一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法
2023-05-29 16:55:01 1
專利名稱：一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法
一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法技術領域
本發明屬於小麥品質檢測技術領域，具體涉及一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法。
背景技術：
小麥籽粒黃色素含量對麵條、饅頭等食品的外觀品質有著重要影響。日本和東南亞國家消費的黃鹼麵條要求亮黃色，高黃色素含量的麵粉有利於提高其外觀品質，然而，中國的小麥製品(如麵條、饅頭等)要求較高白度，需要亮度好、黃色素含量低的麵粉，因此，選育高、低黃色素含量的小麥新品種是小麥品質育種的重要目標。
許多研究表明小麥籽粒黃色素含量與麵粉、麵團黃度的相關係數高達0.8^0.9，與麵包和麵條顏色的相關係數分別為0.69和0.76。品種間黃色素含量可相差3 4倍，選擇潛力較大。雖然環境對黃色素含量有一定影響，但基因型是影響黃色素含量的主要因素，Parker等對150個SSD系分析表明，黃色素含量的遺傳力為0.67(Parker G D, Chalmers KJ, Rathjen A J, Langridge P.Mapping loci associated with flour color in wheat.Theor Appl Genet, 1998，97(1-2): 238 - 245);在硬粒小麥中黃色素含量的遺傳力更高，Clarke 等研究顯示其遺傳力為 0.88 0.%(Clarke F R, Clarke J M, McCaig T N, Knox RE, DePauw R M.1nheritance of yellow pigment concentration in seven durum wheatcrosses.Canadian Journal of Plant Science, 2006, 86(1): 133—141.
隨著分子生物學和生物信息學技術的快速發展，人們對小麥中控制黃色素含量的基因及功能性標記的研究也更加深入。研究表明，普通小麥中控制黃色素含量的主效QTL 位於 7A 和 7B 染色體上(Parker G D, Chalmers K J, Rathjen A J, Langridge P.Mapping loci associated with flour color in wheat.Theor Appl Genet, 1998,97(1-2): 238 - 245)。He等克隆了普通小麥7A染色體上Psyl (八氫番茄紅素合酶，phytoene synthase, Psy)基因Psy-Al的全長序列，並開發了相應的共顯性標記YP7A和YP7A-2 ;鑑定並克隆了 7B染色體Psy-BI位點的等位變異，並開發了功能標記YP7B-1、YP7B-2、YP7B-3和YP7B-4。He等開發的功能標記YP7A能有效地區分小麥7A染色體上控制高、低黃色素含量的等位基因Psy-Ala和Psy-Alb (He X Y, He Z H, Ma ff, Appels R,Xia X C.Allelic variants of phytoene synthase I (Psyl) genes in Chinese andCIMMYT wheat cultivars and development of functional markers for flour colour.Mol Breed, 2009，23(4): 553 - 563)，為準確區分高、低黃色素含量的小麥品種(系)及其分布規律提供了可能，但是此法對於大批量的田間育種材料篩選檢測來說成本仍較高，同時也要求操作人員具備高水平的分子生物學技術，距離實現高通量檢測仍有一定距離。普通的化學檢測需要破碎樣品，使用的化學試劑正丁醇有特殊怪異的酒氣味，不適合大量檢測，長時間操作對工作人員呼吸道有一定損害，並且速度也較慢。同時，上述兩種方法所使用的化學試劑容易對環境造 成汙染。
近紅外光譜分析技術的快速發展給大批量育種材料的快速檢測帶來了可能，近紅外光譜分析技術具有分析簡便、快速、高效、低成本、無汙染及樣品的非破壞性和多組分同時測定等優點。它是利用有機物中含有的各種含氫基團(CH、OH、NH、SH等)的倍頻與合頻譜帶在近紅外光譜區的特徵振動吸收信息，從而快速測定樣品中多種化學成分的含量。近紅外光譜分析方法在測定小麥中水分含量、蛋白質含量、籽粒硬度、吸水率、溼麵筋含量、麵團形成時間和麵團穩定時間等方面已有研究，但用於小麥籽粒黃色素含量快速檢測研究在國內外還未見報導。發明內容
本發明的目的在於提供一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法。
為實現上述目的，本發明採用以下技術方案: 一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法，包括以下步驟: (1)採集每個樣品的近紅外光譜數據，並測定其黃色素含量； (2)對光譜數據進行預處理:將光譜數據與化學值一一對應，導入分析軟體，應用分析軟體採用一階導數法和標準正態變量轉換法對近紅外光譜數據進行預處理； (3)建立模型:採用偏最小二乘法和多元線性回歸算法對黃色素含量和預處理後的光譜數據進行計算並建立模型； (4)應用模型:將建立好的定標模型導入近紅外光譜分析儀模型庫中，即可對小麥籽粒黃色素含量進行快速測量。
上述方法中，在步驟(I)之前對樣品進行前處理，除去樣品中的石頭、土塊等雜物，自然風乾，水分含量控制在12% —13%。
上述方法中，步驟(I)中所述近紅外光譜數據為每個樣品重複掃描2-100次的平均光譜數據；所述黃色素含量的測定方法為分光光度法。
較好的，步驟(I)中的近紅外光譜數據為每個樣品重複掃描4次的平均光譜數據；所述分光光度法為紫外-可見分光光度法。
上述方法中，在掃描近紅外光譜時，樣品杯直徑為50—140mm,深度為10—25mm,解析度為I一5nm，掃描範圍950— 1650nm，溫度為22— 25°C;用紫外-可見分光光度法測量黃色素含量的方法包括以下步驟:從每個樣品中隨機取樣部分小麥籽粒，用旋風磨把小麥籽粒磨成全麥粉，每Ig的全麥粉用5ml的水飽和正丁醇進行萃取，將萃取液轉入2 — IOml的離心管中，在4000— 5000 r/min的離心速率下，離心8 —10 min，得上清液，然後以水飽和正丁醇溶液為空白對照，在436.5nm波長下測定上清液的吸光度並計算黃色素的含量；其中所述全麥粉的制粉篩網直徑為0.5—0.8_，所述全麥粉用量為3.0—6.0g，萃取時間為lh，所用比色皿為光路長1.0cm，1.4一3.5ml的半微量紫外石英比色皿。黃色素含量的計算公式為: 黃色素含量(mg/kg)=吸光度*30.1 較好的，所述樣品杯直徑75mm，深度25mm，所述解析度為2nm，溫度為25°C;所述全麥粉的制粉篩網直徑為0.5mm ;全麥粉用量為3.0g ;離心管體積為2ml ;離心速率4000 r/min ；離心時間IOmin ;所用比色皿容量為1.4ml。
上述方法步驟(2)中利用軟體The Unscrambler 9.7進行一階導數處理時選取光滑點數2— 4個。
上述方法步驟(3)中進行線性回歸分析時方法選取PLS1，X變量設定為光譜數據，Y變量設定為黃色素含量，經主成分分析法分析，選用自動選擇最優主成分個數，並經交叉驗證處理。根據主成分分析結果，挑出異常值，再對回歸模型進行優化處理，得出可用的模型。
上述方法步驟(4)中應用模型時，先通過預測值對曲線截距和斜率值進行調整，達到與化學值誤差最小，並通過線性回歸對預測值和化學值進行相關性分析，再將該模型融入到原有其他參數模型中，達到一次掃描分析，可以在得到原有其他參數結果的同時也得到黃色素的含量。所述原有其他模型為原有的測量水分含量、蛋白質含量、籽粒硬度等的模型。
本發明前處理方法簡單，能較好的降低對近紅外光譜採集的幹擾。
本發明採用一階導數法和標準正態變量轉換法對近紅外光譜數據進行預處理可提取近紅外光譜的特徵信息，消除各種噪聲和幹擾，降低樣品表面不均勻和色差等因子影響，提聞1旲型預測的精度和穩定性。
本發明方法操作簡單、快速、高效、低成本、無汙染，對樣品無破壞性，不影響樣品的後續使用，適合實驗室和生產一線使用，並且可以和多組分同時測定，為小麥育種提供了一種快速篩選高、低黃色素含量小麥品種的新方法。
圖1為樣品的近紅外光譜採集數據； 圖2為模型優化後定標集原始值與預測值的擬合圖； 圖3為樣品預測值與原始值相關性圖譜。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護範圍並不限於此。
實施例1 挑選南淮麥區南部的具有廣泛代表性一批不同小麥品種的籽粒作為定標集樣品，本試驗選取不同類型的自育高代品系材料70份。樣品名稱如表I (表I中為挑出異常值後的樣品)。
1、樣品前處理:挑出小麥籽粒樣品中的石子、土塊和雜草等雜質，自然風乾，水分含量控制在12 13%。從每個樣品中隨機取樣20g採用旋風磨將小麥籽粒磨成全麥粉(所用制粉篩網直徑為0.5_)，用於黃色素含量化學值檢測，剩餘部分小麥籽粒用於近紅外光譜數據採集。
2、樣品黃色素含量化學值檢測:稱取3.0OOg樣品全麥粉放入50ml帶蓋的塑料瓶子內，加入15.0ml水飽和正丁醇溶液，蓋緊蓋子，放在混旋器上混合，使樣品充分溼潤，把塑料瓶放在往復震蕩器上震蕩lh，靜置lOmin，將上部分萃取液倒入2ml塑料離心管內，在4000r/min的離心機上離心lOmin，將離心後的上清液倒入1.4ml半微量紫外石英比色皿中，比色皿光程長1.0cm,以水飽和正丁醇溶液為空白對照，用紫外-可見分光光度計在436.5nm下測定上清液的吸光度A，計算黃色素含量，公式為: 黃色素含量(mg/kg)=吸光度*30.1 3、樣品近紅外光譜採集:用DA7200近紅外光譜分析儀採集樣品的近紅外光譜，將樣品置於光譜儀上的旋轉樣品杯(直徑75mm，深度25mm)中，設定採集光譜解析度為2nm，光譜掃描範圍為950— 1650nm,室溫25°C，每個樣品重複掃描4次，求平均光譜，存入計算機待用。樣品的近紅外光譜採集數據如圖1所示。
4、對光譜數據進行預處理並建立模型:將光譜數據和黃色素含量一一對應導入應用軟體The Unscrambler 9.7，在軟體中先後利用一階導數法和標準正態變量轉換法對光譜數據進行優化處理，其中在進行一階導數處理時選取光滑點數3個對光譜數據優化，接著採用偏最小二乘法計算和多元線性回歸算法對黃色素含量和光譜數據同時進行處理並建立模型，在回歸分析時方法選取PLS1，X變量設定為光譜數據，Y變量設定為黃色素含量化學值，經主成分分析法分析，選用自動選擇最優主成分個數，對樣品進行了挑選，並經交叉驗證處理。根據主成分分析結果，挑出異常值(本試驗挑出10個異常值)，再對回歸模型進行優化處理，優化後樣品的原始值決定係數為0.995，預測值決定係數為0.892，如圖2所示為模型優化後樣品原始值I與預測值2的擬合圖，表示該模型決定係數較高，標準偏差均較小，可以應用，保存該定標模型備用。
5、定標模型驗證:將樣品隨機排列,在The Unscrambler 9.7軟體中調用該模型，對樣品再進行預測，得到籽粒黃色素含量預測數據，將預測數據與原始值進行相關分析，結果表明預測數據與原始值呈正相關，線性關係如圖3所示，決定係數為0.9958，預測數據與原始值差值絕對值小於0.1，預測效果較理想，可以進行該模型應用。
6、定標模型應用:將建立的定標模型導入到DA7200型近紅外光譜儀模型庫中，與原有的水分含量、蛋白質含量、籽粒硬度等模型合併到一起，即可對小麥籽粒樣品進行測試分析。這樣，通過一次掃描分析，可以在得到蛋白質含量等多個原有參數結果的同時，也可以得到籽粒黃色素含量的結果，實現簡便、快速、高效、高通量、低成本、無汙染、不破壞樣品和多組分同時測定的目的，達到對小麥育種早期世代的大批量育種材料快速檢測篩選的要求。
表1:挑出異常值後用於定標集的60個品種代號及黃色素含量值
權利要求
1.一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)採集樣品的近紅外光譜數據，測定樣品的黃色素含量； (2)對光譜數據進行預處理:採用一階導數法和標準正態變量轉換法對近紅外光譜數據進行預處理； (3)建立模型:採用偏最小二乘法和多元線性回歸算法對黃色素含量和預處理後的光譜數據進行計算並建立模型； (4)應用模型:將建立好的定標模型導入近紅外光譜分析儀模型庫中，即可對小麥籽粒黃色素含量進行快速測量。
2.如權利要求1所述一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法，其特徵在於，步驟(2)中利用軟體TheUnscrambler 9.7進行一階導數處理時選取光滑點數2— 4個。
3.如權利要求1所述一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法，其特徵在於，步驟(3)中進行線性回歸分析時方法選取PLS1，X變量設定為光譜數據，Y變量設定為黃色素含量，經主成分分析法分析，選用自動選擇最優主成分個數，並經交叉驗證處理。
4.如權利要求1所述一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法，其特徵在於，步驟(4)中應用模型時，先通過預測值對曲線截距和斜率值進行調整，達到與化學值誤差最小，再將該模型融入到原有其他參數模型中，所述原有其他模型為原有的測量小麥籽粒水分含量、蛋白質含量、籽粒硬度的模型。
5.如權利要求1所述一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法，其特徵在於，在步驟(I)之前，除去樣品中的雜物，水分含量控制在12% —13%。
6.如權利要求1所述一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法，其特徵在於，步驟(O中所述近紅外光譜數據為每個樣品重複掃描2-100次的平均光譜數據；所述黃色素含量的測定方法為分光光度法。
7.如權利要求6所述一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法，其特徵在於，所述近紅外光譜數據為每個樣品重複掃描4次的平均光譜數據；所述分光光度法為紫外-可見分光光度法。
8.如權利要求7所述一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法，其特徵在於，在掃描近紅外光譜時，樣品杯直徑為50— 140mm，深度為10 — 25mm，解析度為I一5nm，掃描範圍950—1650nm,溫度為22—25°C;所述紫外-可見分光光度法測量黃色素含量的方法包括以下步驟:每Ig的全麥粉用5ml的水飽和正丁醇進行萃取，將萃取液轉入2 — IOml的離心管中，在4000— 5000 r/min的離心速率下，離心8 —10 min，得上清液，然後以水飽和正丁醇溶液為空白對照，在436.5nm波長下測定上清液的吸光度並計算黃色素的含量；其中所述全麥粉的制粉篩網直徑為0.5一0.8mm,所述全麥粉用量為3.0一6.0g,萃取時間為Ih,所用比色皿為光路長1.0cm, 1.4—3.5ml的半微量紫外石英比色皿。
9.如權利要求8所述一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法，其特徵在於，所述樣品杯直徑75mm，深度25mm，所述解析度為2nm，溫度為25°C ;所述全麥粉的制粉篩網直徑為0.5mm,全麥粉用量為3.0g,離心管體積為2ml，離心速率4000 r/min,離心時間lOmin，所述比色皿容量為1.4ml。
10.如權利要求1一9任一所述一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法在檢測小麥籽粒黃色素含量中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測小麥籽粒中黃色素含量的方法，該方法主要以化學定量檢測為基礎，利用近紅外光譜分析儀和分析軟體，對近紅外光譜數據先後通過一階導數和標準正態變量轉換法進行預處理，採用偏最小二乘法和多元線性回歸算法建立定標模型並進行優化處理，將優化的模型再植入到近紅外光譜分析儀中，利用近紅外光譜掃描實現快速預測小麥籽粒黃色素含量。該方法實現了對小麥育種早期世代大批量材料的簡便、快速、高效、高通量、低成本、無汙染、不破壞樣品和多組分同時測定的目的，為小麥育種快速篩選高、低黃色素含量小麥新品種(系)提供了一種新方法。
文檔編號G01N21/31GK103149174SQ20131008790
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月19日 優先權日2013年3月19日
發明者殷貴鴻, 高豔, 唐建衛, 韓玉林, 黃峰, 王麗娜, 於海飛, 楊光宇, 李新平 申請人:周口市農業科學院