基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方法

2023-06-14 01:04:11 1

基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方法
【專利摘要】一種應用範圍廣泛、分析快速簡便以及利於環保的基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方法。技術方案是：其特徵在於包括下列步驟：（1）通過泵輸送被測水樣溶液；（2）水樣溶液流經過濾柱；（3）流經過濾柱後的水樣進入螢光池；（4）利用高頻的脈衝激發光源-深紫外雷射二極體泵浦固體雷射器產生連續波段的光源，照射螢光池，利用在螢光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行空間分光，色散後形成λ1-λ2的光譜帶；（5）位於探測窗口處的CCD光電探測器同時採集λ1-λ2的光譜數據，通過內部轉變和時間序列積分得到波長-光強二維光譜；（6）數據處理系統經過海洋細菌螢光識別模式計算分析海洋細菌豐度和多樣性。
【專利說明】基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於海洋細菌原位豐度和多樣性檢測方法領域，尤其是一種應用範圍廣 泛、分析快速簡便以及利於環保的基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測 方法。本方法利用雷射誘導螢光過程產生的螢光光譜與各種海洋細菌本身具有的"特徵光 譜"的光學特性一即各種海洋細菌在雷射誘導螢光過程中產生的螢光光譜在不同波段上進 行比對，結合海洋細菌螢光識別模式，分析海洋細菌豐度和多樣性。

【背景技術】
[0002] 海洋細菌是海洋生態系統的的重要組成部分。對海洋環境中細菌的研究不僅是 目前生命科學前沿的領域之一，也是對海洋生態系統結構研究的重要組成部分。海洋細菌 參與降解各種海洋汙染物和毒物的過程，有助於保持海洋生態系的平衡和促進海洋自淨能 力；海洋細菌是產生新抗菌素、胺基酸、維生素和其他生理活性物質的重要生產者；細菌參 與海洋的沉積成巖作用，如參與硫礦和深海錳結核的形成等；在海洋成油、成氣的過程中， 細菌起著重要作用；海水具有殺菌效果，是由於海洋細菌的拮抗和溶菌作用，致使陸源致 病菌迅速死亡；海洋細菌可直接作為海洋經濟動物的餌料；細菌參與對各種海洋物質的腐 蝕、變性、汙穢和破壞過程；某些海洋細菌是人體或海洋生物的致病菌；在特定條件下，海 洋細菌代謝產物的積累會毒化養殖環境，如氨和硫化氫的積累危害生物養殖；也可以利用 細菌的代謝活動來改善被毒化的養殖環境，如氨的氧化等，因此對海洋細菌豐度和多樣性 檢測方法研究，對於進一步了解海洋細菌的生態結構以及在海洋碳循環中的作用具有相當 重要的意義。
[0003] 在研究方法上，目前主要採用海洋現場採樣，實驗室分離培養、基因測序的方法以 及螢光顯微鏡技術來觀察和研究海洋細菌的多樣性。螢光檢測技術由於其具有較高的靈敏 度在細菌研究中一直處於相當重要的位置。目前常用的螢光檢測技術在細菌中的應用主要 有螢光顯微技術、流式細胞螢光計數法、ATP螢光快速檢測法以及螢光蛋白標記等等。由於 這些技術存在需要對樣品進行採集和製片，進樣要求嚴格，需要製作螢光標記物等缺陷，很 難應用在海洋現場對細菌進行檢測。同時螢光顯微鏡技術和平板培養法研究證明，在大洋 環境中，只有少量的海洋細菌能通過傳統的固定平板技術形成菌落，一些細菌處於活的非 可培養狀態，應用常規的分離培養方法無法全面反映海洋細菌資源狀態以及生態功能，很 難全面了解細菌的豐度和多樣性及其生態學意義和在海洋碳循環中的作用。
[0004] 另外方法採用現場取樣後到實驗室分析的模式，即不能實現現場、實時測量的方 式，樣品運輸過程以及處理過程易引入其他幹擾物質，影響分析的準確性。海洋細菌豐度和 多樣性檢測涉及一定的環境條件以及複雜的過程，因此這個過程不可能保證不會出現二次 受汙的可能性，最重要的是由於海洋細菌的難培養性以及對高氧環境的不適應性，加上實 驗室環境與海洋環境之間差別較大，導致測量結果與實際情況之間有很大的差別，其結果 的準確性和可靠性受到質疑。
[0005] 上述方法不同程度存在著以下缺陷：1、必須在實驗室中完成，應用不能現場實時， 範圍受到限制。2、分析持續時間長，至少需要幾天時間。3、分析過程繁雜，條件苛刻、能耗 大，對實驗人員的技術水平要求高。
[0006] 由於海洋環境的特殊性以及海洋細菌的不可培養性，採取現場檢測可以更為真實 地反映海洋細菌的狀況。而螢光測量具有快速、便捷、連續測量、不需要培養等優勢，可以更 好地對細菌進行現場測量。
[0007] 近年來，雷射誘導突光（laser induced fluorescence,LIF)檢測法作為一種新型 的高靈敏度檢測方式，近年來得到了快速發展和廣泛的應用，是迄今為止靈敏度最高的光 學檢測方法，雷射誘導螢光檢測技術的靈敏度比普通螢光高1-3個數量級，其對螢光物質 的檢測限可以達到年nmo 1數量級，在適當的條件下甚至可以實現單分子檢測，由於其具有 靈敏度高、快速、便捷、連續測量、不需要培養等優勢，因此，採用原位雷射誘導螢光技術可 以較好地對海洋細菌的豐度和多樣性進行檢測，可以作為海洋細菌豐度和多樣性原位檢測 的一種重要方法。


【發明內容】

[0008] 本發明提供了一種應用範圍廣泛、分析快速簡便以及利於環保的基於雷射誘導熒 光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方法。該方法將雷射誘導螢光技術與細菌體內螢光 物質的不同種類、含量以及比例有機地結合起來，建立基於雷射誘導螢光的海洋細菌豐度 和多樣性檢測模式，為現場、快速監測海洋細菌豐度和多樣性提供了手段。
[0009] 為了達到解決上述技術問題的目的，本發明採用如下技術方案： 一種基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性檢測方法，其特徵在於本發明的 方法步驟如下： (1) 通過泵輸送被測水樣溶液； (2) 水樣溶液在泵的作用下，流經過濾柱，過濾柱內部填充氧化鎂負載鈷鐵金屬磁性納 米材料，並且具有控溫裝置，由於水體中含有粒徑較大浮遊植物，因此通過過濾柱可以過濾 掉粒徑大的浮遊植物； (3) 流經過濾柱後的水樣，進入螢光池，螢光池的窗口材料，靠近激發光源側的採用納 米金剛石材料，主要消除水體拉曼散射，靠近探測窗口一側的採用貼有薄膜材料-石墨烯 的矽玻璃，主要消除水體的螢光散射； (4) 利用高頻的脈衝激發光源-深紫外雷射二極體泵浦固體雷射器產生連續波段的光 源，照射螢光池，利用在螢光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行空間分光，色散後形成 入「入 2的光譜帶； (5) 位於探測窗口處的C⑶光電探測器同時採集的光譜數據，通過內部轉變和 時間序列積分得到波長-光強二維光譜； (6) 首先，針對水體中微微型藻類可能帶來的檢測誤差，利用高頻的脈衝激發光源，激 發採用400nm，發射採用685nm，CCD光電探測器採集光譜數據，作為水體藻類影響因子； (7) 其次，針對水體中CD0M的影響，根據CD0M有著自己的特徵螢光(激發340/發射 430)，同樣利用利用高頻的脈衝激發光源，激發採用340nm，發射採用430nm，(XD光電探測 器採集光譜數據，作為水體CD0M影響因子； (8) 最後，利用高頻的脈衝激發光源-深紫外雷射二極體泵浦固體雷射器產生連續 波段的光源275-450nm，照射螢光池，利用在螢光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行 空間分光，色散後收集280-535nm的光譜帶，位於探測窗口處的CCD光電探測器同時採集 280-535nm的光譜數據，通過內部轉變和時間序列積分得到波長-光強二維光譜； (9) 數據處理系統中採用建立的海洋細菌多樣性螢光識別模式，經過海洋細菌螢光識 別模式計算分析海洋細菌豐度和多樣性。
[0010] 在本發明中，還具有以下技術特徵：水樣流量為5. 0-10. Oml/min。
[0011] 在本發明中，還具有以下技術特徵：過濾柱內部填充氧化鎂負載鈷鐵金屬磁性納 米材料，控溫裝置的溫度範圍10-15 °C。
[0012] 在本發明中，還具有以下技術特徵：利用高頻的脈衝激發光源-深紫外雷射二 極管泵浦固體雷射器，具有體積小、無需水冷、波動噪音小、供電簡單等特徵，高頻範圍 100-150KHZ。另外採用連續激髮式脈衝激發光源，在一定程度上提高了測量精度，同時採用 深紫外激發可以激發細菌體內典型的螢光物質，不需要進行染色等步驟。
[0013] 在本發明中，還具有以下技術特徵：所述的建立的海洋細菌多樣性螢光識別模式 是基於細菌體內含有一些可以激發產生螢光的成分，採用雷射誘導螢光方法檢測海洋細菌 的過程當中，都會發出"特徵光譜"，這些成分的不同類別、含量或比例的不同，導致螢光峰 出現較大的差別，通過對螢光信號的採集和分析，採用主成分螢光矩陣的方法對細菌多樣 性進行鑑別，同時考慮到環境因素如藻類、CDOM、以及無機顆粒對螢光有可能產生影響，採 用主成分螢光光譜分析方法，建立海洋細菌多樣性螢光識別模式。
[0014] 在本發明中，還具有以下技術特徵：泵為蠕動泵，管路採用聚四氟乙烯材料製成。
[0015] 在本發明中，還具有以下技術特徵：CCD探測元件採用美國海洋光學背照式二維 面陣CCD光譜儀。
[0016] 在本發明中，還具有以下技術特徵：微型計算機數據分析處理系統中採用海洋細 菌多樣性螢光識別模式，該模型針對藻類以及CDOM等影響因子具有很好的修正作用，可以 消除這些影響因子對計算分析海洋細菌豐度和多樣性的影響。
[0017] 本發明的效果是： 本發明採用雷射誘導螢光方法檢測海洋細菌豐度和多樣性，是目前海洋生態環境監 測系統中的重要組成部分，方法利用海洋細菌體內螢光物質都會發出"特徵光譜"的現象， 通過雷射誘導螢光技術與細菌體內螢光物質的不同種類、含量以及比例有機地結合起來， 通過分光系統得到以波長為橫坐標和以光譜序列為縱坐標的平面色散圖，導入CCD探測元 件，光信號經光電探測處理轉換為電信號輸出，輸出電信號經微弱信號放大電路進行轉換， 放大到一定電壓幅度送數據處理部分的A/D轉換通道進行量化，時間序列積分處理後得到 全譜。
[0018] 通過時間序列積分處理後得到的全譜，根據各種細菌體內螢光物質的"特徵光 譜"，經經海洋細菌多樣性螢光識別模式軟體對全譜進行分析得到海洋細菌豐度和多樣性。
[0019] 本發明利用雷射誘導螢光方法檢測海洋細菌豐度和多樣性，方法能夠準確、連續、 快速的分析測試海洋細菌豐度和多樣性，可在惡劣的環境中長期可靠工作。
[0020] 下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是本發明方法工作原理流程圖； 圖2是本發明方法所採用的檢測裝置結構示意圖； 圖3是海洋細菌多樣性的雷射誘導螢光識別模式圖。
[0022] 圖中標號說明：1.水樣；2.水樣泵；3.脈衝激發光源；4.納米金剛石；5.螢光 池；6.石墨烯的矽玻璃；7. (XD光電探測器；8.控制部分；9.數據處理部分；10.廢液收 集；11.過濾柱；12.譜分光器件。

【具體實施方式】
[0023] 參見圖1、圖2， 本發明的方法步驟如下： (1) 通過泵2輸送被測水樣溶液； (2) 水樣溶液在泵2的作用下，流經過濾柱11，過濾柱11內部填充氧化鎂負載鈷鐵金 屬磁性納米材料，並且具有控溫裝置，由於水體中含有粒徑較大浮遊植物，因此通過過濾柱 可以過濾掉粒徑大的浮遊植物； (3 )流經過濾柱後的水樣，進入螢光池5，螢光池的窗口材料，靠近激發光源側的採用納 米金剛石4材料，主要消除水體拉曼散射，靠近探測窗口一側的採用貼有薄膜材料-石墨烯 的矽玻璃6,主要消除水體的螢光散射； (4) 利用ΙΟΟΚΗζ的脈衝激發光源3-深紫外雷射二極體泵浦固體雷射器產生連續波段 的光源，照射螢光池5,利用在螢光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行空間分光，色散 後形成λ 1- λ 2的光譜帶； (5) 位於探測窗口處的C⑶光電探測器7同時採集λ 1-λ 2的光譜數據，通過內部轉 變和時間序列積分得到波長-光強二維光譜； (6) 首先，針對水體中微微型藻類可能帶來的檢測誤差，利用ΙΟΟΚΗζ的脈衝激發光源 3,激發採用400nm，發射採用685nm，CCD光電探測器7採集光譜數據，作為水體藻類影響因 子； (7) 其次，針對水體中CD0M的影響，根據CD0M有著自己的特徵螢光(激發340/發射 430)，同樣利用利用ΙΟΟΚΗζ的脈衝激發光源3,激發採用340nm，發射採用430nm，C⑶光電 探測器7採集光譜數據，作為水體CD0M影響因子； (8) 最後，利用ΙΟΟΚΗζ的脈衝激發光源3-深紫外雷射二極體泵浦固體雷射器產生連續 波段的光源275-450nm，照射螢光池，利用在螢光池5探測一側的光譜分光器件12-光柵進 行空間分光，色散後收集280-535nm的光譜帶，位於探測窗口處的CCD光電探測器7同時採 集280-535nm的光譜數據，通過內部轉變和時間序列積分得到波長-光強二維光譜； (9) 數據處理系統中採用建立的海洋細菌多樣性螢光識別模式，經過海洋細菌螢光識 別模式計算分析海洋細菌豐度和多樣性。
[0024] 所述方法水樣流量為5. 0-10. 0ml/min。
[0025] 所述方法過濾柱內部填充氧化鎂負載鈷鐵金屬磁性納米材料，並且具有控溫裝 置，溫度範圍l〇_15°C。
[0026] 所述方法利用ΙΟΟΚΗζ的脈衝激發光源-深紫外雷射二極體泵浦固體雷射器，具有 體積小、無需水冷、波動噪音小、供電簡單等特徵，另外採用連續激髮式ΙΟΟΚΗζ脈衝激發光 源，在一定程度上提高了測量精度，同時採用深紫外激發可以激發細菌體內典型的螢光物 質，不需要進行染色等步驟。
[0027] 所述方法螢光池的窗口材料，靠近激發光源側的採用納米金剛石材料，主要消除 水體拉曼散射，靠近探測窗口一側的採用貼有薄膜材料-石墨烯的矽玻璃，主要消除水體 的螢光散射。
[0028] 所述的建立的海洋細菌多樣性螢光識別模式是基於細菌體內含有一些可以激發 產生螢光的成分，採用雷射誘導螢光方法檢測海洋細菌的過程當中，都會發出"特徵光譜"， 這些成分的不同類別、含量或比例的不同，導致螢光峰出現較大的差別，通過對螢光信號的 採集和分析，採用主成分螢光矩陣的方法對細菌多樣性進行鑑別，同時考慮到環境因素如 藻類、CD0M、以及無機顆粒對螢光有可能產生影響，採用主成分螢光光譜分析方法，建立海 洋細菌多樣性螢光識別模式。
[0029] 所述方法泵為蠕動泵，管路採用聚四氟乙烯材料製成。
[0030] 所述方法CCD探測元件採用美國海洋光學背照式二維面陣CCD光譜儀。
[0031] 所述方法微型計算機數據分析處理系統中採用海洋細菌多樣性螢光識別模式，該 模型針對藻類以及⑶0M等影響因子具有很好的修正作用，可以消除這些影響因子對計算 分析海洋細菌豐度和多樣性的影響。
[0032] 本發明的工作原理是： 採用雷射誘導螢光方法對細菌類別進行鑑別，主要因為細菌體內含有一些可以激發產 生螢光的成分，如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、DNA，RNA，NADH，NADPH，FAD以及胞外酶等，這 些成分的不同類別、含量或比例的不同，導致螢光峰出現較大的差別。這些物質的激發波長 範圍從250-450nm，而產生螢光的發射波長最大峰值出現在280-540nm之間。
[0033] 海洋細菌體內外不同螢光目標物的最大激發波長和發射波長，如表1 : 表1 :突光目標物光學特徵

【權利要求】
1. 一種基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方法，其特徵在於包括 下列步驟： (1) 通過泵輸送被測水樣溶液； (2) 水樣溶液在泵的作用下，流經過濾柱，過濾柱內部填充氧化鎂負載鈷鐵金屬磁性納 米材料，並且具有控溫裝置，由於水體中含有粒徑較大浮遊植物，因此通過過濾柱可以過濾 掉粒徑大的浮遊植物； (3) 流經過濾柱後的水樣，進入螢光池，螢光池的窗口材料，靠近激發光源側的採用納 米金剛石材料，主要消除水體拉曼散射，靠近探測窗口一側的採用貼有薄膜材料-石墨烯 的矽玻璃，主要消除水體的螢光散射； (4) 利用高頻的脈衝激發光源-深紫外雷射二極體泵浦固體雷射器產生連續波段的光 源，照射螢光池，利用在螢光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行空間分光，色散後形成 λ「入2的光譜帶； (5) 位於探測窗口處的C⑶光電探測器同時採集的光譜數據，通過內部轉變和 時間序列積分得到波長-光強二維光譜； (6) 數據處理系統中採用建立的海洋細菌多樣性螢光識別模式，經過海洋細菌螢光識 別模式計算分析海洋細菌豐度和多樣性。
2. 根據權利要求1所述的基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法，其特徵在於所述高頻的脈衝激發光源，激發採用400nm，發射採用685nm，CCD光電探測 器採集光譜數據，作為水體藻類影響因子； 所述高頻的脈衝激發光源，激發採用340nm，發射採用430nm，CCD光電探測器採集光譜 數據，作為水體CDOM影響因子； 所述高頻的脈衝激發光源-深紫外雷射二極體泵浦固體雷射器產生連續波段的光源 275-450nm，照射螢光池，利用在螢光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行空間分光，色 散後收集280-535nm的光譜帶，位於探測窗口處的(XD光電探測器同時採集280-535nm的 光譜數據，通過內部轉變和時間序列積分得到波長-光強二維光譜。
3. 根據權利要求1所述的基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法，其特徵在於所述的水樣流量為5. 0-10. Oml/min。
4. 根據權利要求1所述的基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法，其特徵在於所述過濾柱內部填充氧化鎂負載鈷鐵金屬磁性納米材料，控溫裝置的溫度 範圍 10-15°C。
5. 根據權利要求1所述的基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測 方法，所述的利用高頻的脈衝激發光源-深紫外雷射二極體泵浦固體雷射器的高頻範圍 100-150KHZ。
6. 根據權利要求1所述的建立的海洋細菌多樣性螢光識別模式是基於細菌體內含有 一些可以激發產生螢光的成分，採用雷射誘導螢光方法檢測海洋細菌的過程當中，都會發 出"特徵光譜"，這些成分的不同類別、含量或比例的不同，導致螢光峰出現較大的差別，通 過對螢光信號的採集和分析，採用主成分螢光矩陣的方法對細菌多樣性進行鑑別，同時考 慮到環境因素如藻類、CDOM、以及無機顆粒對螢光有可能產生影響，採用主成分螢光光譜分 析方法，建立海洋細菌多樣性螢光識別模式。
7. 根據權利要求1所述的基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法，其特徵在於所述的泵為蠕動泵，管路採用聚四氟乙烯材料製成。
8. 根據權利要求1所述的基於雷射誘導螢光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法，其技術特徵在於CCD探測元件採用美國海洋光學背照式二維面陣CCD光譜儀。
【文檔編號】G01N21/64GK104089937SQ201410344857
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月21日 優先權日:2014年7月21日
【發明者】張穎, 王昭玉, 張述偉, 褚東志, 任國興, 孔祥峰, 鄒研, 尤小華, 吳寧, 吳丙偉, 高楊, 王茜, 石小梅, 劉東彥, 郭翠蓮, 張穎穎, 範萍萍, 呂靖, 張國華, 曹璐, 張婷, 曹煊, 程巖, 劉巖, 侯廣利 申請人:山東省科學院海洋儀器儀表研究所