神經氨酸苷酶的純化方法

2023-05-29 20:21:36 3

專利名稱：神經氨酸苷酶的純化方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢驗技術領域，具體涉及一種在醫學檢驗中使用的神經氨酸苷酶的純化方法。
背景技術：
N-乙醯神經氨酸(N-Acetylneuraminic Acid，NANA)，俗稱唾液酸(Sialic acid, SA)，主要分布於哺乳動物體內，血管內皮細胞內含量尤其豐富。人體血清中總唾液酸 (total sialic acid，TSA)含量約為1. 5 2. 5mmol/L，包括游離唾液酸和結合唾液酸。其中游離唾液酸的含量較低，約為1 3ymol/L;與脂蛋白和糖蛋白結合的唾液酸即結合唾液酸，是血清中唾液酸的主要存在形式。
正常代謝時，人體血清中唾液酸含量穩定。當組織細胞惡變時，細胞表面糖蛋白在結構和功能上均發生明顯改變，結合在糖蛋白上的唾液酸隨異常表達的糖蛋白脫落入血， 是血液中唾液酸含量升高的原因之一。許多研究發現帶瘤動物及腫瘤患者的瘤體及血液中唾液酸含量增加並隨病情的加重而升高、隨病情的緩解而降低，因此在臨床檢驗中唾液酸常被作為惡性腫瘤存在和發展監控的一個指標，被廣泛地應用於很多腫瘤的診斷和監控中。
目前，在臨床檢驗中，通常通過神經氨酸苷酶(Neuraminidase，ΝΑ)來進行檢測血清樣本中的唾液酸含量。其反應原理為神經氨酸苷酶催化水解與糖蛋白、寡糖連接的N-乙醯神經氨酸殘基，使唾液酸糖苷鍵斷裂生成游離的N-乙醯神經氨酸，N-乙醯神經氨酸在神經氨酸醛縮酶的作用下生產成丙酮酸和甘露糖胺，丙酮酸與NADH在乳酸脫氫酶(LDH)的作用下生成乳酸和NAD+，而NADH在340nm有特異性吸收，通過檢測NADH的減少量就可以檢測出血清樣本中的唾液酸含量。其反應過程如下
神經氨酸苷酶唾液酸(結合型)-^ N-乙醯神經氨酸
神經氨酸醛縮酶 N-乙醯神經氨酸- N-乙醯甘露糖胺+丙酮酸
LDH丙酮酸+ NADH + H+- 乳酸+ NAD+
該檢測方法具有操作簡單快捷、準確安全、可自動化分析等優點，被廣泛應用於臨床醫學檢驗中。但由於血清中N-乙醯神經氨酸與糖蛋白、寡糖可以α 2_3、α 2_6、α 2_8、α 2_9鍵等多種形式連接，而目前神經氨酸苷酶由於純度不高等原因，使其底物特異性結合能力低， 不能和全部的與糖蛋白、寡糖連接的N-乙醯神經氨酸殘基特異性結合，從而導致N-乙醯神經氨酸殘基不能全部從糖蛋白、寡糖上解離下來，最終影響了該檢測方法的檢測精確度。發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種神經氨酸苷酶的純化方法，該方法純化得到的神經氨酸苷酶純度高、底物特異性結合能力高，用該神經氨酸苷酶進行檢測人體血清中唾液酸含量精確度高。
本發明所採用的技術方案為
一種神經氨酸苷酶的純化方法，包括以下操作步驟
(1)超濾濃縮量取產脲節桿菌(ArthrcAacter Ureafaciens)的發酵液上清1 20L,進行膜超濾，用緩衝液A對超濾後的濃縮液進行稀釋至0. 5 10L，稀釋具體為進行對半稀釋操作3 5次；
(2)硫酸銨沉澱緩慢加入226 516g硫酸銨，攪拌20 40min後靜置1 5h， 5000 15000g離心10 30min，去上清，沉澱用緩衝液B溶解到100 1000ml，攪拌充分後透析過夜，透析後樣品電導< 1. 5ms/cm ；
(3) DEAE瓊脂糖凝膠FF柱層析DEAE瓊脂糖凝膠FF柱用緩衝液B平衡後，將透析後樣品進行上樣，緩衝液B平衡，緩衝液C洗脫，收集洗脫樣品；
(4)苯基瓊脂糖凝膠FF柱層析往收集的洗脫樣品中加入(NH4)2SO4使終濃度達到 0. 6 0. 8M，然後苯基瓊脂糖凝膠FF柱用緩衝液D平衡，將加入了(NH4) 2S04的洗脫樣品進行上樣，緩衝液D平衡，緩衝液E洗滌，緩衝液F洗脫；
(5)將步驟(4)得到的洗脫樣品進行超濾濃縮後用緩衝液B進行換液，然後凍幹。
以上操作均在0 5 °C條件下進行。
以上緩衝液々、8、(、03、？分別是
緩衝液A 10 IOOmM Tris-HCl, 100 500mM NaCl，ρΗ6· 5 8. 5 ；
緩衝液B :10 IOOmM Tris-HCl, ρΗ 6. 5 8. 5 ；
緩衝液C :10 IOOmM Tris-HCl, 10 IOOOmM NaCl，ρΗ6· 5 8. 5 ；
緩衝液D 10 IOOmM Tris-HCl, 0. 7 0. 9M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 8. 5 ；
緩衝液E 10 IOOmM Tris-HCl, 0. 4 0· 6M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 8. 5 ；
緩衝液F 10 IOOmM Tris-HCl, 0. 2 0· 4M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 8. 5。
經過實驗表明，通過本發明純化方法得到的神經氨酸苷酶純度高、底物特異性結合能力高，用該神經氨酸苷酶進行檢測人體血清中唾液酸含量精確度高。


附圖所示的是本發明神經氨酸苷酶的純化方法中神經氨酸苷酶的SDS-PAGE電泳圖。其中，條帶1 對照例2的神經氨酸苷酶樣品；條帶2 對照例1的神經氨酸苷酶樣品； 條帶3 實施例1的神經氨酸苷酶樣品；條帶4 實施例2的神經氨酸苷酶樣品；條帶5 實施例3的神經氨酸苷酶樣品。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明作進一步具體描述，但不局限於此。
實施例1
一種神經氨酸苷酶的純化方法，包括以下操作步驟
(1)超濾濃縮量取產脲節桿菌(ArthrcAacter Ureafaciens)的發酵液上清1L，進行膜(中空纖維膜，型號uzep 503，天津膜天膜工程有限公司)超濾，用緩衝液A對超濾後的濃縮液採用對半稀釋操作4次的方法進行稀釋至0. 5L ；
(2)硫酸銨沉澱緩慢加入226g硫酸銨，攪拌30min後靜置lh，5000g離心lOmin， 去上清，沉澱用緩衝液B溶解到100ml，攪拌充分後在IL緩衝液B中透析(透析袋CMW8000) 過夜；
(3) DEAE瓊脂糖凝膠FF柱層析DEAE瓊脂糖凝膠FF柱(25mmX 15cm)用緩衝液B 平衡後，將透析後樣品進行上樣，緩衝液B平衡，緩衝液C洗脫，收集洗脫樣品；
(4)苯基瓊脂糖凝膠FF柱層析往收集的洗脫樣品中加入(NH4)2SO4使終濃度達到0.6M，然後苯基瓊脂糖凝膠FF柱(25mmX15cm)用緩衝液D平衡，將加入了(NH4)2SO4W 洗脫樣品進行上樣，緩衝液D平衡，緩衝液E洗滌，緩衝液F洗脫；
(5)將步驟(4)得到的洗脫樣品進行超濾濃縮(P2B010A05，MILLIP0RE)後用緩衝液B進行換液，然後凍幹。
以上操作均在O 5 °C條件下進行。
以上緩衝液A、B、C、D、E、F分別是
緩衝液A =IOmM Tris-HCl, IOOmM NaCl，pH 6. 5 ；
緩衝液B =IOmM Tris-HCl, pH 6. 5 ；
緩衝液C =IOmM Tris-HCl, IOOmM NaCl，ρΗ6· 5 ；
緩衝液D =IOmM Tris-HCl, 0. 7M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 ；
緩衝液E =IOmM Tris-HCl, 0. 4M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 ；
緩衝液F =IOmM Tris-HCl, 0. 2M(NH4)2SO4, ρΗ6· 5。
取凍幹的樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結果見附圖中條帶3。
將上述方法純化得到的神經氨酸苷酶對待測血清樣品1 5中的唾液酸進行檢測，採用的方法如下取100 μ 1血清加入到880 μ l，pH 7. 5,0. IM Tris-HCl緩衝液(Sigma) 中，加入Img上述方法純化得到的神經氨酸苷酶和1 μ 1 N-乙醯神經氨酸醛縮酶(Roche)， 37°C水浴孵育lOmin，空白調零，再往反應杯中加入0. 6mg β -NADH(Sigma)，混勻，讀取 340nm吸光度值(Atl)，加入1 μ 1乳酸脫氫酶(sigma)，混合均勻，37°C水浴孵育lOmin，記錄 340nm吸光度(A1)，神經氨酸酶對血清中結合唾液酸的解離活性以A1-Atl表示，結果見表1。
實施例2
一種神經氨酸苷酶的純化方法，包括以下操作步驟
(1)超濾濃縮量取產脲節桿菌(ArthrcAacter Ureafaciens)的發酵液上清20L， 進行膜(中空纖維膜，型號uzep 503，天津膜天膜工程有限公司)超濾，用緩衝液A對超濾後的濃縮液採用對半稀釋操作4次的方法進行稀釋至IOL ；
(2)硫酸銨沉澱緩慢加入516g硫酸銨，攪拌30min後靜置釙，15000g離心 30min,去上清，沉澱用緩衝液B溶解到IOOOml，攪拌充分後在IOL緩衝液B中透析(透析袋 CMW8000)過夜；
(3) DEAE瓊脂糖凝膠FF柱層析DEAE瓊脂糖凝膠FF柱(25mmX 15cm)用緩衝液B 平衡後，將透析後樣品進行上樣，緩衝液B平衡，緩衝液C洗脫，收集洗脫樣品；
(4)苯基瓊脂糖凝膠FF柱層析往收集的洗脫樣品中加入(NH4)2SO4使終濃度達到0.8M，然後苯基瓊脂糖凝膠FF柱(25mmX15cm)用緩衝液D平衡，將加入了(NH4)2SO4W洗脫樣品進行上樣，緩衝液D平衡，緩衝液E洗滌，緩衝液F洗脫；
(5)將步驟(4)得到的洗脫樣品進行超濾濃縮(P2B010A05，MILLIP0RE)後用緩衝液B進行換液，然後凍幹。
以上操作均在0 5 °C條件下進行。
以上緩衝液A、B、C、D、E、F分別是
緩衝液A =IOOmM Tris-HCl, 500mM NaCl，pH 8. 5 ；
緩衝液B IOOmM Tris-HCl, pH 8. 5 ；
緩衝液C IOOmM Tris-HCl, IOOOmM NaCl，ρΗ8· 5 ；
緩衝液D IOOmM Tris-HCl, 0. 9M(NH4)2SO4, ρΗ8· 5 ；
緩衝液E IOOmM Tris-HCl, 0. 6M(NH4)2SO4, ρΗ8· 5 ；
緩衝液F =IOOmM Tris-HCl, 0. 4M(NH4)2SO4, ρΗ8· 5。
取凍幹的樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結果見附圖中條帶4。
將上述方法純化得到的神經氨酸苷酶對待測血清樣品1 5中的唾液酸進行檢測，檢測方法同實施例1，檢測結果見表1。
實施例3
一種神經氨酸苷酶的純化方法，包括以下操作步驟
(1)超濾濃縮量取產脲節桿菌(ArthrcAacter Ureafaciens)的發酵液上清5L， 進行膜(中空纖維膜，型號uzep 503，天津膜天膜工程有限公司)超濾，用緩衝液A對超濾後的濃縮液採用對半稀釋操作4次的方法進行稀釋至2. 5L ；
(2)硫酸銨沉澱緩慢加入361g硫酸銨，攪拌30min後靜置lh，IOOOOg離心 15min,去上清，沉澱用緩衝液B溶解到500ml，攪拌充分後在IOL緩衝液B中透析(透析袋 CMW8000)過夜；
(3) DEAE瓊脂糖凝膠FF柱層析DEAE瓊脂糖凝膠FF柱(25mmX 15cm)用緩衝液B 平衡後，將透析後樣品進行上樣，緩衝液B平衡，緩衝液C洗脫，收集洗脫樣品；
(4)苯基瓊脂糖凝膠FF柱層析往收集的洗脫樣品中加入(NH4)2SO4使終濃度達到0.8M，然後苯基瓊脂糖凝膠FF柱(25mmX15cm)用緩衝液D平衡，將加入了(NH4)2SO4W 洗脫樣品進行上樣，緩衝液D平衡，緩衝液E洗滌，緩衝液F洗脫；
(5)將步驟(4)得到的洗脫樣品進行超濾濃縮(P2B010A05，MILLIP0RE)後用緩衝液B進行換液，然後凍幹。
以上操作均在0 5 °C條件下進行。
以上緩衝液A、B、C、D、E、F分別是
緩衝液A :20mM Tris-HCl, 150mM NaCl，pH 7. 5 ；
緩衝液B :20mM Tris-HCl, pH 7. 5 ；
緩衝液C :20mM Tris-HCl, IOOmM NaCl，ρΗ7· 5 ；
緩衝液D :20mM Tris-HCl, 0. 8M(NH4)2SO4, ρΗ7· 5 ；
緩衝液E :20mM Tris-HCl, 0. 5M(NH4)2SO4, ρΗ7· 5 ；
緩衝液F :20mM Tris-HCl, 0. 3M(NH4)2SO4, ρΗ7· 5。
取凍幹的樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結果見附圖中條帶5。
將上述方法純化得到的神經氨酸苷酶對待測血清樣品1 5中的唾液酸進行檢測，檢測方法同實施例1，檢測結果見表1。
對照例1 用市售的神經氨酸苷酶(來源於Arthrobacter ureafaciens)進行 SDS-PAGE電泳，電泳結果見附圖中條帶2，並對待測血清樣品1 5中的唾液酸進行檢測， 檢測方法同實施例1，檢測結果見表1。
對照例2 用市售的神經氨酸苷酶(來源於Clostridium perfringens)進行 SDS-PAGE電泳，電泳結果見附圖中條帶1，並對待測血清樣品1 5中的唾液酸進行檢測， 檢測方法同實施例1，檢測結果見表1。
由附圖可知，實施例1、實施例2、實施例3純化的得到的神經氨酸苷酶蛋白SDS-PAGE電泳條帶清晰、雜帶鮮見，與市售神經氨酸苷酶(來源於ArthrcAacter ureafaciens，對照例1)類似，說明經過本發明的純化方法得到的神經氨酸苷酶純度高。
表 權利要求
1. 一種神經氨酸苷酶的純化方法，其特徵在於包括以下操作步驟(1)超濾濃縮量取產脲節桿菌的發酵液上清1 20L，進行膜超濾，用緩衝液A對超濾後的濃縮液進行稀釋至0. 5 IOL ；(2)硫酸銨沉澱緩慢加入2 516g硫酸銨，攪拌20 40min後靜置1 5h，5000 15000g離心10 30min，去上清，沉澱用緩衝液B溶解到100 1000ml，攪拌充分後透析過夜；(3)DEAE瓊脂糖凝膠FF柱層析DEAE瓊脂糖凝膠FF柱用緩衝液B平衡後，將透析後樣品進行上樣，緩衝液B平衡，緩衝液C洗脫，收集洗脫樣品；(4)苯基瓊脂糖凝膠FF柱層析往收集的洗脫樣品中加入(NH4)2SO4使終濃度達到 0. 6 0. 8M，然後苯基瓊脂糖凝膠FF柱用緩衝液D平衡，將加入了(NH4) 2S04的洗脫樣品進行上樣，緩衝液D平衡，緩衝液E洗滌，緩衝液F洗脫；(5)將步驟(4)得到的洗脫樣品進行超濾濃縮後用緩衝液B進行換液，然後凍幹，以上操作均在0 5°C條件下進行；以上緩衝液A、B、C、D、E、F分別是緩衝液 A 10 IOOmM Tris-HCl，100 500mM NaCl，ρΗ6· 5 8. 5 ；緩衝液 B :10 IOOmM Tris-HCl，ρΗ6. 5 8. 5 ；緩衝液 C :10 IOOmM Tris-HCl，10 IOOOmM NaCl，ρΗ6· 5 8. 5 ；緩衝液 D :10 IOOmM Tris-HCl,0. 7 0. 9Μ(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 8. 5 ；緩衝液 E :10 IOOmM Tris-HCl,0. 4 0. 6Μ(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 8. 5 ；緩衝液 F :10 IOOmM Tris-HCl,0. 2 0. 4Μ(NH4)2SO4, ρΗ6· 5 8. 5。
全文摘要
本發明提供了一種神經氨酸苷酶的純化方法，它包括超濾濃縮；硫酸銨沉澱；DEAE瓊脂糖凝膠FF柱層析；苯基瓊脂糖凝膠FF柱層析；然後換液，凍幹。以上操作均在0～5℃條件下進行。用該方法純化得到的神經氨酸苷酶純度高、底物特異性結合能力高，用該得到的神經氨酸苷酶進行檢測人體血清中唾液酸含量精確度高。
文檔編號C12R1/06GK102517267SQ20111043869
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月12日 優先權日2011年12月12日
發明者沃燕波, 賈江花, 鄒炳德 申請人:寧波美康生物科技有限公司