新穎啟動子及包含其之病毒載體的製作方法

2023-06-24 08:44:11

專利名稱：新穎啟動子及包含其之病毒載體的製作方法
技術領域：
本發明系關於一種分離的核酸啟動子及包含其的條件複製型腺病毒載體 (conditionalreplication adenovirus vector,CRAD)。特定而言，分離的核酸啟動子包含 剔除p53反應組件(response element)的人類雙微粒體基因2 (human double minute 2， hdm2) P2啟動子。
背景技術：
癌症為死亡的重要原因。視癌症類型而定，主要以手術、化學治療及/或放射治療 處理。此等治療通常無法成功地以手術去除所有的癌症且可能發生轉移；一些癌症對化學 治療及放射治療具有抗性；及抗化學治療的腫瘤常會擴散。有需要發展單獨使用或結合傳 統技術的新穎療法。一種可能療法為使用表現抗癌蛋白質的病毒載體治療腫瘤。腺病毒載體已被證 明可用於各種基因治療應用，基於腺病毒的載體具有適合於癌症及基因疾病治療的數種特 徵。腺病毒易於在培養基生長且達到安定的高效價病毒液。它們的宿主範圍廣泛，可在大 部分的人類癌症細胞中複製，且可藉位置突變及插入以外來啟動子調控的外來基因而操縱 其基因組。條件複製型腺病毒載體(CRAD)已成為新一類的抗癌劑，其可在腫瘤細胞中選擇 性複製並溶裂他們(1-3)。美國第7，109，029號專利發現一病毒載體，其具有至少一種幹擾 基因組件(interfering genetic element)，包含至少一種轉錄單元，其中至少一個隔絕序 列(insulating sequence)位於5』至該轉錄單元的轉錄起始位置及3』至該幹擾基因組件。 美國第7026164號專利提供E1A/E1B缺陷腺病毒(E1A/E1B deficient adenovirus)生長 的腺病毒包裝細胞株(adenovirus packaging cell lines)，其實質上不含複製型腺病毒 (r印licationcompetent adenoviruses, RCA)。以CRAD為主的癌症治療已進行臨床試驗評 估(4-7)。CRAD的安全性及有效性視相對於正常細胞，腫瘤中的特定病毒複製而定。在正 常細胞，但不在腫瘤細胞，刪除編碼病毒生命周期所需蛋白質的基因是誘導腫瘤專一性病 毒複製溶裂的策略(3)。此策略已用於剔除ElB-55kD的治療性CRAD，其在p53-非功能性 腫瘤細細胞中運用特定細胞病變效果(8，9)。p53基因是已被充分研究且已知的基因之一。 P53在將各種不同刺激(例如，DNA損傷，轉錄或複製的去調控(deregulation)及致癌基因 轉化(oncogene transformation))轉變成細胞生長抑制或凋亡(cell growth arrest or apoptosis)的細胞壓力反應(cellular stress response)中扮演重要角色。P53人類癌 細胞中被去活化。當P53被去活化，不正常的腫瘤細胞無法自細胞族群中去除且能夠增殖。 剔除ElB-55kD的治療性CRAD的實例為0NYX-015 (dl 1520)，其在p53非功能性腫瘤中已顯 示抗腫瘤活性(10，11)。剔除ElB-55kD的腺病毒在具p53wild的細胞中無法有效複製。在 正常細胞中由剔除ElB-55kD的腺病毒誘導的p53表達使得此等細胞對剔除ElB_55kD的腺 病毒的溶裂複製具有抗性。相反地，缺乏P53使腫瘤細胞對剔除ElB-55kD的腺病毒的溶裂 複製不具抗性。
人類ras基因家族由3個成員組成H-ras、K-ras及N_ras基因。此等基因編碼 21kD的相關蛋白質，其位於細胞膜的內側且被認為涉及從細胞表面受體至其細胞內目標的 轉導訊號。腫瘤細胞株及新鮮腫瘤組織的重要部份已被發現具有活化的ras基因。此等基 因的特徵在於誘導細胞的致癌基因轉化(oncogenic transformation) 0在大部分的例子 中分析，活化是由於ras基因的第12或13密碼的點突變導致基因產物的單一胺基酸取代。 RAS的活化突變與許多惡性疾病(包括肺癌及大腸直腸癌，比例分別為約21%及34% )的 腫瘤生成有關(12，13)。亦有許多其它惡性疾病帶有RAS活化突變並呈現升高的RAF活性 (14)。為了延伸CRAD的細胞病變效果至具有活化RAS的腫瘤，可使用採取隔離腫瘤細胞的 P53但留下未影響的帶有p53wild的正常細胞的策略。反常地，已發現剔除ElB-55kD的腺病 毒可在p53wildW瘤細胞中複製(15)。在這些例子中，可能牽涉到p53的負調控因子Hdm2， 由於其被P53轉錄地上調並與p53形成回饋環以去活化p53 (16)。hdm2基因的轉錄可藉 RAS-上調的RAF/MEK/MARK通路以與p53無關的模式打開(17)。由ETSA及AP-1/ETSB組 件組成的 RAS/Raf■訊號級聯反應組件(Ras/Raf singalingcascade-responsive element) 在老鼠雙微粒體基因2 (double minute 2 ；mdm2)P2啟動子被鑑定出來，位於p53反應啟動 子組件的上遊(17，18)。該hdm2 P2啟動子由AP-1/ETSa組成，其為位於mdm2 P2啟動子的 AP-1/ETSB的保守性同源物；然而，不包括位於mdm2 P2啟動子的ETSA的對應物。Hdm2 P2 啟動子的RAS/Raf訊號級聯反應確實發現於人類癌細胞(17)。因此，仍有需要發展有效地在腫瘤中複製及散布的載體，但他們被修飾使得不會 在正常組織中複製。

發明內容
剔除ElB_55kD基因區段(AElB_55kD)的腺病毒，能分解具有p53突變或不 表達P53的腫瘤細胞。然而許多腫瘤細胞具KRAS活化突變(KRASafct)，且表達自然型 p53(p53wild)。為增加AElB-55kD腺病毒對腫瘤分解的應用性，使能分解表達自然型p53的 腫瘤細胞，本發明利用KRAS活化突變去引導human double minute 2 (hdm2)的表達進而中 和自然型P53，而創作一個不拘腫瘤細胞p53突變或不突變的腫瘤分解腺病毒。hdm2的啟 動子含KRAS和p53的調控區段，去除p53調控區段後，本發明提供一個僅受KRASafct調控的 hdm2啟動子-Ap53REP2啟動子，並藉由啟動子報告系統實驗確定了其僅受KRASafct調控的 特異性。將藉由Ap53REP2去調控hdm2表達的系統導入Δ ElB_55kD的腺病毒內而製造出 一種新的受KRASafct調控的腫瘤分解腺病毒-Ad-KRHdm2。本發明的啟動子在一方面，本發明提供一種分離的核酸啟動子，其包括部分或全部的p53反應組 件(p53 response element)被剔除的人類雙微粒體基因2 (hdm2)啟動子。用語「分離的(isolated)」，當用於分子(如啟動子序列)，意指該分子是分離自 與其在體內或在其天然存在狀態結合的至少一種其它化合物，如蛋白質、DNA、RNA或其它汙 染物。因此，當一核酸序列已自與其天然結合的任何其它成分分離時，則被視為分離。用語 「天然存在(naturally occuring) 」或「野生型(wild type) 」被用於描述發現於自然的物 體，與人工製造的不同。例如，存在於生物(包括病毒)中的蛋白質或核苷酸序列，其可分 離自天然來源且其不為人類在實驗室中蓄意修飾，為天然存在。
用語「核酸(nucleicacid)」或「核酸序列(nucleic acid sequence) 」 為一核苷 酸、寡核苷酸、聚核苷酸、或其任何片段。用語「啟動子(promoter) 」為一不轉譯DNA序列，通常位於編碼區域的上遊，其包 含RNA聚合酶II的結合位置並開始DNA的轉錄。啟動子區域亦可包括作為基因表達的調 控子的其它組件。在本發明，啟動子基因是衍生自人類雙微粒體基因2(hdm2)P2啟動子，其中其p53 反應組件被刪除。該hdm2P2啟動子(Δ p53REP2啟動子)含有RAS/RAF通路反應組件(RAS/ RAF pathway response element)及兩個p53 反應組件(p53 response element)。根據本發 明，在 hdm2 P2 啟動子中的 448 至 505 的 DNA 序列(GGT CAAGTTCAGACACGTTCCGA AACTGCAGTA AMGGAGTTA AGTCCTGACT TGTCT ；SEQ ID NO 1)被剔除且該新構築的啟動子稱為 Ap53REP2 啟動子。衍生自Δ p53REP2啟動子的啟動子DNA可藉刪除一部分而被修飾，只要該啟動子 活性具有與Δρ53Ι ΕΡ2啟動子類似的活性。根據本發明的具體實施例，本發明Ap53REP2 啟動子約為574bp長。本發明啟動子的一較佳具體實施例具有下列序列1 GGATGGTGAG GAGCAGGTAC TGGCCCGGCAGCGAGCGGTC ACTTTGGGT51 CTGGGCTCTG ACGGTGTCCC CTCTATCGCT GGTTCCCAGCCTCTGCCCGT101 TCGCAGCCTTTGTGCGGTTC GTGGCTGGGG GCTCGGGGCGCGGGGCGCGG151 GGCATGGGGC ACGTGGCTTT GCGGAGGTTT TGTTGGACTGGGGCTAGGCA201 GTCGCCGCCA GGGAGGAGGG CGGGATTTCGGACGGCTCTC GCGGCGGTGG251 GGGTGGGGGT GGTTCGGAGG TCTCCGCGGG AGTTCAGGGTAAAGGTCACG301 GGGGCCGGGG GCTGCGGGGC CGCTTCGGCGCGGGAGGTCC GGATGATCGC351 AGGTGCCTGT CGGGTCACTA GTGTGAACGC TGCGCGTAGTCTGGGCGGGA401 TTGGGCCGGT TCAGTGGGCA GGTTGACTCA GCTTTTCCTCTTGAGCTCCA451 GCTGGGGCTA TTTAAACCAT GCATTTTCCC AGCTGTGTTCAGTGGCGATT501 GGAGGGTAGA CCTGTGGGCA CGGACGCACG CC(SEQ ID NO 2)本發明的條件複製型腺病毒載體(conditional replication adenovirus vector, CRAD)在一方面，本發明提供一種病毒載體，其包括本發明的啟動子(較佳為Ap53REP2 啟動子)。根據本發明，該病毒載體為腺病毒、腺病毒相關病毒(adeno-associated virus, AAV)、牛痘病毒(vaccinia virus)、逆轉錄病毒(retrovirus)、慢病毒(Ientivirus)或單 純皰疫病毒(herpes simplex virus)。根據本發明的具體實施例，本發明也提供一種條件複製型腺病毒載體，其包括本 發明的啟動子(較佳為Δρ53Ι ΕΡ2啟動子)。根據本發明的另一具體實施例，該條件複製型 腺病毒載體包括Ap53REP2啟動子、位於Δp53REP2啟動子下遊且操作連結至Ap53REP2 啟動子的Hdm2編碼DNA及ElA和ElB_19kD (但無ElB_55kD)的編碼DNA。用語「條件複製(conditionally-r印licative) 」為病毒基因的表達或病毒或載體 的複製，其中該表達或複製視目標細胞中存在或缺乏特定因子而定。用語「操作連結(operably linked) 」為功能性相關的核酸序列。啟動子與編碼序 列操作連結，如啟動子控制編碼多肽的轉譯。用語「腺病毒(adenovirus) 」及「腺病毒顆粒(adenoviral particle) 」包括任何及所有分類為腺病毒的病毒，包括感染人類或動物的腺病毒，包括所有群(group)、亞群 (subgroup)及血清型(serotype)。因此，「腺病毒」及「腺病毒顆粒」為病毒本身或其衍生 物，並涵蓋所有血清型及亞群及天然存在及重組型式。在一具體實施例，此等腺病毒感染人 類細胞。此等腺病毒可為野生型或以各種已知或本發明揭示的各種方式修飾。此等修飾包 括修飾包裹於顆粒中以製造感染性病毒的腺病毒基因組。本發明例示的腺病毒載體包括， 但不限於，DNA、包含於腺病毒外殼的DNA、包裹於另一種病毒或類病毒形式(如單純皰疹病 毒或AAV)的腺病毒DNA、包含於微脂體(liposomes)的腺病毒DNA、與聚賴氨酸複合的腺病 毒DNA、與合成聚陽離子分子複合的腺病毒DNA、與運鐵蛋白(transferrin)結合的腺病毒 DNA或與化合物(如PEG)複合以遮蔽抗原性及/或增加半衰期的腺病毒DNA、或與非病毒 蛋白質結合的腺病毒DNA。根據本發明，「E1A」為編碼腺病毒ElA區域的所有基因產物，包括兩個主要RNA: 13S及12S的表達產物。他們分別轉譯成289及243個胺基酸的多肽。此兩個蛋白質有46 個胺基酸不同，其自12S mRNA剪切。本發明條件複製型腺病毒載體中的ElA編碼核酸序列 為ElA編碼序列及其變異體。根據本發明，「E1B」為編碼腺病毒ElB區域的所有基因產物，包括19kd及55kd的 三個主要多肽。ElB 19kd及55kd蛋白質在細胞轉化方面具有重要性。本發明條件複製型 腺病毒載體包含ElB-19kd但不包含ElB-55kd的編碼序列。本發明條件複製型腺病毒載體 中的ElB-19kd但不包含ElB-55kd的編碼序列為ElB_19kd但不包含ElB_55kd的編碼序列 及其變異體。本發明條件複製型腺病毒載體在癌細胞中選擇性複製並以活化RAS，與p53基因 的狀態無關，藉由形成溶菌斑(plaque)及在細胞中呈現細胞毒性而發揮細胞病變效果。本 發明複製型腺病毒載體，如同其它剔除ElB-55kD的腺病毒，以失去p53功能在腫瘤細胞中 發揮細胞病變效果。本發明的病毒載體可使用重組DNA技術製備。「重組DNA技術(recombinant DNAtechnology) 」為組合兩個或多個DNA分子的技術。重組DNA分子一般藉基因工程製造。 同義用語包括「基因剪切(gene splicing) 」、「分子克隆(molecular cloning) 」及「基因工 程(genetic engineering)」。此等操作的產物導致重組物或重組分子。本發明包括一種本發明病毒載體於製造治療癌症的藥劑的用途。因此，本發明病 毒載體可用於調節癌症的發展及進展，其包括，但不限於，贅瘤(neoplasm)、腫瘤(tumor)、 癌瘤(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、腺瘤(adenoma)、骨髓白血病、肝細胞癌、肝母細胞瘤、 橫紋肌肉瘤、食管癌、甲狀腺癌、神經節母細胞瘤、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉 瘤、骨肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤 文氏瘤(ewing' s sarcoma)、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、大腸癌、胰臟癌、肝癌、 乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭 狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、腎細胞癌、血腫、膽管癌、黑色素瘤、絨毛膜癌、精母細 胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、 膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果腺瘤、血 管母細胞瘤、視網膜母細胞腫瘤、白血病、(如急性淋巴細胞白血病)，急性成髓細胞性白血 病、(骨髓母細胞白血病、急性前骨髓細胞性白血病，急性骨髓單核球性白血病，急性單核球性白血病及急性紅血球性白血病)、慢性白血病(慢性髓細胞白血病(顆粒球性白血病)及 慢性淋巴球性白血病)、真性紅細胞增多症、淋巴瘤(何杰金氏症及非何杰金氏症)，多發性 骨髓瘤、Waldenstrom氏巨蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、直腸癌、頭頸癌、 腦癌、原發部位未明癌、周圍經系統癌、中樞經系統癌、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤、腦膜瘤、 神經母細胞瘤、重鏈病、癌轉移、及未控制或不正常細胞生長的任何疾病。較佳地，癌症為肺 癌、小細胞肺癌、大腸癌或直腸癌。在一具體實施例，本發明病毒載體藉由直接注射至腫瘤或癌組織投藥。在另一 具體實施例，本發明病毒載體或複製型腺病毒載體可為全身性投藥(如靜脈注射)。在 另一具體實施例，本發明複製型腺病毒載體系投藥至組織或器官的內腔(lumen)(如 intravesically) 0在本發明的另一具體實施例，本發明病毒載體可與放射治療結合使用。放射治療 可為本領域中已知的任何形式的放射治療，如X射線治療的外部光束放射、藉插入放射活 性物質而遞送於體內接近或在腫瘤位置的放射治療，如以發散伽瑪射線(gamma ray)的放 射性核種的治療、利用中子或帶電荷粒子及其類似物的粒子光束治療。此外，本具體實施例 包括使用多於一種的本發明載體結合放射治療。本發明的另一具體實施例涉及使用本發明病毒載體與化學治療結合。化學治療劑 是本領域中已知且包括抗代謝劑(包括嘧啶類似物及嘌呤類似物的抗代謝劑)、植物生物 鹼、抗腫瘤抗生素、烷化劑及其類似物。使用多於一種本發明載體與化學治療劑也包括於本 具體實施例。本發明病毒載體在具活化KRASmutant的腫瘤細胞也在具p53mutant的腫瘤中呈現細胞 病變效果。其針對具活化KRASmutant的腫瘤細胞，不拘p53基因的型態，且對鄰近的正常細胞 沒有明顯的細胞病變效果。因此，本發明的條件複製型腺病毒載體具有腫瘤選擇性。本發 明條件複製型腺病毒載體亦可去活化P53以進行複製溶裂。本發明的病毒載體可作為抗癌 劑。醫藥組合物在另一方面，本發明提供一種醫藥組合物，包括本發明病毒載體及醫藥可接受的 載劑。本發明醫藥組成物可藉任何現有技術中已知的適合路徑投藥，包括例如直接注射 至腫瘤或藉其它注射路線如靜脈內、皮下、肌內、穿皮、氣管內或腦內。投藥可如注射般快速 或藉緩慢灌注或緩慢釋出調配物而投藥一段時間。根據本發明的組合物可為醫藥製劑的形式。此等製劑以醫藥技術領域中已知的方 式製造。一較佳的製劑利用生理食鹽水溶液媒劑，但可使用其它醫藥上可接受載劑，如其它 無毒性鹽的生理上濃縮物、5%的葡萄糖水溶液、無菌水或其類似物。醫藥組合物亦可包括 適合的緩衝液。此等溶液可被冷凍乾燥並貯存於無菌瓶，添加無菌水後復原後用於立即注 射。主要溶劑可為水性或非水性。載劑可包括用於修飾或維持pH、滲透壓、黏度、澄清度、顏色、無菌、安定性、溶離 率、或調配物顏色的其它醫藥上可接受的賦形劑。同樣地，載劑可包括用於修飾或維持釋出 或吸收或穿透血腦障壁的其它醫藥上可接受的賦形劑。此等賦形劑為慣用於調配單位劑型 或多劑型式的非經腸投藥劑型或藉連續或周期灌注的直接灌注於腦脊髓液的劑型的彼等物質。包含本發明複製型腺病毒載體的組合物可口服投藥。此等調配物較佳與適合載劑 囊封並調配為固體劑型。適合載劑、賦形劑及稀釋劑的一些實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山 梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯膠(gum acacia)、磷酸鈣、洋菜膠(alginate)、矽酸鈣、微結 晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纖維素、明膠、糖漿、甲基纖維素、甲 基及丙基羥羥基苯甲酸酯(methyl-and propylhydroxybenzoate)、滑石(talc)、硬脂酸鎂、 水、礦物油及其類似物。調配物可另外包括潤滑劑、溼潤劑、乳化及懸浮劑、保存劑、甜味劑 或香料。組合物可經調配以提供活性成分在投藥後快速、持續或延遲釋放至病患。劑量系根據病患體重或體表面積或身體體積計算。劑量的計算亦視投藥路線而 定。決定治療的適當劑量所需的進一步的精細計算由所屬技術領域的技術人員進行。此等 計算可由所屬技術領域的技術人員不需過度試驗而進行。精確的劑量繫結合標準劑量反應 研究而決定。應了解確實投藥的組合物量將由醫生決定，基於病況、所選擇投藥的組合物、 年紀、重量、個別病患的反應、病患症狀的嚴重性及所選擇的投藥路線。可基於劑型調配物 的藥物動力參數及所使用的投藥路線重複投藥。


圖1顯示在活化突變KRAS調控啟動子控制下的Hdm2轉基因及構築成包裹腺病毒 載體的穿梭質粒的控制。A:插入產生々(1414(1-八？531^32及4(1-1(他(11112腺病毒載體的穿梭 質粒的轉基因。Ad-El腺病毒載體含有腺病毒的全長El編碼序列；Ad-Ap53REP2腺病毒載 體含有ElA至Elbl9KD編碼序列及Ap53REP2啟動子推動的emptycassette ；及Ad-KRhdm2 腺病毒載體帶有Ad- Δ p53REP2腺病毒載體的所有組件及藉Δ p53REP2啟動子推動的Hdm2 cDNA。B:Ap53REP2啟動子構築圖。在A及B，顯示引物的位置且其序列列於實施例的 材料及方法部分。引物1，El-337-XhoI-F ；2，El-3528-BglII-R ；3，El-2150-NotI-R ；4， BpA-NotI-F ；5, BpA-KpnI-R ；6, P2_KpnI_F ；7, P2_BglII_R ；8, P2_BamHI-R ；9, H2-BamHI_F ； 10，H2-BglII-R ;11，P2-Kpnl-F ；12，P2_BglII-R ;13，P2_INT_F ；14，P2-INT-R。C 轉基因的 片段長度藉PCR片段長度及直接測序檢測。PCR片段溶解于洋菜膠。片段長度Ad5El 為3208bps、AElB-55kD El (ElA to ElB_19kD)為1935bps、牛生長激素基因的多聚腺苷 酸(polyadenylation)訊號為 295bps、Δp53REP2 啟動子為 574bps 及 Hdm2 編碼 DNA 為 1533bps。圖2顯示Hdm2及pl4ARF於以Ad_KRhdm2轉染的細胞株及對照組的表達的Western blot分析。A :Hdm2的代表性Western blot分析及B :pl4ARF的代表性Westernblot分析。 以八(141、六(1-八？531^32或六(1-1(詘(11112載體在1. O的MOI感染1小時，2天後自每一細胞株 提取蛋白質。作為上樣量(loading)對照，每一實驗槽(panel)均分析α-tubulin蛋白 質。C :Hdm2的強度及D :pl4ARF的強度，藉α -tubulin的對應強度正常化，數據以平均值 +/-SE(3 個實驗組)呈現。*，p<0.05 by the Mann-Whitney test。圖3顯示活化KRASmutatnt調控的啟動子及p53反式活化的p21Cip啟動子的螢光素 酶報告子(luciferase reporter)活性。A :KRAS但非p53調控的Δ p53REP2啟動子的報告 子活性及B :p53反式活化的p21Cipl啟動子在每一細胞株的活性。為測定螢光素酶活性， 4. 5ug 的pAp53REP2-L(A)或pp2ICip 1-Luc (B)報告子質粒，及0. 5ug 的pCMV0 報告子質粒被共轉染至5X105的細胞株。轉染後48小時測定螢光素酶活性。相對β -galactosidase活 性，螢光素酶活性被正常化以呈現相對的活性單位(relativeluminescence units, RLU)。 數據以平均值 +/"SE(3 個實驗組)呈現。*，ρ < 0. 05 by theMann-ffhitney test。圖4顯示腺病毒載體的病毒效價分析。A 以腺病毒載體感染的細胞株形成的溶菌 斑。針對每一細胞株，IO6細胞接種於每一 60mm培養皿，且於Ad在10_4的MOI感染1小時後， 7天後評估以溶菌斑形成單位顯示的細胞病變作用(CPE)。以lml、0.03%中性紅(neutral red)溶液染色後計算溶菌斑。B 以 mock-Ad (supernatant of HEK293 cellculture)、 Ad-El、Ad- Δ p53REP2或Ad_KRhdm2轉染的細胞株的溶菌斑形成單位的數目以平均值 +/-SE (3個實驗組)呈現。圖5顯示以Ad_KRhdm2及對照組轉導的細胞株的存活結果。針對藉MTT分析測定 的細胞存活，每一細胞株接種IO4細胞至96孔盤的每一孔中並以Ad-El、Ad-Ap53REP2或 八(1-1(詘(11112在指定的腸1(0.01，0.1，1，10，100及1，000)感染。7天後測定細胞存活。數據 以平均值+/-SE (3個實驗組)呈現。圖6顯示裸鼠異種移植模型的腫瘤內注射Ad_KRhdm2及對照組的細胞病變作用。 裸鼠的異種移植如實施例的材料及方法所述。每一 RKO、LoVo, SW620及LS174T細胞株在 4隻裸鼠的8個異種移殖生長至IOOmm3並在該時間於腫瘤內注射liTpfus的各Ad_El、 Ad- Δ ElB55kD或Ad_hMDM2載體或PBS (每組4隻小鼠)。監測平均腫瘤體積(+/-SE)並於 Ad注射每5天後如材料及方法所述測定腫瘤體積。當腫瘤大到難以負荷時犧牲小鼠。
具體實施例方式本發明的較佳具體實施例描述於下列實施例。但該等實施例並非用以限制本發 明。實例1材料及方法細胞株及細胞培養方法本實驗中所使用的人類腎臟胚胎上皮細胞(HEK293)、人類正常肺纖維母細胞 (MRC-5)及人類大腸直腸癌細胞(RKO, HCT116、LoVo, LS174T、LS123、SW620 及 HT29)皆 是取自美國細胞培養暨儲存中心(American Type Culture Collection, Rockmille, Maryland)。以上各細胞中p53及KRAS基因的表達參考自「the catalogue of somaticmutations in cancer, in The Sanger Institute COSMIC database，， (www. sanger. ac. uk)。其中MRC5及RKO細胞的KRAS及p53基因表達皆為正常，HCT116、LoVo及 LS174T細胞中p53基因表達為正常；KRAS活化突變的形式分別為G13D、G13D及G12D，而 LS123、SW620及HT29細胞的p53基因突變；且KRAS活化突變的形式分別為G12S、G12V及 G61L。HEK293 細胞以 MEM 培養基培養(Eagle's minimum essential medium 加入 2mM 左旋 麩醯胺酸、0. ImM非必需胺基酸、ImM丙酮酸鈉及10%去補體的馬血清)，RKO and MRC5細胞 以MEM培養基培養(Eagle's minimum essential medium加入10%去補體的胎牛血清)， HCTl 16 and HT29 細胞以 McCoy『 s 5A 培養基培養(McCoy' s 5Amedium 加入 1. 5mM 左旋 麩醯胺酸及10%去補體胎牛血清)。LoVo細胞以Ham' s F12K培養基培養(Ham' s F12K medium加入2mM左旋麩醯胺酸及10%去補體胎牛血清)。LS174T and LS123細胞以MEM培 養基培養(Eagle's minimum essential medium加入2mM左旋麩醯胺酸、0. ImM非必需胺基酸、ImM丙酮酸鈉及10%去補體胎牛血清。SW620細胞以Leibovitz' s L-15培養基培養 (Leibovitz' s L-15me dium加入2mM左旋麩醯胺酸及10%去補體胎牛血清)。所有細胞 皆置於37°C、5% C02培養箱中培養。建構僅受KRASmutant調控的hdm2啟動子-Δ p53REP2 啟動子hmd2P2啟動子包含RAS/RAF反應區段和兩個p53反應區段。ρΔp53REP2_Luc 報告載體是藉由交迭引伸PCR的方式，將兩個p53反應區段從hmd2 P2啟動子中剔除 (圖1B) (19)，兩套引物被用來擴增p53反應區段前端與後端的P2片段，其序列為第一組 P2-Kpnl-F 5~-CTGAGGTACCGGATGGTGAGGAGCA-3『 (SEQ ID NO 3)和 P2-INT-R -CCCCAGC TGGAGCTCAAGAGGAAAAGCTGA-3『 (SEQ ID NO 4)；第二組 P2-INT-F :5、-CTCTTGAGCTCCAGCTGG GGCTATTTAAAC-3"(SEQ ID NO 5)和 P2_BglII-R _TGCTAGATCTGGCGTGCGTCCGTGC_3~ (SE QiD n0 :6)，兩個內部引物，P2-INT-F和P2-INT-R，包含有相同的序列區段，因此進一步將 這兩段PCR相加，利用其中間相同序列區段進行黏合作用，再用P2-Kpnl-F與P2-BglII-R 作引物進行第二次PCR，即可得到剔除掉p53反應區段的P2啟動子，然後插入包含螢光 素酶基因的 pGL3-Basic 質粒(Promega，Madison, WI)，即建構成 ρ Δ p53REP2_Luc 報告載 體。pp21Cipl-LuC報告載體包含螢火蟲冷光酶基因，其表達是受兩段p53反應區段所調控 (20)，作為對照組的報告載體是pCMV β，其帶有的β-galactosidase基因是受CMV啟動子 所調控，能持續在細胞中表達(Clontech，Mountain View, CA).。螢光素酶報告系統實驗偵測相對的螢光素酶活性，試驗p53調控pp2ICipI-Luc報告載體及KRAS調 控pAp53REP2-Luc報告載體的能力。利用SuperFect 細胞轉染試劑(Qiagen, Hilden， Germany)將 4· 5 μ g pp21Cipl_Luc 或 ρ Δp53REP2_Luc 或 pGL3_Basic(對照組)與 0. 5 μ gpCMV β共同轉染入5 X 105細胞內，48小時後收集細胞蛋白，利用Dual- Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI)測試其中的螢光素酶活性，同時利用 β -Galassay(Invitrogen, Carlsbad, CA)測試其中的 β-galactosidase 活性，相對的熒 光素酶活性單位(relative luminescent unit, RLU)的計算方式為將螢光素酶活性除以 β -galactosidase 活性。建構及包裹腺病毒載體腺病毒載體的製作是利用同源重組的原理，將所希望加載的序列置入pShuttle 載體後，再與含有剔除El Ad5基因組的AdEasy 腺病毒載體(Stratagene，Cedar Creek, TX)進行重組。如圖1所示，製造複製勝任的Ad-El腺病毒載體的穿梭質粒包含有完整的 腺病毒El編碼序列；製造包含有ElA至ElB-19kD的ElB_55kD剔除的El的Ad- Δ p53REP2 腺病毒載體的穿梭質粒及僅含有Δρ53Ι ΕΡ2啟動子；Ad-KI hdm2腺病毒載體除了包含有 ElA至ElB-19kD的基因區段外，還包含有由Δp53REP2啟動子引導Hdm2的表達系統。 Ad5-El (3208bps)及 ElA 至 ElB19kD (1935bps)的基因區段利用 PCR 的方式，從 HEK293 細 胞的DNA中得出(圖1C)，其使用引物分別為ElA組El-337-XhoI-F 5~ -CACTCGAGGTAATA TTTGTCTAGGGCCGC-3" (SEQ ID NO 7)及 El-3528-BglII-R -GCAGATCTGCCCACACATTTCAG TACC-3" (SEQ ID NO 8) ；ElA 至 ElB19kD 引物組 El-337-XhoI-F 5~ -CACTCGAGGTAATATTT GTCTAGGGCCGC-3" (SEQ ID NO 9)及 El-2150-NotI-R -AGGCGCGGCCGCCAACATTCATTCCC GA 二 3(SEQ ID NO :10)。聚腺甘酸信號(polyadenylation signal) (295bps, Fig. 1C) M從 pGlow-TOPO 質粒(Invitrogen, Carlsbad, CA)序列中得到，使用的引物為 BpA-NotI-F 5~-GTTGGCGGCCGCCCCGCTGATCAGCCT-3~ (SEQ ID NO :11)及 BpA-KpnI-R -ATCCGGTACCT CAGAAGCCATAGAG-3" (SEQ ID NO 12)。Δp53REP2 啟動子序列(574bps ；圖 IB 及 C)是從 ρ Δ p53REP2-Luc 報告載體中得出，使用引物組 P2_KpnI_F 5~ -CTGAGGTACCGGATGGTGAGGAGC A-3~ (SEQ ID NO :13)及P2_BamHI-R _TGCTGGATCCGGCGTGCGTCCGTGC_3~ (SEQ ID NO :14)。 hdm2編碼DNA(153;3bps ；圖1C)是利用RT-PCR的方式，從MRC5mRNA中得到，其利用的引物 為 Hdm2-BamHI-F _CGCCGGATCCAGCAGGCAAATGTGC_3~ (SEQ ID NO :15)及 Hdm23glII_R -AGAAAGATCTTTATAGACAGGTCAAC-3~ (SEQ ID NO :16)。經由適當的限制酶作用後，個別的 PCR片段相互黏合後置入pShuttle載體，進而與AdEasy 腺病毒載體(Stratagene，Cedar Creek, TX)於大腸桿菌株BJ5183內進行重組後，將重組完成的腺病毒載體轉染至HEK293細 胞內進行完整的腺病毒複製，再利用Adeno-XTM病毒純化試劑盒(Clontech)，即可從細胞 培養液中得到新的腺病毒Ad-El，Ad-Ap53REP2, Ad_KRHdm2。所有腺病毒皆經過完整的基 因序列分析確定其正確性，並以病毒效價測定法確定其效價。人類腺病毒 5 型 呆藏編號(Human adenovirus type 5 DNA accession number) AC000008 ；hdm2 DNA 保藏編號(accession number) :AF527840.西方墨點法(Western Blot Analysis)將樣品分別提取蛋白質後，先經過蛋白質電泳分離，再將其轉至硝化纖維膜 上(Schleicher & Schuel 1，Dassel，Germany)，分另Ij 以 anti—α-tubulin(DMlA)單 3 ^ δ # (Calbiochem, Darmstadt, Germany)、 anti-Hdm2 (D 12) 3 ^ # (Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA) ,anti-pl4ARF (4C6/4)單克隆抗體(Cell Signaling, Danvers, MA) > anti-p53(1C12)單克隆 ^體(Cell Signaling) R anti-adenovirus hexon(3G0)單克隆抗體(Santa Cruz)對膜上蛋白作專一性的結合，再用二次抗體 (Promega, Madison, WI)，對上述抗體進行專一性的結合，然後以鹼性磷酸酶(Thermo Scientific, ffaltham, ΜΑ)呈色，以偵測個別蛋白質的表達量。細胞存活率(CellViability Assay)將IO4個細胞置入96孔盤中，經M小時培養後，分別加入序列稀釋的腺病毒 載體(0. 01，0. 1，1，10，100及1，000的MOIs)，經7天培養，利用細胞活性測試TACS MTTassay (R&D Systems, Minneapolis, MN)計算細胞存活率。病毒效價測定法(Plaque-Forming Assay)將IO6個細胞置入6公分培養皿中，經過M小時的培養後，在培養基中分別加 入1毫升序列稀釋後的病毒載體，再經過2小時培養的後，加入0. 65%瓊脂膠(BD Difco, Loveton Circle Sparks, MD)覆蓋(以MEM培養基溶解，並加入2%胎牛血清)，於37V, 5% C02下培養7天後，以中性紅(neutral red)染色，計數噬菌斑(plaque)的數目即可算 出病毒效價。利用裸鼠外殖腫瘤模式試驗於腫瘤內注射腺病毒載體其毒殺腫瘤細胞的能力本實驗使用6周大的裸鼠(Balb/c Nude mice)購自樂斯科生物科技公司 (BioLASCO, Taiwan)，所有的實驗內容皆遵循臺北榮民總醫院動物管理委員會的規範。首 先，先經由皮下注射在裸鼠下肢分別植入5 X 106個人類大腸直腸癌細胞(RK0、LoVo、SW620 及LS174T)，每隔7天測量腫瘤大小，並由公式(寬2X長)/2算出腫瘤體積。待腫瘤體積約為100立方釐米時，將老鼠隨機分為四組，分別由皮下注入食鹽水(negative control), Ad-KRhdm2> Ad- Δ p53REP2 (the Hdm2_negative control)及 Ad-Elvectors (theElB_55kD_ positive control)，各病毒載體的效價皆為1010pfus。
實例2腺病毒載體的構築如圖IA所示的Ad-El、Ad-Ap53REP2&Ad_KRhdm2的轉基因併入用於Ad載體的構 築的對應穿梭質粒。使用攜帶Ad 5的編碼全長El DNA的Ad-El載體的轉基因插入物構築 複製勝任的Ad-El。Ad- Δ p53REP2載體的轉基因插入物含有ElA及ElB_19kD_編碼DNA但 不含 ElB-55kD-編碼 DNA，及 Ap53REP2 啟動子-推動的 empty cassette, Δ p53REP2 啟動 子是以兩個被剔除的P53反應組件推動自hdm2P2啟動子(圖IB)。Ad-KRhdm2載體的轉基 因插入物的構築系藉由將Hdm2編碼DNA併入Δ p53REP2啟動子的Ad- Δ p53REP2下遊。以 PCR片段長度(圖1C)及DNA定序分析確認此等轉基因插入物的正確構築及序列。hdm2-P2 啟動子的ETSA位置並未保留在Ap53REP2啟動子並剔除兩個p53反應組件。Ap53REP2啟 動子的序列顯示如下1 GGATGGTGAG GAGCAGGTAC TGGCCCGGCAGCGAGCGGTC ACTTTTGGGT51 CTGGGCTCTG ACGGTGTCCC CTCTATCGCT GGTTCCCAGCCTCTGCCCGT101 TCGCAGCCTT TGTGCGGTTC GTGGCTGGGG GCTCGGGGCGCGGGGCGCGG151 GGCATGGGGC ACGTGGCTTT GCGGAGGTTT TGTTGGACTGGGGCTAGGCA201 GTCGCCGCCA GGGAGGAGGG CGGGATTTCGGACGGCTCTC GCGGCGGTGG251 GGGTGGGGGT GGTTCGGAGG TCTCCGCGGGAGTTCAGGGT AAAGGTCACG301 GGGGCCGGGG GCTGCGGGGC CGCTTCGGCGCGGGAGGTCC GGATGATCGC351 AGGTGCCTGT CGGGTCACTA GTGTGAACGC TGCGCGTAGTCTGGGCGGGA401 TTGGGCCGGT TCAGTGGGCA GGTTGACTCA GCTTTTCCTCTTGAGCTCCA451 GCTGGGGCTA TTTAAACCAT GCATTTTCCC AGCTGTGTTCAGTGGCGATT501 GGAGGGTAGA CCTGTGGGCA CGGACGCACG CC以Ad-KI hdm2的成功轉導藉Hdm2的表達得以證明(圖2A)。實例3 Hdm2在Ad-KI hdm2轉導細胞中的表現系由活化KRASmutant調控，不拘p53基 因的狀態在密碼12或13的pl4ARF的表達Hdm2表達顯著增加，相較於具野生型KRAS的 MRC5正常纖維母細胞或在RKO腫瘤細胞中Hdm2的表達(圖2A及C)。然而，在Ad_KRhdm2 轉導的肌四細胞(其帶有G61L KRAS突變)，Hdm2表達並未顯著增加且不會顯著活化 hdm2 Δ p53REP2啟動子(圖2Α及C及圖3Α)。增加的Hdm2表達發生於具p53wild的Ad_KRhdm2 轉導的HCTl 16、LoVo及LS174T細胞株及具p53mutant的LS123及SW620細胞株。在以 Ad-Ap53REP2轉導的細胞中，Hdm2表達不會增加，其為負對照組。實例4在具活化KRASmutant的腫瘤細胞中pl4AKF的表達相當低且在Ad轉導中增加在帶有KRAS 活化突變的 HCTl 16、LoVo, LS174T、LS123 及 SW620 細胞株，pl4AKF 的 表達顯著低於其在具有野生型KRAS的MRC5正常纖維母細胞或在RKO腫瘤細胞的表達(圖 2B及D)。在具KRAS活化突變的細胞株中pl4AKF的表達(但不在MRC5或RKO細胞中表現) 在Ad感染後增加，然而，不超過以Ad-KRHDMS感染的MRC5或RKO細胞中的表現量(圖2B 及D)。
實例5hdm2 Δ p53REP2啟動子的反式活化(transactivation)反應至活化 KRASmutatnt,不拘p53基因的狀態進行報導分析以測定hdm2 Δ p53REP2啟動子的活性對各種基因狀態的KRAS的調 控。為達成此目的，將Ap53REP2啟動子的報告子質粒轉染至圖3A所示的細胞株。相較於 在具有野生型KRAS的MRC5正常纖維母細胞或RKO腫瘤細胞，hdm2 Δ p53REP2啟動子的活 性在具KRAS活化突變的HCTl 16、LoVo, LS174T、LS 123及SW620細胞株中增加6至9倍。 然而，具G61L突變的KRAS在Η ^9細胞中無法顯著反式活化hdm2 Ap53REP2啟動子。實例6藉Hdm2的活化KRASmutant-調控的表達，藉p53的P21Cipl啟動子的反式 活化被破壞圖 3B 顯示者為 p53wild(as in mock-transducted MRC5, RKO, HCTl 16, LoVo R LS 174T 細胞株)但並非 p53mutant (as in mock-transducted LS123，SW620 及 HT29 細胞 株)反式活化轉染質粒中的P2ICipl啟動子。圖:3B亦顯示Ad-KI hdm2轉導於p53反式活 化活性的效果。P53wild在具活化KRASmutant/p53wild細胞株的反式活化活性藉由轉導 Ad-KRhmd2而破壞，其中Hmd2表達系上調如圖2A及C所示。相較於Ad- Δ p53REP2轉導的控 制，表現於此等Ad-KRhmd2轉導的細胞的Hdm2負責p53反式活化活性的破壞。P21Cipl啟動 子在具p53wild的細胞株的反式活化藉Ad-El而不藉Ad-Ap53REP2感染而破壞。Elb_55kD 表達於Ad-El但不表達於具p53wild的REP2轉導的細胞株系抑制p53反式活化功能的結^ ο實例7AcH hdm2的選擇性活體外細胞病變作用進行活體外病毒效價測定以評估Ad_KRhmd2對腫瘤細胞株及MRC正常細胞株的細 胞病變作用(cytopathic effect, CPE)。Ad-El及Ad-Δ p53REP2系用於感染作為對照組。 以Ad-KI hmd2在乜10_5 to 4x10-3的MOI感染細胞。如圖4所示，在乜10_4的MOI感染1 小時後評估溶菌斑形成單位(plaque-forming units (pfu))。Ad-KI hdm2形成的溶菌斑標 示於具活化KRASmutan，不拘p53狀態，的HCTl 16、LoVo, LS174T、LS123及SW620細胞培養 物(圖4A及B)。Ad-Ap53REP2在LS123、SW620及Η ^9細胞株培養物(其帶有失去ρ53 功能的突變)亦產生標示的溶菌斑形成(圖:3Β及圖4)。由於在相同的MOI形成較多的溶 菌斑，此等細胞株(LS123、SW620及ΗΤ29)相較於Ad-El對Ad_KRhdm2呈現較高的感受性 (susceptible)。為定量劑量效果，檢測Ad_KRhmd2對細胞株的細胞存活的選擇性細胞病變作用。 Ad載體的「CE50」代表以腺病毒載體感染，培養7天後，導致存活率降低50 %的Μ0Ι。如 表 1 及圖 5 所示，Ad-KRhdm2 對帶有活化 KRASmutant/p53wild 的 HT116、LoVo 及 LS174T 細胞株的 CE50 分別為 3. 18士0. 49，0. 48士0. 06，and 0. 46士0. 03，其低於 Ad_KRhdm2 於正 常纖維母細胞(MRC^)及RKO腫瘤細胞的440至3400倍，低於Ad-Δ p53REP2的1,000至 17,000 倍，及低於 Ad-El 於 HTl 16、LoVo 及 LS174T 細胞株的 2-11 倍。同樣地，Ad_KRhmd2 於具 KRASmutant/p53mutant 的 LS123、SW620 及 HT 細胞株的 CE50 分別為 0. 41 士0. 09， 0. 53 士0.08，and 6. 07 士0. 11，其與Ad-Δ p53REP2或Ad-El載體於此等細胞株並無顯著不 同。表1腺病毒載體於細胞株的CE50
權利要求
1.一種分離的核酸啟動子，其包含剔除部分或全部P53反應元件(response element) 的人類雙微粒體基因2 (human double minute 2，hdm2) P2啟動子。
2.根據權利要求1所述的啟動子，其包含人類雙微粒體基因2(hdm2)P2啟動子，其 中所述 hdm2P2 啟動子的胺基酸序列 498 至 505 (GGT CAAGTTCAGA CACGTTCCGAAACTGCAGTA AAAGGAGTTA AGTCCTGACT TGTCT)被剔除。
3.根據權利要求1所述的啟動子，其中人類雙微粒體基因2(hdm2)P2啟動子為約 574bp 長。
4.根據權利要求1所述的啟動子，其具有如SEQID NO :2所示的核酸序列(Ap53REP2 啟動子)。
5.一種病毒載體，其包含根據權利要求1所述的啟動子。
6.根據權利要求5所述的病毒載體，其中該病毒載體為腺病毒、腺相關病毒、牛痘病 毒、逆轉錄病毒、慢病毒或單純皰疹病毒。
7.根據權利要求5所述的病毒載體，其中該病毒載體為腺病毒。
8.一種條件複製型腺病毒載體，其包含如權利要求4的Ap53REP2啟動子、位 於Δ p53REP2啟動子下遊且操作連結至Δ p53REP2啟動子的Hdm2編碼DNA及ElA和 ElB-19kD (但無 ElB-55kD)的編碼 DNA。
9.根據權利要求5或8所述的病毒載體，其可用於結合放射治療或化學治療。
10.根據權利要求5或8所述的病毒載體，其具有腫瘤選擇性。
11.一種根據權利要求5或8所述的病毒載體於製備治療癌症的藥劑中的應用。
12.根據權利要求11所述的應用，其中所述癌症選自由贅瘤(neoplasm)、腫瘤 (tumor)、癌瘤(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、腺瘤(adenoma)、骨髓白血病、肝細胞癌、肝母 細胞瘤、橫紋肌肉瘤、食管癌、甲狀腺癌、神經節母細胞瘤、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、 軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間 皮瘤、尤文氏瘤(ewing' s sarcoma)、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、大腸癌、胰臟 癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭 狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、腎細胞癌、血腫、膽管癌、黑色素瘤、絨毛膜 癌、精母細胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小 細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松 果腺瘤、血管母細胞瘤、視網膜母細胞腫瘤、白血病、急性成髓細胞性白血病、慢性白血病、 真性紅細胞增多症、淋巴瘤(何杰金氏症及非何杰金氏症)，多發性骨髓瘤、Waldenstrom氏 巨蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、直腸癌、頭頸癌、腦癌、原發部位未明癌、周 圍經系統癌、中樞經系統癌、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤、重鏈病、癌 轉移、及以未控制或不正常細胞生長表徵的任何疾病或病症組成的群組。
13.根據權利要求11所述的應用，其中該癌症為肺癌、小細胞肺癌、大腸癌或直腸癌。
14.一種醫藥組合物，其包含根據權利要求5或8所述的病毒載體及醫藥上可接受載劑。
15.根據權利要求14所述的醫藥組合物，其系用於治療癌症。
16.根據權利要求15所述的醫藥組合物，其中所述癌症選自由贅瘤(neoplasm)、腫瘤 (tumor)、癌瘤(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、腺瘤(adenoma)、骨髓白血病、肝細胞癌、肝母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、食管癌、甲狀腺癌、神經節母細胞瘤、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉 瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、 間皮瘤、尤文氏瘤(ewing' s sarcoma)、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、大腸癌、胰臟 癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭 狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、腎細胞癌、血腫、膽管癌、黑色素瘤、絨毛膜 癌、精母細胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小 細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松 果腺瘤、血管母細胞瘤、視網膜母細胞腫瘤、白血病、急性成髓細胞性白血病、慢性白血病、 真性紅細胞增多症、淋巴瘤(何杰金氏症及非何杰金氏症)，多發性骨髓瘤、Waldenstrom氏 巨蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、直腸癌、頭頸癌、腦癌、原發部位未明癌、周 圍經系統癌、中樞經系統癌、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤、重鏈病、癌 轉移、及以未控制或不正常細胞生長表徵的任何疾病或病症組成的群組。
全文摘要
本發明構築一種活化KRASmutant但非p53調控的啟動子和產生一種剔除E1B-55kD(ΔE1B-55D)的腺病毒，帶有轉錄上活化的轉基因並在具活化KRASmutant的腫瘤細胞中具有溶裂複製能力。本發明腺病毒可用於治療癌症。
文檔編號C12N15/86GK102108356SQ20091026079
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月29日 優先權日2009年12月29日
發明者劉俊煌, 劉錦誠 申請人:臺北榮民總醫院