吹掉液體，加入1.25ml 20%piperidine/DMF，混合15min; (3)重複步驟
(1) ; (4)加入1.25ml 25nM的Fmoc-Met-OH;加入1.25ml 0.4NMM / DMF， 混合反應45min，用N2吹掉液體；(5)重複步驟(1) ; (6)重複步驟(1)
(5) ，依次加入Fmoc-Met-OH、 Fmoc-Gln (Trt) -OH，完成多肽序列中每個氨 基酸的偶聯；(7)用N2吹乾樹脂。
已合成的肽切割基本步驟如下(1)加入1.25ml DMF，混合10min，用 N2吹掉DMF，重複3次以上；(2)加入1,25ml 20%piperidine/DMF，混合5min， 用N2吹掉液體，加入1.25ml 20%piperidine/DMF，混合15min; (3)重複步驟 (1); (4)用DCM洗滌三次以上；(5)加入94XTFA混合反應2小時以上；
(6) 收集切割產物。
多肽合成產物粗提將無水乙醚緩慢加入到收集的產物中，冰浴10min， 300rpml0min，留沉澱，棄上清，重複3次，沉澱物用凍幹機乾燥，-2(TC保存 備用。取少量樣品用於HPLC和GC—MS檢測。
實施例二採用液質聯用儀進行合成肽段的鑑定及純度分析
純化和鑑定多肽用Waters Quattro Micro液質聯用儀(LC-MS)。 洗脫系統為①A液50 mL/L乙腈氾20溶液；②B液950 mL/L乙腈/ 20 溶液。手動進樣，每次lmL，流速4mL/min;線性梯度45 min內，B液從50mL/L 升到500mL/L，然後5min內從500mL/L升到950mL/L， B液做最後洗脫。220 nm處檢測紫外吸收，按峰收集組分，用於質譜檢測，質譜檢驗多肽採用電噴霧 電離解析質譜鑑定多肽，數據分析軟體為Masslynx4.0，方法嚴格按照操作手冊 進行，檢測合成多肽的分子質量，將分子質量檢測正確的組分收集，凍幹，成 為需要的純品，備用。
實施例三玫瑰花環抑制試驗檢測合成物的免疫抑制活性
1. 人淋巴細胞的準備靜脈採集人血液，0.1%肝素鈉抗凝，加入等體積 D-Hanks平衡鹽溶液，混勻，按每管2 3ml輕輕疊加於盛有等量淋巴細胞分離 液的10ml離心管中，2000rpm20min，離心結束後，吸取分離液與血漿交界部 位的灰白層，用5倍體積的D-Hanks液以1000rpm離心10 15min，洗滌2次， 取l滴細胞懸液，用臺盼蘭拒染法鏡檢計數細胞，計算細胞活率，活率應在95% 以上，用含20%犢牛血清的D-Hanks液將細胞調整到4xl(^個/mL。
2. 綿羊紅細胞懸液(SRBC)的準備用常規方法自綿羊頸靜脈採血，0.1% 肝素鈉抗凝，分離紅細胞，用D-Hanks液洗3次，配成終濃度為"108個/ mL的紅 細胞懸液，供當日使用。
3. 犢牛血清除去犢牛血清中對綿羊紅細胞的嗜異性抗體，經56T:30min 加熱滅活，加半量壓積綿羊紅細胞，混合後，37'C水浴20min。水浴後，2000rpm 10min，吸取上清液。
4. 玫瑰花環抑制試驗取500pL淋巴細胞懸液(4xl(^個/mL)與100iiL待測樣 品混合，37。C孵育30min。分別取9份孵育液，每份50iiL，在9份孵育液中分別加
入D-Hanks液100nL和ALG系列稀釋液(l: 2、103、 2、103.......、 216xl03) 100pL，
37X:孵育60mim力BD-Hanks液清洗2次；再加入l %綿羊紅細胞懸液50^和含20 W犢牛血清的D-Hanks液50nL，充分混勻800rpm 5min，棄去大部分上清液，重 懸細胞；再加入l 2滴0.8X戊二醛固定10min，塗片，姬姆薩-瑞氏複合染液染色，
記錄每200個淋巴細胞中的花環數目。RIT值按花環數低於陰性對照組75^時 ALS的最高稀釋度計算，即以ALS的最高稀釋倍數的倒數xlO-s後取對數表示，其 計算公式為
RIT=log2(l(T3 / ALS最高稀釋倍數)。
5.對每個肽段採用玫瑰花環抑制試驗進行檢測，結果有活li的肽段為 H-Cys-Phe-Arg-Asp-Gly-Asp-Ile-Leu畫Gly-Lys誦Tyr-Val-Asp-OH， H-Asp-Lys畫Asp-Tyr-Phe畫Leu-Phe-Arg-Asp-Ser畫Asp-Ile-Leu-Gly-Lys-Tyr-Val-Asp-O H，
H-Lys-Asp-Tyr-Phe-Leu-Phe-Arg-Asp-Ser-Asp-Ile-Leu-Gy-Lys-Tyr-Val-Asp-OH,
H-Asp-Tyr畫Phe-Leu-Phe-Arg-Asp-Ser誦Asp-Ile-Leu-Gly-Lys-Tyr-Val腸Asp-OH，
H國Phe-Leu-Phe-Arg-Asp-Gly-Asp-Ile-Leu-Gly-Lys-Tyr-Val陽Asp-OH，
H國Leu-Phe-Arg-Asp-Gly隱Asp-Ile-Leu-Gly-Lys-Tyr-Val-Asp-OH，
H-Phe-Arg-Asp-Gly-Asp-Ile國Leu-Gly-Lys-Tyr-Val腳Asp-OH,
H國Phe-Arg-Asp誦Gly-Asp-Ile-Leu-Gly-Lys-Tyr-Val-OH。
上述各肽段的免疫抑制活性相同。
實施例四家兔皮膚移植檢測肽段的免疫抑制活性
1. 實驗動物同種家兔20隻，2隻間進行相互的皮膚移植，每隻家兔在其 臀部一側作為受體部位，另一側作為供體部位。各移植一處。
2. 造創將家兔放於多功能手術臺上保定，對其左、右臀部分別進行剃毛、 清洗。用0.1%新潔爾滅消毒，將3%普魯卡因注射液於臀部做局部扇形浸潤麻醉，
手術切去一塊包括皮膚全層的皮瓣，面積為lcmX3cm，徹底止血。
3. 創面處理對創面進行充分止血後，用青黴素溶解於生理鹽水清洗創面， 去除血汙、滲出液及組織碎片。用雲南白藥覆於創面，外蓋上紗布，用膠帶固 定。到第12天，肉芽面分泌物減少，肉芽覆蓋了整個創面，肉芽顆粒緻密、堅 實、無水腫，呈粉紅色，有光澤。此時，切除螯生肉芽組織。用含青黴素的生 理鹽水清洗肉芽面，除去膿汁，創緣及創圍用75%酒精消毒，然後用浸有生理鹽 水的紗布覆蓋創面，保護肉芽組織，準備進行皮膚移植。
4. 皮膚移植取同種異體家兔另一側臀部全層的皮瓣，用生理鹽水清洗， 移植於另一隻家兔的創面，縫合併固定包紮。
5. 移植後處理將20隻家兔分為2組，IO只作為試驗組，IO只為對照。每
天觀察移植部位的癒合情況。
試驗組分別在移植後的4天、8天、12天、16天和20天靜脈注射肽段 (H-Phe-Arg-Asp-Gly-Asp-Ile丄eu-Gly-Lys-Tyr-Val-OH，用PBS按1 mg/ml稀釋)， 每隻每次靜脈注射50(HiL。對照組用PBS等量注射。
6. 植皮成活標準判斷^皮片與肉芽面完全融合，肉芽面老化；皮片色素逐 漸向四周擴散；皮片上的被毛迅速生長；植皮後l月以上未發現免疫排斥反應， 認為被移植的皮膚成活。
7. 結果
試驗組(IO只)3隻移植不成功；7隻移植成功，癒合時間為21 27天，平 均25天。
對照組(IO只)3隻未移植成功；4隻在移植後的第9 14天，植皮被排斥 掉，植床凹面輪廓光滑，植皮無毛；2隻在移植後第18天出現排斥，植皮脫落， l只成功，癒合時間為26天。
實驗結論通過上述實驗可以看出，試驗組10隻家兔中有7隻移植成功， 表明H-Phe-Arg-Asp-Gly-Asp-Ile-Leu-Gly-Lys-Tyr-Val-OH為EPF免疫抑制作用的 活性關鍵肽段。
序列表
河南省動物免疫學重點實驗室
早孕因子中具有免疫抑制作用的關鍵活性肽段
多肽合成的方法
1
Patentln version 3.4
1
11
PRT 人工序列
1
Phe Arg Asp Gly Asp lie Leu Gly Lys Tyr Val 1 5 10
權利要求
1.哺乳動物中具有免疫抑制作用的關鍵活性肽段，其特徵在於該肽段的胺基酸序列為Phe Arg Asp Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val。
2. 根據權利要求1所述的活性肽段，其特徵在於所述的肽段為早孕因子的部分肽段。
3. 根據權利要求1所述的活性肽段，其特徵在於所述的肽段為合成多肽。
4. 編碼權利要求1所述活性肽段的核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及動物繁殖免疫學領域，特別是涉及哺乳動物早孕因子的部分肽段，該肽段的胺基酸序列為Phe Arg Asp Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val。該肽段為早孕因子的部分合成肽段。本發明首次合成了哺乳動物早孕因子EPF的部分肽段，通過玫瑰花環抑制試驗進行檢測，結果發現該肽段能抑制玫瑰花環的形成，通過家兔皮膚移植檢測，也表明EPF在免疫抑制上具有生物學活性。本發明的EPF部分肽段為免疫抑制作用的關鍵肽段，為進一步研究早孕因子EPF及其臨床應用奠定了基礎。
文檔編號C07K7/00GK101367866SQ20081014155
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月28日 優先權日2008年9月28日
發明者喬松林, 張改平, 凱 權, 李清洲, 楊蘇珍, 柴書軍, 王愛萍, 王選年, 肖曙光, 東 趙, 趙旭永, 鄧瑞廣, 邢廣旭, 郅玉寶, 陳其新, 陳理盾 申請人:河南省農業科學院