日本血吸蟲miRNA及其應用的製作方法

2023-10-27 17:28:32 3

專利名稱：日本血吸蟲miRNA及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學和寄生蟲領域；更具體地，本發明涉及分離自血吸蟲的
miRNA、其前體及反義寡核苷酸，以及它們在製備抑制血吸蟲的組合物中的用途。
背景技術：
微小RNA (Mi croRNA ， mi RNA)是 一 類真核生物高度保守的內源性小調節RNA ，長 度約18 26個核苷酸，通過與靶mRNA特異性鹼基配對引起靶mRNA降解或翻譯抑制，調 控基因轉錄後表達。它來源於長度約為lOOObp的長鏈RNA初始轉錄產物(Pri-miRNA)， Pri-miRNA分子在細胞核中經Drosha酶剪切形成長度約60 80nt的具有莖環結構的 miRNA前體(Pre-miRNA) 。 Pre-miRNA轉運至胞質後，被Dicer酶進一步切割成長約22nt的 雙鏈miRNA。雙鏈miRNA解開後，成熟的miRNA進入RNA誘導基因沉默複合物(RNA-induced silencing complex, RISC)，與互補mRNA完全或不完全配對，降解耙mRNA或阻遏其表達。 miRNA具有廣泛的基因調節功能，能對基因活動(生長、分化、凋亡及應激反應等)的各個層 面進行調節，參與了生命過程中的一系列重要進程，包括早期胚胎發育、細胞增殖、細胞凋 亡、細胞死亡、脂肪代謝以及幹細胞維持和分化等。 目前，雖然已經發現了大量的miRNA，但嚴重危害人類健康的血吸蟲病的病原 體——血吸蟲的miRNA尚屬空白。因此本領域需要鑑定出與日本血吸蟲生長發育或致病相 關的miRNA，從而為日本血吸蟲病的防治和藥物的研製提供新的途徑。

發明內容
本發明的目的在於提供分離自血吸蟲的miRNA、其前體及反義寡核苷酸，以及它們 在製備抑制血吸蟲的組合物中的用途。 本發明的目的還在於提供用於調節(下調或上調)血吸蟲miRNA表達或數量的 方法，從而發揮調節血吸蟲生長、發育等作用；以及提供一種新的抑制血吸蟲生長發育的方法。 在本發明的第一方面，提供一種分離的miRNA，所述的miRNA選自
(i)序列如SEQ ID NO :n所示的miRNA，其中n為選自1_5的正整數；或
(ii)與SEQ ID NO :n所示序列互補的miRNA。
在另一優選例中，所述的miRNA分離自血吸蟲。在另一優選例中，所述的血吸蟲是日本血吸蟲(Schistosoma j即onicum)。
在本發明的第二方面，提供一種分離的前體miRNA，所述的前體miRNA選自
(A)序列如SEQ ID NO : (n+5)所示的前體miRNA，所述的前體miRNA可在血吸蟲細 胞內被剪切且表達成如SEQ ID NO :n所示的miRNA，其中n為選自1_5的正整數；或
(B)與SEQ ID NO: (n+5)所示序列互補的前體miRNA。 在本發明的第三方面，提供所述的miRNA的反義寡核苷酸，所述的反義寡核苷酸 選自
(a)序列如SEQ ID NO : (n+10)所示的寡核苷酸，其中n為選自1-5的正整數；或 (b)與SEQ ID NO : (n+10)所示序列互補的寡核苷酸。 在另一優選例中，所述的寡核苷酸是核酸鎖(LNA)修飾的寡核苷酸. 在另一優選例中，所述的寡核苷酸是硫代修飾磷酸二酯鍵骨架的寡核苷酸；或者
所述的寡核苷酸是2'-核糖甲乙氧基、甲氧基、甲基或氟嘧啶修飾的寡核苷酸。 在另一優選例中，所述的反義寡核苷酸是DNA或與所述序列相應的RNA。 在本發明的第四方面，提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸能被血吸蟲細
胞轉錄成前體miRNA，所述的前體miRNA能在血吸蟲細胞內被剪切且表達成如SEQ ID NO:
n所示的miRNA，其中n為選自1_5的正整數。 在另一優選例中，所述的多核苷酸含有式I所示的結構
formula see original document page 4 式I中， Seq正^為能在血吸蟲細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸序列，
Seq反^為與Seq正^基本上互補的核苷酸序列； X為位於Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，並且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向不互補， 式I所示的結構在轉入血吸蟲細胞後，形成式II所示的二級結構
formula see original document page 4 式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述， I I表示在Seq^和Seq反^之間形成的鹼基互補配對關係。 在本發明的第五方面，提供所述的反義寡核苷酸的用途，用於製備抑制血吸蟲生長發育(或殺血吸蟲)的組合物。 在本發明的第六方面，提供一種抑制血吸蟲生長發育(或殺血吸蟲)的組合物，所
述的組合物含有有效量的所述的反義寡核苷酸；以及藥學上可接受的載體。 在本發明的第七方面，提供一種抑制血吸蟲生長發育(或殺血吸蟲)的方法(優
選非治療性的方法)，所述的方法包括給予血吸蟲或感染血吸蟲的宿主有效量的所述的
反義寡核苷酸。 本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1.日本血吸蟲和曼氏血吸蟲miRNA莖環二級結構。
圖2. Northern blot檢測五種日本血吸蟲miRNA。 圖3.日本血吸蟲三種miRNA莖環RT real time PCR融解曲線(B)和擴增產物8% PAGE電泳分析(A)。 圖4.莖環RT-PCR檢測血吸蟲miRNA特異性分析。 圖4A中，泳道1為以小鼠血細胞RNA為模板獲得的擴增產物的電泳結果；泳道2為以兔血細胞RNA為模板獲得的擴增產物的電泳結果；泳道3為以日本血吸蟲成蟲RNA為模板獲得的擴增產物的電泳結果。 圖4B中，泳道1為5 ii g總RNA ;泳道2為從5 ii g總RNA中分離低分子量(L麗)
RNA ;泳道3為採用15%變性PAGE從5 y g總RNA中分離的miRNAs前體(60-100nt);泳道
4為採用15%變性PAGE從5 ii g總RNA中分離的成熟miRNAs (約22nt)。 圖5.日本血吸蟲三種新miRNA在其生活史6個階段表達分析。 圖6.反義寡核苷酸(ASO)轉染肝期童蟲後三種miRNA表達變化；圖示結果為三次
獨立試驗的平均結果。
具體實施例方式
miRNA能夠特異性結合到mRNA的相應部位，影響相應的mRNA的轉錄或翻譯，從而影響相應的基因的表達。本發明人經過長期而廣泛的研究，首次從血吸蟲中分離獲得一類新的miRNA。不同生活史表達分析表明，血吸蟲miRNA在血吸蟲生長發育不同階段存在期表達特異性，提示可對血吸蟲生長、發育產生影響。此外，本發明人還設計了針對所述miRNA的反義寡核苷酸等，用於在細胞內調節(如下調或上調)miRNA的表達或數量，以發揮調節血吸蟲生長、發育等作用。
miRNA及其前體 本發明提供了一類從血吸蟲中發現的miRNA。如本文所用，所述的"miRNA"是指一種RNA分子，從可形成miRNA前體的轉錄物加工而來。成熟的miRNA通常具有18-26個核苷酸(nt)(更特別的約19-22nt)，也不排除具有其它數目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印跡檢測到。 血吸蟲來源的miRNA可被從血吸蟲細胞中分離。如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。 血吸蟲miRNA可從前體miRNA (Precursor mi RNA ， Pre-mi RNA)加工而來，所述的前體miRNA可摺疊成一種穩定的莖環(髮夾)結構，所述的莖環結構長度一般在50-100bp之間。因此，本發明的另一方面關於可在血吸蟲細胞中被加工產生miRNA的前體miRNA。並且，所述的前體miRNA也是可從血吸蟲中被分離的。所述的前體miRNA可摺疊成穩定的莖環結構，莖環結構的莖部兩側包含基本上互補的兩條序列。所述的前體miRNA可以是天然的或是人工合成的。 前體miRNA可被血吸蟲細胞剪切生成miRNA，所述的miRNA可與編碼基因的mRNA的至少一部分序列基本上互補。如本文所用，"基本上互補"是指核苷酸的序列是足夠互補的，可以以一種可預見的方式發生相互作用，如形成二級結構(如莖環結構)。通常，兩條"基本上互補"的核苷酸序列互相之間至少有70%的核苷酸是互補的；優選的，至少有80%的核苷酸是互補的；更優選的，至少有90%的核苷酸是互補的；進一步優選的，至少有95%的核苷酸是互補的；如98%、99%或100%。 一般地，兩條足夠互補的分子之間可以具有最多40個不匹配的核苷酸；優選的，具有最多30個不匹配的核苷酸；更優選的，具有最多20個不匹配的核苷酸；進一步優選的，具有最多10個不匹配的核苷酸，如具有0、 1、2、3、4、5、8、9個不匹配的核苷酸。
如本文所用，"莖環"結構也被稱作"髮夾"結構，是指一種核苷酸分子，其可形成一種包括雙鏈區域(莖部)的二級結構，所述的雙鏈區域由該核苷酸分子的兩個區域(位於同一分子上)形成，兩個區域分列雙鏈部分的兩側；其還包括至少一個"環"結構，包括非互補的核苷酸分子，即單鏈區域。即使該核苷酸分子的兩個區域不是完全互補的，核苷酸的雙鏈部分也可保持雙鏈狀態。例如，插入、缺失、取代等可導致一個小區域的不互補或該小區域自身形成莖環結構或其它形式的二級結構，然而，該兩個區域仍可基本上互補，並在可預見的方式中發生相互作用，形成莖環結構的雙鏈區域。莖環結構是本領域技術人員所熟知的，通常在獲得了一條具有一級結構的核苷酸序列的核酸後，本領域技術人員能夠確定該核酸是否能形成莖環結構。 本發明以血吸蟲成蟲為材料進行miRNA克隆分析。利用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離回收日本血吸蟲18 26nt大小RNA，兩端分別連接接頭進行RT-PCR，構建日本血吸蟲成蟲小RNA的cDNA文庫。挑取陽性克隆進行測序分析，將獲得的18 26nt的RNA序列檢索日本及曼氏血吸蟲資料庫去除mRNA、 rRNA和tRNA降解產物後，針對候選miRNA編碼區域，以Mfold程序分析包括候選序列兩端約80bp的側翼序列，分析其是否可形成pre-miRNA結構，並進一步通過Nothern blot雜交驗證。結果發現了一類新的miRNA，其前體序列均可以形成miRNA前體的典型莖環結構，符合miRNA的結構特徵。對這些miRNA的研究發現，它們在血吸蟲不同生活階段(蟲卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、肝期童蟲及成蟲等)具有不同程度的表達。
本發明所述的miRNA具有如SEQ ID NO :n所示的序列，其中n為選自1-5的正整數(也即n選自1，2，3，4或5)。較優選的，所述的miRNA是具有如SEQ ID NO :2所示的序列的miRNA。在下調了 SEQ ID NO :2所示的序列miRNA的表達後，可以明顯地減少血吸蟲的產生和抑制生長發育，因此可見該miRNA具有促進血吸蟲生長發育的作用，可基於此開發抑制血吸蟲生長發育的藥物。 為了提高miRNA的穩定性或其它性質，還可在所述的miRNA的至少一端加上至少一個保護性鹼基，如"TT"等。本發明所述的前體miRNA具有如SEQ ID NO : (n+5)所示的序列，其中n為選自1_5的正整數(也即n選自1，2，3，4或5)。較優選的，所述的前體miRNA是具有如SEQ ID NO:7所示的序列的前體miRNA。
反義寡核苷酸 根據所述的血吸蟲miRNA序列，本發明人還設計出了它們的反義寡核苷酸，所述的反義寡核苷酸可在體內下調相應的miRNA的表達。如本文所用，"反義寡核苷酸(antisense-oligo皿cleotides， AS-Ons或ASO)"又稱為"反義核苷酸"，是指長度約為18-26nt (更特別的約19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其類似物。 本發明所述的反義寡核苷酸具有如SEQ ID NO : (n+10)所示的序列，其中n為選自l-5的正整數(也即n選自1，2，3，4或5)。較優選的，所述的反義寡核苷酸具有如SEQID NO :11-13所示的序列(分別對應於SEQ ID NO :1_3所示序列的miRNA);更優選的，所述的反義寡核苷酸具有如SEQ ID N0:12所示的序列(分別對應於SEQ ID NO :2所示序列的miRNA)。 在本發明中，所述的"反義寡核苷酸"還包括採用如基於核酸鎖或核酸鏈骨架修飾技術等手段獲得的經修飾的反義核苷酸，所述的修飾基本不改變反義寡核苷酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義寡核苷酸的穩定性、活性或治療效果。核酸鎖(locked nucleicacid，LNA)通常是指通過一個亞甲基橋將核糖的2'氧原子和4'碳原子連接起來的修飾技術。LNA能延長miRNA的血清半衰期，提高對耙標親和性，減少脫耙作用的範圍和程度。基於核酸鏈骨架的修飾技術發展出的反義藥物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易於大量合成。寡核苷酸的骨架修飾方法有多種，包括硫代法，例如將脫氧核苷酸鏈硫代修飾為硫代脫氧核苷酸鏈。該方法是將DNA骨架上的磷酸鍵的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。應理解，任何能夠保持所述反義寡核苷酸的大部分或全部活性的修飾都包含在本發明中。 作為本發明的優選方式，對反義寡核苷酸進行核酸鎖修飾；更佳地還進行硫代修飾。 將本發明所述的反義寡核苷酸轉移到血吸蟲體內後，它們能夠明顯下調相關miRNA的表達。該結果說明所述的血吸蟲miRNA分子在日本血吸蟲的生長和發育中具有重要的生物學功能。 本發明還提供了所述的反義寡核苷酸的用途，用於製備抑制血吸蟲生長發育(或殺血吸蟲)的組合物。 本發明還提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有有效量的所述的反義寡核苷酸，以及藥學上可接受的載體。所述的組合物可抑制血吸蟲生長發育或殺死血吸蟲。
所述"藥學上可接受的"的成分是適用於人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、剌激和變態反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。所述"有效量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述"藥學上可接受的載體"指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身並不是必要的活性成分，且施用後沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington' sPharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. ， N. J. 1991)中可找到關於藥學上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。 本發明的反義寡核苷酸的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限於反義寡核苷酸的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當本發明的反義核苷酸每天以約0. 001-100mg/kg(優選的為0. 01-20mg/kg)動物體重的劑量給予時，能得到令人滿意的效果。 本發明還提供了一種抑制血吸蟲生長發育或殺血吸蟲的方法，所述的方法優選是非治療性的，所述的方法包括給予血吸蟲或感染血吸蟲的宿主有效量的所述的反義寡核苷酸。所述的血吸蟲的宿主例如是非人哺乳動物或人。
多核苷酸構建物 此外，根據本發明所提供的血吸蟲miRNA序列，可設計出在被導入血吸蟲中後可被血吸蟲加工成可影響相應的mRNA表達的miRNA的多核苷酸構建物，也即所述多核苷酸構建物能夠在體內上調相應的miRNA的量。因此，本發明提供了一種分離的多核苷酸(構建物)，所述的多核苷酸(構建物)可被血吸蟲細胞轉錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可向
被血吸蟲細胞剪切且表達成所述的miRNA。 作為本發明的一種優選方式，所述的多核苷酸構建物含有式I所示的結構
Seq正向-X-Seq反向 式I， 式I中， SeqE^j為可在血吸蟲細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反^為與Seq正 基本上互補的核苷酸序列；或者，Seq反^為可在血吸蟲細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸
序列，Seq正^)為與Seq正^)基本上互補的核苷酸序列 X為位於Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，並且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向 不互補； 式I所示的結構在轉入血吸蟲細胞後，形成式II所示的二級結構
「 ，Seq正向_/^n
u X式II， 式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述； | |表示在Seq^^和Seq^^之間形成的鹼基互補配對關係。 本發明還提供一種抑制目的基因表達的方法，所述的方法包括步驟 (1)提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸可被血吸蟲細胞轉錄成前體
miRNA，所述的前體miRNA可被血吸蟲細胞剪切且加工成能夠與該目的基因對應的mRNA的
至少一部分序列互補的miRNA ; (2)將(1)中所述的多核苷酸導入到血吸蟲細胞中，從而抑制所述目的基因的功 能。 將所述的多核苷酸構建物導入到血吸蟲中，該多核苷酸構建物在體內被轉錄成前 體miRNA，之後所述的前體miRNA被加工成miRNA，所述的miRNA可與相應的mRNA的部分序 列相互補，從而抑制該mRNA相應的目的基因的表達。 通常，所述的多核苷酸構建物位於表達載體上。因此，本發明還包括一種載體，它 含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸構建物。所述的表達載體通常還含有啟動子、複製起 點和/或標記基因等。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建本發明所需的表達載體。 這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的表達載體優選地 包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如卡拉黴 素、慶大黴素、潮黴素、氨苄青黴素抗性。
晶片 此外，利用本發明所述的miRNA序列，還可以點制miRNA晶片研究其表達譜以及 miRNAs的調節方式，具有很高的應用價值。通過利用所述的miRNA製備的miRNA晶片，可分 析miRNA基因的表達模式，可了解血吸蟲中相應的基因對血吸蟲生長發育不同周期的調節 情況；可設計相應的策略，調節和修飾靶基因，調節血吸蟲的生長發育。因此本發明還提供 一種用於分析miRNA表達譜的晶片，所述的miRNA晶片包括
固相載體；以及 有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應 於SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:5所示的序列。較佳的，所述的寡核苷酸探針具有SEQ ID NO: 11-SEQ ID N0:15所述的序列。所述固相載體可採用基因晶片領域的各種常用材料，例如但不限於尼龍膜，經活性基團(如醛基、氨基等)修飾的玻片或矽片、未修飾的玻片、塑料片等。 所述的miRNA晶片的製備可採用本領域已知的生物晶片的常規製造方法。例 如，如果固相載體採用的是修飾玻片或矽片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將 寡核苷酸探針配製成溶液，然後採用點樣儀將其點在修飾玻片或矽片上，排列成預定的 序列或陣列，然後通過放置過夜來固定，就可得到本發明的miRNA晶片。如果核酸不含 氨基修飾，則其製備方法也可參照王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》； J丄erisi， V. R. Iyer， P. 0. BROWN. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science, 1997 ;278 :680禾口馬立人，蔣中華主編.生 物晶片.北京化學工業出版社，2000， 1-130。
本發明的主要優點在於 (1)從血吸蟲這一重要病原體中分離獲得一類新的miRNA，這些miRNA與調節血吸 蟲生長發育相關。 (2)針對所述新的miRNA，獲得了一類反義寡核苷酸，具有良好的下調所述miRNA 的作用，且部分反義寡核苷酸具有非常顯著的減蟲作用。 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。 實施例1.日本血吸蟲小RNA的分離純化 日本血吸蟲尾蚴經貼片感染實驗動物(紐西蘭大白兔或昆明鼠)，42天後剖殺動 物，獲取成蟲。 血吸蟲成蟲標本液氮研磨至粉末狀，用Trizol (Invitrogen)提取總RNA。用DEPC 處理水將無降解的總RNA調整濃度到lmg/ml，加入終濃度為0. 5M的NaCl和5% PEG8000, 混勻，室溫沉澱10min，12000rpm，4°C，15min，取上清，加入2. 5倍體積的無水乙醇，混 勻，-20。C沉澱2h以上。然後13000rpm，4。C，30min。棄去上清，沉澱室溫乾燥5min。加入 適量DEPC處理水或者甲醯胺溶解RNA，測定濃度，用於18 26nt小RNA分離。
實施例2.構建小RNA的cDNA文庫 用15 %尿素變性PAGE膠回收18 26nt的小RNA，分別用T4 RNA連接 酶(MBI)力B 3，-接頭5' -p acuGTAGGCACCATCAA(SEQ ID NO :16)p-3，禾P 5，-接頭 5， -ATCGTaggcaccugaaa-3， (SEQ ID NO :17)(其中，小寫為RNA，大寫為DNA， p指磷酸基 團)，然後用RT引物(5'-ATTGATGGTGCCTAC-3' (SEQ IDNO :18))逆轉錄加接頭的小RNA，獲 得cDNA。根據RT引物及RNA接頭設計PCR引物(5'引物5'-ATCGTAGGCACCTGAAA-3' (SEQ ID NO :19) ，3'引物5'-ATTGATGGTGCCTACAG-3' (SEQ ID NO :20))。以所得cDNA為模板 進行PCR擴增，PCR產物經BshN I(MBI)酶切，將酶切產物自身連接，再補平，連接T載體 pMD18-T質粒(Takara) ， PCR篩選陽性克隆，測序。
實施例3.血吸蟲小RNA文庫生物信息學分析 將測序獲得的序列去除載體及兩端接頭序列，獲得小RNA序列。選擇18 26nt長度序列進一步分析。將獲得的序列比對(BLAST)日本血吸蟲(S. j即onicum)轉錄組數 據庫(htto: 〃www. ncbi. nih. gov/Genbank/index. html),及尚未完成拼接的某因組資料庫 (htto:〃lifecenter. sgst. cn/si. do)。曼氏血吸蟲基因組資料庫(S. mansoni) (htto:〃 www, sanger. ac. uk/Pro iects/S mansoni)也用於輔助解析克隆獲得的序列。若與報導的 序列存在3個或3個以上鹼基差異將不進一步分析。在排除rRNA， tRNA及mRNA序列之後， 剩餘的小RNA序列進一步二級結構預測。從基因組選擇包括候選序列2端約lOObp的側 翼序列，應用RNA 二級結構預測l軟體Mfold(httD:〃www. bioinfo. :roi. edu/a加lications/ mfold)分析形成穩定莖環結構可能。 miRNA確定標準和鑑定方法miRNA區別於其他內源性小RNA的一個重要特徵是其 前體能形成典型的莖環結構。傳統上以表達特徵和生物起源作為判定miRNA標準。(l)表 達標準①在RNA標本中檢測到長度約22nt的RNA轉錄產物，通常以Northern blotting 檢測；②在構建的小RNA cDNA文庫中存在與該物種基因組嚴格匹配的長度約22nt的序列。 (2)生物起源標準①以最低自由能規則(如mfold軟體)能預測到包含約22nt序列的莖 環前體結構(pre-miRNA)，不存在內環或膨出，特別是大的不對稱膨出。動物的莖環前體長 度通常60 80nt。②miRNA及其預測的髮夾結構前體物種間保守；③下調Dicer酶能檢測 到pre-miRNA積聚。理想的miRNA需滿足上述所有標準，但實際上，往往以表達長度約22nt 且存在典型莖環結構的小非編碼RNA定義為miRNA。 通過以上分析，共獲得五種日本血吸蟲成蟲新的miRNA序列如下(分別命名為 sj_miR_l至sj_miR_5):
0099] l)sj-miR-l 5， GGAGGUAGUUCGUUGUGUGGU(SEQ ID N0:1); 0100] 2)sj-miR-2 5， UGAAAGACGAUGGUAGUGAGA(SEQ ID NO :2); 0101] 3)sj-miR-3 5， UGAGAUCGCGAUUAAAGCUGGU(SEQ ID NO :3); 0102]4)sj-miR-4 5， UCCCUGAGACCCUUUGAUUGUC(SEQ ID NO :4); 0103] 5)sj-miR-5 5' UCCCUGAGACUGAUAAUUGCUC(SEQ ID NO :5)。 0104] 及其前體RNA序列如下 0105] sj-miR-1前體 0106] 5'
UUUCCCA(SEQ ID NO :6); 0107] sj-miR-2前體 0108] 5'
CGGUAAGAAUCAC(SEQ ID NO :7);
0109] sj-miR-3前體
0110] 5' AUUAAAGCUGGUUU(SEQ ID NO :8);
O川] sj-miR-4前體
0112] 5， AAGUGACUCAGGUGUGC(SEQ ID NO :9);
0113] sj-miR-5前體
0114] 5'UUCUCAGGUGU(SEQ ID NO :10)。 經鑑定，五種日本血吸蟲成蟲新的miRNA前體均可以形成典型的髮夾結構。另外， 分析表明，這些miRNA序列在曼氏血吸蟲中也是保守的。包括miRNA序列的約70nt的曼氏 血吸蟲序列也能形成典型的miRNA前體二級結構，見圖1。
實施例4. Nothern blot檢測miRNA 根據上述候選的miRNA序列，合成5'端生物素標記的miRNA反義寡核苷酸探針。 本實施例用到的Northern探針序列分別為(其中，b表示生物素化的(biotinylated)):對應sj--miR-1的探針:5，-b ACCACACAACGAACTACCTCC(SEQ ID NO :11)-3，；對應sj--miR-2的探針:5，-b TCTCACTACCATCGTCTTTCA(SEQ ID NO :12)-3，；對應sj--miR-3的探針:5，-b ACCAGCTTTAATCGCGATCTCA(SEQ ID NO:13)-3,對應sj--miR-4的探針:5，-b GACAATCAAAGGGTCTCAGGGA(SEQ ID NO:14)-3,對應sj--miR-5的探針:5，-b GAGCAATTATCAGTCTCAGGGA(SEQ ID NO:15)-3，。 按照常規Northern blot方法檢測sj-miR-1至sj-miR-5在日本血吸蟲成蟲中 的表達。其結果如圖2，其中泳道l-5分別代表sj-miR-l至sj-miR-5的檢測結果。可見 sj-miR-l、sj-miR-2和sj-miR-3具備miRNA典型特徵(檢測到約22nt的成熟的miRNA及 70nt的前體)；sj-miR-4和sj-miR-5僅檢測到約22nt的成熟的miRNA。
實施例5.日本血吸蟲miRNA莖環RT-Real Time PCR分析方法建立
血吸蟲總RNA經特異莖環RT引物逆轉錄後，再利用特異的前向引物和通用的反向 引物進行擴增。伴隨著擴增的過程，SYBR Green染料摻入到雙鏈的DNA分子中，產生螢光。 擴增的循環數與樣品的模板量成反比。機器檢測PCR擴增到達檢測閾值的循環數。表l為 本部分研究相關的RT及隨後定量分析的real time PCR引物序列。通用反向引物與莖環 RT引物的環狀部分匹配。按照常規的real time定量PCR進行。以a-微管蛋白作為內參 照，8% PAGE電泳分析real time PCR產物。 表l日本血吸蟲miRNA莖環RT real time PCR檢測相關引物序列
11CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAC
RT莖環引物
CACACA (SEQ ID NO: 21)
sj陽miR-l
ACACTCCAGCTGGGGGAGGTAGTTCGTTG (SEQ ID NO:
正向引物
_^}_
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCT
RT莖環引物
CACTAC (SEQ ID NO: 23)
sj-miR-2
ACACTCCAGCTGGGTGAAAGACGATGGT (SEQ ID NO:
正向引物
24)
CTCAACTGGTGTCGTGGAG丁CGGCAATTCAGTTGAGAC
RT莖環引物
CAGCTT (SEQ ID NO: 25)
sj-miR_3
ACACTCCAGCTGGGTGAGATCGCGATTAAA (SEQ ID
正向引物
_NO: 26) _
通用的反向弓I物 CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA (SEQ ID NO: 27)_
O!-微管蛋 正向引物 GTACATGTTGGTCAAGCTGGTGT (SEQ ID NO: 28) 白_反向引物 AGTTCGCACTTCATCCACTACAGT (SEQ ID NO: 29) 其結果如圖3和圖4。如圖3所示，日本血吸蟲miRNA莖環RT-PCR後在8XPAGE 上顯示為分子量約67bp的擴增條帶(A)， real time RT-PCR融解曲線(dissociation curves)顯示為狹窄尖銳的單一峰(B)。如圖4A所示，以宿主(小鼠及兔子)血細胞抽提的 RNA為模板，無擴增條帶(圖4A泳道1、2)，由此說明建立的莖環RT-PCR能特異的擴增相應 的miRNA，不受宿主miRNA的影響。為分析建立的基於莖環RT-PCR是否能區分成熟的miRNA 或是miRNA前體，本發明人使用5 ii g總RNA，並從同樣量總RNA分離低分子量L麗RNA (小 於200nt)、利用15%尿素變性PAGE分離60 100nt的miRNA前體部分，以及22nt左右的 成熟miRNA部分，進行莖環RT-PCR分析。如圖4B所示，不管循環數是25還是30，總RNA和 L麗RNA的條帶亮度幾乎一致。30個循環後，miRNA前體部分才可見到微弱條帶，25個循環 未見擴增。上述的結果表明，本發明人建立的方法是特異針對成熟的miRNA分析方法，不受 pre-miRNA影響。這些數據說明莖環RT real time PCR高度敏感特異的檢測到目的miRNA。
實施例6.莖環RT-real time PCR分析三種miRNA在日本血吸蟲不同發育階段表 達 採用實施例5建立的莖環RT-real time PCR對血吸蟲發育不同階段的三種 miRNA表達水平進行分析。以日本血吸蟲a-微管蛋白為內參，分析前述鑑定的sj-miR-l、 sj-miR-2和sj-miR-3分別在蟲卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、肝期童蟲及成蟲等血吸蟲6個生活史 階段的表達。 結果如圖5所示，在上述三個miRNA中，s j-miR-2在各階段中表達豐度最高，其次 是sj-miR-3， sj-miR-1表達豐度最低。就sj-miR-1不同生活史表達而言，蟲卵和毛呦階段表達最低，胞蚴時表達快速升高，尾蚴階段表達達高峰。當尾蚴進入宿主後，該miRNA表達 略有下降。sj-miR-2和sj-miR-3在尾蚴階段表達水平最高，肝期童蟲階段相對低表達，其 它生活史階段維持在相對中等的恆定水平。 實施例7. miRNA反義寡核苷酸(AS0)對日本血吸蟲生長發育的影響
(1)化學修飾的miRNA反義寡核苷酸(AS0)的合成 為探討鑑定到的血吸蟲miRNA功能，本發明人合成化學修飾的miRNAASO，轉染血 吸蟲，分析其對血吸蟲生長發育變化。本發明人設計了核酸鎖(LNA)修飾的miRNA ASO。其 中sj-miR-1至sj-miR-5的反義寡核苷酸如下 l)sj-miR-l反義寡核苷酸5'ACCACACAACGAACTACCTCC 3' (SEQ IDNO :11);
2)sj-miR-2反義寡核苷酸5'TCTCACTACCATCGTCTTTCA 3' (SEQ ID NO :12)
3)sj-miR-3反義寡核苷酸5'ACCAGCTTTAATCGCGATCTCA 3' (SEQ IDNO :13)
4)sj-miR-4反義寡核苷酸5， GACAATCAAAGGGTCTCAGGGA 3' (SEQ IDNO :14)
5)sj-miR-5反義寡核苷酸5， GAGCAATTATCAGTCTCAGGGA 3' (SEQ IDNO :15)。
上述反義寡核苷酸與對應的成熟miRNA完全配對，每隔3個鹼基以LNA修飾。由 於LNA和DNA/RNA化學結構完全一致，可用氨基磷酸法在DNA自動合成儀上合成，通過高效 液相色譜(HPLC)純化獲得。LNA-ASO-s j-miR-1至LNA-ASO-s j-miR-5 (統稱為miRNA ASO) 序列分別為 LNA-ASO-s j-miR-l ， 5' -accAcamCaamCgaActAccTcc_3';
LNA-AS0-sj-miR-2，5' -tctmCacTacmCatmCgtmCttTca-3';
LNA-ASO-s j-mi R_3， 5' -acmCagmCttTaaTcgmCgaTctmCa-3，。 同時本發明人設計了與LNA-ASO-sj-miR-2序列三個鹼基突變(mutation)的對 照LNA-ASO-s j-miR-2-3M，其序列為5'-tctmCacTacAatActmCttTca-3'。大寫為LNA，小寫為 DNA， mC為甲基化胞嘧啶。為增加合成的miRNA ASO穩定性，可進一步硫代修飾(PS)磷酸 二酯鍵骨架。 硫代修飾方法寡核苷酸合成時，每合成一個磷酸二酯鍵即用硫化劑四乙基秋藍
姆(tetraethylthiorame)等進行硫化。 一般情況下，硫代修飾寡核苷酸序列兩端的各一個
鹼基，必要時全部鹼基給予硫代修飾。 (2)化學修飾的miRNA ASO轉染效應分析 a)肝期童蟲電轉染 尾蚴感染小鼠約14天後，將小鼠脫臼處死，以滅菌的生理鹽水灌注法取肝期童 蟲。以RPMI1640無血清培養基洗滌2次後，取約100條童蟲至200iil含終濃度為2uM miRNA ASO的RPMI1640無血清培養基，並轉移至4mm電極杯中。採用Bio-Rad的Gen印luser Xcell 電轉儀，按以下條件進行電轉化125V電壓矩形波，20ms，電擊一次。電轉結束後，將血吸蟲 童蟲轉移到6孔板，補充培養液至2ml，其中含青鏈黴素雙抗及10%胎牛血清，並補加miRNA ASO至終濃度為2uM，連續培養3天。培養結束後，吸棄培養液，用生理鹽水洗滌童吸蟲3次， 然後加入Trizol，收集RNA。然後以莖環real-time PCR分析miRNA表達豐度變化。
結果如圖6所示，化學修飾的A S 0轉染對血吸蟲對應耙m i RNA表達具明顯抑 制效應。與對照組比較，LNA-ASO-sj-miR-1轉染後使得sj-miR-1靶下調表達18. 9倍 (P = 0. 014) ， LNA-ASO-s j-mi R-2轉染後使sj-miR-2下調表達2. 8倍(P = 0. 028)，LNA-AS0-s j-miR-3轉染後使s j-miR-3下調表達12. 6倍(P = 0. 041)，而這些ASO的 轉染基本不影響其他miRNA的表達。另外，與LNA-ASO-sj-miR-2存在三個鹼基突變的 LNA-AS0-sj-miR-2-3M比較，LNA-ASO-s j-miR-2幹擾效應是LNA-ASO-s j-miR-2_3M的1. 5 倍(p = o. 084)，這種趨勢說明miRNA ASO的幹擾效應是序列特異性的。同時也提示，中間 區域3個鹼基突變的ASO可能尚不能完全消除與靶miRNA結合的能力。
b)尾蚴浸泡轉染 上述的結果表明，miRNA ASO轉染血吸蟲後能下調其對應miRNA的表達。血吸蟲 不同發育階段miRNA表達分析表明，本發明人檢測的三條miRNA除sj-miR-1夕卜，sj-miR-2 和sj-miR-3在尾蚴階段特異高表達。為此，將三條LNA修飾的miRNA ASO以通用的浸泡方 式轉染尾蚴，若具有推測的幹擾效應，則血吸蟲的生長發育應受到影響，比較分析這些幹預 組成蟲數量及病變嚴重程度，即可初步了解這些miRNA對血吸蟲生長發育的影響。
新釋放的尾呦分別浸泡於含2uM LNA修飾的sj-miR-l、sj-miR-2、sj-miR-2-3M及 sj-miR-3 ASO的去氯水，作用4hr後，分別取30條尾蚴感染BALB/c小鼠，10隻/組。於感 染42天後，肝門靜脈灌注法衝蟲，收穫成蟲並計數。計算實驗組減蟲率。計算公式為減 蟲率(％)=[(對照組回收蟲體平均數-幹預組回收蟲體平均數)/對照組回收蟲體平均 數]X100%。 實驗結果表明，sj-miR-2 ASO幹預組具顯著的減蟲效果，減蟲率為29%-40% 。這 一結果表明，該miRNA與日本血吸蟲生長發育相關。 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。序列表〈110〉同濟大學〈120〉日本血吸蟲miRNA及其應用〈130>087221〈160>29〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>21〈212>RNA〈213>日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)〈400>1gg鄉img皿cg皿gugugg u〈210>2〈211>21〈212>RNA〈213>日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)〈400>2
ug朋3g3cga uggimgugag a 21 〈210>3 〈211〉22 〈212>RNA 日本血吸蟲(Schistosoma japonicum) 〈400>3 ugagaucgcg auimaagcug gu 22 〈210>4 22 〈212>RNA 〈213〉日本血吸蟲(Schistosoma japonicum) 〈400>4 ucccugagac ccu皿ga皿g uc 22 〈210>5 〈211>22 〈212>RNA 日本血吸蟲(Schistosoma japonicum) 〈400>5 ucccugagac ugauaa皿gc uc 22 〈210>6 74 〈212>RNA 〈213>日本血吸蟲(Schistosoma japonicum) 〈400>6 uggg3ggimg uucguugugu gguuugcuim uimEi肌ugEiu cu1m3g肌g3 ccaimc肌cc 60gacuggcuuu ccca 74 〈210>7 〈211>80 〈212>RNA 〈213>日本血吸蟲(Schistosoma japonicum) 〈400>7 gugauacimg ugcuguga朋 gacgauggim gugagaugcc 3guugcaucu cgcuuccccg 60 ccuuucccgg uaagaaucac 80 〈210>8 〈211>81
15
〈212>RNA 〈213〉日本血吸蟲(Schistosoma japonicum) 〈400>8 aagucggcuu uuauugcgcu cugagaaaaa ccaauucauu gcuuuuuuuu auuuaucuga 60 gaucgcgauu 3a3gcugguu u
81 〈210>9 〈211>84 RNA 〈213〉日本血吸蟲(Schistosoma japonicum) 〈400>9 gcucccugag acccuuugmi ugucucguim 肌cau肌uuc imimuguu朋 augimaucag 60 gcagccaaag ugacucaggu gugc 84 〈210〉10 〈211>78 〈212>RNA 日本血吸蟲(Schistosoma japonicum) 10 3ucccugag3 cugmmauug cucimguimu imuaucauim augaguuimc 肌u肌gggca 60 ￡iuu￡iuuauuc ucaggugu 78 〈210〉11 〈211>21 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈221>misc—feature 〈223>寡核苷酸 11 accacacaac gaactacctc c 21 〈210>12 〈211>21 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈221>misc_feature 〈223〉寡核苷酸
tctcactacc atcgtctttc〈210>13〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列13accagcttta atcgcgatct〈210〉14〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221〉mi sc_feature〈223〉寡核苷酸〈400〉14gacaatc肪3 gggtctcagg〈210〉15〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈22l〉misc—feature〈223〉寡核苷酸〈400〉15gagc肌ttet cagtctcaggg￡l〈210〉16〈211〉17〈212〉DNA〈213〉人工序列〈22l〉misc_feature〈223>寡核苷酸〈400〉163cugtaggca ccatc朋〈210〉17〈211〉17〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221〉mi sc_feature
i兌明 書 15/18頁
21
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17〈223〉寡核苷酸〈400>17atcgtaggc3 ccug朋a17〈210〉18〈211〉15〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221〉mi sc—feature〈223〉寡核苷酸19〈211〉17〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉寡核苷酸〈400〉193tcgt3ggc3 cctgaem17〈210>20〈211>17<212〉DNA〈213〉人工序列44〈212>DNA〈213〉人工序列〈221〉misc_feature〈223〉寡核苷酸〈400>21ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattcagttgagacc3 caca 44〈210〉22〈221>misc_feature〈223〉寡核苷酸〈400>22acactccagc tgggggaggtagttcgttg29〈210>23〈211>44〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉寡核苷酸〈400>23ctcaactggt gtcgtggagtcggcaattcagttgagctcactec44〈210>24〈211>28〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉寡核苷酸〈400>24acactccagc tgggtgaaag acgatggt28〈210>25〈211>44〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉寡核苷酸〈400>25ctcaactggt gtcgtggagtcggcaattcagttgagaccagctt44〈210>26〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈223〉寡核苷酸〈400>26acactccagc tgggtgagatcgcgatte朋30〈210>27〈211>21〈212>DNA
〈213〉人工序列 misc_feature 〈223〉寡核苷酸 〈400〉27 ctggtgtcgt ggagtcggca a 21 28 〈211>23 〈212>DNA 〈213〉人工序列 misc_feature 〈223〉寡核苷酸 〈400>28 gtacatgttg gtcaagctgg tgt 23 29 〈211>24 〈212>DNA 〈213>人工序列 misc_feature 〈223〉寡核苷酸 〈400>29 agttcgcact tcatccacta cagt 2權利要求
一種分離的miRNA，其特徵在於，所述的miRNA選自(i)序列如SEQ ID NOn所示的miRNA，其中n為選自1-5的正整數；或(ii)與SEQ ID NOn所示序列互補的miRNA。
2. 如權利要求1所述的miRNA，其特徵在於，所述的miRNA分離自血吸蟲。
3. —種分離的前體miRNA，其特徵在於，所述的前體miRNA選自(A) 序列如SEQ ID NO :(n+5)所示的前體miRNA，所述的前體miRNA可在血吸蟲細胞內 被剪切且表達成如SEQ ID NO :n所示的miRNA，其中n為選自1-5的正整數；或(B) 與SEQ ID N0:(n+5)所示序列互補的前體miRNA。
4. 權利要求l所述的miRNA的反義寡核苷酸，所述的反義寡核苷酸選自(a) 序列如SEQ ID NO : (n+10)所示的寡核苷酸，其中n為選白1_5的正整數；或(b) 與SEQ ID NO: (n+10)所示序列互補的寡核苷酸。
5. 如權利要求4所述的反義寡核苷酸，其特徵在於，所述的寡核苷酸是核酸鎖修飾的 寡核苷酸.
6. 如權利要求4所述的反義寡核苷酸，其特徵在於，所述的寡核苷酸是硫代修飾磷酸 二酯鍵骨架的寡核苷酸；或者所述的寡核苷酸是2'-核糖甲乙氧基、甲氧基、甲基或氟嘧啶 修飾的寡核苷酸。
7. —種分離的多核苷酸，其特徵在於，所述的多核苷酸能被血吸蟲細胞轉錄成前體 miRNA，所述的前體miRNA能在血吸蟲細胞內被剪切且表達成如SEQID NO :n所示的miRNA， 其中n為選白l-5的正整數。
8. 權利要求4-6任一所述的反義寡核苷酸的用途，用於製備抑制血吸蟲生長發育的組 合物。
9. 一種抑制血吸蟲生長發育的組合物，其特徵在於，所述的組合物含有有效量的權利 要求4所述的反義寡核苷酸；以及藥學上可接受的載體。
10. —種抑制血吸蟲生長發育的方法，其特徵在於，所述的方法包括給予血吸蟲或感 染血吸蟲的宿主有效量的權利要求4所述的反義寡核苷酸。
全文摘要
本發明關於日本血吸蟲miRNA。本發明首次從血吸蟲中分離獲得一類新的miRNA，這些miRNA在血吸蟲生活史中的表達具期特異性特點。血吸蟲感染階段的尾蚴轉染修飾的miRNA的反義寡核苷酸，能影響其後續的發育。本發明人提供鑑定到的日本血吸蟲miRNA及其前體序列、調節所述miRNA表達的反義寡核苷酸等在血吸蟲防治中的用途。
文檔編號C12N15/11GK101736003SQ20081020253
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月11日 優先權日2008年11月11日
發明者孫軍, 汪章勳, 潘衛慶, 薛向陽 申請人:同濟大學