糖蛋白組合物的製作方法

2023-06-11 09:12:21

專利名稱：：糖蛋白組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及包含具有改變的糖基化模式的糖蛋白的組合物。更具體地本發明涉及包含具有Fc區的糖蛋白的組合物，其中約80-100%的糖蛋白包含成熟的核心碳水化合物結構，該結構缺乏巖藻糖，附著於糖蛋白的Fc區。
背景技術：
：抗體抗體是顯示與特定抗原結合的特異性的蛋白。天然抗體通常是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，不同免疫球蛋白的同種型(isotype)的重鏈間二硫鍵數目不同。每條重鏈和每條輕鏈也都具有規則排列的鏈間二硫橋。每條重鏈在一個末端具有可變區(VH)和多個恆定區。每條輕鏈在一個末端具有可變區(VO,在其另一末端具有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一恆定區並列，輕鏈的可變區與重鏈的可變區並列。據信特定胺基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區之間形成界面。術語"可變的"指不同抗體的可變區特定部分的序列差異極大，並導致每種特定抗體對其特定抗原的結合特異性。然而，該可變性在抗體的可變區中並非均勻分布。它主要集中在輕鏈和重鏈可變區中稱為互補決定區(CDRs)的三個片段中。可變區較保守的部分稱為框架區(FRs)。天然重鏈和輕鏈的可變區各包含四個FRs,大多數採用由三個CDRs連接的p-摺疊構型，這三個CDRs形成連接P-摺疊結構的環，在某些情況下形成P-摺疊結構的一部分。每條鏈中的CDRs由FRs緊密相連，並且與來自另一條鏈的CDRs一起形成抗體的抗原結合位置(見Kabat等，SequencesofproteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但顯示多種效應器(effectorflmctions)功能。根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，抗體或免疫球蛋白可分為不同種類。主要有五種免疫球蛋白IgA，IgD，IgE,IgG和IgM，其中幾種可被進一步分成亞類(同種型)，例如IgGl，IgG2，IgG3，和lgG4;IgAl和IgA2。相應於免疫球蛋白不同種類的重鏈恆定區分別稱為a,5,s，y，和iu。不同的人免疫球蛋白種類中，已知只有人IgGl,IgG2，IgG3和IgM活化補體；並且人IgGl和IgG3介導ADCC比IgG2和IgG4更有效。圖1A顯示了天然IgGl的圖示，該圖示表明了天然抗體分子的各個部分。抗體經木瓜蛋白酶消化可產生兩個相同的抗原結合片段(稱為"Fab"片段)和殘餘的"Fc"片段，每個"Fab"片段都具有單獨的抗原結合位點，"Fc"片段的名稱反應了其易於結晶的能力。已測定人IgGFc區的晶體結構(Deisenhofer，J/oc/7em/w720:2361-2370(1981))。在人IgG分子中，通過木瓜蛋白酶在N末端到Cys226的切割產生Fc區。Fc區對抗體的效應器功能很重要。本發明還涉及其它抗體樣分子。例如，已有文獻報導"免疫粘附素"，它組合了異源蛋白(例如受體，配體或酶)的結合結構域和Fc區的效應器功能。此種分子的實例是美國專利5,610,297所述的腫瘤壞死因子受體-IgG(TNFR-IgG)免疫粘附素。已描述雙特異免疫粘附素和抗體-免疫粘附素嵌合體。Stabila,P"淑匿胸ec/2，16:1357(1998)描述了另一種包含Fc區、胞漿膜錨著的融合蛋白。在該對比文件中，該融合蛋白結合位於胞漿膜的II型跨膜結構域，該跨膜結構域融合於Fc區的N末端。抗體和免疫粘附素正^皮用作人類疾病的治療劑。(Glennie等/^wm/"o/.7b(iay21:403-410(2000);King等,CwrOp/".Z>wgZ)/scove^yZ)ew/op2:110-117(1999);Vaswani等，j〃w^爿w/2/wa/wmwo/.81:105-119(1998);和Abraham等，/她m^wf騰wa/TTzew.MeW"gowSe戸、，Deauville，France(1995))。這些抗體和免疫粘附素中的一些可不利用抗體效應器^l制起作用，例如與受體或配體結合併因此阻斷配體受體相互作用的那些。其它可能需要募集(recruit)免疫系統來殺死靶細胞(Clynes等iVamMet/.6:443畫446(2000);Clynes等屍A^S(X/S/i」95:652-656(1998);和Anderson等所oc/ze肌5bcTraw.25:705-708(1997))。抗體的效應器功能抗體Fc區介導的效應器功能可分成兩類(l)抗體與抗原結合後啟動的效應器功能(這些功能涉及補體級聯作用或具有Fc受體(FcR)的細胞的參與)；和(2)不依賴抗原結合起作用的效應器功能(這些功能賦予在循環中的持續性和通過胞轉(transcytosis)越過細胞屏障轉移的能力)。Ward和Ghetie，7Tzera/ew/z.c7m/Mwo/ogy2:77-94(1995)。儘管抗體與必需抗原的結合具有中和效應，可防止外來抗原與其內源性靶點(例如受體或配體)的結合，但結合本身不能去除外來抗原。為有效去除和/或破壞外來抗原，抗體應具有對其抗原的高親合力和有效的效應器功能。抗體和抗體-抗原複合物與免疫系統細胞的相互作用產生多種應答，包括抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和補體依賴的細胞毒作用(CDC)(綜述見Dagron'/mwwwo/.15:203-234(1997);Ward和Ghetie，772en3/ewdc/wmwwo/.2:77-94(1995);k乂及Ravetch和Kinet，Zev./畫,/.9:457-492(1991))。Fc受體(FcRs)介導若干抗體效應器功能，該受體結合抗體的Fc區。按照對免疫球蛋白同種型的特異性定義FcRs;IgG抗體的Fc受體稱為FcyR,IgE抗體的Fc受體稱為FcyR，IgA抗體的Fc受體稱為FcryR，以此類推。已鑑定FcyR的三種亞類FcyRI(CD64)，FcyRn(CD32)和FcyRIII(CD16)。由於每種FcYR亞類由二個或三個基因編碼，並且可選地，RNA剪拼產生多種轉錄物，因此存在大量不同的FcyR同種型。編碼FcyRI亞類(FcyRIA，FcyRIB和FcYRIC)的三種基因聚集在染色體1長臂上的lq21.1區；編碼FcyRII亞類(FcyRIIA，FcyRIIB和FcyRIIC)的基因和編碼FcYRIII(FcyRIIIA和FcyRIIIB)的兩種基因都聚集在lq22區。這些不同的FcR亞型在不同的細胞類型上表達(綜述見Ravetch和Kinet，Wev./wwwwo/.9:457-492(1991》。例如在人體內，FcyRIIIB只見於中性粒細胞，而FcyRIIIA見於巨嗟細胞，單核細胞，自然殺傷細胞(NK)和T細胞亞群。結構上，FcyR是免疫球蛋白超家族的所有成員，具有結合IgG的oc鏈，其胞外部分由二個FcyRI和FcyRIII或三個(FcyRI)Ig樣結構域組成。此外，FcYRI和FcYRIII具有附加的蛋白鏈(Y，它們與在信號轉導中起作用的a鏈相連。受體也由其對IgG的親合力而被鑑別。FcyRI對IgG顯示高親合力，Ka二108-l9M"(Ravetch等j朋.iev./mww"o/.19:275-290(2001))，而且可結合單體IgG。相反FcyRII和FcyRIII對單體IgG顯示相對較弱的親合力，K^l7m"(Ravetch等iev./mmw"o/.19:275-290(2001))，並因此只與多聚體免疫複合物相互作用。FcyRII受體包括FcyRIIA("活化受體，，)和FcyRIIB("抑制受體")，其具有類似的胺基酸序列，它們的主要差別在其胞漿區。活化受體FcyRIIA的胞漿區包含免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB的胞漿區包含免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)(見DaSron,力畫.7ev,/畫,/.15:203-234(1997)中的綜述)。NK細胞只攜帶FcyRIIIA，而且抗體與FcyRIIIA的結合導致NK細胞產生ADCC活性。在人群中發現了若干人FcyR的等位基因變體。已證明這些等位基因變體形式在與人和鼠IgG的結合中顯示差異，一些聯合研究也將臨床結果與特定等位基因形式聯繫起來(見Lehrnbecher等94(12):4220-4232(1999))。已有對FcyRIIA的兩種形式R131和H131以及它們與臨床結果的關係的若干研究。(Hatta等awd/www"/(y1:53-60(1999);Yap等Lw戸8:305-310(1999);和Lorenz等乂/www"oge"e"cs22:397-401(1995))。而僅現在正在研究FcyRIIIA的兩種等位基因形式F158和V158(Lehrnbecher等，見上文；和Wu爭J!C7/"./"veW.100(5):1059-1070(1997))。FcyRinA(Vall58)的同種異型與人IgG的反應優於FcYRIIIA(Phel58)的同種異型(Shields等J5/。/.Ozem.276:6591-6604(2001);Koene等說ood90:1109-1114(1997);和Wu等乂C/Z"./"ve"100:1059-1070(1997))。Fc受體的另一種類型是新生兒Fc受體(FcRn)。FcRn在結構上與主要組織相容性複合物(MHC)相似，並且由與P-微球蛋白非共價結合的ot鏈組成。據稱FcRn調節血液中IgG的動態平衡並可能控制組織間的胞轉作用。(Ghetie等力聽.iev./畫,/.18:739-766(2000))。"較低鉸鏈區，，(EU索引編號見Kabat等，Sequenceso//raWrao//w麗wo/og7'ca//"temsf,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991))。Woof等Mo/ec./wmw"o/.23:319-330(1986);Duncan等A^we332:563(1988);Canfield和Morrison,/似W.173:1483-1491(1991);Chappel等，iVoc.Ato/.爿c^/.88:卯36-9040(1991)。在殘基233-239中，據稱P238和S239可能參與結合。可能參與同FcyR結合的其它已述區域是G316-K338(人IgG)結合人FcyRI(僅通過序列比對；沒有評估取代突變體)(Woof等Mo/ec./wmw"o/.23:319-330(1986));K274-R301(人IgGl)結合人FcYRIII(根據肽)(Sarmay等Mo/ec./mwwwo/.21:43-51(1984));Y407-R416(人IgG)結合人FcyRIII(根據肽)(Gergely爭所oc/^肌5bc.!Trara.12:739-743(1984));以及N297和E318(小鼠IgG2b)結合小鼠FcyRII(Lund等，Mo/ec/mmw"o/.29:53-59(1992))。也見Armour等/www"o/.29:2613-2624(1999)。WO00/42072(Presta)描述了具有對FcRs增強或降低的結合的多肽變體。該專利公開的內容包含於本文中作為參考。也見Shields等J所o/.Ozem.9(2):6591-6604(2001).Clq和兩種絲氨酸蛋白酶，Clr和Cls，形成複合物Cl,它是補體依賴的細胞毒作用(CDC)途徑的第一組分。Clq是六價分子，其分子量約為460,000，並且具有^C比作一束鬱金香花的結構，在該結構中，六個互相粘《連的"莖，，與六個^求開j頭區相連。Burton和Woof,爿dv""cw/"/wmw"o/.51:1-84(1992)。為活化補體級聯反應，需要Clq與IgGl，IgG2或IgG3中至少兩個分子結合(大多數人認為IgG4不活化補體)，但只需要與一個IgM分子結合，從而附著於抗原耙點。Ward和Ghetie,777era/ew"c/wmw"o/ogy2:77-94(1995)p80。基於化學修飾和晶體學研究，Burton等Atowre,288:338-344(1980)認為IgG上補體亞成分Clq的結合位點涉及CH2區最後兩個(C末端)卩鏈。Burton後來認為(Mo/ec.^wmmo/.，22(3):161-206(1985))包含胺基酸殘基318到337的區可能參與補體固定。Duncan和WinterAtowe332:738-40(1988)，利用定點誘變，報導Glu318,Lys320和Lys322形成對Clq的結合位點。Duncan和Winter的數據是通過檢測小鼠IgG2b同種型與豚鼠Clq的結合產生的。通過包含這些殘基的短合成肽抑制補體介導的溶解的能力證實了Glu318，Lys320和Lys322殘基在Clq的結合中的角色。類似的結果在1997年7月15日公開的美國專利5,648,260和1997年4月29日公開的美國專利5,624,821中被公開。通過分析人IgG亞類行使補體介導的細胞溶解的能力表明殘基Pro331參與Clq結合。IgG4中Ser331突變成Pro331可賦予其活化補體的能力。(Tao等，《/Exp.Med,178:661-667(1993);Brekke等，￡wk/www"o/"24:2542-47(1994》.通過比較Winter組和Tao等以及Brekke等的文章的數據，Ward和Ghetie在其綜述中推斷至少有兩個不同的區參與Clq的結合一個在CH2區的p鏈上，包含Glu318，Lys320和Lys322殘基，另一個區的位置在與同一P鏈緊鄰的轉向(turn)處，包含位置331上的關鍵胺基酸殘基。其它報導稱位於較低鉸鏈區的人IgGl殘基Lys235，和Gly237,在補體固定和活化中起重要作用。Xu等，J/zwrnmo/.150:152A(Abstract)(1993)。1994年12月22日公開的W094/29351報導人IgGl的Clq和FcR的結合必需的胺基酸殘基位於CH2區的N末端區，即殘基231到238處。據稱IgG結合Clq和活化補體級聯反應的能力也有賴於位於兩個CH2區之間的碳水化合物部分(通常錨著於Asn297)的存在、缺失或修飾。Ward和Ghetie,TherapeuticImmunology2:77-94(1995),第81頁。美國專利6，194,551B1和W099/51642中描述了具有改變的Fc區的胺基酸序列和增加或降低的Clq結合能力的多肽變體。那些專利公開的內容包含於本文中作為參考。也見爭J.Immunol.164:4178-4184(2000)。其它增強免疫系統募集的方法包括雙特異抗體，其中抗體的一條臂結合IgG受體(Segal等J.Immunol.Meth.248:1-6(2001);以及細胞因子-IgG融合蛋白(Penichet等J.Immunol.Meth.248:91-101(2001))。抗體的糖基化許多多肽，包括抗體，經過涉及碳水化合物部分的多種翻譯後修飾，例如以寡糖糖基化。此種糖基化的多肽稱為"糖蛋白"。若干因素影響糖基化。物種，組織和細胞類型對糖基化發生的方式很重要。此外，通過改變胞外環境的培養環境例如血清濃度，可能對糖基化有直接的影響。(Lifely等Gfyco6/o/ogy5(8):813-822(1995))。多種方法可改變特定宿主有機物的糖基化模式，包括引入或過度表達參與寡糖產生的特定酶(美國專利5,047,335;美國專利5,510,261)。這些方案不限於細胞內方法(美國專利5,278,299)。所有抗體在重鏈恆定區的保守位置包含碳水化合物。每種抗體同種型都具有多種獨特的N連接的碳水化合物結構。除了附著於重鏈的碳水化合物，約30%的人IgGs具有糖基化的Fab區。IgG在CH2區的Asn297具有單一的N連接雙觸角碳水化合物。本文圖2顯示附著於Asn297的充分加工後的碳水化合物結構。就連接於Asn297的碳水化合物而言，來自血清或在體外由雜交瘤製備或由改造後的細胞產生的IgG是異源性的。Jefferis等Immunol.Rev.163:59-76(1998);和Wright等TrendsBiotech15:26-32(1997)。對於人IgG，核心寡糖通常由GlcNAc2Man3GlcNAc組成，其外部殘基的數目不同。本文的圖2顯示將寡糖加工成成熟碳水化合物的方法。當初期合成的種類Glu3Man9GlcNac2自核糖體脫出時，將它轉移至抗體CH2區的Asn297。糖蛋白經過內質網時三個末端葡萄糖被修剪，此後糖蛋白移向高爾基體內側網絡(cisGolgi)，在該處甘露糖殘基經ot甘露糖苷酶的作用被去除。加工可停止於該結合點，產生高甘露糖基化的糖蛋白。否則，加工可繼續進行產生Man5GlcNac2。高爾基體中間囊泡(medicalGolgi)上的N-乙醯葡糖胺醯轉移酶(N-acetylglycosaminyltransferase)I是複合寡糖合成中的限速步驟。在高爾基體中間和外側網絡中，寡糖經進一步加工修剪去掉甘露糖殘基，並順序加入糖殘基。新合成的糖蛋白隨後離開高爾基體，並被轉運至細胞膜或被分泌。通過半乳糖和/或半乳糖-唾液酸在兩個末端GlcNac的附著或通過第三個GlcNAc臂(對分(bisecting)GlcNAc)的附著產生單個IgG間的變異。已對連接於IgG的Asn297的碳水化合物進行了研究。碳水化合物的缺失影響與Clq和FcyR的結合(並因此影響補體活化和ADCC)。Leatherbarrow等Mo/ec./mmw"o/.22:407-415(1985);Duncan等iVamre332:738-740(1988);Walker等石/0c/7e肌J259:347-353(1989);Dorai等/fy6〃^w^10:211-217(1990);和HoranHand等Ca"cer/mmwwo/./m附w"o,/ze^35:165-174(1992)。儘管與FcRn的結合看似未受碳水化合物缺乏的影響，(Hobbs爭Mo/ec./www朋/.29:949-956(1992);和Kim等￡wk//wmmo/.24:542-548(1994))，但對清除的影響是不確定的。(Dorai等/fy6n^/oma10:211-217(1990);HoranHand等Cawcer7mmwwo/./m/wwwof/zeK35:165-174(1992);Hobbs爭A/o/ec./mmmo/.29:949-956(1992);Kim等五w:J/wmw"o/,24:542-548(1994);Wawrzynczak等B/oc/zew.Soc,!Tra肌17:1061-1062(1989);和Tao等《//m畫肌143:2595-2601(1989))。當存在碳水化合物時，糖殘基的性質也可影響IgG效應器功能。據報導末端半乳糖殘基的存在或缺失可影響功能(Wright等J/w/mwo/.160:3393-3402(1998))並似乎與類風溼性關節炎相關(Parekh等A^we316:452-457(1985))。自患有多發性骨髓瘤的病人血清中分離的人IgG在巖藻糖，半乳糖和對分N-乙醯葡糖胺的存在/缺失方面顯示極端情況。(Parekh等A^m316:452-457(1985))。Raju等描述了不同物種的IgG糖基化的變異(Raju等G/yco^o/o"10(5):477-486(2000))。Boyd等發現通過糖肽酶F的消化從源於CHO的CAMPATH-1H去除末端唾液酸不影響任何待測IgG活性，而發現從去除唾液酸後的CAMPATH-1H中去除多數半乳糖殘基降低(但不完全破壞)補體溶解活性。其它活性未受去半乳糖基化的影響。Boyd等Mo/ec./wwwwo/.32(17/18):1311-1318(1995)。Kumpel爭，我6od7/>^^omas,5(3-4):143-151(1994)報導人IgG單克隆抗體的半乳糖基化影響Fc受體介導的功能活性。Rothman等檢驗了自雜交瘤純化的單克隆IgG的ADCC功能，所述雜交瘤經在碳水化合物加工途徑中的不同階段起作用的糖普酶抑制物的處理。Rothman等Mo/ecw/w/mww"o/.26(12):1113-1123(1989)。經慄樹精胺(castanospermine)(抑制自初生寡糖去除葡萄糖殘基(Kaushal等M"/z.￡"2^wo/.230:316-329(1994)))處理後，僅表達Fcr/RIII的NK細胞顯示增強的ADCC,而其它類型的效應細胞例如單核細胞則不顯示增強的ADCC。凝集素結合分析顯示慄樹精胺處理後的IgG缺乏巖藻糖；然而經慄樹精胺處理產生的IgG可能具有其它的碳水化合物結構，例如高甘露糖基化以及末端葡萄糖殘基(Kaushal等Me仇￡"，0/.230:316-329(1994);Hashim等/酬,/ogy63:383-388(1988);Hashim等Mo/ec./ww""o/.24:1087-1096(1987))，它們在由未處理的細胞分泌或來自人血清的IgG上未^皮常規地發現。WO97/30087描述了糖基化抗體的製備，其中抗體Fc區的N糖基化位置被雙觸角(biantennary)的寡糖取代。Umana等將(3(l,4)-A^乙醯葡糖胺轉移酶III(GcTIII)基因引入中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，該酶催化向附著於抗體的Asn297的碳水化合物核心上添加對分GlcNAc。認為通過改造的CHO細胞產生的糖基化形式具有最優化的ADCC。見WO99/54342和Umana等，A^wreAo&c/wo/ogv，17:176-180(1999)。W098/58964(Raju等)描述了抗體組合物，其中基本上所有N連接的寡糖是G2寡糖。G2指具有兩個末端Gals而不具有NeuAcs的雙觸角結構。W099/22764(Raju等)指其CH2區基本上不包含具有N連接的Gl，G0或G-l寡糖的糖蛋白的抗體組合物。Gl指具有一個Gal而不具有NeuAcs的雙觸角結構，GO指其中不存在末端NeuAcs或Gals的雙觸角結構，而G-l指核心單位減去一個GlcNAc。WO00/61739報導了YB2/0(大鼠骨髓瘤)細胞表達的抗-hlL-5R抗體的47。/。具有al-6巖藻糖連接的糖鏈，而NSO(小鼠骨髓瘤)細胞表達的該抗體的73%具有該糖鏈。不同宿主細胞表達的a-hlL-5R抗體的巖藻糖相對比例是YB2/0<CHO/d<NSO。Routier等研究了CHO-DUKX細胞表達的人源化IgGl抗體(D1.3)的糖基化模式。CHO表達的該抗體的N-多糖結構是具有核心巖藻糖但缺乏對分GlcNAc和唾液酸的雙觸角N-多糖。因其末端半乳糖基化不同，上述結構是異質的，並因此被稱作G2，Gi和G0。Routier爭G7ycoco"乂wga^J14:201-207(1997)。已有報導O-連接的巖藻糖見於一些多肽中而且附著的巖藻糖對多肽的適當活性很重要。見W098/33924，其描述了以O-巖藻糖部分進行糖基化的方法。Stankova等《//www"o/.135(6):3719-3728(1985)發現巖藻糖顯著增強混合白細胞培養(MCL)物誘導的或預孵育的效應細胞的溶細胞能力。Cameron等/附mw"o/.11:39-44(1985)發現a-L-巖藻糖在巨噬細胞-腫瘤細胞相互作用中起重要作用。本領域持續需要產生諸如抗體等具有改良生物活性的糖蛋白。發明綜述本發明涉及具有Fc區的糖蛋白的糖蛋白組合物，組合物中約80-100%(優選約90-99%)的糖蛋白包含缺乏巖藻糖的成熟核心碳水化合物結構，該結構附著於糖蛋白的Fc區。令人吃驚地，在本文中此種組合物與FcyRIIIA(F158)的結合顯示增強100倍，但與人IgG的相互作用方面不及FcyRinA(V158)有效。因此，預計本文的組合物優於前述的組合物，尤其是對於治療表達FcyRIIIA(F158)的人類病人。通常情況下，健康的非洲裔美國人和白人中，FcyRIIIA(F158)比FcyRIIIA(V158)更常見。見Lehrnbecher等94:4220(1999)。本發明進一步證實由於本文的糖基化變體與糖蛋白Fc區的胺基酸序列修飾的結合導致FcyRIII結合和/或ADCC功能的協同增加。為產生具有增強的ADCC活性的Fc區胺基酸序列變體，技術人員通常改造具有增強的對FcyRIII的結合親合力的Fc區變體，其被認為是介導ADCC的重要FcR。例如，技術人員可將胺基酸修飾(例如取代)引入親本Fc區的胺基酸位點256，290,298，312，326，330，333，334,360,378或430中的任何一個或多個位置以產生此種變體。具有增強的對FcYRIII的結合親合力的變體可進一步具有降低的對FcyRII的結合親合力，尤其是對抑制性FqRIIB受體的親合力。在優選的實施方案中，Fc區在位置298，333和334具有胺基酸取代，例如S298A/E333A/K334A。具有改變的胺基酸序列的Fc區進一步包含更進一步增強ADCC的糖基化改變。例如，變體Fc區可附著於缺乏巖藻糖的成熟核心碳水化合物結構。因此，本發明提供包含具有Fc區的糖蛋白的組合物，組合物中的糖蛋白的約51-100%包含缺乏巖藻糖的成熟核心碳水化合物結構，並附著於糖蛋白的Fc區，而且其中的Fc區包含與天然序列Fc區不同的胺基酸序列。更優選地，組合物中的糖蛋白約80-100%包含缺乏巖藻糖的成熟核心碳水化合物結構，並更優選，組合物中的糖蛋白約卯-99%缺乏附著於成熟核心碳水化合物結構的巖藻糖。例如，所述糖蛋白可包括抗體和免疫粘附素。糖蛋白通常包含Fc區，優選人Fc區；例如人IgGl,IgG2，IgG3或IgG4的Fc區。糖蛋白顯示對FcyRin(例如FcyRIIIA(F158)和/或FcyRIIIA(V158))的增強的結合，並且相對於具有附著於其成熟核心碳水化合物結構的巖藻糖的糖蛋白ADCC增強。本發明還提供藥物製劑，它包含糖蛋白和可選的藥用載體或稀釋劑。可以用於治療的製劑是無菌的並可以是凍幹的。本文涉及所述糖蛋白的診斷和治療用途。在診斷應用中，本發明提供確定感興趣抗原的存在的方法，包括將包含該抗原的可疑樣品暴露於糖蛋白，並測定糖蛋白對樣品的結合。在治療應用中，本發明提供治療患有可從此種治療中獲益的疾病或有患該疾病傾向的哺乳動物的方法，包括對哺乳動物使用治療有效量的本文的組合物，尤其在該組合物是藥物製劑時。本發明進一步提供了包含編碼糖蛋白的核酸的宿主細胞，該糖蛋白包含Fc區，其中宿主細胞產生的糖蛋白的約80-100%包含成熟核心碳水化合物結構，該結構缺乏附著於糖蛋白Fc區的巖藻糖。此外，本發明提供了生產糖蛋白的方法，包括培養宿主細胞以表達所述核酸，並且可選地，自宿主細胞培養物中回收糖蛋白(例如從宿主細胞培養基中)。本發明進一步提供了可用於治療疾病的製品或試劑盒中的糖蛋白。更具體地，本申請涉及下列內容1.包含具有Fc區的糖蛋白的組合物，該組合物中約80-100%的糖蛋白包含成熟的核心碳水化合物結構，該結構缺乏巖藻糖，附著於糖蛋白的Fc區。2.項1的組合物，其中的糖蛋白包括抗體。3.項1的組合物，其中Fc區包括人IgGFc區。4.項3的組合物，其中人IgGFc區包括人IgGl，IgG2，IgG3或IgG4的Fc區。5.項1的組合物，其中的糖蛋白結合FcyRIII。6.項5的組合物，與具有附著於糖蛋白Fc區的包含巖藻糖的成熟核心碳水化合物結構的糖蛋白相比，該組合物中的糖蛋白以更好的親合力結合FcyRIII，或者更有效地介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用。7.項2的組合物，其中抗體是嵌合的，人源化的或人的抗體。8.項2的組合物，其中抗體結合選自如下的抗原B細胞表面標誌物，ErbB受體，腫瘤相關抗原或血管生成因子。9.項2的組合物，其中抗體結合CD20,HER2，血管內皮生長因子(VEGF)，CD40,或前列腺幹細胞抗原(PSCA)。10.項9的組合物，其中抗體包括人源化抗-HER2抗體，嵌合抗-CD20抗體和人源化抗-VEGF抗體。11.項1的組合物，該組合物中約90-99%的糖蛋白包含成熟核心碳水化合物結構，該結構缺乏巖藻糖，附著於糖蛋白的Fc區。12.項l的組合物，其中糖蛋白由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生。13.項12的組合物，其中CHO細胞是Lecl3細胞。14.項1的組合物，其中糖蛋白基本不含附著於成熟核心碳水化合物結構的對分N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)。15.項1的組合物，其中糖蛋白含有附著於成熟核心碳水化合物結構的對分N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)。16.項1的組合物，其中糖蛋白含有附著於成熟核心碳水化合物結構的一個或多個半乳糖殘基。17.項1的組合物，其中糖蛋白基本不含附著於成熟核心碳水化合物結構的一個或多個半乳糖殘基。18.項1的組合物，其中糖蛋白含有附著於成熟核心碳水化合物結構的一個或多個唾液酸殘基。19.項1的組合物，其中糖蛋白基本不含附著於成熟核心碳水化合物結構的一個或多個唾液酸殘基。20.項1的組合物，它是一種藥物製劑。21.項20的藥物製劑，進一步包含可藥用的載體。22.項1的組合物，它是無菌的。23.項1的組合物，它是凍幹的。24.項1的組合物，其中糖蛋白是免疫粘附素。25.包含具有Fc區的糖蛋白的組合物，該組合物中約51-100%的糖蛋白包含成熟核心碳水化合物結構，該結構缺乏巖藻糖，並附著於糖蛋白的Fc區，其中Fc區包含與天然序列Fc區不同的胺基酸序列。26.項25的組合物，對其中的Fc區殘基採用EU編號，該Fc區包含胺基酸位置256，290,298，312，326，330，333，334,360，378或430中的任何一個或多個位置上的胺基酸取代。27.項26的組合物，其中Fc區包含對位置298，333和334中的任何二個或三個殘基的胺基酸取代。28.項27的組合物，其中Fc區包含對位置298，333和334的胺基酸取代。29.項28的組合物，其中位置298,333和334上的取代殘基是丙氨酸。30.—種製品，其包括谷為，所述容器上的標籤；和包含在所述容器內的項1的組合物。31.項30的製品，其中容器上的標籤說明該組合物可用於治療癌症，自身免疫性疾病，炎性疾病，感染，或其它需要去除細胞或組織的病症。32.治療哺乳動物的方法，包括以有效治療能從該治療獲益的哺乳動物的疾病的量，將項1的組合物用藥於哺乳動物。33.項32的方法，其中的哺乳動物是人。34.項33的方法，其中所述的人表達FcyRIII(F158)。35.項32的方法，其中所述的疾病或病症選自癌症，自身免疫性疾病，炎性疾病，感染，或其它需要去除細胞或組織的病症。36.包含編碼糖蛋白的核酸的宿主細胞，該糖蛋白包含Fc區，其中由該宿主細胞產生的糖蛋白約80-100%包含成熟核心碳水化合物結構，該結構缺乏巖藻糖，並附著於糖蛋白的Fc區。37.項36的宿主細胞，其為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。38.產生糖蛋白的方法，包括培養項36的宿主細胞以便表達所述核酸。39.項38的方法，進一步包括自宿主細胞培養物回收所述糖蛋白。40.項39的方法，進一步包括將所述糖蛋白與異源分子偶聯。41.項40的方法，其中的異源分子是細胞毒劑或酶。附圖簡述圖1A是天然IgG和其經酶消化所產生的各種抗體片段的圖示。以CH1和CL區和兩個CH2區之間的雙線代表二硫鍵。V是可變區；C是恆定區；L代表輕鏈而H代表重鏈。圖1B顯示附著於血清IgG的Asn297的經充分加工或"成熟，，的核心碳水化合物結構(2100)，具有單個半乳糖殘基(2110)的成熟核心碳水化合物結構以及具有兩個半乳糖殘基和一個對分GlcNAc(3120)的核心碳水化合物結構。本圖顯示的四位編號系統反映了GlcNAc，巖藻糖，半乳糖和唾液酸殘基各自的編號。圖2顯示將寡糖添加到IgGCH2區的Asn297，隨後在高爾基體內側、中間和外側對其進行加工以產生充分加工的複合雙觸角碳水化合物結構。慄樹精胺抑制自初生寡糖去除葡萄糖和甘露糖殘基。圖3顯示具有正常巖藻糖代謝的CHO細胞表達的抗體上發現的重鏈(Fc)寡糖。在整個和實施例中，使用以下名稱"Hu4D5"是人源化抗-HER24D5抗體的簡稱，中國倉鼠卵巢筒稱為"CHO"，15cm板中培養的CHO-DP12細胞命名為"CHO-P，，，旋轉培養瓶(spinnerflask)中培養的CHO-DP12細胞命名為"CHO-S"，人胚胎腎293細胞簡稱為"HEK293","Lec13"代表由AlbertEinsteinCollegeofMedicineofYeshivaUniversityBronx,NewYork的PamelaStanley提供的具有巖藻糖代謝缺陷的CHO細胞系。在其Fc區具有S298A/E333A/K334A取代的Hu4D5稱為"Hu4D5-AAA"，"E27"是美國專利6,172,213描述的親合力成熟的/人源化的抗-IgE抗體，在其Fc區具有S298A/E333A/K334A取代的E27稱為"E27-AAA",外周血單個核細胞抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用簡稱為"PBMCADCC"。圖4顯示Hu4D5單體與人FcyRI的結合。Hu4D5抗體在CHO-S，HEK293細胞，CHO-P,或Lecl3CHO細胞(不同的兩批)中表達。圖5顯示Hu4D5二聚體與人FcyRIIB的結合。Hu4D5抗體在CHO-S或Lecl3細胞(不同的三批)中表達。圖6顯示Hu4D5二聚體與人FcyRIIA(R131)的結合。Hu4D5抗體在CHO-S或Lecl3細胞(不同的三批)中表達。圖7顯示Hu4D5二聚體與人FcyRIIA(R131)的結合。Hu4D5抗體在CHO-S或Lecl3細胞中表達(不同的三批)。圖8人FcylIIA(V158):Hu4D5二聚體的結合，該圖顯示CHO-S或Lecl3細胞(分別是不同的三批和兩批)中表達的Hu4D5或Hu4D5-AAA二聚體與人FcylIIA(V158)的結合。圖9人Fc丫IIIA(F158):Hu4D5二聚體的結合，該圖顯示CHO-S或Lecl3細胞(不同的三批)中表達的Hu4D5二聚體或Lecl3細胞(不同的兩批)中表達的Hu4D5-AAA二聚體與人FcylIIA(F158)的結合。圖10顯示抗-IgE(E27)二聚體與人FcYRIIIA(V158)的結合。在該試驗中檢測了HEK293細胞，CHO-P細胞(兩批)或Lecl3細胞(兩批)中表達的E27。圖11顯示抗-IgE(E27)二聚體與人FcyinA(F158)的結合。在該試驗中檢測了HEK293細舉，CHO-P細胞(兩批)或Lecl3細胞(兩批)中表達的E27。圖12抗-IgEE27六聚體與人FcyIIIA(F158)的結合，該圖顯示抗-IgE(E27)六聚體和E27-AAA與FcyinA(F158)的結合。該抗體是在CHO-P，Lecl3或HEK293細胞中表達的。圖13抗-IgEE27六聚體與々FcyniA(V158)的結合，該圖顯示抗-IgE(E27)六聚體和E27-AAA與F(yylIIA(V158)的結合。該抗體是在CHO-P,Lecl3或HEIC293糹田月包中表達的。圖14mAb與人FcRn的結合，該圖顯示CHO-P,CHO-S或Lecl3細胞中表達的Hu4D5與人FcRn的結合。圖15mAb與人Clq的結合，該圖顯示Hu4D5和抗-CD20(RITUXAN⑧)與人Clq的結合。Hu4D5在CHO-P或Lecl3細胞(兩批)中表達。RITUXAN⑧在CHO-P細胞中表達。圖16mAb與人Clq的結合，該圖代表Hu4D5或RITUXAN⑧與人Clq的結合。用於本試驗的Hu4D5在CHO-P,Lecl3(不同的三批)或CHO-S細胞中表達。RITUXAN⑧在CHO-P細胞中表達。圖17利用FcyRIIIVF供體0557顯示對SKBR3乳腺腫瘤細胞的PBMCADCC(E:T30:1)。顯示了自發ADCC與由CHO-S或Lecl3細胞中表達的Hu4D5產生的ADCC的比較。圖18利用另一種FcyRIIIVF供體8059顯示對SKBR3乳腺腫瘤細胞的PBMCADCC(E:T30:1)。顯示了自發ADCC與由CHO-S或Lecl3細胞中表達的Hu4D5產生的ADCC的比較。圖19利用FcyRIIIFF供體9123顯示對SKBR3乳腺腫瘤細胞的PBMCADCC(E:T30:1)。顯示了自發ADCC與由CHO-S或Lecl3細胞中表達的Hu4D5產生的ADCC的比較。圖20利用另一種FcyRIIIFF供體1497顯示對SKBR3乳腺腫瘤細胞的PBMCADCC(E:T30:1)。顯示了自發ADCC與由CHO-S或Lecl3細月包中表達的Hu4D5產生的ADCC的比較。圖21利用FcyRIIARR供體8764顯示對SKBR3乳腺腫瘤細胞的PBMCADCC(E:T10:1)。利用FcyRIIARR供體顯示對SKBR3乳腺腫瘤細胞(E:T10:1)的PBMCADCC。顯示了自發ADCC與由CHO-S或Lecl3細胞(不同的兩批)中表達的Hu4D5產生的ADCC的比較。圖22利用FcyRIIAHH供體9730顯示對SKBR3乳腺腫瘤細胞的PBMCADCC(E:T10:1)。顯示了自發ADCC與由CHO-S或Lecl3細胞中表達的Hu4D5產生的ADCC的比較。圖23顯示天然序列IgGFc區的比對。顯示了天然序列人IgGFc區的序列，humlgGl(非-A和A同種異型)(分別為SEQIDNOs:l和2)，humlgG2(SEQIDNO:3)，humlgG3(SEQIDNO:4)和h腦IgG4(SEQIDNO:5)。人IgGl序列是非-A同種異型，並在人IgGl序列下顯示了該序列與A同種異型的差異(位置356和358;EU編號系統)。也顯示了天然序列小鼠IgGFc區的序列，murlgGl(SEQIDNO:6),murlgG2A(SEQIDNO:7),murlgG2B(SEQIDNO:8)和murlgG3(SEQIDNO:9)。圖24顯示Hu4D5和Hu4D5-AAA與CD56陽性自然殺傷(NK)細胞的結合。被才企物是(1)FITC偶聯的抗-人IgG，(2)來自CHO-S的Hu4D5，(3)Lec13細胞中表達的Hu4D5，和(4)Lec13細胞中表達的Hu4D5-AAA。圖25顯示表達FcyRIII(F/F)受體的純化的NK細胞的免疫螢光染色。圖26提供了來自CHO-S的Hu4D5，來自Lecl3細胞的Hu4D5，來自Lec13細胞的Hu4D5-AAA，和來自HEK293細胞的Hu4D5的NKADDC活性的比較。供體是FcyRIII(F/F)。圖27用不同的FcYRIII(F/F)供體重複了圖26中的試^^。圖28顯示抗-HER2Hu4D5單體與穩定轉染人FcyRIIIAa鏈和y鏈的CHO細胞系的結合(一次實驗的圖示)。Hu4D5CHO-S，空心環；Hu4D5Lecl3-D，空心正方形；Hu4D5Lecl3-E，空心菱形；Hu4D5Lecl3-F,空心三角形；Hu4D5HEK293-AAA，實心環；Hu4D5Lecl3-AAA-B,實心正方形；Hu4D5Lecl3-AAA-C,實心菱形。優選實施方案詳述I.定義在本說明和權利要求書中，免疫球蛋白重鏈中殘基的編號使用EU索引，^口Kabat等戶斤述，tSegwe"c&so/pra/e/wso/Tmwwwo/og/ca//"&reW，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),第5版，其引入本文中作為參考。"Kabat中的EU索引，，指人IgGlEU抗體的殘基編號。將參考通常用於描述寡糖的命名法描述本發明的碳水化合物部分。使用該命名法的碳水化合物化學的綜述見Hubbard等Jm7.iev.Bz'oc/z^w.50:555-583(1981)。該命名法包括，例如，Man代表甘露糖；GlcNAc代表2-N-乙醯葡糖胺；Gal代表半乳糖；Fuc代表巖藻糖；和Glc代表葡萄糖。通過以簡化符號NeuNAc代表5-N-乙醯神經氨酸，NeuNGc代表5-乙醇醯4申糹至氨酸(5-glycolylneuraminic)4苗述p垂'液酉臾。術語"糖基化"指寡糖(包含兩個或更多連接在一起的單糖的碳水化合物，例如連接在一起的二到約十二個單糖)與糖蛋白的附著。寡糖側鏈通常通過N或O連接與糖蛋白的骨幹連接。本發明的寡糖通常作為附著於Fc區的CH2區的N連接的寡糖出現。"N-連接的糖基化"指碳水化合物部分附著於糖蛋白鏈中的天冬醯胺殘基。本領域熟練技術人員已知，例如小鼠IgGl，IgG2a,IgG2b和IgG3中的每一種，以及人IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgDCH2區在胺基酸殘基297具有單獨的N連接糖基化位點(Kabat等5^e"e"ceso/蛋^s"糖蛋白"是具有一個或多個附著於它的寡糖側鏈的多肽。本文的"成熟核心碳水化合物結構"指附著於Fc區的加工後的核心碳水化合物結構，通常由以下碳水化合物結構組成，GlcNAc(巖藻糖)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)2，該結構通常是下圖所示的雙觸角寡糖該術語特別包含缺乏p-l,2GlcNAc殘基的核心成熟碳水化合物結構的G-l形式。然而，優選該核心碳水化合物結構包含兩種(3-l,2GlcNAc殘基。本文的成熟核心碳水化合物結構通常不是高甘露糖基化的。成熟核心碳水化合物結構通常通過與Fc區的CH2區的Asn297之間的N連接，附著於糖蛋白的Fc區。"對分GlcNAc"是附著於成熟核心碳水化合物結構的pi,4甘露糖的GlcNAc殘基。通過p(l,4)-N-乙醯葡糖胺醯轉移酶III(GnIII)的作用，對分GlcNAc可附著於成熟核心碳水化合物結構。CHO細胞通常不表達GnTIII(Stanley等S/o/.C&w,261:13370-13378(1984))，但經改造可以表達之(Umana等A^fww5z'o&c/z.17:176-180(1999))。"基本不含"一個或多個選定的糖基(例如對分GlcNAc,—個或多個半乳糖殘基，或一個或多個唾液酸殘基)的糖蛋白通常由將選定的糖基添加到成熟核心碳水化合物結構上有缺陷的宿主細胞產生，例如組合物中約90-100%的糖蛋白缺乏附著於成熟核心碳水化合物結構的選定的糖基。"糖苷酶"是涉及天冬醯胺連接的(N-連接的)糖蛋白的生物合成的酶。"修剪(trimming)"酶是除去寡糖的酶，而"轉移酶"添加寡糖。糖香酶的實例包括修剪性葡萄糖苷酶(trimmingglucosidase)例如葡萄糖苷酶I和葡萄糖苷酶II;修剪甘露糖苷酶例如粗面內質網甘露糖苷酶(rER甘露糖普酶)，甘露糖苷酶IA,甘露糖苷酶IB和甘露糖香酶II;以及轉移酶如糖基轉移酶，例如((l，4)-N-乙醯葡糖胺醯轉移酶in(GnTIII),Gal-轉移酶，唾液酸轉移酶和巖藻糖轉移酶。"糖苦酶抑制物"指降低或阻止通過一種或幾種糖苷酶所進行的N-連接的寡糖加工的化合物或組合物。實例包括，野艽黴素(nojirimycin)，1-脫氧野艽黴素(l-deoxynojirimycin)(dNM)，iV-曱基-l-脫氧-野艽黴素(M-dNM)，慄樹精胺(castanospermine)，溴環己烯四醇(bromoconduritol)，1-脫氧甘露野艽黴素(l-deoxymannojirimycin)(dMM)，australine，MDL，lentiginosine，和苦馬豆素(Swainsonine)(Sw)。糖苦酶抑制物的綜述見Fuhrmann等5/oc/2/m.所c^/^義爿cto825:95-110(1985);Kaushal和Elbein,A^AoA/"五"2yw.230:316-329(1994);和Elbein，A.FASS55:3055-3063(1991)。"Lecl3"指凝集素抗性中國倉鼠卵巢(CHO)突變細胞系，該細胞系顯示有缺陷的巖藻糖代謝，並因此具有降低的將巖藻糖添加到複合碳水化合物的能力。該細胞系在Ripka和Stanley,5bwa/z'cCe〃c&Mo/ec.12(1):51-62(1986);和Ripka等^rc/z.Aoc/zem.B/0//7;^.249(2):533-545(1986)中描述並可自AlbertEinsteinCollegeofMedicineofYeshivaUniversity,Bronx,NewYork獲得。據信Lecl3細胞缺乏GDP-D-甘露糖-4，6-脫水酶的轉錄物，該酶是巖藻糖代謝的關鍵酶。Ohyama等《/CTzew.273(23):14582-14587(1988)。GDP-D-甘露糖-4,6-脫水酶從GDP-甘露糖產生GDP-甘露糖-4-酮-6-D-脫氧甘露糖，後者隨後被FX蛋白轉化成GDP-L-巖藻糖。巖藻糖基化寡糖的表達有賴於GDP-L-巖藻糖供體底物和巖藻糖轉移酶。"巖藻糖轉移酶"是將一個或多個巖藻糖添加於糖蛋白的酶。實例包括P-l，6-巖藻糖轉移酶，FucTI，FucTII，FucTIII,FucTIV，FucTV,FucTVI和FucTVII。Uozumi等/所o/,Ozew.271:27810-27817(1996)，和Yanagidani等/5/oc/7ew.121:626-632(1997)分別描述了豬和人al,6-巖藻糖轉移酶。"唾液酸轉移酶"是將一個或多個唾液酸殘基添加到糖蛋白的酶。a2，3唾液酸轉移酶可將唾液酸殘基添加到附著於成熟核心碳水化合物結構的半乳糖殘基。"半乳糖轉移酶"是將一個或多個半乳糖殘基添加到糖蛋白的酶。Pl，4-半乳糖轉移酶可將半乳糖殘基添加到成熟核心碳水化合物結構。術語"包含Fc區的糖蛋白"指糖蛋白，例如包含Fc區的抗體或免疫粘附素。術語"Fc區"用於定義免疫球蛋白重鏈的C末端區，例如，如圖1A所示。Fc區可以是天然序列Fc區或變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈Fc區的邊界可變，人IgG重鏈Fc區通常被限定為自胺基酸殘基Cys226位點，或自位點Pro230延伸至該重鏈羧基端的區段。免疫球蛋白的Fc區通常包括兩個恆定區，CH2區和CH3區，如圖1A所示。"功能性Fc區"包括天然序列Fc區的"效應器功能"。"效應器功能"的實例包括Clq結合；補體依賴的細胞毒作用(CDC);Fc受體結合；抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)，吞噬作用；細胞表面受體下調(例如B細胞受體，BCR)等。此種效應器功能通常需要Fc區與結合區(例如抗體的可變區)相組合，並可使用例如本文公開的多種方法對其進行評估。"天然序列Fc區"包括與天然發現的Fc區的胺基酸序列相同的胺基酸序列。天然序列人Fc區顯示於圖23，並包括天然序列人IgGlFc區(非-A和A同種異型)；天然序列人IgG2Fc區；天然序列人IgG3Fc區和天然序列人IgG4Fc區以及其天然存在的變體。天然序列小鼠Fc區也顯示於圖23。天然序列Fc區的其它實例包括天然序列人IgAFc區和天然序列人IgDFc區。"變體Fc區"包含經過本文限定的至少一個"胺基酸修飾"，與天然Fc區的胺基酸序列不同的胺基酸序列。優選，變體Fc區與天然序列Fc區或與親代多肽Fc區相比具有至少一個胺基酸取代，例如天然序列Fc區中或親代多肽Fc區中從約一個到約十個胺基酸取代，例如從約一個到約十個胺基酸取代，優選天然序列Fc區中或親代多肽Fc區中從約一個到約五個胺基酸取代。本文的變體Fc區將優選與天然序列Fc區和/或親代多肽Fc區具有至少約80%的同一性，更優選地至少約90%的同一性，更優選地至少約95%的同一性。"同一性"定義為經過序列比對胺基酸序列變體中相同殘基的百分比，並在必要時引入缺口以獲得序列最大百分比的同一性。本領域技術人員熟悉比對的方法和計算^L程序。一種這樣的計算^l程序是"ALIGN-2"，該程序由Genentech，Inc.授權，其原始碼已連同用戶手冊於1991年11月10日提交美國版權局，華盛頓特區，20559，"Fc受體"或"FcR"描述結合抗體Fc區的受體。優選的FcR是天然序列人FcR。而且，優選的FcR是結合IgG抗體(y受體)和包括FcyRI、FcyRII和FcyRIII亞類的受體，包括等位基因變體和這些受體的不同剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體，，)，這兩種受體具有相似胺基酸序列，它們的差別主要在胞漿區域。活化受體FcyRIIA的胞漿區包含免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB的胞漿區包含免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)(參見Daeron，Annu.Rev.Immunol.,15:203-2349(1997)中的綜述)。本文的Fc受體包括兩種已知天然存在的人FcyRII同種異型，即FcyRII(H131)和FcyRII(R131)(由位置131的胺基酸決定(Clark等//mmw"o/.143:1731-1734(1989))),和人FcyRIIIA的天然存在的同種異型。人FcyRIIIA在位置48(Leu，His或Arg)和位置158(Val或Phe)上具有天然存在的同種異型。F(7RIIIA(V158)同種異型與人IgG的反應優於Fc7RIIIA(Fl58)同種異型(Shields等/所o/.C7ze肌276:6591-6604(2001);Koene等90:1109-1114(1997);和Wu等J/"veW,100:1059-1070(1997))。有關FcRs的綜述可參見Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991);Capel等，Immunomenthods，4:25隱34(1994);和deHaas等，Lab.Clin.Med.，126:330-41(1995)。其它FcRs，包括有待將來鑑定的那些，均包含於本文術語"FcR"中。該術語還包i舌新生兒受體，FcRn，其負責將IgGs由母體轉運至胎兒(Guyer等，J.Immunol.,117:587(1976)和Kim等，J.Immunol"24:249(1994))。"抗體依賴細胞介導的細胞毒作用"或"ADCC"指一種細胞介導的反應，其中表達FcRs的非特異細胞毒作用細胞(例如自然殺傷(NK)細胞，中性粒細胞和巨噬細胞)識別耙細胞上的結合抗體並隨後？1起耙細胞的溶解。介導ADCC的主要細胞，NK細胞只表達FcyRIII，而單核細胞表達FcyRI、FcyRII和FcyRIII。造血細胞上FcyR的表達在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991)464頁的表3中總結。"人效應器細胞"是表達一種或多種FcRs並行使效應器功能的白細胞。優選，該細胞至少表達FcyRIII並行使ADCC效應器功能。介導ADCC的人白細胞的實例包括外周血單個核細胞(PBMC),自然殺傷細胞(NK)，單核細胞，細胞毒性T細胞和中性粒細胞；優選PBMCs和NK細胞。效應器細月包可自其天然來源，例如自血液或PBMCs中分離。"鉸鏈區"通常被定義為人IgGl的自Glu216至Pro230的延伸區域(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。可通過將形成重鏈間S-S鍵的最開始的和最後的半胱氨酸殘基置於相同位置上，來比對其它IgG同種型的4交《連區和IgGl的序列。Fc區的"較低鉸鏈區"通常被限定為緊鄰鉸鏈區C末端殘基的延伸區，即Fc區的殘基233到239。本發明的"CH2"區用於描述具有至少一個N-連接寡糖的附著位點的CH2區，該位點通常在Asn297。本發明的糖蛋白的特徵在於其包含或經修飾而至少包含具有人IgGCH2區的N-連接寡糖的CH2區。優選CH2區是人IgGl的CHy2區。使用免疫球蛋白重鏈殘基編號方式的eu索引，人IgGCH2區通常自Fc區的大約胺基酸231延伸至大約胺基酸340。"CH3區"包括Fc區中C末端到CH2區殘基的延伸區域(即IgG中自大約位點341的胺基酸殘基到大約位點447的胺基酸殘基)。術語"胺基酸"指所有天然存在的a胺基酸的D和L的立體異構形式，及其類似物和衍生物。類似物定義為以通常具有相似性質的不同原子對胺基酸中的原子的取代。衍生物定義為具有附著於它的另一分子或原子的胺基酸。衍生物包括，例如氨基基團的乙醯化，羧基基團的氨化，或將兩個半胱氨酸分子的硫殘基氧化以形成胱氨酸。本文的"多肽，，通常指具有約十個以上胺基酸的肽和蛋白質。多肽可以和表達它的宿主細胞同源，或優選，可以是外源的，意味著它們是異源的，即，對所使用的宿主細胞而言是外來的，例如CHO細胞產生的嵌合的，人源化的或人抗體。術語"抗體，，是指最廣義上的抗體並尤其包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)，多克隆抗體，多特異抗體(例如雙特異抗體)和顯示所需生物活性的抗體片段。用於本發明目的的"抗體片段"包含完整抗體的一部分，通常包括完整抗體的抗原結合區或可變區或抗體的Fc區。抗體片段的實例包括線形抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。本文術語"單克隆抗體"是指自一群基本同質的(homogeneous)抗體群獲得的抗體，即除了少量可能天然存在的突變以外，包含在該群中的各個抗體完全相同。單克隆抗體針對單個抗原位點高度特異。而且，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體製劑相反，每種單克隆抗體針對抗原的單個決定簇。除特異性外，單克隆抗體的優點在於可通過雜交瘤培養來合成，不受其它抗體汙染。修飾詞"單克隆"表明抗體的特點是來自基本同質的抗體群，而不解釋為需通過任何特殊方法產生抗體。例如，根據本發明應用的單克隆抗體可通過Kohler等(Nature，256:495(1975))首先描述的雜交瘤法，或者重組DNA法製備(例如見美國專利4816567)。還可用例如Clackson等(Nature,352:624-628(199l))和Marks等(J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))所述的技術從噬菌體抗體文庫中分離"單克隆抗體"。本文中單克隆抗體特別包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類或亞類的抗體的相應序列相同或同源，但該鏈剩餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類或亞類的抗體(以及此抗體的片段，只要它們顯示所需生物活性)的相應序列相同或同源。美國專利4,816,567;和Morrison等，Pro"Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。非人(例如小鼠)抗體的"人源化"形式是包含非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在很大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受者超變區的殘基被具有所需特異性、親合力和性能的來自非人物種例如小鼠、大鼠或家兔(供體抗體)的超變區殘基所取代。在一些實例中，人免疫球蛋白的Fv框架區(FR)殘基被相應非人殘基取代。而且，人源化抗體可包括在受者抗體或供體抗體中未被發現的殘基。這些修飾旨在進一步改善抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(通常包括兩個)可變區的全部，其中全部或基本上全部超變區環對應於非人免疫球蛋白的超變區環，而全部或基本上全部FR區是人免疫球蛋白序列的FR區。人源化抗體可選還包含至少部分免疫球蛋白恆定區(Fc),通常是人免疫球蛋白的Fc區。詳見Jones等，A^/we321:522-525(1986);Riechmann等，A^,w"332:323-329(1988);和Presta,C髒Qp.&n/".淑.2:593-596(1992)。"人抗體"是具有相應於人產生的抗體的胺基酸序列的抗體和/或使用本文公開的任何一種製備人抗體的技術製備的抗體。人抗體的定義明確排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。使用各種本領域已知的技術可產生人抗體。在一個實施方案中，人抗體選自噬菌體文庫，該噬菌體文庫表達人抗體(Vaughan等A^/ww所o&c/wo/ogy14:309-314(1996):Sheets等屍A^S(C/5^」95:6157-6162(1998));Hoogenboom和Winter,/Mo/.5/o/.，227:381(1991);Marks等，/Mo/.脂.，222:581(1991))。也可通過將人免疫球蛋白基因座引入轉基因動物製造人抗體，該轉基因動物可以是例如內源性免疫球蛋白基因被部分或完全滅活的小鼠。攻擊後觀察人抗體的產生，其與在人中所見的情形在各方面均十分相似，包括基因重排，組裝，和抗體庫。該方法在例如美國專利5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633，425;5，661,016和以下科學出版物中描述Marks等，S/o/Tec/wo/ogy10:779-783(1992);Lonberg等，A/awre368:856-859(1994);Morrison,A^wre368:812-13(1994);Fishwild等，A^wre所otec/z"o/ogy14:845-51(1996);Neuberger,5,她c/zwo/ogy14:826(1996);Lonberg和Huszar,iev./^wmwo/.13:65-93(1995)。可選地，可通過將產生針對目的抗原(此種B淋巴體。見例如，Cole等，單克隆抗體和癌症治療，AlanR.Liss,p.77(1985);Boerner等，//mm畫/.，147(1):86-95(1991);和美國專利5,750,373。本文中術語"超變區"是指抗體上負責與抗原結合的胺基酸殘基。超變區包含來自"互補決定區"或"CDR"的胺基酸殘基(即，輕鏈可變區中的殘基24-34(Ll),50-56(L2)和89-97(L3)，重鏈可變區中的31-35(Hl)，50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等，5"e《we"ceo/prafe/rao//wmwwo/og/ca//"&rn^，第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991))，和/或來自"超變環"的那些殘基(即，輕鏈可變區中的殘基26-32(L1),50-52(L2)和91-96(L3),重鏈可變區中的26-32(Hl)，53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。"框架區"或"FR"殘基是那些可變區的殘基而不是本文定義的超變區殘基。本文中所用術語"免疫粘附素"為抗體樣分子，其組合了異源"粘附素"蛋白(例如受體，配體或酶)的"結合結構域"與免疫球蛋白恆定區。結構上，免疫粘附素包括不同於抗體的抗原識別和結合位點(抗原結合位點)，但具有所需結合特異性的粘附素胺基酸序列(即是"異源性的")與免疫球蛋白恆定區序列的融合。本文的術語"配體結合區"指任何細胞表面的天然受體或其至少保持相應天然受體性質上的配體結合能力的任何區或衍生物。在特定的實施方案中，受體來自於具有胞外區的細胞表面多肽，該多肽與該免疫球蛋白超家族的成員同源。其它不是免疫球蛋白超家族成員但又為該概念明確涵蓋的受體是細胞因子的受體，特別是具有酪氨酸激酶(受體酪氨酸激酶)活性的受體，促紅細胞生成素和神經生長因子受體超家族成員，以及細胞粘附分子，例如(E-，L-和P-)選擇素。術語"受體結合區"指任何受體的天然配體，包括細胞粘附分子，或至少保持相應天然配體性質上的受體結合能力的此種天然配體的任何區或衍生物。此外，該定義特別包括了上述受體的配體的結合序列。"抗體-免疫粘附素嵌合體"包含將抗體(本文的)的至少一個結合區與至少一個免疫粘附素(本文的)結合的分子。抗體-免疫粘附素嵌合體的實例是雙特異CD4-IgG嵌合體，見Berg等，屍A^S(T/5^)88:4723-4727(1991)和Chamow等，乂/www"o/.153:4268(1994)。本文術語"製備物"定義了已被鑑定並分離和/或作為其環境的組分回收的組合物或糖蛋白。該製備物的環境的汙染成分是幹擾組合物或糖蛋白的診斷或治療用途的物質，例如不需要的或不想要的糖形式(glycoform)，並且可包括酶，激素，和其它蛋白或非蛋白溶質。本發明的製備物基本不含這些汙染物。在優選的實施方案中，糖蛋白製備物可被純化(l)至通過Lowry方法測定的抗體重量的95%以上，並最優選大於99%重量，(2)至足以通過採用轉杯式測序儀(spinningcupsequenator)得到N-末端或內部胺基酸序列的至少15個殘基，或(3)至在還原或非還原條件下經SDS-PAGE及考馬斯蘭或優選《艮染色證實為均質。本文的"藥物製劑"是適合用藥於哺乳動物，尤其是人的組合物。因此該組合物可用於治療哺乳動物中的疾病或失調。此外，組合物中的活性成分糖蛋白經過一次或多次純化或分離步驟，使得可能干擾其治療用途的汙染物從中分離出來。通常，藥物製劑包含治療性糖蛋白和可藥用的載體或稀釋劑，其實例在下文描述。該製劑通常是無菌的，也可以是凍幹的。本文的"親本糖蛋白"是除巖藻糖附著於成熟核心碳水化合物結構外，具有與本發明糖蛋白變體相同的胺基酸序列和成熟核心碳水化合物結構的糖蛋白。例如在包含親本糖蛋白的組合物中，約50-100%或約70-100%的親本糖蛋白包含具有附著的巖藻糖的成熟核心碳水化合物結構。以比親本糖蛋白"更好的親合力"結合FcR的糖蛋白變體，是當結合實驗中糖蛋白變體和親本多肽的量基本相同時，以實質好於親本糖蛋白的結合親合力結合任何一種或幾種上述的FcR的糖蛋白。例如，具有提高的FcR結合親合力的變體與親本糖蛋白相比，在FcR結合親合力上可顯示約5倍到約1000倍，例如從約10倍到約500倍的提高，其中按照如本文實施例公開的內容測定FcR結合親合力。與親本多肽相比，"在人效應器細胞存在時更有效地介導抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)"的糖蛋白變體是當結合實驗中糖蛋白變體和親本糖蛋白的量基本相同時，在體外或體內比親本糖蛋白更有效地介導ADCC的糖蛋白。通常，使用本文公開的體外ADCC實驗可鑑定此種糖蛋白變體，但也涉及其它測定ADCC活性的實驗或方法，例如在動物模型中等等。優選的糖蛋白變體介導ADCC的效率比其親本糖蛋白高約1.5倍到約100倍，例如約2倍到約50倍，例如在本文公開的體外實驗中。"胺基酸修飾"指預先測定的胺基酸序列的胺基酸序列中的變化。修飾的實例包括胺基酸取代，插入和/或缺失。本文優選的胺基酸修飾是取代。特定位點的"胺基酸修飾"，例如Fc區的胺基酸修飾，指特定殘基的取代或缺失，或者與特定殘基鄰近的至少一個胺基酸殘基的插入。"鄰近"特定殘基的插入指在其鄰近一至二個殘基內的插入。該插入可位於特定殘基的N末端或C末端。"胺基酸取代，，指以另一個不同的"取代，，胺基酸殘基取代至少一個存在於預測定的胺基酸序列中的胺基酸殘基。取代的一個殘基或多個殘基可以是"天然存在的胺基酸殘基"(即由基因密碼編碼)和選自以下的胺基酸丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬醯胺(Asn);天冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);穀氨醯胺(Gln);穀氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);組氨酸(His);異亮氨酸(Ile);亮氨酸(Leu);賴氨酸(Lys);蛋氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro);絲氨酸(Ser);蘇氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和纈氨酸(Val)。優選，取代殘基不是半胱氨酸。以一個或多個非天然存在的胺基酸進行取代也包含在本文的胺基酸取代概念中。"非天然存在的胺基酸殘基"指能夠共價結合多肽鏈中的鄰近胺基酸殘基的殘基，而不是上述的那些天然存在的胺基酸。非天然存在的胺基酸殘基的實例包括正亮氨酸，鳥氨酸，正纈氨酸，高絲氨酸和其它胺基酸殘基類似物，例如Ellman爭Me仇五"z少m.202:301-336(1991)中描述的那些。為產生此種非天然存在的胺基酸殘基，可使用Noren等5We"ce244:182(1989)和Ellman等，見上文中的方法。簡言之，這些方法涉及以非天然存在的胺基酸殘基以化學方法活化抑制tRNA，並隨後進行RNA的體外轉錄和翻譯。"胺基酸插入"指至少一個胺基酸納入預測定的胺基酸序列。儘管插入通常由一或兩個胺基酸殘基的插入組成，但本發明還涉及更大的"肽插入"，例如約三個到約五個甚至約十個胺基酸殘基的插入。如上述，插入殘基可以是天然存在的或非天然存在的胺基酸殘基。"胺基酸缺失"指自預測定的胺基酸序列去除至少一個胺基酸殘基。"Clq"是包括免疫球蛋白Fc區的結合位置的多肽。Clq和兩種絲氨酸蛋白酶，Clr和Cls,形成複合物C1，其是補體依賴的細胞毒作用(CDC)途徑的第一成分。人Clq可自例如Quidel，SanDiego,CA，作為商品購買。"治療"指治療性療法和防病或預防措施。需要治療的包括那些已患該病或那些需預防該病的人。文中的"疾病，，指任何可從糖蛋白的治療中受益的情況。包括慢性和個實施方案中，該疾病是癌症，自身免疫病，炎性疾病，感染或其它情況例如需要去除不良組織或細胞的曱狀腺腫。本文優選的待治療疾病是癌症或自身免疫病。術語"癌症"和"癌症的"指或描述哺乳動物以失控的細胞生長為典型特徵的病理性情況。癌症的實例包括但不限於，癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病。此種癌症更具體的例子包括鱗狀細胞癌，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌，胃腸道癌，肺鱗狀細胞癌，腹膜癌，肝細胞癌，胰腺癌，膠質母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，乳腺癌，結腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，曱狀腺癌，和各種頭頸部癌。本文的"B細胞惡性疾病"包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，包括低級/濾泡狀NHL，小淋巴細胞性(SL)NHL，中級/濾泡狀NHL，中級瀰漫型NHL，高級免疫母細胞性NHL，高級淋巴母細胞性NHL，高級小非凹陷(non-cleaved)細胞NHL,巨大腫塊(bulkdydisease)NHL,套細胞(mantlecell)淋巴瘤，AIDS-相關的淋巴瘤，和原發性巨球蛋白血症；白血病，包括急性淋巴母細胞白血病(ALL)，慢性淋巴細胞白血病(CLL)，毛細胞白血病和慢性粒細胞白血病；和其它血液系統惡性疾病。針對B細胞表面標誌物例如CD20的抗體可治療此類惡性疾病。"非激素依賴的"癌症是其生長不依賴於同癌症細胞表達的受體結合的激素的存在的一類癌症。施用可降低腫瘤中或其附近的激素濃度的藥物或手術不能使此類癌症發生臨床退化。非激素依賴的癌症的實例包括非雄激素依賴的前列腺癌，非雌激素依賴的乳腺癌，子宮內膜癌和卵巢癌。此種癌症可以開始是激素依賴的腫瘤，然後在抗激素治療後，從激素敏感的階段發展到激素抵抗的肺瘤。本文中"自身免疫病"是一種源自個體自身組織或直接針對個體自身組織的非惡性疾病。自身免疫性疾病或失調的實例包括但不限於，炎性反應例如炎性皮膚病，包括銀屑病和皮炎(如異位皮炎)；系統性硬化和硬皮病，與炎性腸管疾病相關的反應(例如克隆氏病(crohn，sdisease)和潰痴性結腸炎)；呼吸窘迫症候群(包括成人呼吸窘迫綜合症；ARDS);皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結腸炎；腎小球腎炎；過敏性疾病例如溼滲和哮喘以及其它涉及T細胞浸潤的情況和慢性炎性反應；動脈硬化症；白細胞粘附缺陷；類風溼性關節炎；系統性紅斑狼痴(SLE);糖尿病(例如I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病)；多發性硬化；雷諾綜合症；自身免疫性曱狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；乾燥綜合症；幼年型糖尿病；和與細胞因子和T淋巴細胞介導的急性和遲發超敏反應相關的免疫反應，常見於結核，結節病，多肌炎；肉芽腫病和血管炎；惡性貧血(艾迪森氏病)；涉及白細胞滲出的疾病；中樞神經系統(CNS)感染性疾病；多器官損傷症候群；溶血性貧血(包括，但不限於冷球蛋白血症或Coombs陽性貧血)；重症肌無力；抗原-抗體複合物介導的疾病；抗腎小球基底膜病；抗磷脂綜合症；過敏性神經炎；Graves'病；Lambert-Eaton肌無力綜合症；大皰性類天皰痴；天皰^;自身免疫性多發性內分泌病；Reiter，s病；僵人綜合症(stiffmansyndrome);白塞病；巨細月包動脈炎；免疫複合物腎炎；IgA腎病；IgM多發性神經病；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少症等等。"炎性疾病"指由炎症造成的病理狀態，通常由中性粒細胞的趨化作用引起。此種疾病的實例包括銀屑病和異位皮炎；系統性硬化和硬皮病；與炎性腸病相關的反應(例如克隆氏病和潰瘍性結腸炎)；缺血再灌注疾病包括手術組織再灌注損傷，心肌缺血病症例如心肌梗死，心臟驟停，心臟手術後再灌注和經皮穿透冠狀血管擴張術(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty)後收縮，中風，和腹主動脈瘤；繼發於中風的腦水腫，腦外傷；低血容量性休克；暈厥；成人呼吸窘迫綜合症；急性肺損傷；白塞病；皮肌炎；多肌炎；多發性硬化；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；骨關節炎；狼瘡腎炎；自身免疫性疾病例如類風溼性關節炎，乾燥綜合症，血管炎；涉及白細胞滲出的疾病；中樞神經系統(CNS)炎性疾病；繼發於敗血症或外傷的多器官損傷症候群；酒精型肝炎；細菌性肺炎；抗原-抗體複合物介導的疾病包括腎小球腎炎；敗血症；結節病；針對組織/器官移植的免疫病理應答；肺部炎症，包括胸膜炎，肺泡炎，血管炎，肺炎，慢性支氣管炎，支氣管擴張，瀰漫性泛支氣管炎，超敏反應性肺炎，特發性肺纖維化(IPF)，和嚢性纖維化；等等。優選的指徵包括急性肺損傷，成人呼吸窘迫綜合症，缺血再灌注(包括手術組織缺血性損傷，心肌缺血和急性心肌梗死)，低血容量性休克，哮喘，細菌性肺炎和炎性腸管(bowel)病例如潰瘍性結腸炎。自身免疫疾病可能與感染性疾病交疊，或反之。"阻斷"對異體抗原的"免疫應答"指減輕或防止至少一種由於暴露於異體抗原產生的免疫介導的應答。例如，通過預防或降低哺乳動物體內可抑制獨特型；"平定"被同種抗體覆蓋的細胞的去除；和/或通過抗原呈遞細胞的損耗，影響對同種抗原(alloantigen)的呈遞。"外來抗原"指對暴露於它的哺乳動物是非內源或非天然的分子。外來抗原可以引起免疫應答，例如哺乳動物中體液和/或T細胞介導的應答。通常外來抗原會引起針對它的抗體的產生。本文涉及的外來抗原的實例包括免疫原性治療劑，例如蛋白質如抗體，特別是包含非人胺基酸殘基的抗體(例如嚙齒類，嵌合/人源化，和靈長類化抗體)；毒素(可選地與目的分子例如抗體偶聯，其中目的分子也可以是免疫源性的)；基因治療病毒載體，例如逆轉錄病毒和腺病毒；移植物；感染性製劑(例如細菌和病毒)；同種抗原(即在同一物種的有些個體中出現，而在其它個體中不出現的抗原)例如血型的不同，人淋巴細胞抗原(HLA)，血小板抗原，在被移植器官上表達的抗原，血液成分，妊娠抗原(Rh)，和血友病因子(例如因子VIII和因子IX)。本文的"腫瘤相關抗原"是其特徵為在腫瘤細胞上的表達較正常細胞高的抗原。具體實例包括ErbB受體，B細胞表面標誌物，神經節苷酯GD2，GD3和GM2(RagupathiG.，Cawcer/m聽wo/./m畫w/zer.43:152(1996》；CD52(Ginaldi等，Zewfew/aWasearc/22:185(1998));前列腺幹細胞抗原(PSCA);和MAGE(Kirkin等，X屍MZS106:665(1998)).本文的"血管生成因子(angiogenicfactor)"是刺激血管生成的分子。實例包括血管內皮生長因子(VEGF),鹼性或酸性纖維母細胞生長因子(FGF)，和血小板來源的內皮細胞生長因子(PD-ECGF)。"ErbB受體"是屬於ErbB受體家族的受體蛋白酪氨酸激酶，並且包括EGFR,ErbB2，ErbB3和ErbB4受體和將在未來被鑑定的其它成員。ErbB受體通常包含結合ErbB配體的胞外區；親脂跨膜區；保守的細胞內酪氨酸激酶區；和具有若干可被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基末端信號區。術語"ErbBl","表皮生長因子受體"和"EGFR，，在本文可互換使用，並且指如Carpenter等^朋.iev.5/oc/^附.56:881-914(1987)中公開的EGFR，包括其天然存在的突變體形式(例如如Humphrey等/W^5"(X/iS力87:4207-4211(1990)中的缺失突變體EGFR)。e^)Bl指編碼EGFR蛋白產物的基因。術語"ErbB2"和"HER2"在本文可互換使用，並且指例如Semba等，/WA^L/S^)82:6497-6501(1985)和Yamamoto等A^w319:230-234(1986)(Genebank保藏號X03363)中所述的人HER2蛋白。結合HER2的抗體的實例包括4D5，7C2，7F3和2C4,及其人源化變體，包括huMAb4D5-l，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8，如美國專利5,821,337的表3所述，包含於文中作為參考；和WO01/00245中所述的人源化2C4突變體560,561,562，568,569,570，571，574,或56869。W098/17797描述了7C2和7F3以及它們的人源化變體。優選的抗體是那些包含huMAb4D5-8，或人源化2C4突變體574的重鏈和輕鏈可變區的抗體。"Trastuzumab"(HERCEPTIN⑧)是重組DNA來源的人源化抗體，它在基於細胞的檢測中以高親合力結合HER2的胞外區(Kd=5nM)。該抗體是包含變體huMAb4D5-8的重鏈和輕鏈可變區的IgGl抗體，如美國專利5,821,337的表3所述。該抗體由CHO-DP12細胞產生。"ErbB3"和"HER3"指在例如美國專利5,183,884和5,480,968以及Kraus等86:9193-9197(1989)中公開的受體多肽。本文術語"ErbB4"，，和"HER4"指在例如歐洲專利申請599,274;Plowman等，Ato/.Am/.5W.t/5^，90:1746-1750(1993);和Plowman等，Atow陽,366:473-475(1993)中公開的受體多肽，包括1999年4月22日公布的W099/19488中公開的其同種型。本文的"B細胞表面標誌物"是在B細胞表面表達的抗原，它可作為與之相結合的抗體的靶向目標。B細胞表面標誌物的實例包括CD10，CD19，CD20，CD21,CD22，CD23,CD24,CD40,CD37,CD53,CD72,CD73,CD74,CDw75,CDw76,CD77,CDw78，CD79a，CD79b，CD80,CD81,CD82,CD83,CDw84，CD85和CD86白細胞表面標誌物。特別感興趣的B細胞表面標誌物是那些與哺乳動物的其它非B細胞組織相比，優先表達在B細胞上的標誌物，並可在前體B細胞和成熟B細胞上表達。在一個實施方案中，所述標誌物是像CD20或CD19—樣，從該譜系的幹細胞階段到恰好最終分化成漿細胞之前的分化階段，見於B細胞上的一種標誌物。本文優選的B細胞表面標誌物是CD19,CD20,CD22和CD40。"CD20"抗原是見於外周血或淋巴器官中90%以上的B細胞表面的35kDa，而非糖基化的磷蛋白質。CD20在早期前B細胞發育過程中表達，並持續存在，直到分化成漿細胞才消失。CD20存在於正常B細胞和惡性B細胞上。文獻中CD20的其它名稱包括"B淋巴細胞限制的抗原"和"Bp35"。在例如Clark等/WASrt/&i)82:1766(1985)中描述了CD20抗原。結合CD20抗原的抗體的實例包括"C2B8"，現在稱為"Rituximab"("RITUXAN")(美國專利5，736,137，包含在文中作為參考)；釔-[90]標記的2B8小鼠抗體，稱為"Y2B8"(美國專利5,736,137,包含在文中作為參考)；可選地以1311標記的小鼠IgG2a"B1",以產生"131I-B1，，抗體(BEXXARTM)(美國專利5,595,721，包含在文中作為參考)；小鼠單克隆抗體"1F5"(Press等B/ood69(2):584-591(1987));"嵌合2H7"抗體(美國專利5,677,180，包含在文中作為參考)；和單克隆抗體L27,G28-2，93-1B3,B-C1或NU-B2，自InternationalLeukocyteTypingWorkshop獲得(Valentine等，丄ewA:oc,III(McMichael，Ed.，p.440，OxfordUniversityPress(1987))。本文術語"Rituximab"或"RITUXAN"指針對CD20抗原的基因改造後的嵌合小鼠/人單克隆抗體，在美國專利5,736,137中稱之為"C2B8"，包含在文中作為參考。該抗體包含小鼠輕鏈和重鏈可變區序列和人恆定區序列的IgG,K免疫球蛋白。Rituximab對約8.0nM的CD20抗原具有結合親合力。Rituximab是由CHODG44細胞產生的。術語"哺乳動物"是指屬於哺乳動物類的任何動物，包括人、牛、馬、狗和貓。本發明優選的實施方案中，哺乳動物是人。本文中"生長抑制劑，，是指在體內或體外抑制細胞(例如癌症細胞)生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低S期惡性細胞百分比的藥物。生長抑制劑的實例包括阻斷細胞周期(在除S期以外的階段)進展的藥物，例如誘導G1停滯和M期停滯的藥物。經典的M期阻斷劑包括長春花類(長春新鹼和長春花鹼)，taxol，美登木素生物鹼和topoII抑制劑如阿黴素、柔紅菌素、依託泊甙和博來黴素等。那些使G1期停滯的藥物還連帶(spillover)使S期停滯，例如DNA烷化劑象他莫昔芬、強的松、達卡巴。秦、氮芥(mechlorethamine)、順鉑、氨曱蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。詳見"癌症的分子基礎"Mendelsohn和Israel編，第一章，Murakami等的題為"細胞周期調節，腫瘤和抗肺瘤藥物"的文章(WBSaunders:Philadephia，1995)，尤其見第13頁。"生長抑制性"抗體的實例是與抗原結合併抑制表達該抗原的細胞生長的那些。優選的生長抑制性抗-HER2抗體在約0.5到30pg/ml的抗體濃度下，抑制細胞培養中SK-BR-3乳腺腫瘤細胞的生長大於20%,並優選大於50%(例如從約50%到約100%),其生長抑制是將SK-BR-3細胞暴露於抗體6天後測定的(見美國專利5,677,171,1997年0月14日7>開)。優選的生長抑制抗體是huMAb4D5-8。"誘導細胞死亡"的抗體是引起活細胞失去活力的抗體。文中的細胞是表達抗體結合的抗原的細胞。在補體和免疫效應細胞不存在時可測定體外細胞死亡，以區別抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)或補體依賴的細胞毒作用(CDC)誘導的細胞死亡。因此，可使用熱滅活血清(即在補體不存在的情況下)和免疫效應細胞不存在的情況下進行細胞死亡的測定。為測定抗體能否誘導細胞死亡，以碘化丙啶(PI)，錐蟲藍(見Moore等C7to&c/m0/0gv17:1-11(1995))或7AAD的攝取進行評估，可相對於未經處理的細胞評定膜的完整性的喪失。優選的細胞死亡誘導抗體是在BT474細胞的PI攝取測定中誘導PI攝取的那些。"誘導調亡"的抗體是誘導程序性細胞死亡的抗體，通過膜聯蛋白V,DNA斷裂，細胞皺縮，內質網擴張，細胞斷裂，和/或膜小泡的形成(稱為凋亡小體)測定程序性細胞死亡。細胞表達抗體結合的抗原。優選細胞是腫瘤細胞。評估與凋亡相關的細胞事件可採用多種方法。例如，通過膜聯蛋白結合可測定磷脂醯絲氨酸(PS)易位；通過DNA梯子可評價DNA斷裂；可通過亞二倍細胞中的任何增加評價核/染色體濃縮和DNA斷裂。優選，誘導凋亡的抗體是在使用BT474細胞的膜聯蛋白結合實驗中，其導致膜聯蛋白結合的誘導相對於未經處理的細胞為約2到50倍，優選約5到50倍，最優選約10到50倍。術語"治療有效量"指有效"治療"個體或哺乳動物的疾病的藥物的量。對於癌症，此藥物治療有效量可減少癌細胞的數量；減小腫瘤體積；抑制(即減慢到一定程度並優選停止)癌細胞對周圍器官的浸潤；抑制(例如減慢到一定程度並優選停止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕與癌症相關的一種或多種症狀。根據阻止癌細胞的生長和/或殺死已有癌細胞的程度，該藥物可以是抑制細胞生長和/或細胞毒作用的。對於癌症治療，可通過例如評定腫瘤進展時間(TTP)和/或測定反應速率(RR)測定其功效。"抗原表達的癌症，，是一種疾病，它包含在其表面具有足夠水平的抗原的細胞，從而使抗-抗原的抗體可與其結合併對癌症具有治療效果。"以受體過度活化"為特徵的癌症是癌細胞中受體活化的程度顯著超出同一組織類型中非癌細胞上該受體活化水平的癌症。此種過度活化可能是由於受體的過度表達和/或活化癌細胞中的受體的配體高於正常水平。此種過度活化可引起癌細胞的惡性狀態和/或由癌細胞的惡性狀態引起。在一些實施方案中，可對癌症進行診斷或預測性分析來確定導致受體如此過度活化的受體的擴增和/或過度表達是否存在。可選地，或此外，可對癌症進行診斷或預測性分析來確定導致受體過度活化的配體擴增和/或過度表達是否存在於癌症中。自此類癌症的亞類中，受體的過度活化可能由自分泌刺激途徑引起。"過度表達"受體的癌症是與同樣組織類型的非癌細胞相比，在其細胞表面具有明顯更高水平的受體，例如HER2的一種。此種過度表達可能由基因擴增或增加的轉錄或翻譯引起。在診斷或預測性分析中，通過評估細胞表面上受體蛋白的增加水平(例如通過免疫組化分析；IHC)可測定受體的過度表達。可選地，或此外，可通過例如原位螢光雜交(FISH;見W098/45479publishedOctober,1998)，southern蛋白印跡，或聚合酶鏈反應(PCR)技術，例如實時螢光定量PCR(RT-PCR)，測定細胞中編碼受體的核酸。也可通過測定生物液體例如血清中的脫落抗原(例如，胞外區)研究受體過度表達。(見，例如，美國專利4,933,294，1990年6月12日；WO91/05264,1991年4月18日公開；美國專利5,401,638，1995年3月28日公開；和Sias等J/wmw"o/,MeAo^132:73-80(1990))。除了上述方法，熟練技術人員可利用多種體內實驗方法。例如，可將病人體內的細胞暴露於可選地由可檢測標誌物標記的抗體，例如放射活性同位素，而且可以通過例如放射活性體外掃描或分析取自曾經暴露於該抗體的病人的活組織來評價抗體與細胞的結合。"過度表達"配體的癌症是與同樣組織類型的非癌細胞相比，產生明顯更高水平的該配體的一種癌症。此種過度表達可能由基因擴增或增加的轉錄或翻譯引起。在例如腫瘤活檢或多種診斷實驗如IHC，FISH,southern蛋白印跡，PCR或上述體內實驗中，通過評估病人體內的配體(或編碼它的核酸)的水平診斷性地測定配體的過度表達。本文所用術語"細胞毒作用製劑"是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9G、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P"和Lu的放射性同位素)，化療劑和毒素例如小分子毒素或細菌，真菌，植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。"化療劑"是在腫瘤治療中使用的化學化合物。化療劑實例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)h環磷醯胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM);烷基磺酸酉旨如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和p底泊舒凡(piposulfan);氮丙"定(aziridine)^口苯並多巴(benaodopa)，卡》皮酉昆(carboquone)，美妥替"底(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa);氮丙咬(ethyleneimine)和methylamelamine包4舌六曱蜜胺(altretamine)，三亞胺。秦(triethylenemelamine)，三亞乙基石粦醯胺，三亞乙基硫代磷醯胺和三羥曱基蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogenmustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥，膽磷醯胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環磷醯胺(ifosfamide),氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，3畐莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine);才元生素如阿克4立黴素，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來黴素，放線菌素C(cactinomycin)，力a利車黴素(力。利車黴素)，carabicin，洋紅黴素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色黴素，放線菌素D，柔紅菌素(daunorubicin)，地託比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿黴素(doxorubicin)，表阿黴素(epirubicin),依索比星(esorubicin),伊達比星(idarubicin),發波黴素(marcellomycin)，絲裂黴素，黴酚酸，諾加黴素(nogalamycin)，橄欖黴素(olivomycin),培洛黴素(peplomycin)，potfiromycin，。票呤黴素，三鐵阿黴素(quelamycin)，羅多比星(rodombicin),鏈黑菌素；鏈脲黴素(streptozocin)，殺結核菌素，烏苯美司(ubenimex),淨司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin);抗代謝藥如氨曱蝶呤，5-氟尿嘧咬(5-FU);葉酸類似物如二曱葉酸(denopterin)，氨曱蝶呤，蝶羅呤，三曱曲沙(trimetrexate);。票呤類似物如氟達拉濱(fludarabine)，6-琉基。票呤，硫咪噪呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苦(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依諾他濱(enocitabine),氟尿苷，5-FU;雄激素類如二曱睪酮(calusterone)，丙酸甲i,火克酉同(dromostanolongpropionate),玉不石克i,醇(epitiostanol)，美名,氛(mepitiostane),睪內酯(testolactone);抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide),米4乇坦(mitotane),曲洛司坦(trilostane);葉酸4卜充劑如frolinicacid;醋葡內酯；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙醯丙酸(aminolevulinicacid);安口丫口定(amsacrine);bestrabucil;t匕生群(biasntrene);依達曲沙、(edatraxate);defofamine;-火7J^4山胺；；也。丫S昆(diaziquone);elfornithine;依矛j醋銨(elliptiniumacetate);依4毛才各魯(etoglucid);硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);米託胍腙(mitoguazone);米4乇蒽、酉昆(mitoxantrone);莫派達醇(mopidamol);;肖p夫旦(nitracrine);噴司4也丁(pintostatin);phenamet;p比柔比星(pirarubicin);鬼臼樹酸(podophyllinicacid);2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(razoxane);西索菲蘭(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);糹田交《連孑包菌酮酸；三亞胺醌；2,2，，2"，-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine);烏拉坦(urethan);長春鹼醯胺；達卡巴溱(dacarbazine);甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇；口底泊;臭;^克(pipobroman);gacytosine;阿4i伯4唐苷("Ara-C，，)；環磷醯胺；三胺硫磷(thiotepa);taxanes，如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和紫杉闢(doxetaxel)(TAXOTERE⑧，Rhone-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine);6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨曱蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花鹼；柏；依託泊戒(etoposide)(VP-16);異環磷醯胺；絲裂黴素C;米託蒽醌；長春新;鹹；長春瑞賓(vinorelbine);新黴醯胺(navelbine);novantrone;替尼泊戒(teniposide);柔紅黴素；氨基蝶呤；xeloda;伊拜膦酸鹽(ibandronate);CPT-11;拓樸異構酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);維曱酸；esperamicins;capecitabine;以及上述任何物質的可藥用鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素製劑，如抗雌激素製劑包括他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(raloxifene),芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene),keoxifene,LY117018,onapristone,和託瑞米芬(Fareston);和抗雄激素製劑如氟4也米特(flutamide)，尼魯米特(nilutamide),bicalutamide，亮丙瑞4木(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);和上述任何物質的藥用鹽、酸或衍生物。本文術語"EGFR定向藥物"指結合EGFR，並可選地，抑制EGFR活化的藥劑。此種藥劑的實例包括抗體和結合EGFR的小分子。結合EGFR的抗體的實例包括MAb579(ATCCCRLHB8506),MAb455(ATCCCRLHB8507),MAb225(ATCCCRL8508),MAb528(ATCCCRL8509)(見美國專利4,943,533，Mendelsohn等)及其變體，例如嵌合225(C225)和再造(reshaped)人225(H225)(見WO96/40210，ImcloneSystemsInc.);結合II型突變體EGFR的抗體(美國專利5,212,290);如美國專利5,891,996中所述的結合EFGR的人源化和嵌合抗體；和結合EGFR的人抗體(見WO98/50433,Abgenix)。抗-EGFR抗體可以和細胞毒作用劑偶聯，從而產生免疫偶聯物(見例如，EP659,439A2,MerckPatentGmbH)。結合EGFR的小分子的實例包括ZD1839(IRESSA)(AstraZeneca)，CP-358774或OSI-774(TARCEVATM)(Genentech)和AG1478。術語"細胞因子"是一般性術語，指由一個細胞群釋放的對另一個細胞群起細胞間介質作用的蛋白。此種細胞因子的實例是淋巴細胞因子，單核細胞因子和傳統的多肽激素。這些細胞因子包括生長激素，如人生長激素，N-曱二磺醯人生長激素，和牛生長激素；曱狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH),曱狀腺刺激素(TSH),促黃體(生成)激素(LH);肝細胞生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-a和(3;苗勒氏管抑制物質(mullerian-inhibitingsubstance);小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內皮細胞生長因子；整合素；血小板生成素(TPO);神經生長因子如NGF-P;血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)如TGF-a和TGF-P;胰島素樣生長因子-I和-II;促紅細胞生成素(EPO);骨誘導因子(osteoinductivefactors);幹擾素如幹擾素-ot,-p,-y;集落刺激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF);粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF);粒細胞-CSF(G-CSF);白細胞介素(IL)如IL-l，IL畫la，IL-2，IL-3,IL-4，IL-5，IL-6,IL-7,IL-8,IL-9，IL-ll，IL-12;胂瘤壞死因子如TNF-a或TNF-卩；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術語細胞因子包括天然蛋白或來自重組細胞培養物的蛋白以及天然序列細胞因子的生物活性等效物。本文所用術語"前體藥物"指藥物學活性物質的前體或衍生物形式，其較親本藥物對癌細胞的細胞毒作用小並能被酶活化或轉化成更具活性的親本形式。見例^口Wilman"ProdrugsinCancerChemotherapy"BiochemicalSocietyTransanctions，14，pp.357-382,615thMeetingBelfast(1986)和Stella等,"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery,"DirectedDrugDelivery,Borchardt等，(ed,)，pp.247-267,人aPress(1985)。本發明的前體藥物包括但不限於，含磷酸鹽前體藥物，含硫代磷酸脂前體藥物，含硫酸鹽前體藥物，含肽前體藥物，D胺基酸修飾的前體藥物，糖基化前體藥物，含P內醯胺的前體藥物，任選取代的含苯氧基乙醯胺的前體藥物或任選取代的含苯基乙醯胺的前體藥物，可被轉化成更具活性且不具有細胞毒作用的藥物的5-氟胞嗜啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物。可被衍生為本發明所用前提藥物形式的細胞毒作用藥物的實例包括，但不限於，上述那些化療劑。"脂質體"是由能向哺乳動物有效運送藥物(如本文的抗體)的各類脂質、磷脂和/或表面活性劑組成的小嚢泡。脂質體的組分通常排列為雙層形式，與生物膜的脂質排列相似。術語"包裝插頁"通常指包含在治療產品的商品包裝中給用戶的說明，其包含有關適應症，用途，劑量，施用方法，禁忌症，和/或與使用此種治療產品有關的說明。"分離的，，核酸分子是一種從通常與該多肽核酸天然來源相關的至少一種混合核酸分子中鑑定並分離的核酸分子。分離的核酸分子不同於其天然發現的形式。因此分離的核酸分子可從天然細胞中的該核酸分子區別出來。然而，分離的核酸分子包括包含於通常表達該多肽的細胞中的核酸分子，在該細胞中核酸分子位於與天然細胞不同的染色體位置。術語"調控序列，，指特定宿主有機體中可操作地連接的編碼序列的表達所需的DNA序列。適合原核生物的調控序列，例如，包括啟動子，可選地包括操縱子序列，和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子，多腺苷化信號和增強子。當與另一核酸序列發生功能關聯時，核酸是"可操作地連接的"。例如，前序列或分泌性前導序列如果被表達為參與多肽分泌的前蛋白，其可操作地連接該多肽的DNA;如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，其可操作地連接於該序列；或如果核糖體結合位點位於可促進翻譯的位置，其可操作地連接編碼序列。通常，"可操作地連接於"的意思是被連接的DNA序列是相鄰的，並且如果是分泌性前導序列，應是相鄰的並且處於閱讀階段。然而，增強子則不一定是相鄰的。通過在方便的限制位點接合(ligation)而實現連接(linking)。如果此種位點不存在，合成的寡核苷酸連接物或連頭的使用符合常規的作法。本文術語"細胞"，"細胞系，，，和"細胞培養，，可互換使用並且所有此種名稱包括其子代。因此，術語"轉化體"和"轉化後細胞"包括原代處理細胞及其衍生的培養物，而不考慮傳代的次數。由於有意和無意的突變，也可理解所有子代的DNA含量均不是恰好相同的。具有與原始轉化後細胞中篩選到的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變體子代也包括在內。儘管命名截然不同，從上下文來看這一點是清楚的。II.具體實施方案本發明涉及製造基本均一的包含Fc區的糖蛋白製備物的方法，組合物中的糖蛋白約80-100%包含附著於糖蛋白Fc區的缺乏巖藻糖的成熟核心碳水化合物。在本文優選的實施方案中，所述蛋白是抗體或免疫粘附素。可通過例如以下方法製備糖蛋白(a)使用改造後的或突變體宿主細胞，其巖藻糖代謝是有缺陷的，因此它具有降低的(或不能)巖藻糖基化所表達的蛋白的能力；(b)在防止或降低巖藻糖基化的條件下培養細胞；(c)巖藻糖的翻譯後去除(例如使用巖藻糖苷酶)；(d)所需碳水化合物的翻譯後添加，例如在非糖基化糖蛋白的重組表達後；(e)糖蛋白的純化用以選出未被巖藻糖基化的產物。本發明涉及結合這些典型方法(a)-(e)中的兩種或多種方法。最優選地，編碼所需糖蛋白的核酸在宿主細胞內表達，該宿主細胞具有降低的(或不能)巖藻糖基化其中表達的蛋白的能力。優選，宿主細胞是二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷的中國倉鼠卯巢(CHO)細胞，例如Lec13CHO細胞，或例如，CHO-K1，DUX-B11，CHO-DP12或CHO-DG44CHO宿主細胞，其經修飾使得其中產生的糖蛋白實質上不被巖藻糖基化。因此，細胞可能顯示巖藻糖轉移酶改變的表達或活性，或者宿主細胞中涉及將巖藻糖添加到N-連接的寡糖的另一種酶或底物可能具有減小的活性和/或降低的水平。核心碳水化合物結構是成熟的，因此，通常應避免使用抑制物例如慄樹精胺，它抑制或幹擾成熟碳水化合物的加工。根據一個本發明優選的實施方案，從產生糖蛋白的重組宿主細胞中回收的組合物中的糖蛋白約80-100%具有附著於糖蛋白Fc區的缺乏巖藻糖的核心碳水化合物結構，下文稱為"不含巖藻糖的糖蛋白組合物"。文中"回收，，的意思是自宿主細胞培養物中直接獲得而不經過純化步驟(可富集不含巖藻糖的糖蛋白)的物質。然而，本發明涉及通過各種技術富集不含巖藻糖的糖蛋白，例如使用凝集素底物從所需的組合物中去除含有巖藻糖的糖蛋白的純化技術。可以認識到來自不同批重組產生的糖蛋白的不含巖藻糖的糖蛋白的量不同。例如，在以下的實例中，不含附著於CHO-Lec13細胞表達的糖蛋白的巖藻糖的寡糖之總百分比的範圍是88%-95%。優選組合物中的糖蛋白約90-99%包含附著於糖蛋白Fc區的缺乏巖藻糖的成熟核心碳水化合物結構。碳水化合物結構的各種形式可存在於組合物中。例如，附著於糖蛋白的碳水化合物可由以下公式代表formulaseeoriginaldocumentpage41其中，M是甘露糖。GN是GlcNAc。X,是可選的對分GlcNAc殘基，其具有任選地附著於對分GlcNAc的附加單糖。X2是優選的GlcNAc殘基。X3是任選的Gal殘基，一個Gal殘基可附著於每個GN臂。X4是任選的末端唾液酸殘基，可附著一個或二個唾液酸殘基。與同樣的糖蛋白組合物相比，文中不含巖藻糖的糖蛋白組合物顯示與一種或多種FcyRIII受體更好的結合，但該組合物中的大部分(例如約50-100%,或約70-100%)糖蛋白具有附著於成熟核心碳水化合物結構的巖藻糖(下文的"含有巖藻糖的糖蛋白組合物")。例如，文中不含巖藻糖的糖蛋白組合物與含巖藻糖的糖蛋白組合物相比，顯示100-1000倍更好的與FcyRIII,例如FcYRIII(F158)的結合。F158同種異型與人IgG的相互作用不如V158有效，因而這從治療角度提供了顯著的優點，尤其是在表達FcyRin(F158)的病人中。此外，文中不含巖藻糖的糖蛋白組合物與其對應的含巖藻糖的糖蛋白組合物相比，顯示更好的ADCC活性，例如約2-20倍提高的ADCC活性。除了不含巖藻糖的成熟核心碳水化合物結構，其它寡糖可附著於核心碳水化合物結構。例如，對分GlcNAc可以附著或不附著。通過舉例，宿主細胞可能缺乏GnTIII酶並因此糖蛋白可基本不含對分GlcNAc。可選地，糖蛋白可在添加了對分GlcNAc的宿主細胞中表達(例如Y0宿主或改造的CHO細胞)。一個或多個(通常是一或二個)半乳糖殘基也可附著於核心碳水化合物結構。最後，一個或多個(通常是一或二個)末端唾液酸殘基可附著於核心碳水化合物結構，例如通過與半乳糖殘基的連接。在優選的實施方案中，製備本文的組合物並將它用於治療用途。因此，優選的組合物是包含糖蛋白和可藥用的載體或稀釋劑(例如下文示例的那些)的藥物製劑。此種製劑通常是無菌的並且可以是凍幹的。在本發明優選的實施方案中，糖蛋白是抗體，而且產生抗體的典型方法在下面的部分更詳細地敘述。然而，糖蛋白可以是任何其它包含Fc區的糖蛋白，例如免疫粘附素。製造免疫粘附素的方法在下文詳述。A.變體Fc區序列在本發明的一個實施方案中，糖基化變體進一步包含具有與天然序列Fc區的胺基酸序列不同的胺基酸序列的變體Fc區。變體Fc區具有多於一處的胺基酸取代時，通常但非必要地，結合同一類別的胺基酸取代以達到所需的結果。下表描述了胺基酸取代的各種類別。tableseeoriginaldocumentpage43*去糖基化版本除了胺基酸取代，本發明還涉及對親代Fc區胺基酸序列的其它修飾，以產生具有改變的效應器功能的Fc區變體。技術人員可以，例如，缺失Fc區的一個或多個胺基酸殘基來降低與FcR的結合。通常，技術人員缺失一個或多個本文鑑定影響FcR結合的Fc區殘基以產生此種Fc區變體。通常，根據本發明的實施方案，將缺失不多於一個到約十個Fc區殘基。本文中包含一個或多個胺基酸缺失的Fc區優選保留親代Fc區或天然序列人Fc區的至少約80%,並優選至少約90%，更優選至少約95%。技術人員也可以製造胺基酸插入Fc區的變體，該變體具有改變的效應器功能。例如，技術人員可在鄰近本文鑑定為影響FcR結合的一個或多個Fc區位置處引入至少一個胺基酸殘基(例如一到二個胺基酸殘基和通常不多於十個殘基)。"鄰近的'，意思是距離本文鑑定的Fc區殘基一個到二個胺基酸殘基內。此種Fc區變體顯示增強或減弱的FcR結合和/或ADCC活性。為產生此種插入變體，技術人員可評估包含FcR結合區(例如感興趣的FcR的胞外區)和胺基酸殘基待插入的Fc區(見，例如，Deisenhofer,所oc/zera'Wo720(9):2361畫2370(1981);和Burmeister等，淑髒342:379-383,(1994))的多肽的共結晶結構，從而理性地設計具有例如改善的FcR結合能力的Fc區變體。此種插入通常在Fc區環中進行，而不在Fc區的二級結構中(即在p鏈中)。通過在親代Fc區中引入適宜的胺基酸序列修飾，技術人員可產生在人效應細胞存在時更有效地介導抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和/或較親代多肽以更好的親合力結合Fcy受體(FcyR)的變體Fc區。此種Fc區變體通常包含Fc區內的至少一個胺基酸修飾。聯合胺基酸修飾被認為是特別可取的。例如，變體Fc區可能包括對例如本文鑑定的特定Fc區位置中的二個，三個，四個，五個等取代。優選地，親代多肽Fc區是人Fc區，例如天然序列人Fc區人IgGl(A和非A同種異型)，IgG2，IgG3或lgG4Fc區。此類序列顯示於圖23中。為產生具有增強的ADCC活性的Fc區，親代多肽優選具有已經存在的ADCC活性，例如，它包含人IgGl或人IgG3Fc區。在一個實施方案中，具有增強的ADCC活性的變體介導ADCC比具有天然序列IgGl或IgG3的Fc區和變體的抗原結合區的抗體有效得多。優選地，變體包含Fc區位置298，333和334中的二個或三個殘基的取代，或者基本由這些取代組成。最優選地，位置298,333和334上的殘基被取代(例如被丙氨酸殘基)。此外，為產生具有增強的ADCC活性Fc區變體，技術人員通常改造對FcYRIII具有增強的結合親合力的Fc區變體，FcyRIII被認為是重要的介導ADCC的FcR。例如，技術人員可將胺基酸修飾(例如取代)引入親代Fc區的胺基酸位置256,290，298，312，326,330，333，334，360，378或430中的任何一個或多個胺基酸位置，以產生此種變體。對FcYRIII具有增強的結合親合力的變體可進一步對FcyRII具有降低的結合親合力，尤其是對抑制性FcyRIIB受體具有降〗氐的親合力。由於本發明的實驗表明CH2區對FcR結合活性很重要，胺基酸修飾優選被引入Fc區的CH2區。此外，與上述所引用技術的教導不同，本申請涉及將修飾引入除較低鉸鏈區外的Fc區部分。用於修飾以產生具有改變的Fcy受體(FcyR)結合親合力或活性的變體IgGFc區的胺基酸位置包括Fc區胺基酸位置238，239，248，249，252，254，255,256,258,265,267，268，269，270，272,276,278，280，283，285，286,289,290，292，293，294,295，296,298，301，303，305,307,309,312，315，320,322，324，326，327，329,330,331,333,334，335,337,338，340，360，373，376，378，382，388，389,398,414,416，419,430，434，435，437，438或439中的任何一個或多個。優選，用作模板以產生此種變體的親本Fc區包含人IgGFc區。殘基331被取代之處的親本Fc區優選不是人天然序列IgG3，或包含位置331處的取代的變體Fc區優選顯示FcR例如對FcyRII的結合增強。為產生具有減弱的與FcyR結合的Fc區變體，技術人員可在胺基酸位置238,239,248，249,252,254,265，268,269，270，272,278,289，292，293，294，295，296,298,301,303,322,324，327，329，333，335，338,340,373,376,382，388,389，414,416,419,434,435,437，438或439中的任何一個或多個位置引入胺基酸修飾。顯示減弱的與FcyRI結合的變體包括那些含有位於胺基酸位置238,265，269，270，327或329中任何一個或多個胺基酸位置上的Fc區胺基酸修飾的變體。顯示減弱的與FcyRII結合的變體包括那些含有位於胺基酸位置238,265，269,270，292,294，295，298，303，324,327,329，333，335，338，373,376,414,416,419，435,438或439中的任何一個或多個胺基酸位置上的Fc區胺基酸修飾的變體。顯示減弱的與FcyRIII結合的Fc區變體包括那些含有位於胺基酸位置238，239，248,249，252,254,265,268，269,270，272，278,289,293，294,295,296，301,303,322,327，329，338,340，373,376,382，388,389,416，434,435或437中任何一個或多個胺基酸位置上的Fc區胺基酸修飾的變體。也可製備具有增強的與一個或多個FcYRs結合的變體。此種Fc區變體可以包含位於Fc區胺基酸位置255，256,258，267，268，272,276,280，283,285，286,290,298，301，305，307，309，312,315，320，322,326,330，331,333,334，337,340,360，378，398或430中任何一個或多個胺基酸位置上的胺基酸修飾。例如，具有增強的FcyR結合活性的變體可以顯示增加的與FcyRIII的結合，並可選地可進一步顯示降低的與FcyRII的結合；例如所述變體可包含位於Fc區胺基酸位置298和/或333上的胺基酸修飾。具有增加的與FcyRII結合的變體包括那些包括那些含有位於Fc區胺基酸位置255,256,258,267,268,272,276，280,283,285,286，290,301，305,307,309，312，315，320,322，326,330，331，337,340,378,398或430中任何一個或多個胺基酸位置上的胺基酸修飾的變體。此種變體可進一步顯示降低的與FcyRIII的結合。例如，它們可包括位於胺基酸位置268,272,298，301，322或340中4壬何一個或多個位置上的Fc區胺基酸^務飾。雖然優選改變與FcyR的結合，本文也涉及具有改變的對新生兒受體(FcRn)的結合親合力的Fc區變體。據預計具有增強的對新生兒受體(FcRn)的親合力的Fc區變體具有更長的血清半衰期，而且此種分子在需要長半衰期的給藥多肽來治療哺乳動物的方法中具有有益的用途，例如治療慢性疾病。相反，預計具有降低的對新生兒受體(FcRn)的親合力的Fc區變體具有較短的半衰期，例如此種分子可在短的循環時間有利時用於哺乳動物，例如用於多肽的體內診斷性顯像，當該多肽較長時間遺留在血流中隨之循環時，具有毒副作用，如此等等。據預計具有降低的FcRn結合親合力的Fc區變體不太可能穿過胎盤，因此可用於治療懷孕婦女的疾病。具有改變的對FcRn的結合親合力的Fc區變體包括含有位於胺基酸位置238，252，253,254，255,256，265，272,286，288,303,305，307,309，311,312,317,340，356，360，362,376,378,380，382,386，388,400，413,415,424,433，434,435，436,439或447中的任何一個或多個胺基酸位置上的Fc區胺基酸修飾的那些。顯示降低的與FcRn的結合的那些變體通常包含位於胺基酸位置252,253,254,255,288,309，386，388，400,415，433，435，436，439或447中的任何一個或多個氨基的位置上的Fc區胺基酸修飾；而具有增強的與FcRn的結合的那些變體通常包含位於胺基酸位置238,256,265，272，286,303,305，307，311，312，317,340，356,360,362,376，378，380,382,413，424或434中的任何一個或多個胺基酸位置上的Fc區胺基酸修飾。通常根據多肽的預期用途，進一步修飾以上述方法製備的多肽變體。此種修飾可能涉及胺基酸序列的進一步改變(胺基酸序列的取代，插入和/或缺失，與異源多肽的融合和/或共價修飾。此種"進一步修飾"可在以上公開的胺基酸修飾(導致Fc受體結合和/或ADCC活性的改變)之前，同時，或之後進行。在一個實施方案中，技術人員可結合本文的Fc區修飾和本說明"相關技術"部分中引用的對比文件中公開的Fc區取代。可選地或此外，將上述胺基酸修飾和改變Fc區的Clq結合和/或補體依賴的細胞毒作用功能的一個或多個進一步的胺基酸修飾結合可能是有用的。本文特別感興趣的起始多肽是通常結合Clq和顯示補體依賴的細胞毒作用(CDC)的多肽。本文所述的進一步的胺基酸取代通常用於改變起始多肽結合Clq的能力和/或修飾該多肽的補體依賴的細胞毒作用功能，例如降低或優選消除這些效應器功能。然而，本文涉及包含位於所述位置中一個或多個位置上的取代的多肽，它具有增強的Clq結合和/或補體依賴的細胞毒作用(CDC)功能。例如，起始多肽可能不能結合Clq和/或介導CDC,但可以根據本文的教導進行修飾使該多肽獲得這些進一步的效應器功能。此外，可以修飾具有已有Clq結合活性，並可選地還具有介導CDC能力的多肽，以便使這些活性之一或均被增強。為產生具有改變的Clq結合和/或補體依賴的細胞毒作用(CDC)功能的Fc區，通常從重鏈位置270,322，326，327,329，331,333，和334中選擇待修飾的胺基酸位置，其中IgG重鏈中殘基的編號按照Kabat等，Se《wewc^o/pra/e/"5o//m聽wo/og/ca//襲ms/，5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中EU索引的方式。在一個實施方案中，以上鑑定的八個位置中只有一個被改變，以便產生具有改變的Clq結合和/或補體依賴的細胞毒作用(CDC)功能的多肽變體區。在這種情況下，優選只改變殘基270，329或322。可選地，^修飾以上鑑定的兩個或多個位置。如果取代將被組合，通常組合增強人Clq結合的取代(例如殘基位置326,327,333和334上的取代)或結合那些降低人Clq結合的取代(例如殘基位置270，322，329和331上的取代)。在後一種實施方案中，可以取代所有的四個位置(即，270，322,329和331)。優選地，將位於位置326,327,333或334中的二個，三個或所有位置上的進一步的取^，可選地與其它Fc區取代組合，產生具有增強的人Clq結合和優選在體外或體內具有增強的CDC活性的多肽。脯氨酸在人IgG，s中的位置329是保守的。該殘基優選由丙氨酸取代，然而，也可用任何其它胺基酸取代，例如絲氨酸，蘇氨酸，天冬醯胺，甘氨酸或纈氨酸。賴氨酸在人IgG，s中的位置322是保守的。該殘基優選由丙氨酸殘基取代，然而，也可用任何其它胺基酸取代，例如絲氨酸，蘇氨酸，甘氨酸或纈氨酸。D270在人IgGs中是保守的。而且，該殘基可被另一種胺基酸殘基取代，例如丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，纈氨酸或賴氨酸。K326在人IgGs中也是保守的。而且，該殘基可被另一種胺基酸殘基取代包括，但不限於，纈氨酸，穀氨酸，丙氨酸，甘氨酸，天冬氨酸，蛋氨酸，或色氨酸，優選色氨酸。同樣地，E333在人IgGs中也是保守的。E333優選地被具有較小的側鏈體積的胺基酸殘基取代，例如纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，或絲氨酸，優選絲氨酸。K334在人IgGs中是保守的，而且，可被另一種殘基取代，例如丙氨酸或其它殘基。在人IgGl和IgG3中，殘基327是丙氨酸。為產生具有增強的Clq結合的變體，該丙氨酸由另一種殘基取代例如甘氨酸。在lgG2和lgG4中，殘基327是甘氨酸，並且可由丙氨酸(或另一種殘基)取代來減少Clq的結合。如上述，技術人員可設計具有改變的效應器功能的Fc區，例如，通過修飾Clq結合和/或FcR結合，並從而改變CDC活性和/或ADCC活性。例如，技術人員可以產生具有增強的Clq結合和增強的FcYRIII結合的變體Fc區；例如具有增強的ADCC活性和增強的CDC活性的變體Fc區。可選地，需要效應器功能降低或消失時，技術人員可以改造出具有降低的CDC活性和/或減弱的ADCC活性的變體Fc區。在其它實施方案中，技術人員可以僅增加這些活性之一，並可選地還減弱其它活性，例如產生具有增強的ADCC活性和減弱的CDC活性的Fc區變體或反之。至於進一步的胺基酸序列變異，通常也可由絲氨酸取代任何未參與保持多肽變體的正確構象的半胱氨酸殘基，從而增進該分子的氧化穩定性並防止錯誤的交聯。另一種類型的胺基酸取代用於改變多肽的糖基化模式。這可以消除多肽中發現的一個或多個碳水化合物部分，和/或增加多肽中不存在的一個或多個糖基化位點獲得。多肽的糖基化通常是N-連接或O-連接的。N-連接指碳水化合物部分對天冬醯胺殘基的附著。三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸和天冬醯胺-X-蘇氨酸是碳水化合物部分對天冬醯胺側鏈的酶附著的識別序列，其中X是除脯氨酸外的任何胺基酸。因此，多肽中這些三肽序列任何一個的存在都創造了一個潛在的糖基化位置。O-連接的糖基化指糖N-乙醯半乳糖胺，半乳糖，或木糖之一對羥基胺基酸的附著，最常見的羥基胺基酸是絲氨酸或蘇氨酸，儘管也使用5-羥脯氨酸和羥賴氨酸。通過改變胺基酸序列使其包含上述三肽序列中的一種或多種，可輕易實現糖基化位點之於多肽的增加(適於N-連接的糖基化位點)。也可通過將一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基加入原始多肽，或用這些殘基進行取代造成改變。典型糖基化變體的重鏈具有殘基Asn297上的胺基酸取代。此外，通過一處或多處進一步的胺基酸取代可改變Fc區的種類，亞類或同種異型，產生出具有與所需的不同類型，亞類或同種異型更同源的胺基酸序列的Fc區。例如，可以改變小鼠Fc區以產生與人Fc區更同源的胺基酸序列；人非-A同種異型IgGlFc區可經修飾產生人A同種異型IgGlFc區如此等等。在一個實施方案中，本文中改變FcR結合和/或ADCC活性的氨基修飾在Fc區的CH2區中產生，而CH3區被缺失或者被另一種二聚化的區域所替換。然而優選地，CH3區是保留的(除了如本文中公開的改變效應器功能的胺基酸修飾)。通常根據糖蛋白的預期用途，將如上述製備的糖蛋白做進一步修飾。此種修飾可能涉及胺基酸序列的進一步改變(胺基酸殘基的取代，插入和/或缺失)，與異源性多肽融合和/或共價修飾.另一種類型的胺基酸取代用於改變多肽的糖基化模式。由於缺乏本文所述的海藻糖，此種糖基化改變可能是文中糖基化改變以外的形式，並且可以通過缺失多肽中發現的一個或多個碳水化合物部分，和/或增加多肽中不存在的一個或多個糖基化位置獲得。多肽的糖基化通常是N-連接或O-連接的。N-連接指碳水化合物部分對天冬醯胺殘基的附著。三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸和天冬醯氨胺-X-蘇氨酸是碳水化合物部分對天冬醯胺側鏈的酶附著的識別序列，其中X是除脯氨酸外的任何胺基酸。因此，多肽中這些三肽序列中任何一個的存在都創造了一個潛在的糖基化位置。O-連接的糖基化指糖N-乙醯半乳糖胺，半乳糖，或木糖之一對羥基胺基酸的附著，最常見的羥基胺基酸是絲氨酸或蘇氨酸，儘管也使用5-羥脯氨酸和羥賴氨酸。通過改變胺基酸序列使其包含上述三肽序列中的一種或幾種三肽序列，可輕易實現糖基化位點之於多肽的增加(適於N-連接的糖基化位點)。也可通過將一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基加入原始多肽，或用這些殘基進行取代造成改變。B.生物活性篩查通過一項或多項試驗，可評估糖蛋白變體較起始多肽在生物活性上的任何變化。優選地，與非變體多肽相比，糖蛋白變體基本保持與抗原結合的能力，即其結合能力不差於非變體多肽的約20倍，例如不差於非變體多肽的約5可測定多肽變體的結合性能。可評估糖蛋白變體結合FcR的能力。若FcR是高親合力Fc受體，例如FcyRI，FcRn，FcyRIIB或FcyRIIIA,可使用抗體通過滴定單體糖蛋白變體並測定結合的糖蛋白變體來測定結合，所述抗體在標準ELISA形式中特異地結合糖蛋白變體(見以下實施例)。低親合力FcRs的另一種FcR結合實驗在WO00/42072(Presta)和美國專利6,242,195B1中敘述。為評定糖蛋白變體的ADCC活性，可使用不同的效應物目標比(effector-target)進行體外ADCC實驗。對此類實驗有用的"效應物細胞"包括外周血單個核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。可選地，或此外，可在體內評定糖蛋白變體的ADCC活性，例如，在如Clynes等屍A^S(t/5^」95:652-656(1998)公開的動物模型中。可以評定變體結合Clq和介導補體依賴的細胞毒作用(CDC)的能力。為測定Clq的結合，可進行Clq結合ELISA。簡言之，將實驗板置於含有糖蛋白變體或起始多肽(對照)的包被緩衝液中包#:,4。C下過夜。然後洗滌並封閉該板。洗滌後，將等量的人Clq加入每個孔中，並在室溫下孵育2小時。進一步洗滌後，將lOOjiil綿羊抗-補體Clq過氧化物酶偶聯的抗體加入每個孔中，並在室溫下孵育1小時。再次用洗滌緩衝液洗滌該板，並在每孔中加入100^1含有OPD(O-二鹽酸亞苯二胺(phenylenediaminedihydrochloride)(Sigma))的底物緩衝液。通過黃色的出現觀察氧化反應，使反應進行30分鐘，然後加入100(14.5NH2S04終止反應。可在(492-405)nm讀取吸收值。典型糖蛋白變體是在本實驗中顯示"Clq結合顯著減少"的糖蛋白變體。這意味著與100pg/ml具有未突變的IgGlFc區的對照抗體相比，約100pg/ml的糖蛋白變體顯示約50倍或更多Clq結合的減少。在最優選的實施方案中，糖蛋白變體"不結合Clq"，即與100fig/ml對照抗體相比，100(ig/ml糖蛋白變體與Clq的結合降低約IOO倍或更多。另一種典型變體是"對人Clq具有比親代多肽更好的結合親合力，，的變體。此種分子可以顯示，例如與親代多肽相比，與人Clq的結合提高約兩倍或更多，並優選約五倍或更多(例如這兩種分子在IC50值時)。例如，與親代多肽相比，與人Clq的結合提高約兩倍到約500倍，並優選從約兩倍或約五倍到約1000倍。為評定補體活化，可進行補體依賴的細胞毒作用(CDC)測定，例如Gazzano-Santoro等，《//w附畫/.MdWs202:163(1996)所述。簡言之，可用緩衝液稀釋得到各種濃度的糖蛋白變體和人補體。可將表達糖蛋白變體結合抗原的細胞稀釋到1x10"田胞/ml的濃度。可將糖蛋白變體混合物，稀釋的人補體和表達該抗原的細胞加到平底組織培養96孔板上，使其在37°C和5%C02下孵育2小時，以便促進補體介導的細胞溶解。隨後將50(1的alamarblue(Accumedlnternational)力口入每個孑L中，並在370C下聘育過夜。在530nm激發，並在590nm發射下使用96孔螢光計測定吸收值結果以相對螢光單位(RFU)表示。樣品濃度可用標準曲線計算，並且報告感興趣的糖蛋白變體較非變體多肽的百分比活性。另一種典型變體"不活化補體"。例如，與0.6(g/ml具有未突變的IgGlFc區的對照抗體相比，0.6(g/ml糖蛋白變體在本實驗中顯示約0-10%的CDC活性。優選地，變體在上述CDC測定中，不具有任何CDC活性。糖蛋白可以是與親代多肽相比，顯示增強的CDC的一種，例如，在體外或體內CDC活性中CDC的活性顯示約兩倍到約IOO倍的提高(例如在每個被比較的分子的IC5C值時)。本文也涉及對新生兒受體(FcRn)具有變異的結合親合力的Fc區變體。對FcRn具有增強的親合力的Fc區變體據預計具有更長的血清半衰期，而且此種分子在需要長半衰期給藥多肽來治療哺乳動物的方法中具有有益的用途，例如治療慢性疾病。相反，預計具有降低的對新生兒受體(FcRn)的親合力的Fc區變體具有較短的半衰期，例如此種分子可在短的循環時間有利時用於哺乳動物，用於例如多肽的體內診斷性顯像，當該多肽較長時間遺留在血流中隨之循環時，具有毒副作用，如此等等。據預計具有降低的FcRn結合親合力的Fc區變體不太可能穿過胎盤，因此可用於治療懷孕婦女的疾病。C.抗體的製備在本發明優選的實施方案中，根據本文的教導修飾的糖蛋白是抗體。產生抗體的方法如下逸舉和絲當糖蛋白是抗體時，它針對感興趣的抗原。優選地，所述抗原是生物學上重要的糖蛋白而且將該抗體用藥於患病哺乳動物可在該哺乳動物中產生治療益處。然而，也涉及針對非多肽抗原的抗體(如肺瘤相關的糖脂類抗原；見美國專利5,091,178)。當抗原是多肽時，它可以是跨膜分子(例如受體)或配體例如生長因子。典型抗原包括如下分子例如腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；曱狀腺刺激激素；脂蛋白；ot-l-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；前胰島素；濾泡刺激激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC，因子IX,組織因子(TF)，和vonWillebrands因子；抗-凝血因子例如蛋白C;心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或組織類型的纖溶酶原激活物(t-PA);鈴蟾肽(bombesin);凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-a和-P;腦啡肽酶；RANTES(由活化調解，通常是T細胞表達和分泌的)；人巨噬細胞炎症蛋白(MIP-l-a);血清白蛋白例如人血清白蛋白；苗勒管抑制物(Muellerian-inhibitingsubstance);+>弛素A-鏈；松他素B-鏈；前鬆弛素；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白，例如p-內醯胺酶；DNase;IgE;細胞毒性T-淋巴細胞相關抗原(CTLA)，例如CTLA-4;抑制素(inhibin);活化素(activin);血管內皮生長因子(VEGF);激素或生長因子的受體；蛋白A或D;類風溼因子；神經營養因子例如骨源性神經營養因子(BDNF)，神經營養因子-3，-4,-5，或-6(NT-3，NT-4,NT-5或NT-6),或神經生長因子例如NGF-P;血小板源性生長因子(PDGF);纖維母細胞生長因子例如aFGF和bFGF;表皮生長因子(EGF);轉化生長因子(TGF)例如TGF-a和TGF-卩，包括TGF-pi，TGF-(32，TGF-卩3，TGF-卩4，或TGF-卩5;腫瘤壞死因子(TNF)例如TNF-a或TNF-(3;胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II);des(l-3)-IGF-I(腦IGF-I);胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白例如CD3，CD4,CD8，CD19,CD20,CD22和CD40;紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP);幹擾素例如幹擾素-a，-P和-人；集落刺激因子(CSFs)，例如，M-CSF，GM-CSF，和G-CSF;白介素(ILs),例如，IL-l,IL畫2，IL-3,IL-4，IL-5，IL-6,IL-7，IL-8,IL-9和IL-10;過氧化物歧化酶；T-細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原如，例如，AIDS包膜的一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；整合素例如CDlla，CDllb，CDllc，CD18,ICAM，VLA-4和VCAM;肺瘤相關抗原例如HER2,HER3或HER4受體；和任何上述多肽的片段。本發明包括的抗體的典型靶分子包括CD蛋白例如CD3，CD4，CD8,CD19,CD20，CD22,CD34和CD40;ErbB受體家族成員，例如EGF受體，HER2，HER3或HER4受體；前列腺幹細胞抗原(PSCA);細胞粘附分子例如LFA-1，Macl，p150.95，VLA-4，ICAM-1，VCAM，a4/(37整合素，和av/p3整合素包括其a或p亞單位(例如抗-CDlla，抗-CD18或抗-CDllb抗體)；生長因子例如VEGF;組織因子(TF);腫瘤壞死因子(TNF)例如TNF-a或TNF-P,(，幹擾素(a-IFN);白介素，例如IL-8;IgE;血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；wp/受體；CTLA-4;蛋白C等等。可選地與其它分子偶聯的可溶抗原及其片段，可用作產生抗體的免疫原。對於跨膜分子，例如受體，這些抗原的片段(例如受體的胞外區)可用作免疫原。可選地，表達跨膜分子的細胞可用作免疫原。此種細胞可來自天然來源(例如癌細胞系)或者可以是經重組技術轉化表達跨膜分子的細胞。其它抗原及其可用於製備抗體的形式對本領域技術人員來說是顯而易見的。問,^i發拔沐優選通過多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑在動物體內製具有免疫原性的蛋口白偶聯。例如，可以;雙功能製劑或衍生製劑使抗原與鑰孔血藍蛋白(KLH),血清白蛋白，牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制物結合，所述雙功能或衍生製劑例如馬來醯亞胺基苯曱醯基磺基琥珀醯亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯)，N-羥基琥珀醯亞胺(通過賴氨酸殘基)，戊二醛，琥珀酸酐，S0C12，或R^NONR，其中R和R1是不同的烷基基團。通過將例如100嗎或5嗎蛋白或偶聯物(分別對兔子或小鼠而言)與3倍體積的弗氏(Freund's)完全佐劑混合，並經皮內多位點注射該溶液，可以使動物對抗原、免疫原性偶聯物、或衍生物接受免疫。一個月後，將含有1/5到1/10最初量的多肽或偶聯物的弗氏完全佐劑經皮下注射到多個位點，來給動物加強免疫。7到14天後，自動物取血並分析血清中抗體的滴度。對動物加強免疫直到抗體滴度至平臺。優選，用同一抗原的偶聯物，但與不同蛋白和/或通過不同交聯劑對動物加強免疫。偶聯物也可在重組細胞培養中產生，為蛋白融合體形式。另外，聚集劑例如明礬也適宜用來增強免疫應答。單克隆抗體可用Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)首先描述的雜交瘤法製備或通過重組DNA法(美國專利4，816，567)製備。在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，例如倉鼠，來激發產生或能產生特異結合免疫所用蛋白的抗體的淋巴細胞。可選地，所述淋巴細胞可被體外免疫。免疫後，淋巴細胞可被分離並隨後使用適宜的融合劑例如聚乙二醇與骨髓瘤細胞系融合，以形成雜交瘤細胞(Goding，卓義發在沐../V/wc^/esa"c//V"c"ce,59-103頁(AcademicPress,1986))。由此製備的雜交瘤細胞被接種於適宜的培養基並在其中生長，該培養基優選包含一種或多種抑制未融合親代骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃噪呤鳥噪呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤的選擇培養基通常包括次黃。票呤，氨基蝶呤，和胸腺嘧啶("HAT培養基")這些抑制HGPRT-缺陷細胞生長的物質。優選骨髓瘤細胞為那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩定的高水平產生抗體、並對如HAT培養基敏感的骨髓瘤細胞系。在眾多這樣的細胞系中，優選的骨髓瘤細胞系是小鼠骨髓瘤系，如由SalkInstituteCellDistreibutionCenter,SanDiego，CaliforniaUSA提供的MOPC-21和M.C,ll小鼠腫瘤，和由美國典型培養物保藏中心，Rockville,MarylandUSA提供的SP-2或其衍生物，如X63-Ag8-653細胞。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系可用於產生人單克隆抗體[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);和Brodeur等，單克隆抗體的製備技術和應用(MarcelDekker，Inc.:NewYork紐約，(1987))51-63頁]。可在含有生長的雜交瘤細胞的培養基中分析抗所述抗原的單克隆抗體的產生。優選地，雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的結合特異性通過免疫沉澱或通過體外結合試驗，如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)來分析。單克隆抗體的結合親合力可通過，例如Muson等，」"a/.5/oc/2e肌，107:220(1980)所述Scatchard分析來測定。一旦鑑定出產生具有所需特異性、親合力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞，這些細胞克隆可通過有限稀釋進行亞克隆，並通過標準方法(Goding，卓義謦我伴/W"cz>/asam/屍rac"ce，59-103頁(AcademicPress,1986))4吏其生長。適合此目的的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，通過例如將細胞注射入小鼠中，可以使雜交瘤細胞以動物腹水肺瘤的形式在體內生長。上述亞克隆所分泌的單克隆抗體可用經典抗體純化方法如，例如，親和層析(例如使用蛋白A-Sepharose)，羥基磷灰石層析，凝膠電泳，透析等從培養基，腹水或血清中分離。使用傳統方法(例如通過使用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結合的寡核苷酸探針)可輕易分離並測序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細胞是此DNA的優選來源。一旦分離出該DNA，可以將它置入表達載體中，該載體隨後被轉染至宿主細胞中例如大腸桿菌細胞，猴COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或不另外生成抗體蛋白的骨髓瘤細胞，從而在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。抗體的重組生產將在下文詳述。在進一步的實施方案中，可從使用McCafferty等，A^w，348:552-554(1990)描述的技術產生的抗體噬菌體文庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson等，Atowe，352:624-628(1991)和Marks等，《/Mo/.5/o/.，222:581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離小鼠和人抗體。隨後的文章描述了通過鏈改組產生高親和性(納米級)人抗體(Marks等，A'o/rec/mo/og^10:779-783(1992))，以及將組合感染和體內重組作為策略構建非常大的噬菌體文庫(Waterhouse等，7Vw.爿c/血Tes.，21:2265-2266(1993))。因此，這些技術是用於分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行(viable)選擇。也可採用以下方法對DNA進行修飾例如，以人重鏈和輕鏈恆定區的編碼序列代替同源小鼠序歹ll(美國專利4，816，567;Morrison等，胸/Jc^/.5W.L/5Li81:6851(1984))，或將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽(異源多肽)的完整或部分編碼序列共價結合。通常，上述非免疫球蛋白多肽序列可取代抗體的恆定區，或它們可取代抗體的一個抗原結合位點的可變區以產生嵌合二價抗體，該抗體包含兩個特異於不同抗原的抗原結合位點。fi'v)入源化拔體^kA祐體人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入它的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基常稱為"引進的，，殘基，它們通常來自"引進的，，可變區。人源化過程基本是按照Winter及其同事(Jones等，Atow，321:522-525(1986);Riechmann等，A^w，332:323-327(1988);Verhoeyen等，5We"ce,239:1534-1536(1988))的方法，通過用嚙齒類CDRs或CDR序列替換人抗體的對應序列來進行。因此，這樣的"人源化"抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整人類可變區的很少一部分被非人物種的相應序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中一些CDR殘基且可能有部分FR殘基被齧齒動物抗體中類似位點的殘基取代。選擇人源化抗體製備所用的人輕鏈和重鏈可變區，對於降低抗原性非常重要。根據所謂的"最適"方法，針對已知人可變區序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體的可變區序列。隨後將與嚙齒類最接近的人序列作為人框架區(FR)用於人源化抗體(Sims等，//mmw"o/.，151:2296(1993);Chothia等，JMo/.5/o/.，196:901(1987))。另一種方法是使用從輕鏈或重鏈特定亞群的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區。同樣的框架區可被用於幾種不同的人源化抗體(Carter等，屍rac.A^/.^cad5W.89:4285(1992);Presta等，//ww畫/.,151:2623(1993))。更重要的是，將抗體人源化後保留了對抗原的高親合力和其它有利的生物特性。為達到此目的，才艮據優選方法，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性(conceptual)人源化產物來製備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領域技術人員所熟悉的。還有用於描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構象結構的電腦程式。通過觀察這些展示結果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基。通過這種方法，可從受體序列和引進序列中選出FR殘基並組合，從而得到所需抗體性質，如對靶抗原的親合力增加。總之，超變區殘基直接並且最主要涉及對抗原結合的影響。可選的，可以製備轉基因動物(如小鼠)，它經過免疫能在缺乏內源性免疫球蛋白生成的情況下產生全套人抗體。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突變小鼠中，抗體重鏈連接區(Jh)基因的純合缺失導致內源性抗體生成的完全抑制。將人胚系免疫球蛋白基因陣列(array)轉移到此胚系突變小鼠中，將導致在抗原攻擊的情況下產生人抗體。見例如，Jakobovits等屍rac.Ato/.^cad5W.t/SA90:2551(1993);Jakobovits等，A^we,362:255-258(1993);Bruggemann等,l^ar7mmw肌，7:33(1993);和Duchosal等,Atowz-e355:258(1992)。人抗體也可來自噬菌體展示文庫(Hoogenboom等，《/Mo/.編.,227:381(1991);Marks等，/Mo/.222:581-597(1991);Vaughan等,A^m5/o&c/z14:309(1996))。多特異抗體對至少兩種不同的抗原具有結合特異性。儘管此種分子通常只結合兩種抗原(即雙特異抗體，BsAbs)，具有附加特異性的抗體例如三特異抗體也包含在文中所用的術語中。BsAbs的實例包括具有針對腫瘤抗原的一條臂和針對細胞毒作用觸發分子(cytotoxictriggermolecule)的另一條臂的那些抗體，例如抗-FcyRI/抗-CD15，抗-pl85HE"/FcyRIII(CD16)，抗-CD3/抗隱惡性B-細胞(1D10),抗-CD3/抗-pl85HER2，抗-CD3/抗-p97,抗-CD3/抗-腎細胞癌，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L畫Dl(抗隱結腸癌)，抗-CD3/抗畫黑色素細胞刺激激素類似物，抗-EGF受體/抗-CD3，抗-CD3/抗-CAMAl，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗-神經細胞粘附分子(NCAM)/抗-CD3，抗-葉酸結合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛癌相關抗原(AMOC-31)/抗-CD3;—條臂特異地結合腫瘤抗原而另一條臂結合毒素的BsAbs例如抗-皂草素/抗-Id-l，抗-CD22/抗-急草素，抗-CD7/抗-皂草素，抗-CD38/抗-皂草素，抗-CEA/抗-蓖麻毒素A鏈，抗-幹擾素-a(IFN-a)/抗-雜交瘤獨特型，抗-CEA/抗-長春花鹼；轉化酶活化的前體藥物的BsAbs例如抗-CD30/抗-鹼性磷酸酶(催化磷酸絲裂黴素前藥物向絲裂黴素醇的轉化)；可用作纖維蛋白溶解劑的例如抗-纖維蛋白/抗-組織纖溶酶原激活物(tPA)，抗-纖維蛋白/抗-尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA);將免疫複合物靶向細胞表面受體的BsAbs例如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受體(例如FcyRI，FcyRII或FcyRIII);用於治療感染性疾病的BsAbs例如抗-CD3/抗-單純皰滲病毒(HSV),抗-T-cell受體:CD3複合物/抗-流感病毒，抗-FcyR7抗-HIV;體外或體內才企測腫瘤的BsAbs例如抗-CEA/抗-EOTUBE,抗-CEA/抗-DPTA，抗-pl85HER2/抗-hapten;作為疫苗佐劑的BsAbs;和作為診斷工具的BsAbs例如抗-兔IgG/抗-鐵蛋白，抗畫辣根過氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生長抑素/抗-物質P，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-P-半乳糖普酶。三特異抗體的實例包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37,抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。雙特異抗體可被製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab，)2雙特異性抗體)。雙特異性抗體的綜述見Segal等J/wmw"o/.MeAoA248:1-6(2001)。製備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。傳統上，全長雙特異性抗體的重組製備是基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同特異性(MillsteinandCuello，Nature,305:537-539(1983))。由於免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機搭配，這些雜交瘤(quadroma)產生10種不同抗體分子的潛在的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。對正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常複雜，且產量很低。類似的方法見WO93/08829(1993年5月13日公開)和Traunecker等，EMBOJ，10:3655-3659(1991)。依據不同的方法，可將具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區與免疫球蛋白恆定區序列融合。該融合優選與至少包含鉸鏈區、CH2及CH3區部分的免疫球蛋白重鏈恆定區融合。優選使含有輕鏈結合所需位點的第一重鏈恆定區(CH1)出現在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉染至適當宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進行構建的實施方案中，能夠較靈活地調整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產時或所述比例無特別意義時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。在該方法的一個優選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發現這種不對稱結構有利於從非必要免疫球蛋白鏈的組合中分離出所需雙特異性化合物，因為只在該雙特異性分子的一半中存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開於1994年3月3日公開的WO94/04690中。製備雙特異性抗體的進一步細節可以參見，例如Suresh等，MethodsinEnzymology，121:210(1986)。才艮據W096/27011所述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養中獲得的異二聚體的百分比最大。優選的界面包括抗體恆定區CH3結構域的至少一部分。在該方法中，源於第一抗體分子界面上的一條或多條小的胺基酸側鏈被較大側鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側鏈大小相同或相近的互補"溝"可通過將胺基酸大側鏈用小側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這提供了一種機制，其使異二聚體的產量比不想要的終產物如同二聚體高。雙特異性抗體包括交聯抗體或"異源偶聯的"抗體。例如，可使異源偶聯物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯，使另一抗體與生物素偶聯。有4676980)，也可用於治療HIV感染(W091/00360，WO92/200373和EP03089)。異源偶聯抗體可通過任何適當的交聯方法製備。適當的交聯製劑和多種交聯技術為本領域已知，可在美國專利4676980號中獲得。本發明還涉及二價以上的抗體。例如可製備三特異抗體。Tutt等《//畫,/.147:60(1991)。多價抗體比二價抗體可更快地被表達與該抗體結合的抗原的細胞內化(和/或異化)。本發明的抗體可以是具有三個或更多個抗原結合位點的多價抗體(例如四價抗體)(它們不是IgM類)，通過使編碼所述抗體多肽鏈的核酸重組表達可輕易製備該抗體。多價抗體可以包含二聚體化結構域和三個或更多個抗原結合位點。優選的二聚體化結構域包括Fc區或鉸鏈區，或由它們組成。在本文中，抗體包含一個Fc區和三個或更多個位於Fc區氨基端的抗原結合位點。優選的多價抗體在此包括三到約八個抗原結合位點，但優選四個抗原結合位點，或由它們組成。多價抗體包括至少一條多肽鏈(並優選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或多個可變區。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一可變區，VD2是第二可變區，Fc是Fc區的一條多肽鏈，XI和X2代表胺基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽鏈可包括VH-CHl-柔韌接頭(flexiblelinker)-VH-CHl-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文的多價抗體優選進一步包含至少二個(優選四個)輕鏈可變區多肽。例如本文的多^f介抗體可包含從約二個到約八個輕鏈可變區多肽。本文的輕鏈可變區多肽包含輕鏈可變區以及可選地進一步包含CL結構域。對多價抗體的描述見WO01/00238andWO00/44788。親和力成煞的拔體本文的抗體可以是親和力成熟的抗體，它包含對親代抗體(例如人源化或人抗體)一個或多個超變區殘基的取代。通常，相對於其產生的親代抗體，生成的用於進一步改造的變體具有改良的生物學特性。產生此種取代變體的便利方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡言之，若干超變區位點(例如6-7位點)經突變在每個位點產生所有可能的氨基取代。以單價形式從絲狀噬菌體顆粒將如此產生的抗體變體顯示為包裹在每個顆粒中的與M13的基因m產物的融合物。隨後篩選該噬菌體展示的變體的生物活性(例如結合親合力)。為鑑定修飾的候選超變區位點，可進行丙氨酸掃描誘變鑑定對抗原結合有顯著貢獻的超變區殘基。可選地，或此外，分析抗原抗體複合物的晶體結構來鑑定抗體及其抗原之間的接觸點是有益的。此種接觸殘基和鄰近殘基是根據本文所述技術進行取代的候選殘基。一旦產生這樣的變體，便對這樣的變體組(panel)進行篩選，可選出在一項或幾項相關實驗中具有出眾特性的抗體進一步改造。本發明還涉及用包含與抗癌藥劑例如細胞毒作用劑或生長抑制劑偶聯的糖蛋白的免疫偶聯物所進行的治療。用於產生此種免疫偶聯物的化療劑已在上文中描述。本文也涉及抗體和一個或多個小分子毒素的偶聯物，例如加利車毒素，美登木素(maytansinoid)，單端孢黴烯(trichothene)和CC1065，以及這些毒素具有毒素活性的衍生物。在一個優選的實施方案中，本發明的糖蛋白與一個或多個美登木素分子偶聯。本領域已知多種製造抗體-美登木素生物鹼偶聯物的連接基團，包括例如美國專利5，208，020或歐洲專利EP0425235Bl，和Chari等C"廳rWasearc/252:127-131(1992)公開的那些。連接基團包括二硫基，硫醚基，酸不穩定基團，光不穩定基團，肽酶不穩定基團，或酯酶不穩定基團，如上述專利所公開，優選二硫基和硫醚基。通過以化學方法將糖蛋白(例如抗體)連接與美登木素分子而不顯著減少糖蛋白或美登木素分子的生物活性可以製備糖蛋白-美登木素偶聯物。雖然即使是一個分子的毒素/抗體比起使用棵露的抗體來，就可以增強細胞毒作用，每個抗體分子平均偶聯的3-4個美登木素分子已顯示出在不負面影響抗體的功能和溶解性下，增強目的細胞細胞毒作用的效力。本領域人員了解美登木素生物鹼並可通過已知技術合成或從天然來源分離它。適宜的美登木素生物^喊在例如美國專利5,208,020和上述的其它專利以及非專利文獻中公開。優選的美登木素生物鹼是美登木醇(maytansinol)和對美登木醇分子的芳香環或其它位點進行修飾的美登木醇類似物，例如美登木醇的各種酯。本領域已知許多製造抗體-美登木素偶聯物的連接基團，包括，例如，美國專利5,208,020或EP專利0425235Bl,和Chari等Om匿i^，c/52:127-131(1992)重公開的那些。連接基團包括二碌u基團，石克醚基團，酸不穩定基團，光不穩定基團，肽酶不穩定基團，或酯酶不穩定基團，如上述專利公開，優選二硫基和硫醚基。使用多種雙功能蛋白偶聯劑可製造抗體和美登木素偶聯物，所述雙功能蛋白偶聯劑例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡咬基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺曱基)環己烷-l-羧酸酯，亞胺基硫烷(iminothiolane)(IT),亞胺酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸二曱基己二酸亞胺酯(dimethyladipimidateHCl))，活性酯類(如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯曱醯基)己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯曱醯基)-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞曱代苯基2,6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。尤其優選的偶聯劑包括N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡咬基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，所oc/zem./173:723-737[1978])和N-琥珀醯亞胺基_4_(2_吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)來提供二硫連接。接頭可附著於美登木素生物鹼分子的不同位點，這取決於連接的類型。例如，使用傳統的偶聯技術通過與羥基反應形成酯連接。該反應可出現在含有羥基的C-3位置，經羥曱基修飾的C-14位置，經羥基修飾的C-15位置，以及含輕基的C-20位置。在優選的實施方案中，在美登木醇或美登木醇類似物的C-3位置形成連接。另一種感興趣的免疫免疫偶聯物包括與一個或多個加利車黴素分子偶聯的糖蛋白。抗生素的加利車黴素家族能夠在亞皮摩爾的濃度造成雙鏈DNA斷裂。加利車黴素家族偶聯物的製備見美國專利5,712,374，5,714,586,5,739,116，5，767，285,5,770,701,5，770，710，5,773,001，5,877,296(均屬於AmericanCyanamidCompany)。可利用的加利車黴素的結構類似物包括，但不限於，Y卩，ot21，ot31，N-乙醯,1，PSAG和eVHinman等Q7"c^W^ean^53:3336-3342(1993)，Lode等Ca"cwWa^a/r/z58:2925-2928(1998)和前述所有屬於AmericanCyanamid的專利)。另一種可偶聯糖蛋白的抗肺瘤藥物是QFA，它是一種抗葉酸劑。加利車黴素和QFA都具有作用的胞內位點，而且不輕易穿過胞漿膜。因此，通過抗體介導的內化，這些藥劑的細胞攝取大大地增強了其細胞毒作用。其它可與本發明的抗體偶聯的抗腫瘤藥物包括BCNU,鏈脲菌素(streptozoicin)，長春新鹼和5-氟尿嘧咬，美國專利5,053,394,5,770,710所述的已知統稱為LL-E33288複合物的藥物家族，以及esperamicins(美國專利5,877,296)。可以應用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、ot-帚曲毒素、油桐04/ew份as/on^7)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(屍/^o/aca力wen'cG"a)蛋白(PAPI,PAPII,PAP-S)、苦瓜(wowoni/C(3c/7ara""a)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、月巴急草(sa;ao"an'aOj^7c/wa/Z力才中製劑,白杉於毒素、米4乇菌素(mitogellin)、局卩艮曲菌素、酚黴素、依諾黴素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日公開的W093/21232。本發明還涉及一種免疫偶聯物，其由抗體與具有核酸分解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內切核酸酶如脫氧核糖核酸酶；DNase)形成。為選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射活性原子。多种放射性同位素可用於製備放射性偶聯的抗體，實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。當偶聯物用於診斷時，它包含可用於閃爍照相研究的放射活性原子，例如tc"m或I123，或可以用於核磁共振(NMR)成像(也稱磁共振現象，mri)的旋轉標記(spinlabel),例如碘-123,碘-131，銦-111，氟-19,碳-13,氮-15，氧-17,禮，錳或鐵。;故射性標記或其它標記可通過已知方法4參入偶聯物中。例如，所述肽可以生物合成，或使用涉及例如氟-19取代氫的適宜胺基酸前體進行化學胺基酸合成。標誌物例如tc99111或I123，Re186，Re^和Inm可以藉助所述肽中的半胱氨酸殘基來附著。釔-90可以藉助賴氨酸殘基來附著。可用IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57摻入石典-123。"免疫閃爍照相術中的單克隆抗體"(Chatal,CRCPress1989)詳細描述了其它方法。抗體和細胞毒作用製劑的偶聯物可通過多種雙功能蛋白偶聯劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯劑如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡咬基二碌^代)丙酸酯(SPDP)，琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺曱基)環己烷-l-羧酸酯，亞胺基硫烷(IT)，亞胺酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸二曱基己二酸亞氨酯)，活性酯類(如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛)，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯曱醯基)己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯曱醯基)-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞曱代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，5We"ce238:1098(1987)所述製備。C"標記的l-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯至抗體的偶聯劑之一。見W094/11026。這種接頭可能是有利於細胞毒作用藥物在細胞內釋放的"可斷開的接頭"。例如，可使用酸不穩定型接頭，肽酶敏感型接頭，光不穩定型接頭，二曱基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等，Owcer/e"arc/z52:127-131(1992);美國專利5,208,020)。可選地，通過例如重組技術或肽合成製備包含抗體和細胞毒作用劑的融合蛋白。DNA的長度可包含分別編碼該偶聯物的兩個部分的區域，它們彼此鄰接，或被編碼接頭肽但不破壞該偶聯物的所需特性的區域分開。在另一實施方案中，抗體可與腫瘤預靶向中應用的"受體"(如鏈黴親和素)偶聯，將該抗體-受體偶聯物給予患者，之後用清除劑(clearingagent)除去循環中未結合的偶聯物，再給予已偶聯了細胞毒作用製劑(如放射性核苷酸)的"配體"(如抗生物素蛋白)。拔沐該^雄介,通過將抗體偶聯於前體藥物活化酶，本發明的抗體也可用於ADEPT,該酶將前體藥物(例如肽基化療劑，見WO81/01145)轉化成活性抗癌藥物。參見，例如，W088/和美國專利4,975,278。用於ADEPT的免疫結合物的酶組分包括任何能夠對前體藥物起作用，將它轉化成更加有活性的細胞毒作用形式的酶。可用於本發明的方法的酶包括，但不限於，鹼性磷酸酶，用於將含有磷酸鹽的前體藥物轉化成游離藥物；芳香硫酸酯酶，用於將含有硫酸鹽的前體藥物轉化成游離藥物；胞嘧啶脫氨酶，用於將含有無毒的5-氟胞嘧啶轉化成抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷氏菌屬蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，羧肽酶和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L)，用於將含肽的前體藥物轉化成游離藥物；D-丙醯胺羧肽酶，用於轉化含有D-胺基酸取代物的前體藥物；碳水化合物-切割酶，例如P-半乳糖苷酶和神經醯氨酶，用於將糖基化的前體藥物轉化成游離藥物；P-內醯胺酶，用於將(3-內醯胺衍生的藥物轉化為游離藥物；和青黴素醯氨酶，例如青黴素V醯氨酶或青黴素G醯氨酶，用於將由苯氧乙醯基或苯乙醯基自其胺氮衍生的藥物分別轉化成游離藥物。可選地，具有酶活性的抗體(本領域也稱"抗體酶")可用將本發明的前體藥物轉化成游離活性藥物(參見，例如，Massey,A/^mw328:457-458(1987))。可如本文所述方法製備抗體-抗體酶偶聯物，從而將抗體酶遞送到腫瘤細胞群。通過本領域已知的技術，本發明的酶可與抗體共價偶聯，例如使用上述的異雙功能交聯劑。可選地，使用本領域技術人員熟悉的重組DNA技術構建融合蛋白，該融合蛋白至少包含本文抗體的抗原結合區，並連接於本發明的酶的至少一個功能活化部分。(見，例如，Neuberger等，M^ww,312:604-608(1984》。W-它潛蛋^發謬本文涉及糖蛋白的其它修飾。例如，糖蛋白可與多種非蛋白聚合物之一連接，例如，聚乙二醇、聚丙二醇，聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。也可以將抗體包封在按照例如凝聚技術或界面聚合技術製備的微膠嚢(分別例如羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚-(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)中，在膠體藥物釋放系統(例如脂質體，白蛋白微球體，微乳劑，納米顆粒和毫孩i膠嚢)中或在大乳劑中。這類技術公開在Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Oslo,A.,Ed.，(1980)。可將本文公開的糖蛋白配製成免疫脂質體。"脂質體"是由能向哺乳動物有效運送藥物(如本文公開的抗ErbB2抗體，和任選的一種化療劑)的各類脂質、磷脂和/或表面活性劑組成的小分子嚢泡。脂質體的組分通常排列為雙層形式，與生物膜的脂質排列相似。含有所述抗體的脂質體可通過本領域已知方法製備，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3688(1985);Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:4030(1980);美國專利4，485，045和4,544,545;以及公開於1997年10月23日的W097/3873L在美國專利5,013,566中公開了循環時間已增加了的脂質體特別有用的脂質體可利用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG衍生的磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物經反相蒸發法產生。通過使脂質體在擠壓之下穿過指定孔徑大小的濾膜，可獲得具有所需直徑的脂質體。本發明抗體的Fab，片段可如Martin等，J.Biol.Chem.，257:286-288(1982)所述，經二硫鍵交換反應與脂質體偶聯。可任選在所述脂質體中包含一種化療藥物。見Gabizon等，J.NationalCancerInst,81(19)1484(1989)。「;a)拔伴時^辦本發明範圍內優選的抗體包括包含以下抗體的胺基酸序列的那些抗-HER2抗體，包括含有huMAb4D5-8(Carter等，屍rac.A^/.^cad5W.89:4285-4289(1992),美國專利5，725，856)的重鏈和輕鏈可變區的抗體；抗-CD20抗體，例如美國專利5，736,137(RITUXAN⑧)中的嵌合抗-CD20"C2B8"，美國專利5,721,108，Bl中2H7抗體的嵌合或人源化變體或Tositumomab(BEXXAR⑧)；抗-IL-8(StJohn等，C7z賊103:932(1993)，和國際申請(國際申請No.)WO95/23865);抗-VEGF抗體，包括人源化和/或親合力成熟抗-VEGF抗體，例如人源化抗VEGF抗體huA4.6.1AVASTINTM(Kim等，OowAFactor,7:53-64(1992)，WO96/30046，和WO98/45331，1998年10月15日公開);抗-PSCA抗體(WO01/40309);抗-CD40抗體，包括S2C6及其人源化變體(WO00/75348);抗匿CD1la(美國專利5,622,700，WO98/23761,Steppe等，Trarap/aW4:3-7(1991)，和Hourmant等，rrara//朋to"o"58:377-380(1994));抗-IgE(Presta等，乂/www"o/.151:2623-2632(1993)，和國際申請WO95/19181;美國專利5,714,338，1998年2月3授權或美國專利5,091,313，1999年2月25日授權，WO93/04173，1993年3月4日公開，或WO99/01556，1999年1月14日7>開，美國專利5,714,338);抗-CD18(美國專利5,622,700，1997年4月22日授權或WO97/26912，1997年7月31日7>開)；抗-Apo-2受體抗體(WO98/51793,1998年11月19日公開)；抗-TNF-a抗體包括cA2(REMICADE⑧)，CDP571和MAK-195(見美國專利5,672,347,1997年9月30日授權，Lorenz等《//www"o/.lSGH^MAG-lGSSGQQG),和Dhainaut等CW/.C置23(9):1461-1469(1995》;抗-組織因子(TF)(歐洲專利0420937Bl，1994年11月9日授權)；抗-人ot4-P7整合素(WO98/06248，1998年2月19日公開)；抗-EGFR(例如WO96/40210中的嵌合或人源化225抗體1996年11月19日公開)；抗-CD3抗體，例如OKT3(美國專利4，515，893，1985年5月7日4受權)；抗-CD25或抗-tac抗體例如CHI-621(SIMULECT⑧)和(ZENAPAX⑧)(參見美國專利5,693,762,1997年12月2日4受斥又)；抗匿CD4抗體例如cM-7412抗體(Choy等JW/zW^//^zw739(1):52-56(1996));抗-CD52抗體，例如CAMPATH-lH(Riechmann等Atowe332:323-337(1988);抗-Fc受體抗體，例如針對FcyRI的M22抗體，Graziano等《//www"o/.155(10):4996-5002(1995);抗-癌胚抗原(CEA)抗體，例如hMN-14(Sharkey等Q/"cw/仏55(23Suppl):5935s畫5945s(1995);針對乳腺上皮細胞的抗體包括huBrE-3，hu-Mc3和CHL6(Ceriani等Ca"cwL55(23):5852s-5856s(1995);和Richman等C騰erL55(23Supp):5916s-5920s(1995));與結腸癌細胞結合的抗體例如C242(Litton等￡wr■//mww"o/.26(1):1-9(1996));抗-CD38抗體，例如AT13/5(Ellis等J/附ww"o/.155(2):925-937(1995));抗-CD33抗體，例如HuM195(Jurcic等awcerWey55(23Suppl):5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771;抗-CD22抗體，例如LL2或LymphoCide(Juweid等OwcwZw55(23Suppl):5899s誦5907s(1995);抗-EpCAM抗體，例如17-lA(PAN或EX);抗隱GpIIb/nia抗體，例如abciximab或c7E3Fab(REOPRO⑧)；抗-RSV抗體，例如MEDI-493(SYNAGIS);抗-CMV抗體，例如PROTOVIR;抗-HIV抗體，例如PR0542;抗-肝炎抗體，例如抗-HepB抗體OSTAVIR;抗-CA125抗體OvaRex;抗-獨特型GD3表位抗體BEC2;抗-ocv(33抗體VITAXIN;抗-人腎細胞癌抗體，例如ch-G250;ING-1;抗-人17-lA抗體(3622W94);抗-人結腸直腸腫瘤抗體(A33);抗-人黑素瘤抗體R24,它針對GD3神經節苷脂；抗-人鱗狀細胞癌(SF-25);和抗-人白細胞抗原(HLA)抗體，例如SmartID10和抗-HLADR抗體Oncolym(Lym-1)。本文感興趣的糖蛋白優選是抗體，和其它可根據本文所述方法修飾的含有Fc區的糖蛋白。此種分子的實例是免疫粘附素。D.免疫粘附素製備最簡單和最直接的免疫粘附素設計將粘附素的結合結構域(例如受體的胞外結構域(ECD))和免疫球蛋白重鏈的Fc區結合。通常，製備本發明的免疫粘附素時，編碼粘附素結合結構域的核酸將以C末端與編碼免疫球蛋白恆定區序列的N末端的核酸融合，而以N末端融合也是可能的。典型地，在所述融合中，所編碼的嵌合多肽會保留至少具有功能活性的免疫球蛋白重鏈恆定區的鉸鏈，CH2和CH3區。也可產生與恆定區Fc部分的C-末端，或重鏈CH1的臨近N-末端或輕鏈的對應區域的融合物。融合所在的精確位置是不嚴格的；特別的位點是眾所周知的並可選以最優化免疫粘附素的生物活性，分泌或結合特性。在優選方案中，將粘附素序列融合到免疫球蛋白Gl(IgGl)的Fc區域的N-末端。可將整個重鏈恆定區融合到粘附素序列。然而，更優選地，在融合物中應用開始於鉸鏈區，剛好位於化學限定IgGFc的木瓜蛋白酶剪切位點上遊的序列(即殘基216，將重鏈恆定區的第一個殘基作為114)或其它免疫球蛋白的類似位點。在特別優選實施方案中，將所述粘附素胺基酸序列融合到IgG重鏈的(a)鉸鏈區，CH2和CH3區，或(b)鉸鏈區，CH1，CH2和CH3區。對於雙特異性免疫粘附素，該免疫粘附素作為多聚體，特別作為異源二聚體或異源四聚體組裝。一般，這些組裝的免疫球蛋白會具有已知的單位結構。基本的四鏈結構單位是IgG,IgD和IgE存在的形式。在較高分子量的免疫球蛋白中重複一種四鏈單位；IgM通常以四個基本單位通過二硫鍵抱團的五聚體存在。IgA球蛋白，偶爾是IgG球蛋白，也會以血清中的多聚體形式存在。在多聚體情況下，每個四單位可相同或不同。本文範圍內多個舉例組裝的免疫粘附素見如下圖表示意(a)ACL-ACL;(b)ACH-(ACH，ACL-ACH，ACl-VhCh，或VlCl-ACh);(c)ACL-ACH-(ACL-ACH,ACl-VhCh，VlCl-ACh，或VlCl-VhCh);(d)ACL-VHCH-(ACH,或ACl-VhCh，VlCl-ACh);(e)VLCL-ACH-(ACL-VHCH,或VLCL-ACH);和(f)(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2,其中每個A代表同一或不同的粘附素胺基酸序列；V^為免疫球蛋白輕鏈可變區；VH為免疫球蛋白重鏈可變區；C^為免疫球蛋白輕鏈恆定區；CH為免疫球蛋白重鏈恆定區；N為大於1的整數；Y命名的是共價交聯劑的殘基。為簡短起見，前述結構只表現出主要性質；它們不表示免疫球蛋白的連接區(J)或其它結構域，也不顯示二硫鍵。然而，當所述結構域對結合活性所必需時，它們將被構建在免疫球蛋白分子中其所佔據的常規(ordinary)位置。可選地，該粘附素序列可被插入免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列之間，因而可獲得包含嵌合重鏈的免疫球蛋白。在此實施方案中，所述粘附素序列被融合到免疫球蛋白每條臂上的免疫球蛋白重鏈的3，末端，或者在鉸鏈和CH2結構域之間，或者在CH2和CH3結構域之間。相似構建體已被Hoogenboom等，Mol.Immunol.,28:1027-1037(1991)報導。儘管本發明的免疫粘附素不需要免疫球蛋白輕鏈的存在，免疫球蛋白輕鏈可以共價連接到粘附素-免疫球蛋白重鏈融合多肽，或直接融合到粘附素的方式存在。在前者的情況下，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA通常與編碼粘附素-免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DNA共表達。一旦分泌，雜交重鏈和輕鏈可共價連接以提供包含兩個雙硫-連接的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的類免疫球蛋白結構。適合製備此種結構的方法，在例如美國專利4,816，567(發表於1989年3月28日)中公開。通過將編碼框內粘附素部分的cDNA序列與免疫球蛋白cDNA序列融合來非常方便地構建免疫粘附素。然而，也可用與基因組免疫球蛋白片段的融合(見例如，Aruffo等，Cell,61:1303-1313(1990);和Stamenkovic等，Cell,66:1133-1144(1991))。後一種類型的融合需要Ig表達調控序列的存在。基於源自脾或外周血淋巴細胞的cDNA文庫的^^布序列，用雜交或聚合酶鏈式反應(PCR)技術，分離編碼IgG重鏈恆定區的cDNA。將編碼"粘附素，，的cDNA和免疫粘附素的免疫球蛋白部分的cDNA串聯插入到在所選宿主細胞中指導有效表達的質粒載體中。E.載體，宿主細胞和重組方法
技術領域：
：本發明還提供編碼本文糖蛋白的分離的核酸，載體和包含該核酸的宿主細胞，和生產糖蛋白的重組技術。為進行糖蛋白的重組生產，分離編碼它的核酸並把核酸插入可複製的載體中進一步克隆(DNA擴增)或表達。編碼糖蛋白的DNA易於利用傳統方法分離和測序(例如，通過使用能夠與編碼糖蛋白的基因特異結合的寡核苷酸探針)。可利用許多載體。載體的組分通常包括，但不限於，以下物質中的一種或多種信號序列，複製起點，一個或多個標記基因，增強子，啟動子，和轉錄終止序列。本發明的糖蛋白不僅可直接被重組生產，也可以作為與異源多肽的融合蛋白被生產，該異源多肽優選是信號序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位點的其它多肽。選定的異源信號序列優選是可由宿主細胞識別和加工(即，由信號肽酶切割)的序列。對於不識別和加工天然多肽信號序列的原核細胞，信號序列由以下原核信號序列取代，例如選自鹼性磷酸酶，青黴素酶，lpp,或熱穩定腸毒素II前導序列。對於酵母分泌物，天然信號序列可由例如酵母轉化酶前導序列，ot因子前導序列(包括糖酵母(Saccharomyces)和克魯維酵母(Kluyveromyces)a-因子前導序列)，或酸性石壽酸酶前導序列，白色念珠菌(C.a/6/ca"力葡糖澱粉酶前導序列，或WO90/13646中所述的信號序列。在哺乳動物細胞表達中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導序列，例如，單純皰滲gD信號。在閱讀框架中，此種前體區的DNA連接於編碼多肽的DNA。"0^賴4為、的趟^表達載體和克隆載體都包含能使該載體在一或多種選定的宿主細胞中複製的核酸序列。一般情況下，在克隆載體中，這種序列是能使該載體獨立於宿主染色體DNA而複製的序列，包括複製起點或自我複製序列。這樣的序列在各種細菌、酵母和病毒中都是眾所周知的。質粒pBR322的複製起點適合大多數革蘭氏陰性細菌，2pi質粒起點適合酵母菌，多種病毒起點(SV40,多瘤病毒(Polyoma),腺病毒，VSV或BPV)可用於哺乳動物細胞中的克隆載體。複製起點組分一般不是哺乳動物表達載體所必需的(SV40起點的使用通常僅僅是由於其包含早期啟動子)。,逸絲順為、表達載體和克隆載體應該包含選擇基因，也稱選擇標記。該基因編碼使經過轉化的宿主細胞在選擇性培養基中存活或生長所必需的蛋白。沒有被包含該選擇基因的載體轉化的宿主細胞在所述選擇性培養基中不能存活。典型的選擇基因編碼具有以下性質的蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒素(如氨苄青黴素，新黴素，氨曱蝶呤或四環素)的抗性，(b)彌補營養缺陷，或(c)提供複合培養基不能供給的關鍵營養物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個實例是利用藥物限制(arrest)宿主細胞的生長。那些被異源基因成功轉化的細胞產生一種賦予藥物抗性的蛋白，從而在該選擇環境中存活。這種顯性選擇可以採用的藥物有新黴素，黴酚酸和潮黴素。適合於哺乳動物細胞的另一例選擇標記是允許鑑定能攝取多肽核酸的細胞的那些標記，如DHFR或胸芬激酶，金屬闢L蛋白-I和-II，優選靈長類金屬硫蛋白基因，腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶等。例如，用DHFR選擇基因轉化的細胞首先通過將所有轉化體培養在包含氨曱蝶呤(Mtx，為DHFR的一種竟爭型拮抗劑)的培養基中來進行鑑定。當採用野生型DHFR時，合適的宿主細胞包括DHFR活性有缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。.或者，宿主細胞(尤其包含內源DHFR的野生型宿主)^皮編碼Bv8的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一種選擇標記如氨基糖苷3，-磷酸轉移酶(APH)轉化或共轉化以後，可以通過在含有針對該選擇標記的選擇試劑如氨基糖苷類抗生素(如卡那黴素，新黴素或G418)的培養基中培養細胞來進行選擇。參見美國專利4，965，199。適用於酵母的合適選擇基因是存在於酵母質粒YRp7中的^1基因(Stinchcomb等，Nature,282:39(1979))。7>^1基因為不能在色氨酸中生長的酵母突變抹(例如ATCC44076或PEP4-1)提供了選擇標記(Jones，Genetics,85:12(1977))。此後，酵母宿主細胞基因組中^1損傷的存在提供了通過在缺乏色氨酸的條件中生長而檢測轉化的有效環境。類似地，丄ew2-缺陷型酵母菌抹(ATCC20，622或38，626)可以由攜帶￡ew2基因的已知質粒來補充。此外，源自1.6pm環狀質粒pKDl的載體可以用於轉化克魯維酵母(A7w戸ram戸》。Bianchi等，C群.Ge威，12:185(1987)。可選地，VandenBerg:所o/Tec/z"o/ogv,8:135(1990)報導了一種用於在乳克魯維酵母(K/ac&)中大規模製備重組小牛凝乳酶的表達系統。已公開由克魯維酵母的工業生產菌抹產生分泌重組人血清白蛋白的穩定的多拷貝表達載體。Fleer等，腸/Tec/wo/ogy,9:968-975(1991)。r/v，啟^f^為、表達載體和克隆載體通常包含能被宿主生物識別的啟動子，它與多肽核酸可操作相連。適用於原核宿主的啟動子，包括p/zo4啟動子，(3-內醯胺酶和乳糖啟動子系統，鹼性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統，和雜化啟動子如tac啟動子。然而，也可以使用其它已知的細菌啟動子。適用於細菌系統的啟動子還包含與編碼多肽的DNA可操作相連的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。真核生物的啟動子序列也是已知的。幾乎所有的真核基因在轉錄起始點上遊約25-30個鹼基處具有AT-富集區。很多基因在其轉錄起始點上遊70-80個i成基處有另一種序列CXCAAT，其中X可以是任何核香酸。大多數真核基因的3'端是AATAAA序列，它可以作為一種信號用於將poly-A尾添加到編碼序列3，端。所有這些序列都適合於插入真核表達載體中。適用於酵母宿主的啟動序列的實例包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，JB/o/.Ozem.，255:2073(1980》或其它糖酵解酶(Hess等，《/A/v.五"^meieg.,7:149(1968);Holland,所oc/zem^o;,17:4900(1978))的啟動子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氬酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶，磷酸葡萄糖異構酶和葡萄糖激酶。其它的酵母啟動子，即那些還具有由生長條件控制轉錄的優點的誘導型啟動子，是下述基因的啟動子區醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP73,657中進一步描述了適用於酵母表達系統的載體和啟動子。酵母增強子與酵母啟動子聯合使用也是有利的。在哺乳動物宿主細胞中，從載體轉錄多肽可以受啟動子調控，所述啟動子例如來自病毒基因組，如多形瘤病毒、雞痘病毒(1989年7月5日公布的UK2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的啟動子，或者來自異源哺乳動物的啟動子，如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子等，來自熱休克蛋白的啟動子，以及來自通常與Bv8序列相連的啟動子，前提是這些啟動子與宿主細胞系統相容。SV40病毒的早期和晚期啟動子可以作為還包含SV40病毒複製起點的SV40限制性片段而方便地獲得。人巨細胞病毒的立即早期啟動子可以作為HindIIIE限制性片段方便地獲得。美國專利4,419,446中公開了在哺乳動物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體來表達DNA的系統。美國專利4,601,978中敘述了對這個系統的改進。另見Reyes等，A^w，297:598-601(1982)中關於在單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表達人P幹擾素cDNA。可選地，可將勞氏肉瘤病毒長末端重複序列作為啟動子。編碼本發明多肽的DNA在高等真核生物中的轉錄常常通過將增強子序列插入載體中來增加。目前已知很多哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的增強子序列。但通常使用真核細胞病毒的增強子。實例包括在其複製起始點晚期側的SV40增強子(bp100-270)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在其複製起始點晚期側的多形瘤增強子，和腺病毒增強子。也可參見Yaniv,A^rt^e,297:17-18(1982)所述用於活化真核啟動子的增強元件。所述增強子可以剪接插入載體中多肽編碼序列的5，或3，側，^f旦優選位於啟動子的5'側。(V,)脊絲J^'為、用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的有核細胞)的表達載體，還包括對轉錄終止和穩定mRNA所必需的序列。這些序列通常來自真核或病毒DNA或cDNA的5'(偶爾為3')非翻譯區。這些區域包含轉錄為編碼多肽的mRNA的非翻譯區中聚腺苦酸化片段的核芬酸片段。一種有用的轉錄終止元件是牛生長激素多腺香區。見WO94/11026和其中/〉開的表達載體。闊涼j滅"遞舉;^絲克隆或表達本文所述載體中DNA的適宜宿主細胞，包括原核生物、酵母或高等真核細胞。適於此目的的原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae),如埃希氏菌屬(Esc/zen'c/z/a)，例如，大腸桿菌C&co//),腸桿菌屬C&&ra6a"e。，歐文菌屬(五rw/"z'a)，克雷白菌屬(A7e&zW/a)，變形菌杆屬(屍ra&w"，沙門菌屬(5V/mowe〃a)(^J口鼠"(另寒沙、門菌(5^/wo"e〃a(y//n.wwWww))，沙'雷菌屬粘質沙雷菌(SerraWawaArascara))和志賀菌屬(57'_^//!)等，以及芽孢桿菌屬(醜a"7")如枯草芽孢桿菌(及sw6"fe)和地衣芽孢桿菌(及//c/7em/om^)(例如1989年4月12日出版的DD266,710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬(屍wwfowo"a力如銅綠假單胞菌ORfl^wg/"osa)，及鏈黴菌(Sr印to^yce力。優選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，但其它菌4朱，如大腸桿菌B,大腸桿菌X1776(ATCC31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些實例是用於說明，並非限制。除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合於多肽編碼載體的克隆或表達的宿主。釀酒酵母或常見的麵包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。還有多個其它屬、種和林已有商品供應，並且可以用於本發明，例如粟酒裂殖酵母(Sc/2Zzosacc/z<3ram_yc^pom&);克魯維酵母屬^7w，erow;^^)宿主，例如乳克魯維酵母(《/"cto)、脆壁克魯維酵母(/C/rag"&)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(AT.Zw/g"n'cw力(ATCC16,045)、威克曼氏克魯維酵母(尺.vw'c/^raw")(ATCC24,178)、AT.wa//"(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(Kdra5op/n7wwm)(ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母(尺Aermoto/erara)和馬克斯克魯維氏酵母(Kmanc/awus)等；yarrowia(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(p/c/z/aptwton'"(EP183,070;Sreekrishna等，/Bos/cMz'cra&o/.，28:265-278(1988));念J朱菌屬；7Wc/2o&m7a"&sz.afEP244,234);粗糙鏈孢黴；許旺氏酵母屬Oc/mww/om;;ce力如西方許旺氏酵母Oc/w""w'owycesoc"Vfe加afe)等；和絲狀真菌，例如鏈孑包黴屬、青黴屬、ro/;^oc/^Z/ww以及麴黴屬宿主如構巢麴黴和黑麴黴。適合於表達糖基化多肽的宿主細胞來自多細胞生物。無脊推動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。目前已經從下述宿主中鑑定了大量的杆狀病毒抹和變體以及相應的容許型昆蟲宿主細胞草地夜蛾(S/7o^/^raFrwg&enia,毛蟲)、^矣及x^op/7a附6/""0(^0/6/-(果蟲1>)和家蠶蛾(50附6>1:\:won')等。用於轉染的各種病毒林公眾可以獲得，例如加利福尼亞Y級夜蛾(^wtogra//wca/z/ww'a)NPV的L-l變體和家蠶蛾NPV的Bm-5抹，並且這些病毒可以在此用作本發明的病毒，尤其是用於轉染草地夜蛾細胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛、西紅柿和菸草等的植物細胞培養物也可以用作宿主。然而，關注最多的是脊推動物細胞，而且在培養(組織培養)中繁殖脊推動物細胞已經成為常規方法。有效哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40轉化的猴腎CV1細胞系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎細胞系(293細胞或經過再克隆以便能在懸浮培養物中生長的293細胞，Graham等，JWra/.36:59(1977));幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCCCCL10);中國倉鼠卯巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，屍rac.Ato/.^cadC/5".A77:4216(1980》；小鼠足細胞(TM4，Mather,23:243-251(1980》；猴腎細胞(CVlATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCKATCCCCL34);布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細胞(W138,ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2，HB8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI細胞(Mather等，爿""a/siV.K爿c^/.5W.383:44-68(1982));MRC5細胞；FS4細胞；小鼠骨髓瘤細胞，例如NSO(如RCB0213,Bebbington等，B/o/Tec/wo/ogy10:169(1992))和SP2/0細胞(例如SP2/0-Agl4細胞，ATCCCRL1581);大鼠骨髓瘤細胞，例如YB2/0細胞(例如YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞，ATCCCRL1662);和人肝癌細胞系(HepG2)。實施本發明優選的細胞系是二氬葉酸還原酶(DHFR)缺陷的CHO，如CHO-K1,DUX-Bll,CHO畫DP12，CHO-DG44(Urlaub等，5bw油.cCW/aw/Mo/ecw/wGe"e"cs12:555(1986))，而Lecl3是典型的CHO宿主細胞系。DUX-Bll細胞已由攜帶前胰島素原cDNA的pSVEHIGNeo轉染，產生克隆CHO畫DP12。對於CHO-K1(ATCCCRL61)，DUX畫B11(Simonsen等屍A^^t/5^」80:2495-2499(1983))，DG44或CHO-DP12宿主細胞，它們可能發生變異導致其巖藻糖基化其中表達的蛋白的能力有缺陷。本發明也可用於雜交瘤細胞。術語"雜交瘤"指通過免疫來源的無限增殖細胞系與抗體生產細胞的融合產生的雜交細胞系。該術語包含異種雜交瘤融合物的子代，它是與人細胞和小鼠骨髓瘤細胞系的融合的結果，其中小鼠骨髓瘤細胞系後來與漿細胞融合，通常稱為三瘤細胞系。進一步地，該術語意在包括任何產生抗體的無限增殖雜交細胞系例如，quadromas(見，例如，Milstein等，A^w",537:3053(1983))。雜交細胞系可以是任何物種的，包括人和小鼠的。在最優選的實施方案中，哺乳動物細胞是非雜交瘤哺乳動物細胞，它由體外分離的感興趣的多肽編碼核酸轉化。"外源性核酸"或"異源核酸"是指與對該細胞而言是外來的核酸序列，或與細胞同源但其在宿主細胞中的位置通常沒有核酸被發現。,培參涼J:勿應宿主細胞由上述多肽生產的表達或克隆載體轉化，並在傳統培養基中培養，該宿主細胞經修飾適合誘導啟動子，選擇轉化體，或擴增編碼所需序列的基因。可在多種培養基中培養用於生產本發明多肽的宿主細胞。作為商品提供的；咅養基例如Ham，sF10(Sigma)，MinimalEssentialMedium((MEM),(Sigma)，RPMI畫1640(Sigma),和Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium((DMEM),Sigma)適宜培養宿主細胞。此外，Ham等，Me仇￡wz_yw.58:44(1979),Barnes等，^"a/.所oc/z亂102:255(1980)，美國專利4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美國專利Re.30,985中所述的任何培養基可用作宿主細胞的培養基。在需要時均可向這些培養基的任何一種補充激素和/或其它生長因子(例如胰島素，轉鐵蛋白，或表皮生長因子)，鹽(例如氯化鈉，鉤，鎂，和磷酸鹽)，緩衝液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苦酸和胸腺嘧啶)，抗生素(例如GENTAMYCINTM藥物)，微量元素(定義為無機化合物，通常終濃度在微摩爾範圍內)，和葡萄糖或對等的能源。也可包括本領域熟練技術人員所知的適當濃度的任何其它必需添加劑。培養條件，例如溫度，pH，等是此前選擇用於表達的宿主細胞的條件，並且是本領域普通熟練技術人員顯而易見的。所有培養基通常提供以下一種或多種類別中的至少一種組分1)能源，通常是碳水化合物的形式，例如葡萄糖；2)所有必需胺基酸，通常是二十種基礎胺基酸加半胱氨酸；3)維生素和/或其它需要保持低濃度的有^L化合物；4)游離脂肪酸；和5)微量元素，其中微量元素定義為無機化合物或天然存在的元素，通常需要保持極低濃度，多在微摩爾範圍內。培養基優選不含血清和其它動物源性蛋白，例如少於約5%，優選少於1%，更優選0到0.1%血清。然而，如果需要，可以^^用上述物質。在本發明優選的實施方案中，細胞培養基包括超量的胺基酸。超量提供的胺基酸可，例如，選自Asn，Asp,Gly,Ile，Leu，Lys，Met，Ser，Thr，Trp,Tyr和Val。優選，超量提供Asn，Asp，Lys,Met，Ser和Trp。例如，可使用的胺基酸，維生素，微量元素和其它介質成分的量是歐洲專利EP307,247或美國專利6,180,401中所述範圍的一或兩倍。對於表達所需蛋白並能夠將所需碳水化合物添加到特定位置的哺乳細胞的培養，只要特別注意到所培養的細胞，可使用多種培養條件。本領域人員熟悉適宜哺乳細胞的培養條件(Cleveland等，乂/wmwwo/.Me56:221-234(1983))或者可由熟練技術人員輕易確定(見，例如，^mVwa/CW/Cw/fwe..爿Pra"/ca/^4//raac/22ndEd.,Rickwood,D.和Hames，B.D.,eds.OxfordUniversityPress,NewYork(1992)),並可才艮據具體選定的宿主細胞變化。「^潛蛋冷的銷化使用重組技術時，糖蛋白可在細胞內，壁膜間隙產生，或直接分泌到培養基中。如果糖蛋白在細胞內產生，第一步需要去除宿主細胞或溶解片段的粒狀殘骸，例如，通過離心或超濾作用。Carter等，10:163-167(1992)描述了分離抗體的方法，該抗體糹皮分泌到大腸桿菌的壁膜間隙。簡言之，細胞懸濁液(paste)在乙酸鈉(pH3.5)，EDTA，和phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)存在下，經過30分鐘解凍。通過離心可去除細胞碎片。如果糖蛋白被分泌到培養基中，通常首先使用作為商品提供的蛋白濃縮濾糹氏(例如，Amicon或MilliporePelliconultrafiltrationunit)濃縮該表達系統的上清。在此前的任何步驟中，可使用蛋白酶抑制物例如PMSF抑制蛋白溶解，以及使用抗生素防止外來汙染物的生長。由細胞製備的糖蛋白組合物可使用如下方法純化例如，羥磷灰石層析，凝膠電泳，透析和親和層析，優選親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性有賴於存在於糖蛋白中的任何免疫球蛋白Fc區的種類和同種型。蛋白A可用於純化基於人(l，y2，或y4重鏈的糖蛋白(Lindmark等，《//附w柳o/.M"/7.62:1-13(1983))。蛋白G用於所有小鼠同種型和人y3(Guss等，五Mj50J5:15671575(1986))。親和配體附著的基質通常是瓊脂糖，但也可用其它基質。物理穩定的基質例如孔徑被控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)比使用瓊脂糖獲得更快的流率而且加工時間更短。對於含有CH3區的糖蛋白，BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg，NJ)可用於純化。根據待回收的糖蛋白，也可利用其它蛋白純化技術例如；在離子-交換柱上分級分離；乙醇沉澱；反相HPLC;在矽石(silica)上層析，在肝素SEPHAROSETM上層析，在陽離子或陰離子-交換樹脂(例如聚天冬氨酸柱)上層析；聚焦層析；SDS-PAGE;硫酸銨沉澱。在一個實施方案中，利用對凝集素底物(例如凝集素親合柱)的吸附也可以純化糖蛋白，該吸附作用可從製備物中去除含有巖藻糖的糖蛋白，從而富集不含巖藻糖的糖蛋白。F.糖蛋白分析可輕易分析按照本發明的方法生產的糖蛋白的複合碳水化合物部分，從而確定上述糖基化反應已完成。通過傳統的碳水化合物分析技術分析寡糖。因此，例如，本領域人員熟悉的凝集素蛋白印跡技術，顯示了末端甘露糖或其它糖例如半乳糖的比例。優選地，利用實施例1和Shields等，《/Ao/.C7e肌9(2):6591-6604(2001)中的MALD1-TOF質譜分析來分析碳水化合物。本領域已知若干糖基化分析方法，這些方法可用在本文中。這些方法提供了關於附著於多肽的寡糖的同一性和組成的信息。用於本發明的碳水化合物分析法包括但不限於，凝集素層析；HPAEC-PAD，它利用高PH陽離子交換層析根據電荷分離寡糖；NMR;質譜分析；HPLC;GPC;單糖成分分析；連續酶消化。此外，本領域人員已知釋放寡糖的方法。這些方法包括1)酶的方法，例如使用巖藻糖苷酶例如ot-L-巖藻糖香酶去除巖藻糖；2)苛刻鹼性環境下的消除，釋放主要是O-連接的結構；和3)化學方法，使用無水肼釋放N-連接的和O-連接的寡糖。通過高效陽離子交換層析和脈沖電流檢測(HPAE-PAD碳水化合物系統，DionexCorp.)檢測中性糖和氨基糖。例如，100。C條件下，通過在20%(v/v)的三氟乙酸中水解6小時可釋放糖。隨後通過凍幹法或由Speed-Vac(SavantInstruments)乾燥水解產物。然後在1°/。的乙酸鈉三水合物溶液中溶解殘基，並如Anumula等爿"a/.B/oc/zew.195:269-280(1991)所述在HPLC-AS6柱上分析。在平行三份樣品中，通過Yao等J"a/所oc/7em.179:332-335(1989))的直接比色法可單獨測定唾液酸。在優選的實施方案中，使用Warren,L.J5/o/C&m238:(8)(1959)的硫代巴比妥酸(TBA)。可選地，可進行免疫印跡碳水化合物分析。根據本方法，使用商品化的多糖檢測系統(Boehringer)可檢測蛋白連接的碳水化合物，該系統基於Haselbeck和Hosel(Haselbeck等G/_ycoco"ywga^/，7:63(1990))所述的氧化物免疫印跡法。分析的方法包括為分析抗體相關的寡糖所述的那些和例如Wormald等，所oc/^w,36:1370-1380(1997);Sheeley等^加/.所oc/zew.247:102-110(1997)andCant等，Q^c^c/z"o/ogy15:223-228(1994)以及其中引用的對比文件所述的那些。G.藥物配製劑可以通過將具有適當純度的所需化合物與可選的藥用載體，賦形劑，或穩、定劑(Remington'sPharmaceuticalSciences,16片反，Osol，A.ed.(1980))〉'昆合形成凍幹製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩沖劑例如磷酸鹽，杵檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二曱基千基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化千烷銨(benzalkoniumchloride),笨索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；烷基對羥基苯曱酸酯如曱基或丙基對羥基苯曱酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間曱酚)；4氐分子量多肽(少於10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA;糖類如蔗糖、甘露醇、巖藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文的配製劑也可包含治療特定指徵所需的一種以上的活性化合物，優選活性互補但相互無副作用的那些。例如，該配製劑可進一步包含另一種抗體或化療劑。此種分子以有效治療量出現於聯合用藥中。該活性成分也可包裹在通過諸如凝聚技術或界面聚合而製備的微膠嚢中，例如，分別在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳狀液，納米顆粒和納米膠嚢)中或在粗滴乳狀液中的羥曱基纖維素或凝膠-微膠嚢和聚—(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢。這些技術公開於Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol，A.Ed.(1980)。用於體內給藥的本發明化合物必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠嚢。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，Ma^:A仏，15:167-277(1981);Langer,Ozem.Tec/z"12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919，EP58,481)，L-穀氨酸與y乙基-L-穀氨酸的共聚物(Sidman，等，Aopo/jwera22:547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinylacetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LupronDepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。當膠嚢化抗體長時間停留在體內時，它們可能由於暴露在37。C潮溼環境中而變性或凝聚，導致損失生物活性，且免疫原性可能會改變。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍幹、控制溼度、採用合適的添加劑、和開發特異性聚合物基質組合物來實現穩定。藥物組合物可以是凍幹的。美國專利6,267,958描述了凍幹的抗體配製劑。美國專利6,171，586Bl描述了穩定的液體抗體配製劑。H.糖蛋白的非治療用途本發明的糖蛋白可用作親合純化試劑。在該方法中，利用本領域已知的方法將糖蛋白固定於例如葡聚糖凝膠樹脂或濾紙的固相上。固定的糖蛋白與含有待純化抗原的樣品接觸，隨後使用適宜的溶劑洗滌支持物，該溶劑可充分去除樣品中除結合與固定糖蛋白的待純化抗原外所有的物質。最後，以另一種適宜的洗滌劑例如甘氨酸緩衝液，pH5.0，洗滌支持物，該緩沖液可將抗原從糖蛋白上釋放出來。糖蛋白也可用於診斷分析，例如，用於檢測特定細胞，組織或血清中感興趣的抗原的表達。用於診斷時，通常用可檢測的部分標記糖蛋白。可利用多種標記，通常分為以下幾類；(a)放射性同位素，例如35S，14C,125I,3H,和1311。使用例如Cwre"f屍ratoco/s/mmwwo/ogy，Volumes1and2,Coligen等,Ed.Wiley-Interscience，NewYork,NewYork,Pubs.(1991)中所述的技術可用放射性同位素標記糖蛋白並且可使用閃爍技術測定放射活性。(b)可利用螢光標記，例如稀土元素螯合物(銪螯合物)或螢光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹醯，裡沙明(Lissamine),藻紅蛋白和TexasRed。利用例如上文的Cwre"/屍ratoco/s/"/wmwwo/ogy,中公開的技術可將螢光標誌物偶聯於糖蛋白。可用螢光計定量螢光。(c)可利用各種酶底物標記，美國專利4,275,149提供了其中的一些的綜述。酶通常催化產色底物的化學變化，利用各種技術可測量這種化學變化。例如，酶可催化底物中的顏色變化，這種變化可用分光光度法測定。可選地，酶可改變底物的螢光或化合光。定量螢光變化的技術見上文。化學發光底物經化學反應而電激發，發射出可測量的光(例如使用化學光度計)或將能量釋放到螢光接收器。酶標記的實例包括螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶和細菌焚光素酶；美國專利4,737,456)，蟲螢光素(luciferin)，2,3-二氫二氮雜萘啶(2，3-dihydrophthalazinedione)，蘋果酸脫氬酶，脲酶，過氧化物酶例如辣根過氧化物酶(HRPO),鹼性磷酸酶，P-半乳糖芬酶，葡糖澱粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，雜環氧化酶(例如尿酸酶和黃噪呤氧化酶)，乳過氧化物酶，；微過氧化物酶(microperoxidase)，如此等等。對將酶偶聯於抗體的技術描述見O，Sullivan等，MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay,inMe//zO(is五wz戸.(edJ.Langone&H.VanVunakis),Academicpress,NewYork,73:147-166(1981)。酶底物結合物的實例包括，例如(i)辣根過氧化物酶(HRPO),以氫過氧化物酶為底物，其中氫過氧化物酶氧化染料前體(例如，鄰苯二胺(OPD)或鹽酸3，3，，5，5，-四曱基聯苯胺(TMB));(ii)石鹹性磷酸酶(AP)，以磷酸對硝基苯作為產色底物;和(iii)(3-D-半乳糖苷酶(P-D-Gal)和產色底物(例如，p-硝基苯-l3-D-半乳糖苷酶)或螢光底物4-曱基傘形醯(methylumbelliferyl)-P-D-半乳糖苷酶.本領域熟練技術人員熟悉許多其它的酶-底物結合物。有關綜述見美國專利4,275,149和4,318,980。有些情況下，標誌物間接地與糖蛋白偶聯。熟練技術人員熟悉各種實現此種偶聯的技術。例如，糖蛋白可與生物素偶聯，而且上述標誌物的三種廣義類別中的任何一種均可與抗生物素蛋白偶聯，或反之。生物素選擇性地結合抗生物素蛋白，並由此將標誌物以這種間接的方式偶聯於糖蛋白。可選地，為獲得標誌物與糖蛋白的間接偶聯，糖蛋白與小的半抗原(例如，地高辛)偶聯，而且上述不同類型的標誌物之一可以和抗-半抗原多肽(例如，抗-地高辛抗體)偶聯。由此實現標誌物和糖蛋白的間接偶聯。在本發明的另一實施方案中，無需標記糖蛋白，而且利用與糖蛋白結合的標記抗體可4企測糖蛋白的存在。本發明的糖蛋白可用於任何已知的實驗方法，例如，竟爭結合分析，直接和間接夾心法分析，和免疫沉澱分析。Zola，單克隆抗體JMa"wa/o/Tec—腦，147-158頁(CRCPress,Inc.1987)。糖蛋白也可用於體內診斷分析。通常，以放射性核素(例如111In,"Tc,14C，131I，1251,3H，32P或"S)標記糖蛋白，使得利用免疫閃爍照相可以定位表達該糖蛋白的抗原或細胞。I.糖蛋白的體內使用據預計本發明的糖蛋白可用於治療哺乳動物例如患有將從該糖蛋白的用藥中受益的疾病或有得病傾向的病人。可由該糖蛋白治療的情形很多，包括癌症(例如糖蛋白結合腫瘤相關抗原，B-細胞表面抗原例如CD20,ErbB受體例如HER2受體，血管生成因子例如血管內皮生長因子(VEGF)的情形)；過敏性疾病例如嗜喘(利用抗-IgE抗體)；和LFA-l-介導的疾病(例如糖蛋白是抗-LFA-l或抗-ICAM-l抗體時)等等。如果抗體結合B-細胞表面標誌物例如CD20,優選的指徵是B-細胞惡性疾病(例如非何杰金氏淋巴瘤)，自身免疫性疾病，或為阻斷對外來抗原的免疫反應(見WO01/03734)。如果抗體結合ErbB受體，優選的疾病是表達ErbB的癌症，例如良性或惡性腫瘤，其特徵是ErbB受體的過度表達。此種癌症包括，但不限於，乳腺癌，鱗狀細胞癌，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，胃腸道癌，胰腺癌，成膠質細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，膀胱癌，肝癌(hepatoma)，結腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜癌，唾液腺癌，腎癌，肝癌(livercancer),前列腺癌，外陰癌，曱狀腺癌，肝癌(livercarcinoma)和各種頭頸部癌。根據本發明的教導，技術人員可以製備具有變體Fc區的糖蛋白，它具有增強的ADCC活性。此種分子常見地用於治療不同的疾病。例如，具有增強的ADCC活性的糖蛋白可用於治療需要破壞或去除組織或外來微生物的疾病。例如，該糖蛋白可用於治療癌症，自身免疫性疾病，炎性疾病；感染(例如細菌，病毒，真菌或酵母菌感染)；和其它需要去除組織的情形(例如曱狀腺腫)等等。糖蛋白可以任何適宜的途徑給藥，包括，胃腸外，皮下，腹膜內，肺內和鼻內，而且如果用於局部免疫抑制治療，可通過損傷部部位內給藥。胃腸外輸液包括肌肉內，靜脈內，動脈內，腹膜內或皮下給藥。此外，糖蛋白適合脈衝輸液給藥，尤其是糖蛋白的劑量遞減時。優選通過注射給藥，更優選靜脈內或皮下注射，根據用藥是短期或長期而不同。為預防或治療疾病，糖蛋白的適當劑量依賴於所治疾病的類型，疾病的嚴重程度和進程，糖蛋白給藥的目的是預防還是治療，先前的治療，患者的臨床病史和對抗體的應答，以及主治醫生的判斷。糖蛋白適宜一次性地或以一系列治療的方式施用於患者。根據受治疾病的嚴重程度和類型，施用於患者的糖蛋白的初始侯選劑量是約1嗎/kg到約15mg/kg體重(例如約0.1-20mg/kg/劑)，無論是例如通過一次或分多次給藥，還是通過連續輸注給藥。典型的日劑量可從約lfig/kg到約100mg/kg或更多，根據上述因素不同而變化。對於數天或更長時間的重複給藥，視具體情況而將治療持續到出現對疾病症狀的所需抑制為止。然而，除此之外，其它的劑量方案也可以使用。治療的進展很容易通過常規技術和試驗來監測。本文的實施例顯示，與含有巖藻糖的糖蛋白相比，可給藥較低劑量的糖蛋白(例如不含巖藻糖的抗體)。糖蛋白組合物的配製，確定劑量，和給藥均應以符合良好醫療實踐的方式進行。本文考慮的因素包括待治療的具體疾病，待治療的具體哺乳動物，每個病人的臨床情況，疾病的原因，藥劑的傳送部位，給藥方法，給藥方案，和其它醫務人員已知的因素。給藥糖蛋白的"治療有效量"由上述因素控制，而且是預防，改善或治療疾病所必需的最小量。糖蛋白無需，但任選地可與一種或幾種目前用來預防或治療所述疾病的藥劑配製在一起。這些其它藥劑的有效量有賴於配置劑中糖蛋白的量，疾病或治療的類型，和上述討論的其它因素。通常它們使用的劑量相同，用藥途徑如上文所述或約為迄今使用劑量的1到99%。治療抗體組合物通常置於具有無菌存取口的容器中，例如靜脈注射袋或帶有能通過皮下注射針刺穿的塞子的小瓶。用作為拮抗劑的本發明抗體治療的患者，也可接受放射治療。或者或此外，可以將其它化療劑給藥該患者。此類化療劑的配製和給藥方案可以按照製造商的指示進行或者由熟練的臨床醫師根據經驗決定。此類化療劑的配製和給藥方案也可以參見ChemotherapyServiceEd.,M.C.Perry,Williams&Wilkins，Baltimore,MD(1992)。化療劑可以在給藥本發明抗體之前或之後給藥，或者二者同時給藥。對於癌症的指徵，也可給藥針對腫瘤相關抗原或針對血管生成因子的額外抗體，例如與HER2或血管內皮生長因子(VEGF)結合的抗體。可選地，或此外，可將一種或多種細胞因子共同給藥病人。本發明進一步提供了製品和含有對治療癌症有用的物質的試劑盒。所述製品包含有標籤的容器。適宜容器包括，例如，瓶，小瓶，和試管。容器可由各種材料如玻璃或塑料製成。該容器內盛放包含上述糖蛋白製劑的組合物。該組合物中的活性劑是特定糖蛋白。容器上的標籤說明該組合物用於治療或預防特定疾病，並說明了體內的用法，例如上述那些。本發明的試劑盒包含上述容器和包含緩衝液的第二容器。進一步包括具有商業需要以及符合用戶需要的其它材料，如其它緩沖液、稀釋劑，過濾用品，針頭，注射器，以及帶有使用說明的包裝插頁。參考以下實施例可更充分的理解本發明。然而，不能將其理解為限制本發明的範圍。涉及的所有文獻和專利說明包含於本文中作為參考。實施例為評價巖藻糖基化的寡糖在IgG功能中的作用，使用Lecl3細胞系(Ripka等爿rc/7.B/oc/zem.Aop/^s.249:533-545(1986))表達人IgGl。該CHO細胞系添加巖藻糖的能力有缺陷，但提供了具有寡糖的IgG，該IgG在其它方面與正常CHO細胞系中發現的和來自人血清的相似。產生的IgG產物用於評估巖藻糖基化的碳水化合物對抗體效應器功能的影響，包括對與人Fc丫R，人Clq,人FcRn結合的影響，和對利用人效應器細胞的ADCC的影響。實施例1:與人FcR的結合紐應,秀的cDA^4溝建體將人源化抗-HER2抗體Hu4D5(Carter等，Prac.Ato/.^c^/.5W.L/S489:4285(1992)),人源化的親合成熟抗-IgE抗體E27(美國專利6,172,213)，和嵌合抗-CD20抗體C2B8(美國專利5,736,137)的重鏈和輕鏈亞克隆入前述的哺乳動物細胞表達載體中(Lucas等7Vwc/.^c/t/A"24,1774-1779(1996))。使用噤呤黴素作為DHFR(+)細胞中的選擇標記，例如Lecl3細胞，並且保留DHFR位點用於穩定細胞系的曱氨喋呤擴增。和野i型i砂應的#染和培^:CHO細胞系Pro-Lecl3.6a(Lec13)自AlbertEinsteinCollegeofMedicineofYeshivaUniversity的PamelaStanley教授獲得。親代細胞系是Pro-(脯氨酸營養缺陷型)和Gat-(甘氨酸，腺苦，胸苷營養缺陷型)。用於野生型抗體的CHO-DP12細胞系是CHO-Kl細胞系(ATCC弁CCL-61)的衍生物，它是二氫葉酸還原酶缺陷的，並且具有降低的對胰島素的需求。使用Superfect法(Qiagen，Valencia,CA)用cDNA轉染細胞系。使用10|ug/ml的二鹽酸。票呤黴素(puromycindihydrochloride)在含有以下成分的培養基中選擇表達所轉染抗體的Lecl3細胞含有L-穀氨醯胺，核糖核香和脫氧核糖核苷(GIBCO-BRL，Gakhersburg，MD)的MEMa培養基，添加10%滅活的FBS(GIBCO)，10mMHEPES，和IX青黴素/鏈黴素(GIBCO)。類似地，在含有無GHT的Ham'sF12生長培養基中選擇CHO細胞低葡萄糖DMEM，不含甘氨酸，含有NaHC03，添加5%FBS(GIBCO),10mMHEPES,2mML-穀氨醯胺，1XGHT(甘氨酸，次黃嘌呤，胸苷)，和lX青黴素/鏈黴素。菌落在兩到三周內形成，收集後用於擴增和蛋白表達。開始將細胞按照3x106個細胞/10cm板接種，用於小批蛋白的表達。一旦細胞長滿該板的卯-95%時，將其轉至不含血清的培養基中，3-5天後，收集細胞上清，並在FcIgG-ELISA和完整IgG-ELISA中進行檢驗，估測蛋白表達水平。轉至PS24生產培養基的前一天，按照大約8x106個細胞/15cm板接種Lecl3和CHO細胞，並添加10mg/L重組人胰島素和lmg/L微量元素。齊^^這:Lec13細胞和CHO細胞在不含血清的生產培養基中保持3-5天。收集上清，在150ml錐形試管中離心去除細胞和碎片。加入蛋白酶抑制物PMSF和抑肽酶(Sigma，St.Louis，MO)，在使用蛋白G層析(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ))進行即刻純化前，4吏用MWCO30濾紙(Amicon，Beverly,MA)在攪勻的細胞上濃縮上清5倍。使用Centripriep-30濃縮器(Amicon)將所有蛋白的緩衝液都換成磷酸鹽緩衝鹽溶液(PBS)並用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分析。用A280測定蛋白濃度並用胺基酸組成分析驗證。平均每個15cm的板中的Lecl3細胞產生10jigmAb;對照CHO細胞中所有抗體的表達比Lecl3細胞中高4-5倍。由板上生長的CHO-DP12產生的抗體表示為CHO-P。CHO-DP12細胞也在玻璃旋轉培養瓶中生長。以6xl05細胞/ml接種細胞，並在37。C下生長兩天。第三天，溫度改為33。C,並且允許細胞生長直到由於PH降低到6.5其生存力降低到70%。玻璃旋轉培養瓶中生長的來自CHO-DP12細胞的抗體表示為CHO-S。天冬凝廢-遂"#,溏的差|裙勿邀^冶席吸/^飛/;^7^:^旭丄^/-779屍」f謬為V《'使用Papac等，G/少co&'o/ogy8,445-454(1998)的方法，將N-連接的寡糖自重組糖蛋白中解離。簡言之，用lOO^il曱醇處理96孔PVDF覆蓋的微滴定板(Millipore,Bedford,MA)的各孔，即使微孔過濾器多銀幕真空歧管(MilliporeMultiscreenvacuummanifold)處於真空從而使曱醇通過真空抽吸穿過PDVF膜。以3X250itil水洗滌處理後的PVDF膜。在所有洗滌步驟之間，通過將微真空加於歧管而完全抽空各孔。使用還原和羧曱基化的緩衝液(RCM)洗滌膜，該緩沖液由6M鹽酸胍，360mMTris，2mMEDTA組成，pH為8.6。將糖蛋白樣品(50iig)加入各孔，再次通過孩支真空抽吸使樣品通過PVDF膜，並使用2X50plRCM緩沖液洗滌各孔。在各孔中加入50pl0.1M二硫蘇糖醇(DTT)溶液，並在37。C下孵育1小時以還原固定後的樣品。通過真空去除DTT,並用4x250nl水洗滌各孔。加入50fi10.1M石典乙S臾(IAA)溶液羧曱基化半胱氨酸殘基，所述IAA溶液在1MNaOH中新鮮製備，並用RCM緩衝液稀釋至0.1M。室溫下避光孵育30分鐘完成羧曱基化。對該板施用真空以去除IAA溶液，並用4x250)^1純淨水洗滌各孔。加入100pl1%PVP360(polyvinylpyrrolidine360,000MW)(Sigma)溶液封閉PVDF膜並在室溫下孵育1小時。利用溫和的真空吸引去除PVP-360溶液並用4x250|ul水洗滌各孔。將PNGaseF(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)消化液，10mM醋酸Tris中的25|ul的25單位/ml溶液，pH8.4,加入各孔並在37。C下消化3小時。消化後，將樣品轉移到500|ulEppendorf管中，並將2.5^1的1.5M乙酸溶液加入各樣品中。酸化的樣品在室溫下孵育3小時，將寡糖由氨基葡糖轉化成羥基形式。在MALDI-TOF質語分析前，使用以攪拌方式緊密填充的0.7-ml柱床體積的陽離子交換樹脂反應管(氫形式AG50W-X8樹脂)(Bio-Rad,Hercules,CA)(USBiochemical,Cleveland,OH)對釋放的寡糖脫鹽JUL。對於樣品在正電荷才莫式中的MALDI-TOF質譜分析，將脫鹽的寡糖(0.5|iil等份)和0.5jil2，5-二羥基苯曱酸基質(sDHB)用於沒有汙染的靶點(stainlesstarget),該基質是通過將2mg2,5二羥基苯曱酸和0.1mg5-曱氧基唾液酸(5-methoxyslicylicacid)溶解於1ml乙醇/10mM氯化鈉l:l(v/v)中製得的。樣品/基質混合物由真空乾燥。對於樣品在負電荷性模式中的MALDI-TOF質譜分析，將脫鹽的N-連接的寡糖(0.5iul等份)和0.5pl2，，4，，6，-三羥基苯乙酮基質(THAP)用於沒有汙染的靶點，該基質是在l:3(v/v)乙腈/13.3mM檸檬酸銨緩衝液中製得的。樣品/基質混合物經真空乾燥，並且在分析前允許樣品吸收空氣中的水分。通過MALDI-TOF在PerSeptiveBioSystemsVoyager-DE質譜分析儀上分析釋放的寡糖。在20kV、具有線性構象的正電荷或負電荷模式下，利用延遲提取(delayedextraction)操作質譜分析儀。使用1300的雷射能量獲得總和狀態的數據(240倍掃描)以提高信號抗噪音的能力。使用標準寡糖混合物校準儀器，並在給出質語值前利用19點Savitsky-Golay算法(19pointSavitsky-Golayalgoritym)處理數據。使用Caesar7.0數據分析軟體包(SciBridgeSoftware)整合質譜數據。結果總結於下表中。表2.抗體與人FcyR的結合均值(S.D.)N%-Fucc%Gal0%Gall%Gal2FcyRIa，bCHO-S1.0053426CHO-P0.97(0.07)27325Lec13(A)1.04(0.07)49250437Lec13(B)1.04(0.10)59155405Fc，A(R13)cCHO-S1,0053426CHO-P0.87(0.14)227325Lec13(A)1.70(0.04)9250437Lec13(B)1.49(0.16)3915540Lec13(C)1.77(0.38)9351437Lec13(D)1.71(0.40)38851437Lecl3-Avg1.62(0.32)1291(2)52(2)42(2)7(1)Fc丫RIIA(H131)dCHO-S1.0053426CHO-P0.87(0.07)273253Lec13(A)0.93(0.08)9250437Lec13(B)0,75(0.07)915540Lec13(C)0.94(0.15)39351437Lec13(D)0.91(0,07)885143"7Lecl3-Avg0.88(0.12)1291(2)52(2)42(2)7(1)Fc，BCCHO-S1.0053426CHO-P0.81(0.11)227325Lec13(A)2.27(0.35)9250437Lec13(B)1.51(0.22)39155405Lec13(C)2.07(0.33)29351437Lec13(D)1.60(0.45)8851437Lecl3-Avg1.8(0.49)1291(2)52(2)42(2)7(1)FcyRIIIA(F158)eCHO-S1.005342CHO-P0.94(0.01)227325Lec13(A)27.0(2.1)39250437Lec13(B)22.8(2.3)3915540Lec13(C)25.1(2.4)39351437Lec13(D)22.3(1.0)38851437Lecl3-Avg24.3(2.6)1291(2)52(2)42(2)7(1)HEK293-AAA20.8(0.9)2Lecl3-AAA(A)32.819575222Lecl3-AAA(B)32.9(2.9)3927522Lecl3-AAA(C)34.8(3.0)Lecl3-AAA-Avg33.5(2.1)6Fcy腿A(F158)fHEK2931.002DP120.35(0.01)2Lec137.63(0.20)2FcyRIIIA(F158)gHEK2931.00CHO-P0.65(0,24)Lec131.92(0.39)HEK293-AAA1.87(0.24)3FcyRIIIA(F158)-轉染的CHO細胞CHO-S1.004Lec13-D15.72.44Lecl3-E17.03.1Lecl3-F15.83.23Lecl3-Avg16.12.510HEK293-AAA10.71-43Lecl3-AAA-B26.86.63Lecl3-AAA-C25.95.9Lecl3-AAA-Avg26.45.66Fcy腿A(V158)eCHO1.003353426DP120.61(0.01)227325Lec13(A)14.9(2.9)3925043"7Lec13(B)12,5(1.3)3915540Lec13(C)12.6(3,3)3935143"7Lec13(D)14.5(1.9)38851437Lecl3-Avg13.6(2.4)1291(2)52(2)42(2)7(1)HEK293-AAA9.31Lecl3-AAA(A)25.41957522Lecl3-AAA(B)23.8(1.1)3927522Lecl3-AAA(C)22.5(0.2)2Lecl3-AAA-Avg23.1(1.4)6Fcy腿A(V158)fHEK2931.002CHO-P0.32(0.01)2Lecl36.44(0.19)2FcyRIIIA(V158)gHEK293.00CHO-P1.00(0.13)3Lecl31.18(0.10)3HEK293-AAA1.15(0.05)3a:所有的值是A490nm測定的A(變體)/A(標準品)的比例。CHO-S代表玻璃旋轉培養瓶中CHO細胞表達的IgG,CHO-P代表15cm板中CHO細胞表達的IgG，Lecl3代表板上Lec13細胞表達的IgG，HEK293代表人胚胎腎293細胞表達的IgG，AAA代表Ser298Ala/Glu333Ala/Lys334AlaIgGl變體，Lecl3-S代表玻璃旋轉培養瓶(而不是板)中Lecl3細胞表達的IgG。括號中的字母表示獨立表達的IgG群。b:Hu4D5二聚體，[mAb]=0.12pg/ml.c:。/。-Fuc是不含巖藻糖的寡糖總量的百分比，％GalO,%Gall,%Gal2是不含(無半乳糖基)，含一個(單半乳糖基)或二個(二半乳糖基)與末端甘露糖殘基共價連接的半乳糖殘基的寡糖總量的百分比。括號中的數值是四個獨立表達的Lecl3-Hu4D5群的均值的偏差。d:Hu4D5二聚體，[mAb]=3.33ng/mle:Hu4D5二聚體，[mAb]=l.llpg/mlf:Hu4D5二聚體，[mAb]=0.12pg/mlg:E27二聚體，[mAb]=0.12pg/mlh:E27六聚體，[mAb]=0.12pg/ml測定IgGl與FcyR和FcRn結合的實驗(ELISA-形式和基於細胞的)已在(Shields等>/C7zem.276:6591-6604(2001)和WO00/42072(Presta)描述。單體Lecl3-Hu4D5IgGl與人FcyRI的結合與Hu4D5-CHO-S和CHO-P的結合等同(圖4;表2)。儘管碳水化合物的存在對於FcyRI的結合是必需的(Walker等B/oc/zew.259:347-353(1989))，但無論巖藻糖含量存在什麼差異(Lecl3對CHO)或半乳糖含量存在什麼差異(CHO-P對CHO-S),IgGl的結合是相等的這一事實顯示人FcyRI對碳水化合物上這些部分的存在不敏感。已經研究了半乳糖苷化對IgG與人FcyRI的結合的影響(Wright等/畫,/.160:3393-3402(1998);Kumpel等顛WM//咖Vfo畫5:143-151(1994);和Tsuchiya等/16:285-290(1989))，數據表明如果半乳糖苷化影響與FqRI的結合，也是非常微小的，並且是同種型(isotype)依賴的(Wright等J/mmw"o/.160:3393-3402(1998))。與IgGl和人FqRI的單體結合不同，低親和力的人FcyR(FcYRII,FcyRIII)的結合實驗需要二聚體(Hu4D5，HuE27)或六聚體(HuE27)的形成才能對結合進行檢測。人FcyRIIA具有兩種已知的、天然存在的同種異型，由胺基酸位置131確定(Clark等j:/附ww"o/.143:1731-1734(1989))。人FcyRIIIA在胺基酸位置48(亮氨酸，組氨酸，或精氨酸)和位置158(纈氨酸或苯丙氨酸)上具有天然存在的同種異型；FcyRIIIA(Vall58)同種異型與人IgG的反應優於FcyRIIIA(Phe158)同種異型(Shields等《/所o/.CTzew.276:6591-6604(2001);Koene等90:1109-1114(1997);和Wu等C7/"./m^W.100:1059-1070(1997))。與CHO-Hu4D5(圖5，6;表2)相比，Lecl3-Hu4D5二聚體與人FcyRIIB和FcyRIIA的人R131多態形式的結合顯示分別提高1.8-倍和1.6-倍。反之，缺乏巖藻糖不影響與人FcyRIIAH131多態形式的結合(圖7;表2)。與對FcyRIIA(H131)沒有作用相比，不含巖藻糖的IgGl與人FcyRIIA(R131)和FcyRIIB(均在位置131上具有精氨酸)的結合的提高程度相似，提示巖藻糖或者可與在位置131上的FcyR殘基直接作用或者當精氨酸出現在位置131上時，改變IgGl構型從而對結合造成微弱的負面影響。FcyRIIIA的多態形式均顯示出與缺乏巖藻糖的IgGl的結合顯著增強。二聚體Lecl3-Hu4D5與FcyRinA(V158)的結合比CHO-Hu4D5增強14倍(圖8;表2)而與FcYRIIIA(F158)的結合顯示至少增強100倍(圖9)。Lecl3-HuE27二聚體也顯示與FcYRIIIA的兩種多態形式的結合增強(圖10，11;表2)。以往關於人IgGl蛋白-序列變體對與人FcyR的結合的影響的研究中，使用由三個抗-IgEE27和三個IgE組成的六聚體複合物(Shields等/C77em.276:6591-6604(2001));因此，這些複合物在抗-IgEE27中是三聚體。在該研究中，S298A/E333A/K334A-IgGl變體與FcyRIIIA(F158)和FcyRIIIA(V158)的結合分別增強1.5-到2-倍和l.l-倍；儘管這樣的增強可能看起來極小，但對ADCC的影響是顯著的(Shields等J所o/.C7^肌276:6591-6604(2001))。在目前的研究中，S298A/E333A/K334A-IgGl六聚體複合物顯示與兩種FcyRIIIA多態形式的結合增強，這與前述的研究數值相符(圖12,13;表2);同樣Lecl3-HuE27六聚體複合物(天然IgGl)顯示與FcyRIIIA(F158)的結合約增強兩倍(表2)。作為二聚體分析時，具有巖藻糖的S298A/E333A/K334A-IgGl變體與FcyRIIIA(V158)和FcyRIIIA(F158)的結合分別增強9-倍和20-倍；不含有巖藻糖的同樣變體與所述多態形式的結合增加更多，分別是21-倍和33-倍(表2)。因此，缺乏巖藻糖不僅增加了天然IgGl與FcyRIIIA的結合，還可增強了IgGlFc變體的結合。因此，蛋白和碳水化合物的改變是協同的。對於所有形式的HuE27(天然的，S298A/E333A/K334A-IgGl，Lecl3-衍生的)，較大複合物(在HuE27中為三聚體)的結合的增加比作為二聚體複合物的相同mAb中所觀察到的要小得多。例如，二聚體Lecl3-HuE27的結合顯示增強約20-倍，但對於較大複合物，只有2倍(表2)。這表明隨著免疫複合物體積的增加，對親合力的影響開始在結合中佔優勢。用與y鏈在CHO細胞上共表達的FcyRinA(Phe158)全長a鏈(圖28;表2)證實了巖藻糖缺陷的IgGl與FcyRIIIA的結合的增強。對於ELISA-中單獨的a鏈融合蛋白，巖藻糖缺陷與S298A/E333A/K334A-IgGl變體是協同的。也可評價天然和去掉巖藻糖的IgGl與小鼠FcyRII和FcyRHI的結合。人IgGl，即使是二聚體，與這些受體的結合也很差，而且在不含巖藻糖的IgGl中沒有發現結合增強。另一種IgG受體，新生兒Fc受體(FcRn)，在結構上與FcyR無關(Burmeister等7Va^"372:379-383(1994);和Raghavan等iev.Ce〃Dev.Ao/.12:181-220(1996))，並且據稱參與多種生物過程包括IgG的清除(Ghetie等iev./附ww"o/.18:739-766(2000))。巖藻糖基化和非巖藻糖基化的IgGl與FcRn的結合相等(圖14)。由於未糖基化的IgGl和糖基化的IgGl(無糖(aglyco)Ab結合FcRn)與該受體的結合相似，因此前述現象並不令人吃驚。Asn29連接的碳水化合物缺乏巖藻糖導致在ELISA形式的實驗中，與人FcyRIIIA(F158和V158多態形式)的結合顯著增強。與FcyRIIIA增強的結合進一步由利用純化的人PBMCs在ADCC分析中，去掉巖藻糖的IgG提高細胞毒作用的能力證實。增強的細胞毒作用在低濃度的抗體時尤其明顯，表明可給予低劑量的利用ADCC的治療性抗體產生與較高劑量的巖藻糖化IgG相同的殺細胞作用。發現去掉巖藻糖的IgG與人FcyRIIA(R131)和FcyRIIB的結合較小程度地增強；而與人FcyRIIA(H131)的結合沒有區別。前兩種受體在位置131上都具有精氨酸，意味著不限於本理論的情況下，在巖藻糖化的IgG中，巖藻糖殘基或可以直接(並且明顯地，負性地)與FcYRII殘基131反應，或可以輕微影響IgG構型，從而導致負性反應(negativeinteraction)。儘管去掉巖藻糖-的IgG與FcyRIIA(R131)和FcYRIIB的結合的增強在ELISA-形式的實驗中較小(2-倍)，但使用單核細胞的ADCC實驗還是顯示了在抗體濃度較低時細胞毒作用的增強。單核細胞表達FcyRI，FcyRIIA,FcyRIIB，而且只有單核細胞的一個亞群表達FcyRIIIA。由於巖藻糖基化的IgG和不含巖藻糖的IgG與人FcyRI的結合相同，因此ADCC的增強不太可能由於與Fc7RI不同的相互作用引起。FcyRIIA(Rl31/R131)和FcyRIIA(Hl31/H131)供體單核細胞的ADCC都顯示有所增強(圖21，22)，表明不限於任何理論，(l)FcYRJIA在單核細胞上的表達水平可能不夠高，不能顯示兩種多態形式之間的差異，(2)FcyRIIB可能是優勢結合FcYR(因此對R131/R131和H131/H131單核細胞的影響相等)，或(3)表達FcyRIIA的單核細胞的亞群可能導致增強的ADCC。天然IgG上發現的碳水化合物與Lecl3-產生的和CHO-產生的IgG上發現的碳水化合物相比，沒有發現半乳糖基化程度有明顯差異，因而該結果可完全歸結於巖藻糖的存在/缺失。然而，相對於S298A/E333A/K334AIgGl變體，Lecl3產生的，HEK293-產生的和DP12-產生的IgG在半乳糖基化中顯示差異。但是，蛋白序列的改變和巖藻糖的缺乏相組合的結果看來確實是相加性的。以前關於人IgG蛋白序列變體的研究發現某些Fc位置上的丙氨酸(和其它)取代會降低或增強與FcyR的結合併顯示增強的ADCC(Shields等Bz'o/.CAem.276(9):6591-6604(2001))。有趣的是，一些取代不臨近人IgGFc-人FcyRIIIA複合物晶體結構的(Sondermann等Atowe406:267-273(2000))作用界面。例如，在三個用於本發明的丙氨酸取代S298A/E333A/K334A中，僅S298位於Fc-FcyRIIIA晶體結構的界面。同樣的，在共結晶結構中，兩條Fc重鏈上的巖藻糖殘基均不與FcyRIIIA反應。對人和嚙齒類Fc或IgG的晶體結構觀察顯示巖藻糖可採用不同的構型，並顯示高B-因子，表明高活動性。正常CHO和HEK293細胞將巖藻糖添加於IgG寡糖，達到較高程度(97-98%)。血清中的IgG也是高度巖藻糖基化的。實施例2:Clq和FcRn的結合Clq與抗體的結合是經典補體活化途徑中的第一步(Makrides,S.C.屍/wrwaco/.50:59-87(1998))。IgG上碳水化合物的性質影響與Clq的相互作用(Wright等J/wm""o/.160:3393-3402(1998);Boyd等Mo/ec./www"o/.32:1311-1318(1995);和Tsuchiya等/i/ewwato/.16:285-290(1989))。Hu4D5結合人Clq不如RITUXAN⑧，後者是抗-CD20小鼠/人嵌合IgGl(圖15，16)(Idusogie等J/wmw"o/.164:4178-4184(2000))，而且缺乏巖藻糖不影響Hu4D5和人Clq反應的能力(圖15，16)。同樣的，巖藻糖的存在或缺乏不影響IgGl與FcRn的結合。實施例3:抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)使用人乳腺癌細胞系SK-BR-3(Hudziak等Mo/.Ce〃9:1165-1172(1989))上的Lecl3-Hu4D5IgGl評價缺乏巖藻糖對ADCC的影響。將來自兩個FcYRIIIA(V158/F158)供者和兩個FcyRIIIA(F158/F158)供者的PBMCs作為效應細胞，其效應細胞靶細胞比是30:1。對於所有的供者，不含有巖藻糖的IgGl與含有巖藻糖的IgGl相比，其ADCC顯著增強(圖17-20)。值得注意的，對於所有的供者，細胞毒作用隨抗體濃度的降低更加明顯增強。這反映了所見到的二聚體的結合與六聚體相比增強的幅度更大，即為影響效應細胞的結合/活化，不含巖藻糖的變體需要位於靶細胞表面的mAbs更少。人單核細胞表達FcyRI，FcyRIIA，FcyRIIB，而只有一個亞群表達FcyRIIIA。由於缺乏巖藻糖不影響與FcyRI的結合，但對與FcyRIIA(R131)和FcyRIIB的結合有較小的影響，將純化的人單核細胞作為效應細胞，在效應細胞耙細胞比為20:1，10:1,和5:1時進行ADCC實驗。單核細胞的純化比PBMCs的純化更困難，因此ADCC實驗也較為困難。與PBMC的ADCC相比，儘管效應看似不明顯，而且單核細胞殺死耙細胞的能力也比PBMCs降低了(圖21-22)，但是單核細胞ADCC還是顯示了缺乏巖藻糖的IgGl具有增強的細胞毒作用。實施例4:Fc變體抗體的ADCC活性以下實驗比較了(1)CHO細胞中表達的Hu4D5(Hu4D5CHO-S)，(2)Lecl3細胞中表達的Hu4D5巖藻糖缺陷變體(hu4D5Lecl3)，(3)293HEK細胞中表達的Hu4D5三丙氨酸Fc區取代變體(Hu4D5HEK293-AAA);和(4)Lecl3細胞中表達的Hu4D5巖藻糖缺陷的三丙氨酸Fc區取代變體(Hu4D5-Lecl3陽AAA)。JZ)CC才法.使用磁性珠子(MiltenyiBiotech,Auburn,CA)自兩個供者的外周血中通過負選擇純化自然殺傷(NK)細胞。選擇的供者是等位基因的純合子，該等位因表達FcyR3(CD16)(F/F158)的F158形式(Shields等，編.C/ze肌276:6591-6604(2001))，該FcyR3表現出與IgG表型的較低的親和力。在5°C，由lng/ml各種抗體在實驗介質(含有50:50HamsF12:DMEM，其中包含1%熱滅活的胎牛血清和10mMHepes緩沖液)中調理過度表達HER2的SKBR-3乳腺癌細胞45分鐘，然後在效應細胞對耙細胞比(E:T)為10:1到0.156的情況下，將各種濃度的NK細胞於37。C下在潮溼的C02孵育箱中孵育5小時。通過乳酸脫氬酶(LDH)的釋放，使用商品試劑盒(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)可測定細月包毒4乍用。勿/敏的河凝i瘦炎^染悉法純化的NK細胞與2jig/ml各種Hu4D5變體在4。C的染色緩衝液(磷酸緩衝鹽溶液，0.1%牛血清白蛋白，0.01%疊氮鈉)中共同孵育30分鐘。洗滌細胞3次，並與藻紅蛋白偶聯的小鼠單克隆抗體抗-人CD56(Pharmingen,SanDiego，CA)和特異性的FITC-F(ab，)2山羊抗-人IgG(F(ab，)2(JacksonImmunoresearch,WestGrove,PA)—起於4。C下再孵育30分鐘。在FACScanTM流式細胞儀上(B.D.Biosciences,SanJose,CA)分析細胞的雙色免疫螢光染色。潛論:在兩個供者中(5365和7580)，當E/T比大於2時，相對於Hu4D5的Hu4D5-Lec13形式，Hu4D5的Hu4D5-Lecl3-AAA形式具有增強的ADCC活性(見圖26和27)，表明在巖藻糖缺陷的三丙氨酸Fc變體中，FcyRIII結合/ADCC協同增強。在表達CD56/CD16的NK細胞中的供體5365(見圖24和25)中，通過NK細胞的間接免疫焚光染色證實了結合的增強。儘管本發明的敘述與具體實施方案相關，應理解還可對本發明進行進一步修飾。本申請意在涵蓋根據本發明原則進行的任何變更，使用或改寫，並且包括脫離本發明但又符合本發明所屬領域的已知或習慣性做法，而且其與所附權利要求範圍內的、上文所述的本質特徵相符合。序列表司(Genentech,Inc.)糖蛋白組合物P1877R1PCTPCT/US02/337392002-10-22<150〉US60/337'6422001-10-25US60/347,694<151〉2002-01-0991<211〉218<212〉PRT人(homosapiens)<400〉1ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPhePro151015ProLysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluVal202530ThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGluValLys354045PheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThr505560LysProArgGluGluGinTyrAsnSerThrTyrArgValValSer657075ValLeuThrValLeuHisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyr808590LysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGluLys95100105ThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArgGluProGinValTyr110115120ThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsnGinValSer125130135LeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaVal140145150GluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThr155160165ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLys170175180LeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSer185190195CysSerValMetHisGlu200SerLeuSerLeuSerPro2152218<212〉PRT人(homosapiens)AlaLeuHisGlyLysAsnHis2052ProAlaPro1ProLysProThrCysValPheAsnTrpLysProArgValLeuThrLysCysLysThrlieSerThrLeuProIxuThrCysGluTrpGluProProValLeuThrValCysSerValGluLeuLeuLysAsp20ValVal35TyrVal50GluGlu65ValLeu80ValSer95LysAla110ProSer125LeuVal140SerAsn155LeuAsp170AspLys185MetHis200ThrAspAspGinHisAsnLysArgLysGlySerSerGluGlyGlyProLeuMetlieValSerHisGlyValGluTyrAsnSerGinAspTrpLysAlaLeuGlyGinProAspGluLeuGlyPheTyrGinProGluAspGlySerArgTrpGinAlaLeuHisSerVal10SerArg25GluAsp40ValHis55ThrTyr70LeuAsn85ProAla100ArgGlu115ThrLys130ProSer145AsnAsn160PhePhe175GinGly190AsnHis205SerLeuSerLeuSerProGlyLys2153<211〉217<212〉PRT人(homosapiens)<400〉3ProAlaProProValAlaGlyProSerValPhe1510TyrThrGinLys210PheLeuPhePro15ThrProGluVal30ProGluValLys45AsnAlaLysThr60ArgValValSer75GlyLysGluTyr90ProlieGluLys105ProGinValTyr120AsnGinValSer135AsplieAlaVal150TyrLysThrThr165LeuTyrSerLys180AsnValPheSer195TyrThrGinLys210LeuPheProPro15LysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThr202530CysValValValAsnTrpTyrValProArgGluGluLeuThrValValCysLysValSerlieSerLysThrLeuProProSerThrCysLeuValTrpGluSerAsnProMetLeuAspThrValAspLysSerValMetHisLeuSerLeuSerAsp35Asp50Gin65His80Asn95Lys110人rg125Lys140Gly155Ser170Ser185Glu200Pro215ValGlyPheGinLysGlyGluGlyGinAspArgAlaGly4218PRT人(homosapiens)<400〉4ProAlaProLysThrCysPheLysLysProProGluLeuProLysValTyrGluValTrpArgAsp20Val35Val50Glu65LeuThrAspAspGinSerHisValGluAsnSerAspTrpGlyLeuGinProGluMetPheTyrProGluGlySerTrpGinLeuHisLysGluAsp40ValHis55ThrPhe70LeuAsn85ProAla100ArgGlu115ThrLys130ProSer145AsnAsn160PhePhe175GinGly190AsnHis205GlyGlyLeuMetValSerGlyValPheAsnProAsnArgGlyProProAsnAspTyrLeuAsnTyrProSer10lieSer25HisGlu40GluVal55SerThr70GluValGinAlaLysThrValValSerLysGluTyrlieGluLysGinValTyrGinValSerlieAlaValLysThrThrTyrSerLysValPheSerThrGinLysArgAspHisPhePhe45Lys60Val75Lys90Thr105Thr120Leu135Glu150Pro165Leu180Cys195Ser210ValPheLeuPheThrProGluProGluValAsnAlaLysArgValValPro15Val30Gin45Thr60Ser75ValLeuThrValLysCysLysValThrlieSerLysThrLeuProProLeuThrCysLeuGluTrpGluSerProProMetLeuLeuThrValAspCysSerValMetSerLeuSerLeuLeu80Ser95Thr110Ser125Val140Ser155Asp170Lys185His200Ser215HisAsnLysArgLysGlySerSerGluProGinAspLysAlaGlyGinGluGluGlyPheGinProAspGlyArgTrpAlaLeuGlyLys<210〉5218PRT<213〉人(homosapiens)5ProAla1ProGluProThrPheLysValLysThrLysCysAsnProLeuCyslieProValTrpArgThrLysSerLysValTyrGluValValLysProLeuThrCysLeuThrLeuProPhe5Asp20Val35Val50Glu65Leu80Ser95Ala110Ser125Val140LeuThrAspAspGinHisAsnLysGinLysGlyGlyLeuMetTrpLeuProMetTyrGluSerGinHisProlieValSerGinGlyValPheAsnGinAspLysGlyGlyGinGluGluGlyPheLeu85Pro100人rg115Thr130Pro145Asn160Phe175Gin190Asn205GluSerTrpLeuProMetTy!AsnAlaGluLysSerAsnPheGlyArgSer10Ser25Glu40Val55Thr70Leu85Pro100人rg115Thr130Pro145ArgAspHisTyrAsnSerGlyLysProlieProGinGluGluValAsnGinValAsplieTyrAsnLeuTyrAsnlieAlaThrSerPhePheThrGinAsnAlaArgValGlyLysSerlieGluProGinValLysSerAsnGinAsplieTyr90Lys105Tyr120Ser135Val150Thr165Lys180Ser195Lys210ValPheLeuPheThrProGluProGluValLysValGluGluValAlaPro15Val30Gin45Thr60Ser75Tyr90Lys105Tyr120Ser135Val150GluTrpGlxSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThr155160165ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerArg170175180LeuThrValAspLysSerArgTrpGinGluGlyAsnValPheSer185190195CysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLys200205210SerLeuSerLeuSerLeuGlyLys215<210〉6<211〉215PRT小鼠(Musmusculus)<400〉6ThrValProGluValSerSerValPhe15LysAspValLeuThrlieThrLeuThr20ValValAspPheValAspGluGluGinlieAspPhelieMetHisGinValAsnSerAlaLysThrLysProProLysMetlieThrTrpAsnGlyMetAspThrGinLysSerLeuHisGluGlyGluAspSer35Val50Asn65Asp80Ala95人rg110Gin125Phe140LysGluAspAspValHisSerThrPheCysPheProMetPheAspGlySer170AsnTrpGlu185GlyLeuHis200TyrPheAlaGlyAsnHisProlie10Pro25Glu40PheProProLysValThrValGinPheThrAlaGinThrGin55LeuAsnProAlaLysAlaAlaLysProGluGinProAlaGluAsn155ArgGlyProProAspAspTyrValAsnHisSer70Lys85lie100Gin115Lys130lie145Lys160Tyr175Thr190Thr205ValSerGluGluPheLysGluLysThrValTyrThrValSerLeuThrValGluAsnThrGinSerLysLeuPheThrCysGluLysSerLysPro15CysVal30SerTrp45ProArg60LeuPro75CysArg90lieSer105liePro120ThrCys135TrpGin150Prolie165AsnVal180SerVal195LeuSer210HisSerProGlyLys215<210〉7<211〉218PRT小鼠(Musmusculus)<400〉7ProAlaProAsnLeuLeuGlyGlyProSerValPheliePhePro151015ProLyslieLysAspValLeuMetlieSerLeuSerProlieVal202530ThrCysValValValAspValSerGluAspAspProAspValGin354045lieSerTrpPheValAsnAsnValGluValHisThrAlaGinThr505560GinThrHisArgGluAspTyrAsnSerThrLeuArgValValSer657075AlaLeuProlieGinHisGinAspTrpMetSerGlyLysGluPhe808590LysCysLysValAsnAsnLysAspLeuProAlaProlieGluArg95100105ThrlieSerLysProLysGlySerValArgAlaProGinValTyr110115120ValLeuProProProGluGluGluMetThrLysLysGinVal丁hr125130135LeuThrCysMetValThrAspPheMetProGluAsplieTyrVal140145150GluTrpThrAsnAsnGlyLysThrGluLeuAsnTyrLysAsnThr155160165GluProValLeuAspSerAspGlySerTyrPheMetTyrSerLys170175180LeuArgValGluLysLysAsnTrpValGluArgAsnSerTyrSer185190195CysSerValValHisGluGlyLeuHisAsnHisHisThrThrLys200205210SerPheSerArgThrProGlyLys2158<211〉218<212〉PRT<213〉小鼠(Musmusculus)<400〉8ProAlaProAsnLeuGluGlyGlyProSerValPheliePhePro151015ProAsnlieLysAspValJLeuMetlieSerLeuThrProLysValThrCysValVallieSerTrpPheGinThrHisArgHisLeuProlieLysCysLysValThrlieSerLysThrLeuProProLeuThrCysLeuGluTrpThrSerAlaProValLeuLeuAsnMetLysCysAsnValArgThrlieSerArg9218PRT小鼠(MuseuAspGlySerTrpAlaLeuLeuProAla100AlaGinThr115MetSerLys130PheSerGlu145GluGinAsp160ThrTyrPhe175LeuGinGly190HisAsnHis205ProlieProGinLysLysAlalieTyrLysLeuTyrGtulieHisThrGluArg105ValTyr120ValSer135SerVal150AsnThr165SerLys180PheThr195GinLys210AsnLeuSerArgSerProGlyLys21權利要求1.包含人Fc區的糖蛋白，其中約51％-100％的糖蛋白包含成熟的核心碳水化合物結構，該結構缺乏巖藻糖，附著於糖蛋白的Fc區，其中Fc區包含不同於天然序列人IgGFc區的胺基酸序列，並且與具有附著於糖蛋白Fc區的包含巖藻糖的成熟核心碳水化合物結構的糖蛋白相比，其中所述糖蛋白(a)以更好的親和力結合FcγRIII，或者(b)更有效地介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC)。2.根據權利要求1的糖蛋白，對其中的Fc區殘基採用EU編號，該Fc區包含在胺基酸位置256,290，298，312，326，330，333,334,360，378或430中的任何一個或多個位置上的胺基酸取代。3.根據權利要求2的糖蛋白，其中Fc區包含對位置298,333和334中的任何兩個或三個殘基的胺基酸取代。4.根據權利要求3的糖蛋白，其中Fc區包含對位置298,333和334的胺基酸取代。5.根據權利要求4的糖蛋白，其中位置298，333和334上的取代殘基是丙氨酸。6.根據權利要求1-5中任一項的糖蛋白，其中的糖蛋白包括抗體。7.根據權利要求6的糖蛋白，其中抗體是嵌合的，人源化的或人的抗體。8.根據權利要求7的糖蛋白，其中抗體結合選自如下的抗原B細胞表面標誌物，ErbB受體，肺瘤相關抗原或血管生成因子。9.根據權利要求8的糖蛋白，其中抗體結合CD20,HER2,血管內皮生長因子(VEGF),CD40,或前列腺幹細胞抗原(PSCA)。10.根據權利要求9的糖蛋白，其中抗體包括人源化抗-HER2抗體，嵌合抗-CD20抗體和人源化抗-VEGF抗體。全文摘要本發明涉及包含具有Fc區的糖蛋白的組合物，該組合物中約80-100％的糖蛋白包含缺乏巖藻糖的成熟的核心碳水化合物結構，該結構附著於糖蛋白的Fc區。優選的糖蛋白是抗體和免疫粘附素。文檔編號C12PGK101357943SQ20081012975公開日2009年2月4日申請日期2002年10月22日優先權日2001年10月25日發明者倫納德·G·普雷斯塔申請人:傑南技術公司