一種海膽多功能肌動蛋白的分離純化方法
2023-06-07 04:12:16
一種海膽多功能肌動蛋白的分離純化方法
【專利摘要】本發明公開了一種海膽多功能肌動蛋白的分離純化方法，其特徵在於它包括以下步驟：（1）取海膽體腔液，經離心後取上清，獲得體腔液上清；（2）以體腔液上清為樣品進行非變性非還原的透析電泳；（3）透析電泳後再進行非變性非還原聚丙烯醯胺凝膠電泳；（4）根據非變性非還原聚丙烯醯胺凝膠電泳後海膽多功能肌動蛋白條帶的特有顏色，對多功能肌動蛋白條帶進行切膠，並通過凝膠破碎溶釋法回收凝膠中的蛋白，得到純化的海膽多功能肌動蛋白。本發明的優點在於：①純化樣品製備簡單、快捷；②試劑和設備要求簡單、易操作、步驟少、時間短；③純化的樣品具有高純度和高蛋白活性。
【專利說明】-種海膽多功能肌動蛋白的分離純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種蛋白質的分離純化方法，具體涉及一種海膽體腔液中多功能肌動 蛋白的分離純化方法，屬於棘皮動物生理學【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 海膽屬於無脊椎動物的最高等類群一棘皮動物門，其生理活動的完成要依賴眾多 生理因子的參與。肌動蛋白（actin)是無脊椎動物體內細胞骨架的主要成分之一，參與多 種細胞機能，包括細胞變形和收縮、細胞激化和細胞分裂等，同時也與損傷修復等免疫功能 密切相關。
[0003] 酚氧化酶（PO)是無脊椎動物體內最重要的免疫因子之一，通過氧化酚類底物的反 應，參與到病原異物的限制和隔離、傷口癒合、病原體的殺傷和抑制、調理作用、包囊作用和 結節形成等多種免疫應答過程。此外，無脊椎動物PO還廣泛應用於催化合成高分子材料 (如無甲醛汙染的新型樹脂材料和人造板材、光電材料等)、工業和生活染色、造紙過程中的 製漿漂白、環境中芳香類有機汙染物的降解與生物修復、食品工業中的健康添加劑(增加葡 萄酒和果汁等的穩定性和耐存性）以及生物檢測等。亞鐵氧化酶（ion oxidase)是無脊椎 動物體內與鐵代謝相關的氧化還原酶，主要參與鐵的吸收和轉運等代謝過程，而鐵是體內 諸多氧化還原酶的輔因子，因此亞鐵氧化酶對無脊椎動物的生長和免疫至關重要。無脊椎 動物體內的部分蛋白同時具有多種生物功能，這種現象稱為"兼職"。同時具有肌動蛋白、 酚氧化酶、亞鐵氧化酶功能的蛋白（簡稱多功能肌動蛋白，multifunctional actin, MA)尚 未在無脊椎動物中報導，是一種新蛋白。我們前期研究發現，在我國北方近海養殖的重要 經濟物種光棘球海膽iro /--?/5·和姦夷馬奠海膽iro 中存在ΜΑ，具有極小分子量(約0. 67kDa)，且嗜熱、耐高溫（100°C )。海膽MA與 單一 PO功能的酶相比，具有以下潛在應用優點：①海膽MA同時具有PO功能和亞鐵氧化酶 功能，可以完成單一 PO功能的酶所無法實現的一些高分子材料合成、染色、有機汙染物降 解和生物檢測等；②海膽MA的極小分子量使該蛋白具有比其他酶更好的擴散性和滲透性， 保證了該蛋白在工業和生活應用中具有更高的效率，同時也保證了該蛋白在基因工程表達 上具有更高的效率；③海膽MA的嗜熱、耐熱特性保證了該蛋白具有更好的適應性。因此，開 發一種可快速分離純化海膽M的方法，一方面對研究海膽的生長與免疫、促進海膽的健康 養殖具有重要意義；另一方面對促進和開發海膽M在工業和生活上的應用具有重要價值。
[0004] 目前分離純化蛋白的方法主要有超濾、鹽析、凝膠過濾層析、離子交換層析、高效 液相色譜等。針對某一蛋白的純化往往需要上述2種或多種方法的聯用，步驟多、操作復 雜、時間長且不利於蛋白活性保持。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種快速、簡便、高效的海膽多功能肌動蛋白的分離純化方 法。
[0006] 本發明通過非變性非還原的透析電泳和凝膠電泳分離海膽中同時具有肌動蛋白、 酚氧化酶、亞鐵氧化酶功能的多功能肌動蛋白（MA)，通過凝膠破碎溶釋技術回收MA，通過 液相色譜與串聯質譜聯用確定純化蛋白的純度與屬性，最後通過生化方法確定M的酶學 特性。
[0007] 非變性非還原電泳可快速、簡便、高效的分離具有不同生化特性的蛋白質，同時可 以最大限度保持蛋白在天然狀態下所具有的生物活性。凝膠破碎溶釋技術(用勻漿器將膠 條在超純水中勻漿使膠條中的蛋白溶釋到水中）可快速回收凝膠電泳中分離的特定蛋白條 帶。
[0008] 本發明的技術方案包括以下具體步驟：（1)取海膽體腔液，離心後取上清，獲得 體腔液上清；（2)將體腔液上清裝入IOkDa的透析袋中，封口後再將IOkDa的透析袋放入 0. IkDa的透析袋中，IOkDa透析袋與0. IkDa透析袋之間填充電泳緩衝液後，封口；再將 0. IkDa透析袋放入電泳緩衝液中進行非變性非還原的透析電泳；（3)非變性非還原透析電 泳後以透析袋之間填充液體為樣品進行非變性非還原聚丙烯醯胺凝膠電泳；（4)根據非變 性非還原聚丙烯醯胺凝膠電泳後M條帶的特有顏色對M條帶進行切膠，通過勻漿器將膠 條在超純水中勻漿使膠條中的M溶釋到水中(凝膠破碎溶釋)，從而得到純化的海膽MA。
[0009] 所述電泳緩衝液為Tris-甘氨酸緩衝液。
[0010] 所述非變性非還原透析電泳條件為30V恆壓電泳Ih。
[0011] 所述非變性非還原聚丙烯醯胺凝膠電泳條件為28mA恆流電泳7h。
[0012] 按所述的海膽MA分離純化方法分離純化光棘球海膽和蝦夷馬糞海膽中的MA， 得到結果如下：蝦夷馬糞海膽和光棘球海膽M在非變性非還原聚丙烯醯胺凝膠電泳條 件下分子量與指示劑溴酚藍的分子量非常接近，約〇. 67kDa，；液相色譜與串聯質譜聯用 (Nano LC-MS/MS)檢測結果顯示，光棘球海膽MA的純度為98. 3%，蝦夷馬糞海膽MA的純度 為99. 5% ;P0活性檢測結果顯示，海膽MA和沸水浴處理IOmin的海膽MA均可氧化左旋多巴 (L-D0PA)、多巴胺、鄰苯二酚、對苯二酚等PO底物，但不能氧化酪氨酸，表明兩種海膽MA具 有漆酶型PO活性，且具有耐高溫的特性；亞鐵氧化酶活性檢測結果顯示，海膽MA和沸水浴 處理IOmin的海膽MA均可氧化亞鐵離子，表明兩種海膽MA均具有亞鐵氧化酶活性，且具有 耐高溫的特性。
[0013] 本發明的優點在於：①使用海膽體腔液上清為樣品，樣品製備簡單、快捷；②通過 非變性非還原電泳和凝膠破碎溶釋實現海膽M的純化，純化試劑和設備要求簡單，純化過 程簡單易行、步驟少、時間短（7小時）；③純化的MA具有高純度（98%以上)，高蛋白活性（以 多巴胺為底物時活力高於3900U/mg ;以硫酸亞鐵為底物時活力高於1200U/mg)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發明分離海膽M的非變性非還原聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。
[0015] 其中，（A)為光棘球海膽MA凝膠電泳分離結果；（B)為蝦夷馬糞海膽MA凝膠電泳 分離結果。
[0016] 圖2為本發明純化的海膽MA的PO活性檢測圖。
[0017] 圖3為本發明純化的海膽M的亞鐵氧化酶活性檢測圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合附圖並通過具體實施例進一步說明本發明。
[0019] 實施例1 :非變性非還原電泳-凝膠破碎溶釋法分離純化光棘球海膽MA (1)製備體腔液上清 用滅菌注射器穿透光棘球海膽的圍口膜抽取體腔液，離心（4°C，3500rpm，IOmin)，取上 清作為體腔液上清。
[0020] (2)以體腔液上清為樣品進行非變性非還原的透析電泳和聚丙烯醯胺凝膠電泳 ①配製Tris-甘氨酸緩衝液（12. OgTris, 60. Og甘氨酸，4L超純水)，預冷至4°C。
[0021] ②將體腔液上清裝入IOkDa透析袋中，用橡皮筋封口，再將IOkDa透析袋放入 0. IkDa透析袋中，IOkDa透析袋與0. IkDa透析袋之間填充電泳緩衝液，將0. IkDa透析袋用 透析夾封口，30V恆壓電泳Ih (4°C )後，快速取出透析袋之間的填充液，作為粗提MA暫存於 4。。。
[0022] ③配製丙烯醯胺濃度為28%的分離膠和濃度為10%的濃縮膠，丙烯醯胺凝膠中不 含有任何變性劑和還原劑。聚丙烯醯胺凝膠配方和規格如表1所示： 表1聚丙烯醯胺凝膠配方和規格
【權利要求】
1. 一種海膽多功能肌動蛋白的分離純化方法，其特徵在於它包括以下步驟：（1)取海 膽體腔液，經離心後取上清，獲得體腔液上清；（2)將體腔液上清裝入lOkDa的透析袋中， 封口後再將l〇kDa的透析袋放入0. lkDa的透析袋中，lOkDa透析袋與0. lkDa透析袋之間 填充電泳緩衝液後，封口；再將〇. lkDa透析袋放入電泳緩衝液中進行非變性非還原的透析 電泳；（3)透析電泳後以透析袋之間填充液體為樣品進行非變性非還原聚丙烯醯胺凝膠電 泳；（4)根據海膽多功能肌動蛋白非變性非還原聚丙烯醯胺凝膠電泳後的特有顏色，對多 功能肌動蛋白條帶進行切膠，並通過凝膠破碎溶釋法回收凝膠中的蛋白，從而得到純化的 海膽多功能肌動蛋白。
2. 根據權利要求1所述的海膽多功能肌動蛋白的分離純化方法，其特徵在於步驟（1) 所述的海膽為光棘球海膽或蝦夷馬糞海膽。
3. 根據權利要求1所述的海膽多功能肌動蛋白的分離純化方法，其特徵在於步驟（2) 所述的電泳緩衝液為Tris-甘氨酸緩衝液。
4. 根據權利要求1所述的海膽多功能肌動蛋白的分離純化方法，其特徵在於步驟（2) 所述的非變性非還原透析電泳條件為30V恆壓電泳lh。
5. 根據權利要求1所述的海膽多功能肌動蛋白的分離純化方法，其特徵在於步驟（3) 所述的非變性非還原聚丙烯醯胺凝膠電泳條件為28mA恆流電泳7h。
6. 根據權利要求1所述的海膽多功能肌動蛋白的分離純化方法，其特徵在於步驟（4) 所述的凝膠破碎溶釋法是通過勻漿器將膠條在超純水中勻漿使膠條中的海膽多功能肌動 蛋白溶釋到水中。
【文檔編號】C07K1/26GK104404008SQ201410753306
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月10日 優先權日:2014年12月10日
【發明者】蔣經偉, 董穎, 陳仲, 高杉, 關曉燕, 姜北, 周遵春 申請人:遼寧省海洋水產科學研究院