具有改變的一氧化碳脫氫酶(CODH)活性的遺傳工程細菌的製作方法

2023-10-11 22:57:54 3

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背景技術：
：某些微生物可以通過使氣體基質發酵而產生燃料，如乙醇；以及其它化學品，如2,3-丁二醇，所述氣體基質包含一氧化碳(co)、二氧化碳(co2)以及氫氣(h2)中的一種或多種。然而，這些燃料和化學品的高效生產可能受到碳基質向不合需要的副產物的轉化或緩慢的微生物生長所限制。因此，仍需要具有改良的產物和/或生長特徵的遺傳工程微生物。技術實現要素：本發明提供了具有改變的一氧化碳脫氫酶(codh)活性的遺傳工程微生物和與其相關的方法。具體來說，本發明提供了一種具有降低或消除的codh1和/或codh2活性的遺傳工程一氧化碳營養型產乙酸細菌。本發明還提供了一種用於產生產物的方法，所述方法是通過在包含co、co2、以及h2中的一種或多種的氣體基質存在下培養所述細菌來實現的。所述細菌可以被修飾以在codh1基因和/或codh2基因中包含至少一個破壞性突變，這使得codh1和/或codh2活性降低或消除。確切地說，所述一個或多個破壞性突變可以減少或消除codh1基因和/或codh2基因的表達。在一個實施方案中，所述破壞性突變是基因敲除突變。此外，所述細菌可以被修飾以具有提高的codh/acs活性。在一個實施方案中，所述細菌可以過表達codh/acs基因，這使得codh/acs活性提高。所述細菌可以產生許多產物或副產物，包括乙醇、2,3-丁二醇、乙酸鹽、和/或乳酸鹽。在一個優選的實施方案中，所述細菌產生乙醇和2,3-丁二醇中的一種或多種。與親本細菌相比，所述細菌還可以具有改變的生長特徵，如縮短的遲緩期或提高的生長速率。優選地，與親本細菌相比，所述細菌產生更高量的乙醇；產生更高量的2,3-丁二醇；產生更低量的乙酸鹽；具有更短的遲緩期；和/或具有更高的生長速率。所述細菌一般消耗氣體基質，如包含co、co2、以及h2中的一種或多種的氣體基質。所述氣體基質可以源自於例如合成氣或工業過程。在一個優選的實施方案中，所述細菌衍生自自產乙醇梭菌(clostridiumautoethanogenum)、揚氏梭菌(clostridiumljungdahlii)或拉氏梭菌(clostridiumragsdalei)的親本細菌。附圖說明圖1a-1d是示出了codh1突變株(三角形)、codh2突變株(十字形)、以及野生型自產乙醇梭菌dsm10061(圓圈)依靠30psico的生長和代謝物特徵的圖表。具體來說，圖1a示出了生長，圖1b示出了乙醇產生，圖1c示出了乙酸鹽產生，並且圖1d示出了2,3-丁二醇產生。n＝3。誤差棒＝平均值的標準誤差。圖2a-2c是示出了codh1突變株(三角形)和野生型自產乙醇梭菌dsm10061(圓圈)依靠鋼廠氣的生長和代謝物特徵的圖表。具體來說，圖2a示出了生長，圖2b示出了乙醇產生，並且圖2c示出了乙酸鹽產生。n＝3。誤差棒＝平均值的標準誤差。圖3a-3c是示出了codh1突變株(三角形)、codh2突變株(十字形)、以及野生型自產乙醇梭菌dsm10061(圓圈)在h2+co2條件下的生長和代謝物特徵的圖表。具體來說，圖3a示出了生長，圖3b示出了乙醇產生，並且圖3c示出了乙酸鹽產生。n＝3。誤差棒＝平均值的標準誤差。圖4是示出了pmtl83157-codh/acs的質粒圖譜的示意圖。圖5a-5e是示出了codh/acs過表達對過表達codh/acs(pmtl83157-codh/acs)的自產乙醇梭菌dsm10061(正方形)和質粒對照pmtl83157自產乙醇梭菌dsm10061(圓圈)依靠100％co的生長和代謝物特徵的影響的圖表。具體來說，圖5a示出了生長，圖5b示出了乙酸鹽產生，圖5c示出了乙醇產生，圖5c示出了乙醇產生，圖5d示出了2,3-丁二醇產生，並且圖5e示出了乳酸鹽產生。n＝3。誤差棒＝平均值的標準誤差。圖6a-6b是示出了codh/acs失活的自產乙醇梭菌dsm10061(正方形)和野生型自產乙醇梭菌dsm10061(圓圈)的生長的圖表。圖6a示出了codh/acs-ko突變株不能依靠co生長。圖6b示出了codh/acs-ko突變株不能依靠co2+h2生長。圖7a-7d是示出了codh/acs失活對codh/acsko突變株(正方形)、以質粒pmtl83157-codh/acs補充的codh/acsko突變株(三角形)、以及野生型(圓圈)自產乙醇梭菌dsm10061依靠果糖的生長和代謝物特徵的影響的圖表。具體來說，圖7a示出了生長，圖7b示出了乙酸鹽產生，圖7c示出了乙醇產生，並且圖7d示出了2,3-丁二醇產生。圖8是示出了以下的示意圖：codh/acs失活可以防止伍德-揚達爾途徑(wood-ljungdahlpathway)用作在糖酵解期間產生的還原當量的庫(sink)以使得過量的還原當量產生用於產生乙醇和2,3-丁二醇的驅動力。具體實施方式本發明尤其提供了具有改變的一氧化碳脫氫酶(codh)活性的新型遺傳工程微生物和與其相關的方法。codh酶(ec1.2.99.2)是根據以下方程式催化co可逆氧化成co2並且產生還原當量的氧化還原酶：codh的性質是公知的並且已經在各種生物體中被描述，包括一氧化碳營養型產乙酸菌。codh可以被廣泛地分成兩類：(i)來自一氧化碳細菌的需氧cox型mo-cu-secodh，它包含高度保守的鉬活性位點並且使用氧(有時是硝酸鹽)作為末端電子受體；以及(ii)厭氧型ni-codh，它將從co氧化所釋放的電子轉移到多種生理電子受體，包括鐵氧還蛋白、細胞色素、黃素氧還蛋白、紅素氧還蛋白、以及nad(p)+。還原當量然後可以在多個途徑中被利用，包括產乙酸、產甲烷、硫酸鹽還原、產氫、以及金屬還原。o2敏感性ni-codh可以被進一步分成兩組：(i)在co氧化中具有生理功能的單功能codh；以及(ii)作為使co2向co部分的還原與乙醯輔酶a生物合成偶聯的雙功能codh/acs複合物的一部分的codh。自產乙醇梭菌例如能夠使用co作為碳和能量的唯一來源來自養生長。基因組測序揭示了這種產乙酸菌中的三種推定的ni-codh：caethg_3005(codh1)、caethg_3899(codh2)、以及caethg_1620-1621(acsa，它編碼雙功能codh/acs複合物的codh組分)。codh1在推定的4fe-4s鐵氧還蛋白fe-s結合蛋白和鐵氧還蛋白-nad(+)還原酶的上遊遺傳共定位，而codh2似乎是孤兒。類似地，一氧化碳營養型產乙酸菌揚氏梭菌和食一氧化碳梭菌(c.carboxidivorans)也被描述具有三種codh，即一種雙功能codh/acs和兩種另外的單功能codh。此外，在包括揚氏梭菌、拉氏梭菌、艱難梭菌(c.difficile)以及伍氏醋酸桿菌(a.woodii)在內的所有測序的一氧化碳營養型產乙酸菌中至少發現codh1。現有技術一般認為包括codh1和codh2在內的codh參與co利用。舉例來說，us2010/0151543描述了產乙酸梭菌內codh的過表達如何可以增加從合成氣組分到氧化核苷酸輔因子nad+和nadp+的電子流，由此所述核苷酸輔因子(nadh和nadph)然後刺激伍德-揚達爾途徑中中間化合物的產生。然而，本申請的發明人已經驚人地鑑定出破壞一氧化碳營養型產乙酸微生物中的codh1和/或codh2不會對氣體利用有負面影響。實際上，本申請的發明人已經發現破壞一氧化碳營養型產乙酸微生物中的codh1和/或codh2會產生與未修飾的親本微生物相比產生更高量的乙醇、產生更低量的乙酸鹽、具有更短的遲緩期、和/或具有更高的生長速率的微生物。本發明提供了一種具有降低或消除的codh1和/或codh2活性的遺傳工程一氧化碳營養型產乙酸細菌。本發明還提供了一種用於產生產物的方法，所述方法是通過在包含co、co2、以及h2中的一種或多種的氣體基質存在下培養所述細菌來實現的。微生物本發明的微生物是遺傳工程的，即非天然存在的。術語「遺傳修飾」或「遺傳工程化」寬泛地指操作微生物的基因組或核酸。同樣，術語「遺傳工程的」指的是包含操作的基因組或核酸的微生物。遺傳修飾的方法包括例如異源基因表達、基因或啟動子插入或缺失、核酸突變、改變的基因表達或失活、酶工程化、定向進化、基於知識的設計、隨機誘變方法、基因改組、以及密碼子優化。「微生物」是微觀生物體，特別是細菌、古菌、病毒、或真菌。本發明的微生物通常是細菌。如本文所用的表述「微生物」應當被認為涵蓋「細菌」。「親本微生物」是用於產生本發明的微生物的微生物。親本微生物可以是天然存在的微生物(即野生型微生物)或先前已經被修飾的微生物(即突變或重組微生物)。本發明的微生物可以被修飾以表達或過表達在親本微生物中不表達或不過表達的一種或多種酶。類似地，本發明的微生物可以被修飾以含有不被親本微生物所含的一個或多個基因。在一個實施方案中，所述親本微生物是自產乙醇梭菌、揚氏梭菌、或拉氏梭菌。在一個優選的實施方案中，所述親本微生物是自產乙醇梭菌lz1561，它以dsmz保藏號dsm23693被保藏。術語「衍生自」表示核酸、蛋白質或微生物是從不同的(例如親本或野生型)核酸、蛋白質或微生物修飾或改造而來，以產生新的核酸、蛋白質或微生物。這些修飾或改造通常包括核酸或基因的插入、缺失、突變、或取代。一般來說，本發明的微生物衍生自親本微生物。在一個實施方案中，本發明的微生物衍生自自產乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌。在一個優選的實施方案中，本發明的微生物衍生自自產乙醇梭菌lz1561，它以dsmz保藏號dsm23693被保藏。本發明的微生物可以基於功能特徵被進一步分類。舉例來說，本發明的微生物可以是或可以衍生自c1固定微生物、厭氧菌、產乙酸菌、產乙醇菌、一氧化碳營養菌、和/或其組合。表1提供了微生物的代表性列表並且標識了它們的功能特徵。1伍氏醋酸桿菌可以由果糖產生乙醇，但是不能由氣體產生乙醇。2已經報導伍氏醋酸桿菌可以依靠co生長，但是方法是有問題的。3尚未研究馬氏梭菌是否可以依靠co生長。4熱醋穆爾氏菌的一種菌株穆爾氏菌屬菌種(moorellasp.)huc22-1已經被報導由氣體產生乙醇。5尚未研究卵形鼠孢菌是否可以依靠co生長。6尚未研究銀醋鼠孢菌是否可以依靠co生長。7尚未研究球形鼠孢菌是否可以依靠co生長。「c1」指的是一碳分子，例如co、co2、ch4、或ch3oh。「c1含氧化合物」指的是還包含至少一個氧原子的一碳分子，例如co、co2、或ch3oh。「c1碳源」指的是用作本發明的微生物的部分或唯一碳源的一碳分子。舉例來說，c1碳源可以包含co、co2、ch4、ch3oh、或ch2o2中的一種或多種。優選地，c1碳源包含co和co2之一或這兩者。「c1固定微生物」是具有由c1碳源產生一種或多種產物的能力的微生物。通常，本發明的微生物是c1固定細菌。在一個優選的實施方案中，本發明的微生物衍生自表1中所標識的c1固定微生物。「厭氧菌」是不需要氧氣來生長的微生物。如果存在高於一定閾值的氧氣，那麼厭氧菌可能起不利反應或甚至死亡。通常，本發明的微生物是厭氧菌。在一個優選的實施方案中，本發明的微生物衍生自表1中所標識的厭氧菌。「產乙酸菌」是產生或能夠產生乙酸鹽(或乙酸)作為厭氧呼吸產物的微生物。通常，產乙酸菌是專性厭氧細菌，它們使用伍德-揚達爾途徑作為它們用於能量保存以及合成乙醯輔酶a和乙醯輔酶a衍生產物，如乙酸鹽的主要機制(ragsdale,biochimbiophysacta,1784:1873-1898,2008)。產乙酸菌使用乙醯輔酶a途徑作為(1)從co2還原性合成乙醯輔酶a的機制；(2)末端電子接受、能量保存過程；(3)在細胞碳的合成中固定(同化)co2的機制(drake,《產乙酸原核生物(acetogenicprokaryotes)》,《原核生物(theprokaryotes)》,第3版,第354頁,紐約州紐約(newyork,ny),2006)。所有天然存在的產乙酸菌均是c1固定的、厭氧的、自養的、以及非甲烷營養的。通常，本發明的微生物是產乙酸菌。在一個優選的實施方案中，本發明的微生物衍生自表1中所標識的產乙酸菌。「產乙醇菌」是產生或能夠產生乙醇的微生物。通常，本發明的微生物是產乙醇菌。在一個優選的實施方案中，本發明的微生物衍生自表1中所標識的產乙醇菌。「自養菌」是能夠在不存在有機碳的情況下生長的微生物。相反，自養菌使用無機碳源，如co和/或co2。通常，本發明的微生物是自養菌。在一個優選的實施方案中，本發明的微生物衍生自表1中所標識的自養菌。「一氧化碳營養菌」是能夠利用co作為唯一碳源的微生物。通常，本發明的微生物是一氧化碳營養菌。在一個優選的實施方案中，本發明的微生物衍生自表1中所標識的一氧化碳營養菌。更廣泛來說，本發明的微生物可以衍生自表1中所標識的任何屬或菌種。在一個優選的實施方案中，本發明的微生物衍生自包括菌種自產乙醇梭菌、揚氏梭菌、以及拉氏梭菌的梭菌屬(clostridia)的集群。這些菌種是由abrini,archmicrobiol,161:345-351,1994(自產乙醇梭菌)；tanner,intjsystembacteriol,43:232-236,1993(揚氏梭菌)；以及huhnke,wo2008/028055(拉氏梭菌)首先報導並且表徵的。這三種菌種具有許多相似性。具體來說，這些菌種均是梭菌屬的c1固定的、厭氧的、產乙酸型、產乙醇型、以及一氧化碳營養型成員。這些菌種具有相似的基因型和表型以及能量保存和發酵代謝的模式。此外，這些菌種聚集在具有大於99％同一的16srrnadna的梭菌rrna同源組i中；具有約22mol％-30mol％的dnag+c含量；是革蘭氏陽性的；具有相似的形態和尺寸(0.5-0.7×3-5μm的對數生長細胞)；是嗜溫的(在30℃-37℃最佳生長)；具有約4-7.5的相似的ph值範圍(最佳ph值是約5.5-6)；缺乏細胞色素；並且經由rnf複合物保存能量。此外，已經證實在這些菌種中羧酸被還原成它們相應的醇(perez,biotechnolbioeng,110:1066-1077,2012)。重要的是，這些菌種還均顯示出依靠含co氣體的強自養生長，產生乙醇和乙酸鹽(或乙酸)作為主要發酵產物，並且在某些條件下產生少量的2,3-丁二醇和乳酸。然而，這三種菌種也具有許多差異。這些菌種是從不同的來源分離的：自產乙醇梭菌來自兔腸道，揚氏梭菌來自雞舍廢物，並且拉氏梭菌來自淡水沉積物。這些菌種在對各種糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽)、胺基酸(例如精氨酸、組氨酸)、以及其它基質(例如甜菜鹼、丁醇)的利用率方面有所不同。此外，這些菌種在對某些維生素(例如硫胺素、生物素)的營養缺陷方面有所不同。這些菌種在伍德-揚達爾途徑基因和蛋白質的核酸序列和胺基酸序列上具有差異，儘管已經發現這些基因和蛋白質的一般組織和數量在所有菌種中是相同的(curropinbiotechnol,22:320-325,2011)。因此，綜上所述，自產乙醇梭菌、揚氏梭菌、或拉氏梭菌的特徵中有許多不是該菌種特有的，而相反是梭菌屬的這一群c1固定的、厭氧的、產乙酸型、產乙醇型、以及一氧化碳營養型成員的一般特徵。然而，由於這些菌種實際上是不同的，因此對這些菌種之一的遺傳修飾或操作在這些菌種中的另一種中可能沒有相同的效果。舉例來說，可以觀測到生長、性能、或產物產生的差異。本發明的微生物還可以衍生自自產乙醇梭菌、揚氏梭菌、或拉氏梭菌的分離株或突變株。自產乙醇梭菌的分離株和突變株包括ja1-1(dsm10061)(abrini,archmicrobiol,161:345-351,1994)、lbs1560(dsm19630)(wo2009/064200)、以及lz1561(dsm23693)。揚氏梭菌的分離株和突變株包括atcc49587(tanner,intjsystbacteriol,43:232-236,1993)、petct(dsm13528、atcc55383)、eri-2(atcc55380)(us5,593,886)、c-01(atcc55988)(us6,368,819)、o-52(atcc55989)(us6,368,819)、以及ota-1(tirado-acevedo,《使用揚氏梭菌從合成氣體產生生物乙醇(productionofbioethanolfromsynthesisgasusingc.ljungdahlii)》,phdthesis,北卡羅來納州立大學(northcarolinastateuniversity),2010)。拉氏梭菌的分離株和突變株包括pi1(atccbaa-622、atccpta-7826)(wo2008/028055)。酶「codh1」指的是根據以下方程式催化co可逆氧化成co2並且產生還原當量的codh：在本文提到「codh1」時，應當被認為包括提到其功能上等同的變體。codh1可以是例如自產乙醇梭菌(seqidno:1)、拉氏梭菌(seqidno:5)、揚氏梭菌(adk13979.1)、艱難梭菌(yp_001086644.1)、或伍氏醋酸桿菌(yp_005269573)的codh1。「codh2」指的是根據以下方程式催化co可逆氧化成co2並且產生還原當量的codh：在本文提到「codh2」時，應當被認為包括提到其功能上等同的變體。codh2可以是例如自產乙醇梭菌(seqidno:3)、拉氏梭菌(seqidno:7)、揚氏梭菌(adk14854.1)、糞味梭菌(seqidno:9)、丙酮丁醇梭菌(c.acetobutylicum)(aak78101.1和aak80452.1)、食一氧化碳梭菌「p7」(zp_05390164.1)、生氫氧化碳嗜熱菌(c.hydrogenoformans)(abb14220.1、abb14432.1以及abb15066.1)、或拜氏梭菌(c.beijerinckii)(yp_001310115.1)的codh2。此外，codh2同源物可以存在於肉毒梭菌(c.botulinum)(cbo_2218；a5i3y9)中，但是不存在於產氣莢膜梭菌(c.perfringens)、熱纖梭菌(c.thermocellum)、巴氏梭菌(c.pasteurianum)、或克氏梭菌(c.kluyveri)中。雙功能「codh/acs」是產乙酸細菌獨有的並且除了co的可逆氧化之外，還催化從co、甲基、以及輔酶a合成乙醯輔酶a。codh/acs酶複合物由多個亞基組成：codh亞基(acsa)；acs亞基(acsb)；類咕啉鐵硫蛋白大亞基(acsc)；類咕啉鐵硫蛋白小亞基(acsd)；甲基轉移酶亞基(acse)；以及codh輔助蛋白(cooc)。本申請的發明人已經發現提高codh/acs的活性水平會提高生長和/或產物形成。驚人的是，codh/acs複合物的單個codh亞基的過表達足以提高複合物的活性。codh/acs的acsb亞基可以是例如自產乙醇梭菌(caethg_1608基因、wp_023162339.1蛋白質)、揚氏梭菌(clju_c37550基因、wp_013240359.1蛋白質)、拉氏梭菌(hq876032.1基因、aei90761.1蛋白質)、食一氧化碳梭菌(ccar3245基因、wp_007061841.1)、糞味梭菌(wp_029162953.1蛋白質)、艱難梭菌(cd0728基因、wp_021369307.1蛋白質)、以及伍氏醋酸桿菌(awo_c10760基因、wp_014357691.1蛋白質)的acsb。codh/acs的acsc亞基可以是例如自產乙醇梭菌(caethg_1610基因、wp_023162341.1蛋白質)、揚氏梭菌(clju_c37570基因、wp_013240361.1蛋白質)、拉氏梭菌(hq876032.1基因、aei90763.1蛋白質)、食一氧化碳梭菌(ccar3247基因、wp_007061843.1蛋白質)、糞味梭菌(wp_029162955.1蛋白質)、艱難梭菌(cd0730基因、wp_021369309.1蛋白質)、或伍氏醋酸桿菌(awo_c10720基因、wp_014357687.1蛋白質)的acsc。codh/acs的acsd亞基可以是例如自產乙醇梭菌(caethg_1611基因、wp_023162342.1蛋白質)、揚氏梭菌(clju_c37580基因、wp_013240362.1蛋白質)、拉氏梭菌(hq876032.1基因、aei90764.1蛋白質)、食一氧化碳梭菌(ccar3248基因、wp_007061844.1蛋白質)、糞味梭菌(wp_029162956.1蛋白質)、艱難梭菌(cd0731基因、wp_021369310.1蛋白質)、或伍氏醋酸桿菌(awo_c10710基因、wp_014357686.1蛋白質)的acsd。codh/acs的acse亞基可以是例如自產乙醇梭菌(caethg_1609基因、wp_023162340.1蛋白質)、揚氏梭菌(clju_c37560基因、wp_013240360.1蛋白質)、拉氏梭菌(hq876032.1基因、aei90762.1蛋白質)、食一氧化碳梭菌(ccar3246基因、wp_007061842.1蛋白質)、糞味梭菌(wp_029162954.1蛋白質)、艱難梭菌(cd0729基因、wp_021369308.1蛋白質)、或伍氏醋酸桿菌(awo_c10730基因、wp_014357688.1蛋白質)的acse。codh/acs的cooc輔助蛋白可以是例如自產乙醇梭菌(caethg_1612基因、wp_023162343.1蛋白質)、揚氏梭菌(clju_c37590基因、wp_013240363.1蛋白質)、拉氏梭菌(hq876032.1基因、aei90765.1蛋白質)、食一氧化碳梭菌(ccar3249基因、wp_007061845.1蛋白質)、糞味梭菌(wp_029162957.1蛋白質)、艱難梭菌(cd0732基因、wp_021369311.1蛋白質)、或伍氏醋酸桿菌(awo_c10709基因、wp_014357685.1蛋白質)的cooc。提供codh1、codh2、以及codh/acs的序列信息以鑑定適用於本發明的示例性序列並且允許本領域技術人員在沒有過度實驗的情況下實施本發明的具體實施方案。應當了解的是，codh1、codh2以及codh/acs的核酸序列和胺基酸序列可以隨微生物而不同。因此，本發明不應當被視為限於這些具體序列和實施方案，而是延及本文所提到的任何具體codh1、codh2、或codh/acs的功能上等同的變體，包括其它菌株和菌種中的同源物。術語「變體」包括序列不同於參考核酸和蛋白質的序列，如現有技術中所公開的或本文所舉例說明的參考核酸和蛋白質的序列的核酸和蛋白質。本發明可以使用與參考核酸或蛋白質發揮基本上相同功能的變體核酸或蛋白質來實施。舉例來說，變體蛋白質可以與參考蛋白質發揮基本上相同的功能或催化基本上相同的反應。變體基因可以與參考基因編碼相同的或基本上相同的蛋白質。變體啟動子可以與參考啟動子具有基本上相同的促進一個或多個基因表達的能力。這樣的核酸或蛋白質在本文可以被稱為「功能上等同的變體」。舉例來說，核酸的功能上等同的變體可以包括等位基因變體、基因的片段、突變基因、多態性等。來自其它微生物的同源基因也是功能上等同的變體的實例。這些包括諸如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、或揚氏梭菌的菌種中的同源基因，這些基因的細節可在諸如基因庫(genbank)或ncbi的網站上公開獲得。功能上等同的變體還包括序列由於針對特定微生物所進行的密碼子優化而變化的核酸。核酸的功能上等同的變體將優選地與參考核酸具有至少約70％、約80％、約85％、約90％、約95％、約98％、或更大的核酸序列同一性(同源性百分比)。蛋白質的功能上等同的變體將優選地與參考蛋白質具有至少約70％、約80％、約85％、約90％、約95％、約98％、或更大的胺基酸同一性(同源性百分比)。變體核酸或蛋白質的功能等同性可以使用本領域已知的任何方法來評價。舉例來說，用於評估codh1、codh2、codh/acs以及其變體的活性的酶測定法包括進行codh的厭氧純化，繼而使用甲基紫精作為電子受體，分光光度測量在604nm處吸光度的變化(ragsdale,jbiolchem,258:2364-2369,1983)。本發明的微生物具有改變的codh1、codh2、和/或codh/acs活性。「酶活性」或簡稱「活性」廣泛地指酶活性，包括但不限於酶的活性、酶的量、或酶催化反應的可用性。因此，「提高」酶活性包括提高酶的活性、提高酶的量、或提高酶催化反應的可用性。類似地，「降低」或「減少」酶活性包括降低酶的活性、降低酶的量、或降低酶催化反應的可用性。在一個實施方案中，codh1和/或codh2的功能或活性降低。在另一個實施方案中，codh1和/或codh2的功能或活性被消除或基本上被消除。在另一個實施方案中，codh/acs的功能或活性提高。在一個相關實施方案中，codh/acs的一個或多個亞基或輔助蛋白的功能或活性提高，特別是codh亞基的功能或活性。作為一種方法，酶活性的變化可以通過使編碼蛋白質的基因突變來實現。「突變」指的是在本發明的微生物中與作為本發明的微生物的來源的野生型微生物或親本微生物相比已經被修飾的核酸或蛋白質。在一個實施方案中，所述突變可以是編碼酶的基因中的缺失、插入、或取代。在另一個實施方案中，所述突變可以是酶中一個或多個胺基酸的缺失、插入或取代。具體來說，「破壞性突變」是減少或消除(即「破壞」)基因或酶的表達或活性的突變。破壞性突變可以使基因或酶部分失活、完全失活、或缺失。破壞性突變可以是基因敲除(ko)突變，由此使得基因或蛋白質不起作用。破壞性突變可以是減少、防止、或阻斷由酶產生的產物的生物合成的任何突變。破壞性突變可以包括例如編碼酶的基因中的突變、參與編碼酶的基因的表達的遺傳調節元件中的突變、產生減少或抑制酶活性的蛋白質的核酸的引入、或抑制酶表達的核酸(例如反義rna、sirna、crispr)或蛋白質的引入。本發明的微生物通常在codh1基因和/或codh2基因中包含至少一個破壞性突變。與親本微生物相比，這樣的突變可以降低或消除codh1基因和/或codh2基因的表達。可以使用本領域已知的任何方法來引入破壞性突變。具體來說，可以通過將外來dna靶向插入到編碼序列中來使基因永久失活以引入破壞性突變。可以使用被稱為clostron的遺傳工具來將內含子(1.8kb)穩定插入到指定的基因座中。確切地說，clostron利用來自乳酸乳球菌(l.lactis)的移動ii型內含子ll.ltrb經由rna介導的反轉錄歸巢(retro-homing)機制來繁殖到指定位點中的特異性(heap,jmicrobiolmeth,80:49-55,2010)。另一種方法涉及轉移具有同源臂的質粒以通過利用同源重組使部分或全部基因永久缺失。舉例來說，可以使用被稱作「ace」或等位基因偶聯交換的遺傳方法(heap,nuclacidsres,40:e59,2012)來實現這一缺失而不依賴於使用反向選擇標記。在一些實施方案中，本發明的微生物具有提高的codh/acs活性與降低或消除的codh1和/或codh2活性的組合。具體來說，所述微生物可以過表達codh/acs基因。在本文，「codh/acs基因」指的是編碼codh/acs酶複合物的任何亞基或輔助蛋白的任何基因。在一個優選的實施方案中，所述微生物表達編碼codh/acs酶複合物的codh亞基的基因。「過表達」指的是在本發明的微生物中與作為本發明的微生物的來源的野生型微生物或親本微生物相比核酸或蛋白質的表達增加。過表達可以通過本領域已知的任何手段來實現，包括改變基因拷貝數、基因轉錄速率、基因翻譯速率、或酶降解速率。可以使用本領域已知的任何方法將核酸遞送到本發明的微生物中。舉例來說，核酸可以作為裸核酸被遞送或可以用一種或多種試劑，如脂質體來配製。在適當時，核酸可以是dna、rna、cdna或其組合。在某些實施方案中可以使用限制性酶切抑制劑。另外的載體可以包括質粒、病毒、噬菌體、粘粒、以及人工染色體。在一個優選的實施方案中，使用質粒將核酸遞送到本發明的微生物中。舉例來說，可以通過電穿孔、超聲處理、聚乙二醇介導的轉化、化學或自然感受態、原生質體轉化、原噬菌體誘導或綴合來實現轉化(包括轉導或轉染)。在具有活性限制性內切酶系統的某些實施方案中，可能需要在將核酸引入到微生物中之前將所述核酸甲基化。此外，核酸可以被設計成包含調節元件，如啟動子以提高或以其它方式控制特定核酸的表達。啟動子可以是組成型啟動子或誘導型啟動子。理想的是，所述啟動子是伍德-揚達爾途逕啟動子、鐵氧還蛋白啟動子、丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶啟動子、rnf複合物操縱子啟動子、atp合酶操縱子啟動子、或磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子啟動子。可以對本發明的核酸進行密碼子優化以在特定的菌株或菌種，特別是自產乙醇梭菌(包括自產乙醇梭菌lz1561)、揚氏梭菌或拉氏梭菌中表達。「密碼子優化」指的是核酸，如基因的突變，所述突變用於使所述核酸在特定的菌株或菌種中的翻譯得到優化或改良。密碼子優化可以引起更快的翻譯速率或更高的翻譯準確性。生長和產物本發明的微生物與作為它的來源的親本微生物相比具有改變的生長和/或代謝特徵。舉例來說，與親本微生物相比，所述微生物可以產生更高量的乙醇；產生更高量的2,3-丁二醇；產生更低量的乙酸鹽；具有更短的遲緩期；和/或具有更高的生長速率。本發明的微生物可以具有改變的遲緩期。「遲緩期」或「生長遲緩期」指的是微生物的培養物或群體在接種之後達到早期對數生長期或對數/指數生長期所花費的時間量。在一個實施方案中，所述微生物與親本微生物相比具有更短的遲緩期。舉例來說，所述微生物可以具有比親本微生物的遲緩期短約20％、25％、或30％的遲緩期。在一個實施方案中，所述微生物具有比親本微生物的遲緩期短約25％至30％的遲緩期。在其它實施方案中，所述微生物可以具有為親本微生物的遲緩期的約1/3、1/5、或1/8的遲緩期。在一個實施方案中，所述遲緩期可以比親本微生物的遲緩期短約7.8天至8天。在另一個實施方案中，所述遲緩期可以是約1天-4天或更短或約2.9天或更短。在一些情況下，所述微生物可以比親本微生物具有顯著更短的遲緩期。舉例來說，所述微生物可以具有為親本微生物的遲緩期的約1/10、1/50、1/100或1/200的遲緩期。在一個實施方案中，所述遲緩期可以是約0.1天或更短。本發明的微生物可以具有改變的生長速率。「生長速率」或「生長的速率」指的是微生物的培養物或群體隨時間增加的速率。生長速率在本文通常使用單位h-1來表示。在一個實施方案中，所述微生物與親本微生物相比具有提高或更高的生長速率。舉例來說，所述微生物可以具有比親本微生物的生長速率高約20％、40％、60％、80％、或100％的生長速率。在某些實施方案中，所述微生物具有為親本微生物的生長速率的約2倍、3倍、4倍或5倍的生長速率。本發明的微生物可以產生改變量的生物質。「生物質」指的是由生長或發酵過程產生的微生物的集合群體。在一個實施方案中，與親本微生物的發酵相比，所述微生物的發酵產生增加或更高量的生物質。舉例來說，與親本微生物的發酵相比，所述微生物的發酵可以多產生約20％、30％、40％、50％、80％、100％、120％、150％、180％、200％或220％的生物質。在一個實施方案中，與親本微生物的發酵相比，所述微生物的發酵多產生約200％至220％的生物質。本發明的微生物可以產生改變量的乙醇。在一個實施方案中，與親本微生物相比，所述微生物產生增加或更高量的乙醇。舉例來說，與親本微生物相比，所述微生物可以多產生約15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、或120％的乙醇。在一個實施方案中，與親本微生物相比，所述微生物多產生約20％至113％的乙醇。本發明的微生物可以產生改變量的2,3-丁二醇。在一個實施方案中，與親本微生物相比，所述微生物產生增加或更高量的2,3-丁二醇。舉例來說，與親本微生物相比，所述微生物可以多產生約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、220％、240％、260％、270％、280％、300％、320％、或340％的2,3-丁二醇。在一個實施方案中，與親本微生物相比，所述微生物多產生約220％至230％的2,3-丁二醇。在另一個實施方案中，與親本微生物相比，所述微生物多產生至少約330％的2,3-丁二醇。在另一個實施方案中，與親本微生物相比，所述微生物多產生約300％至330％的2,3-丁二醇。在另一個實施方案中，所述微生物產生約0.5g/l-20g/l的2,3-丁二醇。本發明的微生物可以產生改變量的乙酸鹽。術語「乙酸鹽」包括單獨的乙酸鹽以及分子或游離乙酸和乙酸鹽的混合物這兩者。在一個實施方案中，與親本微生物相比，所述微生物產生降低或更低量的乙酸鹽。舉例來說，與親本微生物相比，所述微生物可以少產生約10％、20％、30％、40％、或50％的乙酸鹽。在一個實施方案中，與親本微生物相比，所述微生物少產生約18％至37％的乙酸鹽。在另一個實施方案中，所述微生物產生約0g/l-5g/l的乙酸鹽。本發明的微生物可以產生改變量的乳酸鹽。在一個實施方案中，與親本微生物相比，所述微生物產生降低或更低量的乳酸鹽。在一個特別優選的實施方案中，與親本微生物相比，本發明的微生物產生增加量的乙醇和/或2,3-丁二醇以及降低量的乙酸鹽。本文所述的微生物和方法可以用於提高發酵過程的效率。「提高效率」、「提高的效率」等包括但不限於提高微生物生長速率、產物產生速率或體積、每單位所消耗的基質體積的產物體積、或產物選擇性。效率可以相對於作為本發明的微生物的來源的親本微生物的性能來測量。本發明的微生物還可以產生一種或多種另外的產物。舉例來說，自產乙醇梭菌產生或可以被工程化以產生乙醇(wo2007/117157)、乙酸鹽(wo2007/117157)、丁醇(wo2008/115080和wo2012/053905)、丁酸鹽(wo2008/115080)、2,3-丁二醇(wo2009/151342)、乳酸鹽(wo2011/112103)、丁烯(wo2012/024522)、丁二烯(wo2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(wo2012/024522和wo2013/185123)、乙烯(wo2012/026833)、丙酮(wo2012/115527)、異丙醇(wo2012/115527)、脂質(wo2013/036147)、3-羥基丙酸鹽(3-hp)(wo2013/180581)、異戊二烯(wo2013/180584)、脂肪酸(wo2013/191567)、2-丁醇(wo2013/185123)、1,2-丙二醇(wo2014/0369152)、以及1-丙醇(wo2014/0369152)。在某些實施方案中，微生物生物質本身可以被認為是產物。本發明還提供了用於產生一種或多種產物，如乙醇和/或2,3-丁二醇的方法，所述方法是通過培養本發明的微生物而實現的。本發明還提供了用於減少來自工業過程的總大氣碳排放的方法，所述方法是通過使用本發明的微生物將工業廢氣中的co、co2和/或h2轉化成有用產物而實現的。基質「基質」指的是本發明的微生物的碳源和/或能量源。通常，所述基質是氣體並且包含c1碳源，例如co、co2、和/或ch4。優選地，所述基質包含co或co+co2的c1碳源。所述基質還可以包含其它非碳組分，如h2、n2或電子。所述基質一般包含至少一定量的co，如約1mol％、2mol％、5mol％、10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％、90mol％、或100mol％的co。所述基質可以包含一定範圍的co，如約20mol％-80mol％、30mol％-70mol％、或40mol％-60mol％的co。優選地，所述基質包含約40mol％-70mol％的co(例如鋼廠氣或高爐氣)、約20mol％-30mol％的co(例如鹼性氧氣轉爐氣)、或約15mol％-45mol％的co(例如合成氣)。在一些實施方案中，所述基質可以包含相對低量的co，如約1mol％-10mol％或1mol％-20mol％的co。本發明的微生物通常將基質中co的至少一部分轉化成產物。在一些實施方案中，所述基質不含或基本上不含co。所述基質可以包含一定量的h2。舉例來說，所述基質可以包含約1mol％、2mol％、5mol％、10mol％、15mol％、20mol％、或30mol％的h2。在一些實施方案中，所述基質可以包含相對高量的h2，如約60mol％、70mol％、80mol％、或90mol％的h2。在另外的實施方案中，所述基質不含或基本上不含h2。富含h2的氣流可以例如經由烴的蒸汽重整，特別是天然氣的蒸汽重整；煤或烴的部分氧化、水的電解、以及來自用於產生氯的電解池和來自煉油廠或化學物流的捕集副產物而產生。所述基質可以包含一定量的co2。舉例來說，所述基質可以包含約1mol％-80mol％或1mol％-30mol％的co2。在一些實施方案中，所述基質可以包含少於約20mol％、15mol％、10mol％、或5mol％的co2。在另一個實施方案中，所述基質不含或基本上不含co2。富含co2的氣流包括例如來自烴燃燒，如天然氣或石油燃燒的廢氣；來自氨、石灰或磷酸鹽生產的副產物；以及天然二氧化碳井。儘管基質通常是氣體，但是所述基質還可以替代形式提供。舉例來說，可以使用微泡分散發生器將基質溶解在用含co氣體飽和的液體中。再舉例來說，可以使基質吸附到固體載體上。所述基質和/或c1碳源可以是作為工業過程的副產物或從某種其它來源，如從汽車尾氣或生物質氣化獲得的廢氣。在某些實施方案中，所述工業過程選自由以下各項組成的組：鐵金屬產品製造(如鋼廠製造)、非鐵產品製造、石油煉製過程、煤氣化、電力生產、炭黑生產、氨生產、甲醇生產、以及焦炭製造。在這些實施方案中，所述基質和/或c1碳源可以在將它排放到大氣中之前，使用任何簡便的方法從工業過程來捕集。所述基質和/或c1碳源可以是合成氣，如通過煤或煉油廠殘渣的氣化、生物質或木質纖維素材料的氣化、或天然氣的重整所獲得的合成氣。在另一個實施方案中，所述合成氣可以由城市固體廢物或工業固體廢物的氣化而獲得。所述基質的組成可能對反應的效率和/或成本具有顯著的影響。舉例來說，氧氣(o2)的存在可能會降低厭氧發酵過程的效率。根據所述基質的組成，可能期望處理、洗滌、或過濾基質以去除任何不希望有的雜質，如毒素、不希望有的組分、或塵粒、和/或增加所期望的組分的濃度。基質和遺傳修飾的影響所述基質的組成可能影響本發明的微生物的生長和/或代謝特徵。舉例來說，與依靠co2+h2生長的微生物相比，依靠co生長的微生物可以具有不同的生長和/或代謝特徵。此外，遺傳修飾的特定組合可能影響本發明的微生物的生長和/或代謝特徵。舉例來說，與在codh2基因中包含破壞性突變的微生物相比，在codh1基因中包含破壞性突變的微生物可以具有不同的生長和/或代謝特徵，與在codh1基因和codh2基因這兩者中包含破壞性突變的微生物相比，所述在codh2基因中包含破壞性突變的微生物可以具有不同的生長和/或代謝特徵。在這些微生物中的任一種中codh/acs的過表達可以進一步改變所述微生物的生長和/或代謝特徵。在策略上組合遺傳修飾並且使微生物依靠特定基質生長可以產生適合於特定應用或生產目標的生長和/或代謝特徵。使codh1基因敲除菌株依靠co生長一般引起生物質產生減少、乙酸鹽產生減少、乙醇產生增加、以及相似的2,3-丁二醇產生。使codh1基因敲除菌株依靠co2+h2生長一般引起遲緩期縮短以及更快的生長。舉例來說，依靠co2+h2生長的codh1基因敲除菌株可以沒有遲緩期並且可以產生約0.4g/l的生物質。使codh2基因敲除菌株依靠co生長一般引起遲緩期縮短、乙醇產生減少、乙酸鹽產生減少、以及增加或相似的2,3-丁二醇產生。舉例來說，依靠co生長的codh2基因敲除菌株可以具有2天-4天的遲緩期並且可以產生約0.1g/l-4g/l的乙酸鹽。使codh2基因敲除菌株依靠co2+h2生長一般引起遲緩期縮短以及更快的生長。舉例來說，依靠co2+h2生長的codh2基因敲除菌株可以具有4天的遲緩期。使codh/acs過表達菌株依靠co生長一般引起遲緩期縮短、乙醇產生增加、相似的乙酸鹽產生、以及乳酸鹽產生增加。發酵通常，在生物反應器中進行培養。術語「生物反應器」包括由一個或多個容器、塔、或管道布置組成的培養/發酵裝置，如連續攪拌釜式反應器(cstr)、固定化細胞反應器(icr)、滴流床反應器(tbr)、鼓泡塔、氣升式發酵罐、靜態混合器、或適用於氣-液接觸的其它容器或其它裝置。在一些實施方案中，所述生物反應器可以包括第一生長反應器和第二培養/發酵反應器。可以將基質提供到這些反應器之一或這兩者中。如本文所用的術語「培養」和「發酵」可互換使用。這些術語涵蓋了培養/發酵過程的生長期和產物生物合成期這兩者。一般將培養物維持在含有足以容許微生物生長的營養素、維生素、和/或礦物質的水性培養基中。優選地，水性培養基是厭氧微生物生長培養基，如基本厭氧微生物生長培養基。合適的培養基是本領域公知的。所述培養/發酵應當理想地在用於產生目標產物的適當條件下進行。通常，所述培養/發酵在厭氧條件下進行。要考慮的反應條件包括壓力(或分壓)、溫度、氣體流速、液體流速、培養基ph值、培養基氧化還原電位、攪拌速率(如果使用連續攪拌釜式反應器的話)、接種物水平、確保液相中的氣體不會成為限制的最大氣體基質濃度、以及避免產物抑制的最大產物濃度。具體來說，可以控制基質的引入速率以確保液相中氣體的濃度不成為限制，這是因為產物可能會在氣體受限的條件下被培養物消耗。在高壓下操作生物反應器允許從氣相向液相的氣體質量傳遞的速率增加。因此，一般優選在高於大氣壓的壓力下進行培養/發酵。而且，由於給定的氣體轉化率部分地隨基質保留時間而變化並且保留時間決定了生物反應器的所需體積，因此使用加壓系統可以大幅減小所需的生物反應器的體積，並且因此減少培養/發酵設備的資金成本。這進而意味著在將生物反應器維持在高壓而不是大氣壓時可以縮短保留時間，所述保留時間被定義為生物反應器中的液體體積除以輸入氣體流速。最佳的反應條件將部分地取決於所使用的具體微生物。然而，一般來說，優選在高於大氣壓的壓力下操作發酵。而且，由於給定的氣體轉化率部分地隨基質保留時間而變化，並且實現所期望的保留時間進而要求生物反應器具有所需的體積，因此使用加壓系統可以大幅減小所需的生物反應器的體積，並且因此減少發酵設備的資金成本。可以使用本領域已知的任何方法或方法的組合從發酵液中分離或純化目標產物，所述方法包括例如分餾、蒸發、全蒸發、氣提、相分離、以及萃取發酵，包括例如液-液萃取。在某些實施方案中，通過連續地從生物反應器中取出一部分發酵液，(方便地通過過濾)從所述發酵液中分離微生物細胞，並且從所述發酵液中回收一種或多種目標產物來從發酵液中回收目標產物。可以例如通過蒸餾回收醇和/或丙酮。可以例如通過吸附在活性炭上來回收酸。優選地將分離的微生物細胞放回生物反應器中。還優選地將在已經去除了目標產物之後剩餘的無細胞滲透物放回生物反應器中。在使所述無細胞滲透物回到生物反應器中之前，可以將另外的營養素(如b族維生素)添加到所述無細胞滲透物中以補充培養基。實施例下列實施例進一步說明了本發明，但是當然，不應當被解釋為以任何方式限制它的範圍。實施例1這個實施例描述了參與自產乙醇梭菌dsm10061中的碳固定的codh1基因和codh2基因的基於ii型內含子的插入失活。自產乙醇梭菌dsm10061是從dsmz(德國布倫瑞克英豪豐大街7b的德國微生物和細胞培養物保藏中心(郵編：38124)(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures,inhoffenstraβe7b,38124braunschweig,germany))獲得的。大腸桿菌綴合菌株ca434是由nigelminton教授(英國的諾丁漢大學(universityofnottingham,uk))友情提供的。自產乙醇梭菌dsm10061的基因組編碼一氧化碳脫氫酶(codh)codh1(seqidno:1和2)和codh2(seqidno:3和4)。使用clostronii型內含子介導的基因破壞工具使這些codh失活(heap,jmicrobiolmeth,80:49-55,2010)。使用在clostron網站上託管的perutka算法來分別鑑定出codh1基因和codh2基因的有義鏈上的鹼基600/601之間和528/529之間的ii型內含子靶位點。使用相同的算法來設計codh1(seqidno:15)和codh2(seqidno:16)的內含子靶向區域，這些區域由dna2.0公司(加利福尼亞州)商業合成並且在ptml007c-e2載體(hq263410.1)中遞送。最終載體pmtl007c-e2-codh1-600！601s和pmtl007c-e2-codh2-528！529s含有反轉錄轉座激活ermb標記(ram)，它在插入到靶位點中時賦予對抗生素克拉黴素(clarithromycin)的抗性。如上文和wo2012/053905中所述將pmtl007c-e2-codh1-600！601s和pmtl007c-e2-codh2-528！529s質粒引入到自產乙醇梭菌dsm10061中。將轉化混合物在ytf瓊脂培養基上點樣並且在厭氧工作站內在37℃孵育。在24小時之後，將細胞刮落並且重懸於500μl的pbs中並且塗鋪在補充有7.5μg/ml的甲碸黴素(thiamphenicol)(西格瑪公司(sigma))的ytf瓊脂培養基上。使用7.5μg/ml的甲碸黴素選擇轉化株。在孵育3天之後觀測到菌落。首先在補充有7.5μg/ml甲碸黴素和10μg/ml甲氧苄啶(trimethoprim)的ytf培養基上，繼而在含有6μg/ml克拉黴素的ytf培養基上依次進行單個菌落的劃線接種。使用側接寡核苷酸，通過pcr(maximepcr預混合試劑盒)針對ii型插入來隨機篩選>8個菌落。使用側接寡核苷酸擴增克拉黴素抗性菌落和凝膠電泳分析顯示存在更大的clostron條帶(>2kb)，而不是更小的野生型條帶(8個菌落。使用側接寡核苷酸擴增克拉黴素抗性菌落以及凝膠電泳分析顯示存在更大的clostron條帶(>2kb)而不是更小的野生型條帶(<520bp)，這表明clostronii型內含子成功插入指定的codh/acs位點中。將這些擴增子使用qiaquickpcr純化試劑盒(快而精公司)純化並且通過桑格測序(英國的sourcebioscience公司)進行序列驗證。作為最終的驗證步驟，對pcr驗證的克隆進行dna印跡分析以確認單一clostron插入。根據bertram,archmicrobiol,151:551-557,1989分離clostron突變株的基因組dna，然後用限制性內切酶hindiii消化所述基因組dna。使用隨機標記的dig探針(羅氏公司)對消化物進行dna印跡分析。使用寡核苷酸ebs2(seqidno:27)和內含子-sali-r1(seqidno:28)以使用質粒pmtl007c-e2作為模板產生探針。所得的探針與ii型內含子雜交。dna印跡分析檢測到每個突變克隆的單個條帶，這表明ii型內含子插入到自產乙醇梭菌dsm10061的基因組中的單個事件。驗證的突變株被稱作codh/acs::ctermb-143s(或「codh/acsko突變株」)。對於補充測定，使過表達質粒pmtl83157-codh/acs綴合到codh/acsko突變株中。因此，codh/acs是為自產乙醇梭菌的自養生長(co或h2+co2)所需的。實施例11這個實施例表明了在果糖上生長的自產乙醇梭菌dsm10061中codh/acs失活的作用。雖然在codh/acs酶失活之後自產乙醇梭菌不能依靠co(圖6a)或co2和h2(圖6b)生長，但是所述菌株仍能在諸如果糖的糖上生長。驚人的是，已發現在這些條件下，codh/acs失活的菌株停止產生乙酸鹽。這是特別驚人的，因為乙酸鹽形成通常是產乙酸菌的一個標誌性特徵。在異養生長期間，產乙酸菌通常在h2存在下在codh/acs和來自伍德-揚達爾途徑(也被稱為還原乙醯輔酶a途徑)的其它基因的作用下將co2(在糖代謝期間產生)固定到生物質和產物中。在n2氣氛下在250ml血清瓶中按一式三份培養codh/acs失活突變株、補充菌株、以及wt自產乙醇梭菌dsm10061，所述血清瓶容納補充有10g/l果糖(最終濃度)的50mlpetc培養基。將0.5od600當量的活性培養物接種到每一個血清瓶中並且收集液相樣品以在600nm的波長下測量od以及通過hplc分析代謝物。codh/acs的失活使峰值od600從4.53的wt水平顯著降低了61％，達到1.77(圖7a)。這還伴有codh/acsko突變株的生長遲緩期延長(圖7a)。在ko突變株中通過pmtl83157-codh/acs的質粒表達補充codh/acs活性使峰值od600增加到3.11並且還使生長遲緩期縮短到更接近wt水平(圖7a)。codh/acsko突變株的一個驚人的特徵是缺乏乙酸鹽產生，這是因為在第2.8天時僅短暫檢測到2.61mm的乙酸鹽(圖7b)。相反，wt在第3.0天時產生多達85.96mm的乙酸鹽(圖7b)。在沒有顯著的乙酸鹽產生的情況下，在codh/acsko突變株中來自果糖的大部分的碳轉向還原產物乙醇和2,3-丁二醇。codh/acs的失活使峰值乙醇水平從48.3mm的wt水平提高了113％，達到102.7mm(圖7c)。此外，codh/acsko突變株的峰值2,3-丁二醇水平也比wt高138％(10.95mm對比4.61mm)(圖7d)。在codh/acsko突變株中補充質粒pmtl83157-codh/acs的表達成功地使乙酸鹽、乙醇、以及2,3-丁二醇水平恢復到更接近wt水平(圖7b-7d)，這確認了codh/acs在自產乙醇梭菌中在異養生長期間的作用。不希望受任何具體理論所束縛，看來codh/acs失活防止伍德-揚達爾途徑用作在糖酵解期間產生的還原當量的庫以使得過量的還原當量產生用於產生乙醇和2,3-丁二醇的驅動力(圖8)。序列說明本文所提到的核酸序列和胺基酸序列簡要匯總如下。本文所引用的包括出版物、專利申請、以及專利在內的所有參考文獻在此以引用的方式併入，該引用的程度就如同每一篇參考文獻被單獨地和具體地指示以引用的方式併入並且在本文整體闡述一般。在本說明書中對任何現有技術的提及不是並且不應當被視作承認該現有技術構成了任何國家在此研究領域中的公知常識的一部分。除非在本文中另外指明或與上下文明顯矛盾，否則在描述本發明的上下文中(特別是在以下權利要求書的上下文中)術語「一個/種(a)」和「一個/種(an)」和「所述」以及類似的指代對象的使用應當被理解為包括單數和複數這兩種形式。除非另外指出，否則術語「包含」、「具有」、「包括」以及「含有」應當被理解為開放性術語(即，意指「包括但不限於」)。除非在本文中另外指明，否則在本文中對值的範圍的表述僅意圖用作單獨提及落入該範圍內的每個單獨值的簡寫方法，並且每個單獨值被併入到本說明書中，如同它在本文中被單獨敘述一般。除非在本文中另外指明或另外與上下文明顯矛盾，否則本文所述的所有方法均可以按照任何合適的順序進行。除非另外要求，否則本文提供的任何和所有實例或示例性語言(例如「如」)的使用僅意圖更好地闡明本發明而不對本發明的範圍構成限制。本說明書中的任何語言不應當被理解成將任何未要求保護的要素指示為對實施本發明來說是必要的。在本文描述了本發明的優選的實施方案。在閱讀上述說明時，那些優選的實施方案的變化方案對於本領域的普通技術人員來說可以變得顯而易見。本申請的發明人期望本領域技術人員在適當時利用這些變化方案，並且本申請的發明人意圖以除本文具體描述的方式之外的方式來實施本發明。因此，本發明包括如由適用法律所允許的所附權利要求書中所敘述的主題的所有改動方案和等同方案。此外，除非本文另外指明或另外與上下文明顯矛盾，否則其所有可能的變化方案中上述要素的任何組合由本發明所涵蓋。序列表朗澤科技紐西蘭有限公司具有改變的一氧化碳脫氫酶（codh）活性的遺傳工程細菌lt105wo162/036,1012014-08-1162/036,1042014-08-1162/036,1072014-08-1136patentin3.5版1626prt自產乙醇梭菌1metserasnasnlysilecyslysseralaasplysvalleuglulys151015pheileglyserleuaspglyvalgluthrserhishisargvalglu202530serglnservallyscysglypheglyglnleuglyvalcyscysarg354045leucysalaasnglyprocysargilethrprolysalaproarggly505560valcysglyalaseralaaspthrmetvalalaargasnpheleuarg65707580alavalalaalaglyserglycystyrilehisilevalgluasnthr859095alaargasnvallysserileglygluthrglyglygluilelysgly100105110metasnalaleuasnthrleualaglulysleuglyilethrgluser115120125aspprohislyslysalavalleuvalalaaspalavalleulysasp130135140leutyrlysprolyspheglulysmetgluvalileasnlysleuala145150155160tyralaproargleugluasntrpasnlysleuasnilemetprogly165170175glyalalyssergluvalpheaspglyvalvallysthrserthrasn180185190leuasnseraspprovalaspmetleuleuasncysleulysleugly195200205ileserthrglyiletyrglyleuthrleuthrasnleuleuasnasp210215220ilevalleuglygluproalaileargproalalysvalglyphelys225230235240valvalaspthrasptyrileasnleumetilethrglyhisglnhis245250255sermetilealahisleuglnglugluleuvallysproglualaval260265270lyslysalaglnalavalglyalalysglyphelysleuvalglycys275280285thrcysvalglyglnaspleuglnleuargglylystyrtyrthrasp290295300valpheserglyhisalaglyasnasnphethrserglualaleuile305310315320alathrglyglyileaspalailevalserglupheasncysthrleu325330335proglyilegluproilealaasplysphemetvallysmetilecys340345350leuaspaspvalserlyslysserasnalaglutyrvalglutyrser355360365phelysaspargglulysileserasnhisvalileaspthralaile370375380glusertyrlysasnargargserlysvalthrmetasnileprolys385390395400asnhisglypheaspaspvalilethrglyvalsergluglyserleu405410415lysserpheleuglyglysertrplysproleuvalaspleuileala420425430alaglylysilelysglyvalalaglyilevalglycysserasnleu435440445thralalysglyhisaspvalphethrvalgluleuthrlysgluleu450455460ilelysargasnileilevalleuseralaglycysserserglygly465470475480leugluasnvalglyleumetserproglyalaalagluleualagly485490495aspserleulysgluvalcyslysserleuglyileproprovalleu500505510asnpheglyprocysleualaileglyargleugluilevalalalys515520525gluleualaglutyrleulysileaspileproglnleuproleuval530535540leuseralaproglntrpleuglugluglnalaleualaaspglyser545550555560pheglyleualaleuglyleuproleuhisleualaileserprophe565570575ileglyglyserlysvalvalthrlysvalleucysgluaspmetglu580585590asnleuthrglyglylysleuileilegluaspaspileilelysala595600605alaasplysleuglugluthrileleualaargarglysserleugly610615620leuasn62521881dna自產乙醇梭菌2atgtcaaataacaaaatttgtaaatcagcagataaggtacttgaaaagtttataggttct60ctagatggtgtagaaacttctcatcatagggtagaaagccaaagtgttaaatgtggtttt120ggtcagctaggagtctgctgtagactctgtgcaaacggtccctgtaggataacacctaaa180gctccaagaggagtatgtggtgctagtgctgataccatggttgcaagaaactttcttaga240gctgtagctgccggcagtggatgttatattcatatagtcgaaaatacagctagaaacgta300aaatccataggtgaaaccggcggcgagataaaaggaatgaatgctctcaatacactggca360gaaaaattaggtataacagaatctgacccacataaaaaagctgtactagtagctgatgcc420gtattaaaggacttatacaaaccaaaatttgaaaaaatggaagttataaataaattagct480tatgcacctagactagaaaattggaacaaattaaatataatgcctggcggtgcaaaatca540gaagtttttgatggtgtagtaaaaacttctacaaatctaaacagtgaccctgtagatatg600cttctaaattgtttaaaacttggaatatccactggaatttatggacttacccttacaaa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